WO2011158829A1 - 表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング - Google Patents

表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング Download PDF

Info

Publication number
WO2011158829A1
WO2011158829A1 PCT/JP2011/063589 JP2011063589W WO2011158829A1 WO 2011158829 A1 WO2011158829 A1 WO 2011158829A1 JP 2011063589 W JP2011063589 W JP 2011063589W WO 2011158829 A1 WO2011158829 A1 WO 2011158829A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
metal nanoparticle
metal
nucleic acid
dna
strand
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/063589
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
古性　均
Original Assignee
日産化学工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日産化学工業株式会社 filed Critical 日産化学工業株式会社
Priority to EP11795734.0A priority Critical patent/EP2584345A4/en
Priority to KR1020137000390A priority patent/KR101886064B1/ko
Priority to US13/704,427 priority patent/US8896829B2/en
Priority to JP2012520456A priority patent/JP5835584B2/ja
Publication of WO2011158829A1 publication Critical patent/WO2011158829A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/10—Metallic powder containing lubricating or binding agents; Metallic powder containing organic material
    • B22F1/102—Metallic powder coated with organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/12—Metallic powder containing non-metallic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F1/00—Metallic powder; Treatment of metallic powder, e.g. to facilitate working or to improve properties
    • B22F1/14—Treatment of metallic powder
    • B22F1/148—Agglomerating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
    • B82B3/00—Manufacture or treatment of nanostructures by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B22—CASTING; POWDER METALLURGY
    • B22F—WORKING METALLIC POWDER; MANUFACTURE OF ARTICLES FROM METALLIC POWDER; MAKING METALLIC POWDER; APPARATUS OR DEVICES SPECIALLY ADAPTED FOR METALLIC POWDER
    • B22F2999/00—Aspects linked to processes or compositions used in powder metallurgy

Definitions

  • the present invention relates to a metal nanoparticle material for molecular sensing used in a surface-enhanced Raman scattering method applying a surface plasmon phenomenon, and a method for producing the same.
  • a metal nanoparticle material for molecular sensing composed of a metal nanoparticle aggregate in which metal nanoparticles having surface plasmon absorption in the visible light region are connected with an organic molecule such as DNA at a predetermined distance.
  • SERS surface enhanced Raman scattering
  • Raman active molecules di organic molecules such as rhodamine 6G
  • vibration spectra can be obtained even from single molecules or single particles. As a result, it becomes possible to detect trace chemical substances such as biomolecule recognition, and various studies are being actively studied.
  • Raman scattering is a physical phenomenon that is completely unsuitable for such a minute detection because of its characteristics.
  • the reason is considered as follows.
  • Raman scattering is caused by collision between a measurement molecule and a photon emitted from a laser beam.
  • the number of photons emitted from an argon laser having a wavelength of 488 nm per second can be estimated to be approximately 2.5 ⁇ 10 18 at 1 W output.
  • about 10 13 to 10 15 photons can collide with molecules, and the majority of photons pass by.
  • the former does not transfer energy between molecules and photons during collision, and the scattering that occurs in this collision mode is called "Rayleigh scattering".
  • Rayleigh scattering there is no energy transfer between photons and molecules, so the frequency of scattered light is equal to the wavelength of incident light.
  • Most of the slight collisions of molecules and photons described above are due to this elastic scattering, and so the majority of the scattered light is due to Rayleigh scattering.
  • photons collide with molecules and transfer their energy to molecules. For this reason, the frequency of scattered light differs from the frequency of incident light as opposed to Rayleigh scattering. Such scattering is called Raman scattering.
  • the case where Raman scattered light is larger than the frequency of incident light (when photons obtain energy from molecules) is called anti-Stokes Raman scattering, and the case where photons give energy to molecules is called Stokes Raman scattering.
  • the photons that cause such inelastic collisions are about 1/10 7 of the entire collision photons.
  • the number of photons causing an inelastic collision with respect to the number of incident photons and causing Raman scattering is very small. For this reason, the detection sensitivity is low, and it has been rarely used as an analysis means until now.
  • Resonance Raman is the effect of significantly increasing the intensity of the Raman band derived from the vibration of the chromophore part that causes the absorption band when measuring Raman scattering using excitation light with a wavelength that overlaps the absorption band of a molecule.
  • the Raman spectrum of a dye having a concentration of several ⁇ M can be measured. Then in 1977, P. P.
  • Non-Patent Document 6 Van Duyne et al. A. A group of Creighton et al. (Non-Patent Document 6) independently found surface enhanced Raman scattering. In fact, a group of Fleischmann et al. Observed this phenomenon three years ago, but they did not seem to notice that the scattering cross section increased as well as the resonance Raman effect.
  • SERS generally refers to a phenomenon in which the Raman scattering intensity of a certain molecule adsorbed on the surface of a metal electrode, sol, crystal, deposited film, or semiconductor is significantly enhanced as compared to when the molecule is in solution. There are still many unclear points regarding the mechanism of the phenomenon. Although SERS has been confirmed in gold, silver, copper, platinum, nickel, etc., the feature of SERS that is currently known is that the enhancement effect is particularly large in silver and gold. The typical physical properties show the following dependency. 1) The roughness of the metal surface has some involvement in SERS expression. 2) The SERS spectrum generally shows a clear wavelength dependence. 3) The SERS intensity depends on the orientation of molecules adsorbed on the metal surface. It also depends on the distance from the metal surface.
  • the reflection spectrum is regarded as surface plasmon absorption caused by the excitation light hitting the metal surface, and is considered to be expressed by the coupling between the molecular vibration of the adsorbed molecule and the surface plasmon excitation.
  • the other model is called a charge transfer model.
  • the reflection spectrum is considered as absorption of a complex formed by a metal surface and a molecule, and SERS is expressed by a resonance Raman effect resulting from this absorption.
  • Nanoparticles using SERS that have been proposed so far include, for example, a method in which a low molecular weight aromatic ring compound is directly adsorbed on the nanoparticle surface by electrostatic interaction, or a reporter molecule such as rhodamine, naphthalene, or quinoline having a thiol end.
  • a reporter molecule such as rhodamine, naphthalene, or quinoline having a thiol end.
  • Those adsorbed on the particle surface are applied as molecular recognition sensors and pH sensors (Non-Patent Document 8).
  • a nanoflaky metal composite material synthesis method see Patent Document 1
  • a method of adsorbing a dye (Raman active molecule) such as rhodamine 6G on the nanoporous surface see Patent Document 2
  • gold nanoparticles include a technique in which gold nanorods are fixed on a substrate and enhanced Raman scattering of surface molecules thereof is used for analysis (see Patent Document 3).
  • SERS is not only limited in the substrate and surface roughness that can be used, but also because the Raman intensity greatly depends on the orientation of the Raman active molecule, it is often measured. There will be large variations depending on the location, and there is a drawback that the analysis for obtaining quantitative properties is very difficult.
  • a low molecular weight Raman active molecule such as a conventionally proposed dye is used, the surface charge of the nanoparticle changes in the adsorption process (electrostatic adsorption process) of the Raman active molecule to the nanoparticle.
  • the present inventors have formed metal nanoparticle aggregates in which metal nanoparticles are connected to each other at predetermined intervals using organic molecules. It has been found that aggregation of metal nanoparticles and uneven concentration distribution of metal nanoparticles can be suppressed, and surface-enhanced Raman scattered light obtained from an enhanced electric field generated at a close interface between metal nanoparticles can be detected stably.
  • the present inventors can not only easily set the distance between metal nanoparticles to a desired distance by using DNA as an organic molecule for linking metal nanoparticles, but also an aggregate of metal nanoparticles. Has been found to be easily produced, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a metal nanoparticle material for molecular sensing, comprising a particle assembly, the assembly including a Raman active molecule in an electric field applied thereto, and emitting enhanced Raman scattered light from the Raman active molecule in an enhanced electric field. .
  • the present invention relates to the metal nanoparticle material for molecular sensing according to the first aspect, wherein the metal nanoparticle is made of a metal element having a resonance wavelength causing surface plasmon resonance in the ultraviolet light region to the infrared light region.
  • the present invention relates to the metal nanoparticle material for molecular sensing according to the first aspect or the second aspect, wherein the metal nanoparticles are particles having an average particle diameter of 1 nm to 100 nm.
  • the metal nanoparticle aggregate any one of the first aspect to the third aspect, in which the connected metal nanoparticles are not coupled in a straight line with the adjacent metal nanoparticles.
  • the molecule according to any one of the first to fourth aspects, wherein the organic molecule has a thiol group or an amino group at a terminal and includes a nucleic acid, polyethylene glycol, or hydrocarbon.
  • the present invention relates to metal nanoparticle materials for sensing.
  • the present invention relates to the metal nanoparticle material for molecular sensing according to the fifth aspect, wherein the organic molecule is a nucleic acid having a base number of 3 to 40 and having a thiol group or an amino group at its terminal.
  • the present invention relates to the metal nanoparticle material for molecular sensing according to the sixth aspect, wherein the nucleic acid is DNA.
  • the present invention relates to the metal nanoparticle material for molecular sensing according to any one of the first aspect to the seventh aspect, wherein the Raman active molecule is bonded to the organic molecule.
  • the molecular sensing according to any one of the first aspect to the eighth aspect, wherein the metal nanoparticles are formed by binding at least one molecular recognition probe molecule to the surface of the metal nanoparticles.
  • the present invention relates to a metal nanoparticle material.
  • the molecular recognition probe molecule is a molecule having a thiol group or an amino group at a terminal, and a molecule recognition probe bound via a nucleic acid, polyethylene glycol, or hydrocarbon.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing according to any one of the ninth aspects.
  • a single-stranded nucleic acid chain having a complement to the partial base structure in the nucleic acid chain (1) and a thiol group at one end of the single-stranded nucleic acid chain (1) as a substrate (2) obtaining a denatured nucleic acid strand in which at least two are associated to form a double helix; b) The thiol group of the denatured nucleic acid chain is reacted with the metal nanoparticle, the denatured nucleic acid chain is bonded to the surface of the metal nanoparticle, and then heated to 60 to 100 ° C. to form a double helical structure of the denatured nucleic acid chain.
  • Obtaining a metal nanoparticle (2) to which a single-stranded DNA strand (3) is bound d) By mixing the metal nanoparticles (1) to which the single-stranded DNA strand (2) is bound and the metal nanoparticles (2) to which the single-stranded DNA strand (3) is bound, the single-stranded DNA strand (2 ) And a single-stranded DNA strand (3) to form a double helix to produce a metal nanoparticle aggregate, And a step of binding a Raman-active molecule to the single-stranded DNA strand (2) used in the step a) or the single-stranded DNA strand (3) used in the step c), or both.
  • the metal nanoparticle having the single-stranded DNA strand (3) bound thereto is equivalent to one equivalent of the metal nanoparticle (1) bound to the single-stranded DNA strand (2).
  • the present invention relates to a method for producing a metal nanoparticle material for molecular sensing according to the twelfth aspect, in which a metal nanoparticle aggregate is produced using 2 equivalents of particles (2).
  • e) reacting a metal nanoparticle with a molecular recognition probe molecule having a molecular recognition probe at one end of a molecular chain containing nucleic acid, polyethylene glycol or hydrocarbon and having a thiol group or amino group at the other end A step of binding a molecular recognition probe molecule to the end of the metal nanoparticle via a thiol group or an amino group,
  • the present invention relates to a method for producing a metal nanoparticle material for molecular sensing according to any one of the twelfth aspect to the fourteenth aspect.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing according to any one of the first aspect to the tenth aspect is contacted with a specimen, and then Raman scattering measurement of the specimen is performed.
  • the present invention relates to a molecular sensing method.
  • the present invention relates to the molecular sensing method according to the sixteenth aspect, in which the metal nanoparticle material for molecular sensing is fixed on a substrate.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing according to the present invention is composed of a metal nanoparticle aggregate in which metal nanoparticles are linked at a predetermined interval, the enhanced electric field strength formed at the interface of the metal nanoparticles can be made constant.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing of the present invention can recognize a target analyte by connecting a molecular recognition probe such as biotin to the surface of the metal nanoparticle of the metal nanoparticle aggregate. And by using the metal nanoparticle material for molecular sensing of the present invention, it becomes possible to keep the surface enhanced Raman scattering intensity which reaches 10 11 times the normal Raman scattering intensity stably, so that the concentration is extremely high. Effective detection is possible even for thin specimens.
  • metal nanoparticles such as gold, silver, copper, platinum or nickel, which are surface-enhanced Raman scattering active particles, are terminated with a thiol group or an amino group.
  • a metal nanoparticle aggregate in which the metal nanoparticles are connected to the distance that generates the strongest enhanced electric field can be produced.
  • SERS active molecule recognition particles capable of recognizing a target analyte by linking a molecule (molecular recognition probe molecule) having a strong interaction with the target analyte to the surface of the metal nanoparticle in the metal nanoparticle aggregate. Can be synthesized.
  • FIG. 1 is a diagram showing a production scheme of a metal nanoparticle material for molecular sensing according to the present invention.
  • FIG. 2 is a transmission electron microscope image of 5′-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles.
  • FIG. 3 is a transmission electron microscope image of 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles.
  • FIG. 4 shows a transmission state of a particle state after mixing of 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles.
  • FIG. 5 is a diagram showing an atomic force microscope image of gold nanoparticles on which 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ is immobilized.
  • FIG. 6 shows the atomic force of the particles after mixing of 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles.
  • FIG. 7 is a diagram showing a shape and electric field measurement of a gold nanoparticle fixed with 5'-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 'using a near-field microscope.
  • FIG. 8 shows a near-field microscope of particles after mixing of 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles. It is a figure which shows the shape and electric field measurement by this.
  • FIG. 9 shows resonant Raman scattering of particles after mixing of 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles. It is a figure which shows a measurement result.
  • FIG. 9 shows resonant Raman scattering of particles after mixing of 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′
  • FIG. 10 shows the change in the temperature of the particles after mixing 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticles. It is a figure which shows explanatory drawing of a Raman scattering intensity change.
  • FIG. 11 shows 5′-HS-C6-GCCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3 ′ surface-modified gold nanoparticles and 5′-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3 ′ surface-modified gold nanoparticle introduced with biotin as a sensing probe on the surface.
  • FIG. 12 is a view showing a transmission electron microscope image of gold nanoparticles connected to a specific distance obtained in Example 1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of molecular recognition of streptavidin using gold nanoparticles linked at a specific distance.
  • FIG. 14 is a view showing a transmission electron microscope image of gold nanoparticles connected to a specific distance obtained in Example 2.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of ultraviolet / visible absorption spectrum measurement of the gold nanoparticle dispersion liquid on which the thiol-terminated DNA 11 obtained in Example 8 was adsorbed.
  • FIG. 12 is a view showing a transmission electron microscope image of gold nanoparticles connected to a specific distance obtained in Example 1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of molecular recognition of streptavidin using gold nanoparticles linked at a specific distance.
  • FIG. 14 is a view showing a transmission electron microscope image of gold nanoparticles connected to a specific distance obtained in Example 2.
  • FIG. 15 is
  • FIG. 16 is a diagram showing ultraviolet / visible absorption spectrum measurement results (DNA11: code 17, DNA12: code 18) of a gold nanoparticle dispersion obtained by further adsorbing the thiol-terminated DNA 11 or thiol-terminated DNA 12 obtained in Example 8. .
  • FIG. 17 is a view showing a transmission electron microscope image of the sample [1] solution obtained in Example 9.
  • FIG. 18 is a diagram showing a transmission electron microscope image of the sample [2] solution obtained in Example 9.
  • FIG. 19 is a view showing a transmission electron microscope image of the gold nanoparticle aggregate obtained in Example 9.
  • FIG. 20 shows the results of ultraviolet / visible absorption spectrum measurement of the gold nanoparticle dispersion liquid adsorbed with the thiol-terminated DNA 13, thiol-termini 14 or thiol-termini 15 obtained in Example 10 (DNA 13: code 19, DNA 14: code 20, DNA 15: It is a figure which shows the code
  • FIG. 21 shows the results of ultraviolet / visible absorption spectrum measurement of the sample [3] solution (DNA13), sample [4] (DNA14) solution or sample [5] solution (DNA15) obtained in Example 10 (DNA13: code 19, DNA14). : Code 20, DNA15: code 21).
  • FIG. 22 is a diagram illustrating the appearance (photographs) of sample [6] and sample [7] obtained in Example 10.
  • FIG. 23 is a diagram showing a resonance Raman scattering measurement result of AS1411 adsorption-gold nanoparticle particle aggregate.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of resonance Raman scattering measurement of a549 cancer cells.
  • FIG. 25 shows the results of resonance Raman scattering measurement of a549 cancer cells adsorbed with AS1411 adsorption-gold nanoparticle aggregates.
  • FIG. 26 is a diagram showing phosphoric acid-derived mapping of cancer cell-derived DNA, mapping of gold particle adsorption sites, and micrographs of cancer cells.
  • metal nanoparticle material for molecular sensing 3 to 10 metal nanoparticles are bonded to each other at a predetermined distance from each other by connecting metal nanoparticles via organic molecules.
  • a metal nanoparticle aggregate having the above structure is provided, and the aggregate includes a Raman-active molecule in an electric field applied thereto.
  • metal nanoparticle used by this invention consists of a metal element which has the resonance wavelength which produces surface plasmon resonance in an ultraviolet region thru
  • the metal nanoparticles desirably have an average particle diameter of 1 nm to 500 nm, preferably 1 nm to 100 nm, more preferably 5 nm to 100 nm, and particularly preferably 5 nm to 20 nm.
  • nucleic acids As an organic molecule used for linking metal nanoparticles, a molecular chain made of an organic compound such as nucleic acid, polyethylene glycol, or hydrocarbon can be used, and these organic molecules serve as groups for bonding to metal nanoparticles (surface). And having a thiol group or an amino group at the terminal.
  • nucleic acids can be made into organic molecules having a desired molecular chain length by adjusting the number of bases, that is, it is easy to adjust the distance between metal nanoparticles to a desired length. This is particularly preferable.
  • the numerical range of the number of bases of the nucleic acid is preferably 3 to 40 bases, more preferably 3 to 20 bases, and for example, it is preferable to use DNA having a length of 12 bases.
  • the organic molecule is bonded with the Raman active molecule (also referred to as a Raman probe) in addition to a compound (DNA or the like) used for adjusting the distance between the metal nanoparticles to a predetermined interval.
  • the Raman active molecule include a condensed ring compound in which several aromatic rings are connected in addition to a dye organic molecule such as rhodamine 6G (R6G), crystal violet (CRV), and coumarin. These Raman active molecules are introduced at either end of the organic molecule.
  • the number of metal nanoparticles connected by the organic molecules is preferably 3 to 10. This is because the direction of the enhanced electric field induced between two adjacent metal particles changes due to the movement of the two particles, and therefore the direction is not always directed to the direction of generating the optimum enhanced magnetic field.
  • particles are further bonded with organic molecules having a bonding direction having an angle of 180 ° or less with respect to the bonding direction of the organic molecules formed between the two particles. This is because it is desirable to form an aggregate of three or more particles. However, it is not preferable to combine aggregates composed of more organic molecules and metal particles with these three particle aggregates, because the concentration difference of the labeled portion occurs in the detection scene.
  • the linked metal nanoparticles are not bonded in a straight line with the adjacent metal nanoparticles, that is, the two organic molecules between the three metal nanoparticles are:
  • the middle metal nanoparticles are bonded at an angle of 180 ° or less, for example 10 to 160 °.
  • the metal nanoparticles (surface) in the metal nanoparticle aggregate may further have a molecule recognition probe molecule that can recognize the target analyte.
  • the molecular recognition probe molecule is, for example, a molecule recognition probe (DNA) having a base sequence different from the nucleic acid (DNA) used as the organic molecule, DNA glycol, or a molecular recognition probe (one) at one end of a molecular chain containing hydrocarbon. Biotin or the like; also referred to as a detection site), and a thiol group, amino group, or the like having a binding ability to the surface of the metal nanoparticle is introduced at the other end. Then, molecular recognition probe molecules are bonded to the metal nanoparticles (surface) via the thiol group.
  • the method for producing a metal nanoparticle material for molecular sensing includes the following steps a) to d). a) At least a single-stranded nucleic acid strand (2) having complementarity to a partial base structure in the nucleic acid strand (1) and having a thiol group at one end is added to the single-stranded nucleic acid strand (1) serving as a substrate.
  • the nucleic acid is preferably DNA, that is, the method for producing a metal nanoparticle material for molecular sensing includes the following steps a) to d).
  • At least a single-stranded DNA strand (2) having complementarity to a partial base structure in the DNA strand (1) and having a thiol group at one end of the single-stranded DNA strand (1) serving as a substrate Obtaining a denatured DNA strand that is associated with two to form a double helix; b) The thiol group of the denatured DNA strand is reacted with the metal nanoparticle, the denatured DNA strand is bonded to the surface of the metal nanoparticle, and then heated to 60 to 100 ° C. to form a double helix structure of the denatured DNA strand.
  • Obtaining a metal nanoparticle (2) to which a single-stranded DNA strand (3) is bound d) By mixing the metal nanoparticles (1) to which the single-stranded DNA strand (2) is bound and the metal nanoparticles (2) to which the single-stranded DNA strand (3) is bound, the single-stranded DNA strand (2 ) And a single-stranded DNA strand (3) to form a double helix to produce a metal nanoparticle aggregate.
  • the single-stranded DNA strand (2) used in the above step can be mutually complementary in the DNA strands (2), but preferably the DNA strands (2) are not mutually complementary. preferable.
  • the DNA (2) is complementary to each other.
  • the molecular chain length (that is, the base chain length) of the single-stranded DNA chain (2) and the single-stranded DNA chain (3) may be different, but it is preferable that they are of equal length.
  • the metal used for the metal nanoparticle (1) and the metal nanoparticle (2) used in the above step may be the same metal species or different metal species, it is preferable to use the same metal species. desirable.
  • the distance between the two thiol groups of the two DNA strands (2) associated with the single-stranded DNA strand (1) serving as the substrate is the metal nanoparticles (1) obtained in the step b) It corresponds to the binding position of the DNA strand (2) formed above.
  • the three metal nanoparticles, that is, the metal nanoparticles (1), and the subsequent d) step Three particles of two metal nanoparticles (2) in which the DNA strand (3) is associated and bound to the strand (2) will be arranged in a straight line.
  • the angle formed by the two enhanced electric fields formed between these three metal nanoparticles is 180 °, which is not preferable as described above. For this reason, it is important to adjust the chain length of the DNA strand and the size (average particle diameter) of the metal nanoparticles to adjust the arrangement (angle) of the three metal nanoparticles to a preferred angle.
  • the step d), that is, the step of producing a metal nanoparticle aggregate by mixing the metal nanoparticle (1) and the metal nanoparticle (2) includes an excessive amount of metal nanoparticles (1) By adding 2).
  • metal nanoparticles (1) and metal nanoparticles (2) at an equivalent ratio of about 1: 2 to 10, DNA strands (2) and DNA strands (3) are associated to form a double helix. Then, a bond by an organic molecule (DNA or the like) is formed between the two metal nanoparticles.
  • the thus obtained metal nanoparticle aggregate in which metal nanoparticles are connected at equal intervals functions as a molecular sensing metal nanoparticle material capable of emitting surface enhanced Raman scattering.
  • DNA1 and DNA2 are DNAs having a complementary strand relationship
  • DNA3 forms a double strand at the center, but both ends are base strands having a complementary strand relationship with DNA1 and DNA2.
  • DNA1 and DNA2 have a thiol group at their ends.
  • the synthesized denatured DNA 4 is mixed with a gold nanoparticle 5 colloid solution and bonded to the gold nanoparticle surface via a thiol group to form a gold nanoparticle having the DNA number 6 in FIG.
  • the solution is heated (the temperature is appropriately set according to the number of bases) to dissociate the double chain, and gold nanoparticles having DNA1 and DNA2 bound as indicated by number 7 in FIG. 1 are synthesized.
  • gold nanoparticles 8 and 9 in which DNA1 and DNA2 containing Raman active molecules are previously bonded to the gold nanoparticle surface via a thiol group are added to the gold nanoparticle indicated by number 7 in FIG.
  • double strands are assembled between DNAs to complete the gold particle bonding indicated by number 10 in FIG.
  • the gold particles can be fixed at a completely controlled position.
  • the above-described metal nanoparticle material for molecular sensing of the present invention is a useful method for molecular sensing by performing Raman scattering measurement of a specimen after contacting the specimen. At this time, the metal nanoparticle material for molecular sensing may be fixed on a substrate.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing of the present invention controls an enhanced electric field formed at the interface of metal nanoparticles by using a metal nanoparticle aggregate in which metal nanoparticles are bonded at a predetermined interval. That is, by forming a stable enhanced electric field on the surface of the metal nanoparticle, a certain Raman chain disturbance strength can be stabilized. Therefore, this is a very useful technique for improving the instability of Raman scattering as in the prior art.
  • These single-strand DNAs (a) and (b) are independently bonded to the gold nanoparticle surface by adding them to the gold nanoparticle solution (gold colloid solution), but the terminal thiol groups of these DNAs are unstable. Since the surrounding thiol groups are easily bonded to each other to form an SS bond, before the DNA is immobilized on the gold surface, the formed SS bond is returned to the thiol by a reducing agent. It is necessary to keep. Although this reduction method is not particularly limited, as an example, this time, the SS bond was reduced by the following procedure.
  • DNA DTT dithiothreitol
  • 5′-thiolated DNA DTT (dithiothreitol) solution was taken into a 1.5 mL microtube, and 20 ⁇ L of 2.5 M NaCl and 950 ⁇ L of ethanol cooled to ⁇ 20 ° C. were added. And left at ⁇ 80 ° C. for 20 minutes. Thereafter, it is centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., the supernatant is discarded, and redissolved with 50 ⁇ L of TE solution (Tris-EDTA Buffer: 10 mM Trishydroxymethylaminomethane, 1 mM EDTA, pH ⁇ 8), and purified thiolation. DNA was used.
  • the operation of immobilizing (binding) DNA to gold nanoparticles is not particularly limited, but this time, the following method was used. That is, 5 nmol of purified thiolated DNA obtained by reducing the SS bond by the method described above was added to 1 mL of the gold nanoparticle solution. At this time, the final concentration of thiolated DNA was 5 ⁇ L. After the addition, the container was stirred for 5 minutes using a vortex mixer and then left in a thermostatic bath at 50 ° C. for 4 to 24 hours to promote the immobilization of DNA on the gold nanoparticle surface.
  • Example 2 Production of gold nanoparticle aggregate
  • Two kinds of gold nanoparticle solutions each having DNA of complementary strands immobilized thereon by the above method are weighed in 0.5 mL macrotubes, centrifuged at 14,000 rpm for 25 minutes, and then the supernatant is removed and 10 mM phosphoric acid is removed.
  • Two kinds of gold nanoparticle dispersion solutions with DNA bonded to the surface thus obtained are mixed and the complementary strands of DNA are associated to form a bond between the gold nanoparticles, thereby forming metal nanoparticles.
  • Aggregates were produced. That is, first, 1 ⁇ L of 1% tween-20, 5 ⁇ L of DNA-modified gold nanoparticles (5 ⁇ L each of the modified particles in a complementary relationship) and 4 ⁇ L of 5M NaCl were added to a PCR tube and left at room temperature for 10 minutes. In the case where formation (appeared as an aggregate) was not observed, the mixture was cooled on ice and allowed to stand for 20 minutes or more, and then lightly centrifuged with a tabletop centrifuge to precipitate the resulting aggregate.
  • the gold nanoparticle aggregate is first added to a PCR tube with 1% tween-2 1 ⁇ L, DNA-modified gold nanoparticles 5 ⁇ L, 1 ⁇ M DNA 10 ⁇ L, 5 M NaCl 4 ⁇ L in a complementary strand relationship with the DNA used for the modification, Leave at room temperature for 10 minutes (If the formation of gold nanoparticle aggregates (looks like an aggregate) is not observed, leave it on ice for 20 minutes or more) and lightly centrifuge in a tabletop centrifuge. It was also obtained by precipitating the aggregate.
  • FIG. 2 shows a transmission electron microscope image of gold nanoparticles bound with the single-strand DNA (a) [5′-HS-C 6 -GCCCACCAGCTCC-C 6 -TAMRA-3 ′].
  • FIG. 3 shows a transmission electron microscope image of gold nanoparticles bound with [5′-HS—C 6 -GGAGCTGGTGGC-3 ′], and these gold nanoparticles were mixed. The transmission electron microscope images are shown in FIG. Further, FIG.
  • FIG. 5 shows an atomic force microscope image of the gold nanoparticle bound with the single-strand DNA (b) [5′-HS-C 6 -GGAGCTGGTGGC-3 ′].
  • the force microscope images are shown in FIG.
  • FIGS. 4 and 6 it was confirmed by transmission electron microscope images and atomic force microscope images that aggregates could be formed by mixing two kinds of monodispersed gold nanoparticles. .
  • Example 4 Analysis of gold nanoparticle aggregate (2): Measurement of enhanced electric field
  • the measurement of the enhanced electric field formed at the interface between adjacent gold nanoparticles and the shape measurement were simultaneously performed using a near-field micro microscope.
  • FIG. 7 shows the electric field (reference numeral 12 in FIG.
  • the gold nanoparticle bound to the single-strand DNA (b) and the single-strand DNA (a) [5′-HS-C 6 -GCCCACCAGCTCC-C 6 -TAMRA- 3 ′]-bonded gold nanoparticles were mixed, and the resulting gold nanoparticle aggregate image (positional information, reference numeral 13 in FIG. 8) and an electric field formed in the vicinity of the surface (in FIG. 8) Reference numeral 14) is shown in FIG.
  • FIG. 7 and FIG. 8 it was confirmed that a very strong enhanced electric field was obtained from the particles in which the gold nanoparticle aggregate was formed. From the Raman active molecules contained in this enhanced electric field, It was expected that very strong Raman scattering could be obtained.
  • the gold nanoparticles are indicated by reference numeral 16 in FIG.
  • FIG. 9 strong Raman scattering was observed from the gold nanoparticles on which the aggregates were formed. This can be said to occur because the aggregated (bonded) / dissociated state of gold nanoparticles as shown in FIG. 10 changes reversibly with temperature.
  • Example 6 Production of molecular recognition probe-containing gold nanoparticle aggregate and molecular recognition
  • the metal nanoparticle surface of the gold nanoparticle aggregate obtained in this way was further modified with a molecular recognition probe capable of recognizing a specific molecule.
  • the method is not particularly limited, but it is general that the DNA shown above is mixed in advance when it is immobilized on the gold nanoparticle surface. That is, first, 1 ⁇ L of 1% tween-20 in a PCR tube, 5 ⁇ L of DNA-modified gold nanoparticles, and 10% by mass in 10 ⁇ L of 1 ⁇ M DNA in a complementary strand relationship with DNA used for the modification of the DNA-modified gold nanoparticles.
  • the molecular recognition probe-containing gold nanoparticle assembly containing the molecular recognition probe thus obtained was added to a streptavidin plate, allowed to stand at room temperature for several minutes, then washed several times with sterile water, and an unfixed molecular recognition probe.
  • the gold nanoparticle aggregate for Raman sensing was thoroughly washed until the plasmon absorption of gold disappeared from the purified water.
  • a Raman scattering spectrum as shown in FIG. 11 was obtained, and molecular recognition by a molecular recognition probe-containing gold nanoparticle assembly for Raman sensing was achieved. It was shown that.
  • a group of bases having sites complementary to the single-stranded DNA and the above-mentioned A single-stranded DNA consisting of a base group that controls the interval between two single-stranded DNAs was prepared. That is, a 65-base DNA of CTGGGGTAGTCGCTACATTGGTAGGAATAGGATTGCATGGGATACTATACACTGCCACAGGCTTAC was synthesized from the 5 ′ end as a complementary DNA to be bound to the DNA shown above.
  • a 65-base DNA of GCACGTATACTAACTAAC TGTATAGATACGTGTAAGCCTGTGCAGGTGTATAGTATCCCCATCACATC was synthesized from the 5 ′ end as a complementary DNA to be bound to the DNA shown later.
  • the structures of the synthesized thiol-terminated 33-base DNA and 65-base DNA are as follows. 1: 5′-HS-C 6 -TTTCATTCCTACCAATGTAGCGACTACTCTAG-C6-TAMRA-3 ′ 2: 5'-HS-C 6 -TTTCGATCTAATACAGTTAGTTTAGTATACGTGC-3 ' 3: 5'-CTGAGGGTAGTCCGCATCATGGTAGGAATAGGATTGCATGGGA TACTATACACTGCACAGGCCTTAC-3 ' 4: 5′-GCACGTATATACAACTAGTGTATATAGCATGGTAAGCCTGTG CAGTGTATATAGTCCATGCAATC-3 ′
  • ⁇ Adsorption of DNA onto gold particles (1): gold nanoparticles with one DNA adsorbed> To 120 ⁇ L of gold nanoparticle dispersion (British Biocell International: particle size: 15 nm), 12 ⁇ L of a preliminarily prepared anhydrous bis (p-sulfonatophenyl) phenylphosphine dipotassium salt solution (10 mg / mL aqueous solution, referred to as BSPP) Mixing in a microtube formed gold nanoparticles whose surface was coated with BSPP. This mixed solution was centrifuged at 21,600 G at 4 ° C. for 1 hour, and the supernatant was discarded to finally make 10 ⁇ L.
  • anhydrous bis (p-sulfonatophenyl) phenylphosphine dipotassium salt solution 10 mg / mL aqueous solution, referred to as BSPP
  • This concentrated gold nanoparticle dispersion was mixed with 2 ⁇ L of tris-borate-EDTA (referred to as TBE) buffer (containing 0.5 ⁇ TBE, 1.4 M NaCl).
  • TBE tris-borate-EDTA
  • 2 ⁇ L of thiol-terminated DNA (2 ⁇ M) DNA1 or DNA2 shown above
  • the final volume was adjusted to 8 ⁇ L with 0.5 ⁇ TBE (containing 100 mM NaCl), and the mixed solution was allowed to stand at room temperature (22 ° C.) for 24 hours.
  • 250 ⁇ L of BSPP (0.25 mg / mL solution) was mixed and centrifuged at 4 ° C. for 1 hour at 21,600 G, and the supernatant was discarded to remove unreacted DNA.
  • ⁇ Adsorption of DNA onto gold particles (2) gold nanoparticles with two adsorbed DNAs> BSPP-coated 15 nm gold nanoparticles were prepared using the same method as in (1) above.
  • DNA5 The following three types of DNA (DNA5, 6, 7, 8, 9, 10) were prepared.
  • DNA5 5'-HS-TTTCATTCCTACCAATGTAGCGACTACTCTAGTTTTTT-3 ' DNA6;
  • DNA 7 and DNA 8 were assembled to form a double-stranded DNA strand (in FIG. 1, the central portion was double-stranded).
  • DNA5 and DNA6 were allowed to act on the single-stranded part of both ends of this DNA strand to form a double strand (corresponding to denatured DNA4 in FIG. 1). All conditions for assembling the duplex were performed according to Example 1. 5 nmol of this double-stranded DNA strand was added to 1 mL of the gold nanoparticle solution. After the addition, the container is stirred for 5 minutes using a vortex mixer, and then left in a constant temperature bath at 50 ° C.
  • gold nanoparticles (corresponding to gold nanoparticles 6 in FIG. 1) to which DNA was bound.
  • this gold nanoparticle-containing solution was heated at 90 ° C. for 5 hours to dissociate the double chain (corresponding to gold nanoparticle 7 in FIG. 1).
  • gold nanoparticles (corresponding to gold nanoparticles 8 and gold nanoparticles 9 in FIG. 1) adsorbed on DNA 9 and 10 prepared independently by the above-described method in advance are added to the gold nanoparticle-containing solution.
  • the gold nanoparticle aggregate (corresponding to the gold nanoparticle aggregate 10 in FIG. 1) was obtained.
  • a transmission electron microscope image of the obtained gold nanoparticle aggregate is shown in FIG.
  • FIG. 14 an aggregate in which three particles were bonded in a non-linear shape was obtained.
  • Example 7 Preparation of nucleic acid (DNA)] ⁇ Preparation and purification of DNA> First, single-strand DNA 11 and DNA 12 having a complementary strand relationship were prepared (see Table 1). Subsequently, in these DNA11 and DNA12, a thiol group was bonded to the 5 ′ end via a linear alkyl group having 6 carbon atoms (C 6 ) as a site to be immobilized on the gold surface.
  • C 6 6 carbon atoms
  • DTT dithiothreitol
  • thiol-terminated DNA 11 or DNA 12
  • a TE solution Tris-EDTA Buffer: 10 mM Trishydroxymethylaminomethane. 1 mM EDTA, pH ⁇ 8).
  • the solution was stirred by pipetting and vortexing, and then reacted at room temperature for 2 hours. By this operation, a portion where a part of SH-modified DNA was S—S bonded was cleaved.
  • a 3M sodium acetate aqueous solution was added to the DTT-treated DNA solution so as to be 1/10 times the amount of the DTT-treated DNA solution. Further, cold ethanol that had been cooled to 4 ° C. in advance was added in an amount 2.5 times that of the DNA solution. Thereafter, it was left in a -20 ° C. freezer for 6 hours or more to precipitate DNA. The precipitated DNA was recovered by centrifugation (4 ° C., 12,000 rpm; 7,740 G, 30 minutes). These ethanol precipitation-purification by centrifugation, that is, the cycle from adding 3M sodium acetate aqueous solution to precipitating and purifying was performed twice more.
  • Example 8 Immobilization of thiol-terminated DNA on gold nanoparticles
  • BB International gold nanoparticle dispersion
  • DNA11 or DNA12 thiol-terminated DNA
  • SS bond gold nanoparticle dispersion
  • FIG. 15 shows the results of ultraviolet / visible absorption spectrum measurement of the gold nanoparticle dispersion with thiol-terminated DNA 11 adsorbed.
  • FIG. 16 shows an ultraviolet / visible absorption spectrum of a gold nanoparticle dispersion liquid in which thiol-terminated DNA 11 (symbol 17 in FIG. 16) and thiol-terminated DNA 12 (symbol 18 in FIG. 16) are adsorbed.
  • Example 9 Production of gold nanoparticle aggregate
  • Two types of gold nanoparticle solutions each having DNAs of complementary strands (DNA11, DNA12) immobilized thereon by the above method were centrifuged at 13,000 rpm for 30 minutes to precipitate the gold nanoparticles, and the supernatant was removed.
  • 0.5 mL of 10 mM phosphate buffer (containing 0.1 M NaCl, pH 7) was added to redisperse the precipitate.
  • the mixture was centrifuged again at 13,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed, and then redispersed in 1 ⁇ L of 0.01% tween-20, 0.25 mL of 10 mM phosphate buffer (containing 0.1 M NaCl, pH 7).
  • the gold nanoparticle dispersion prepared using DNA 11 is referred to as a sample [1] solution
  • the gold nanoparticle dispersion prepared using DNA 12 is referred to as a sample [2] solution.
  • the results of observing each sample solution with a transmission electron microscope are shown in FIGS. 17 and 18, respectively.
  • a 3M sodium acetate aqueous solution was added to the DTT-treated DNA solution so as to be 1/10 times the amount of the DTT-treated DNA solution. Further, cold ethanol that had been cooled to 4 ° C. in advance was added in an amount 2.5 times the amount of the DNA solution. Thereafter, it was left in a -20 ° C. freezer for 6 hours or more to precipitate DNA. The precipitated DNA was recovered by centrifugation (4 ° C., 12,000 rpm; 7,740 G, 30 minutes). These ethanol precipitation-purification by centrifugation, that is, the cycle from adding 3M sodium acetate aqueous solution to precipitating and purifying was performed twice more.
  • ⁇ Immobilization of thiol-terminated DNA to gold nanoparticles 5 mL of the thiol-terminated DNA (DNA13 to DNA15) purified in the above step was added to 1 mL of a gold nanoparticle dispersion (BB International (BBB International) production: particle size: 10 nm), and the mixture was stirred for 1 minute by pipetting and vortexing, and then 50 ° C. For 24 hours to promote DNA immobilization on the gold nanoparticle surface. After standing for 12 hours, 40 ⁇ L of 2.5 M NaCl and 50 ⁇ L of 200 mM phosphate buffer (pH 7) were added to each gold nanodispersion, and the mixture was further allowed to stand at 50 ° C. for 45 hours.
  • the three kinds of gold nanoparticle solutions to which the above three kinds of DNA (DNA13 to DNA15) are respectively fixed are then centrifuged at 14,000 rpm (18,700 G) for 30 minutes to precipitate the gold nanoparticles, and the supernatant is removed. It was. To this, 0.5 mL of 10 mM phosphate buffer (containing 0.1 M NaCl, pH 7) was added to redisperse the precipitate. Centrifugation was again performed at 14,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was removed, and then redispersed in 0.25 mL of 0.01% tween-20 1 ⁇ L, 10 mM phosphate buffer (containing 0.1 M NaCl, pH 7).
  • Gold nanoparticles prepared using DNA 13 are referred to as a sample [3] solution
  • gold nanoparticles prepared using DNA 14 are referred to as a sample [4] solution
  • gold nanoparticles prepared using DNA 15 are referred to as a sample [5] solution.
  • the measurement results of ultraviolet and visible absorption spectra of each sample solution are shown in FIG. 21 (in the figure, DNA13: code 19, DNA14: code 20, DNA15: code 21).
  • sample [3] Solution and sample [5] Solution> To a 1.5 mL microtube, add 1 ⁇ L of 1% tween-20, 10 ⁇ L of sample [3] solution (DNA chain length: 42 mer), 10 ⁇ L of sample [5] solution (DNA chain length: 15 mer), 4 ⁇ L of 5 M NaCl, and 75 ° C. After being left in a high-temperature bath for 1 hour, it was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After allowing to stand for 10 minutes, it was confirmed that the color of the solution changed from red to purple, and after further standing for 20 minutes, light centrifugation was performed to associate the complementary strands of DNA bases, thereby binding the gold nanoparticles. A gold nanoparticle aggregate obtained by forming was obtained. The obtained aggregate is referred to as sample [6].
  • sample [4] Solution and sample [5] Solution> To a 1.5 mL microtube, add 1 ⁇ L of 1% tween-20, 10 ⁇ L of sample [4] solution (DNA chain length: 27 mer), 10 ⁇ L of sample [5] solution (DNA chain length: 15 mer), 4 ⁇ L of 5 M NaCl, and 75 ° C. After being left in a high-temperature bath for 1 hour, it was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After allowing to stand for 10 minutes, it was confirmed that the color of the solution changed from red to purple, and after further standing for 20 minutes, light centrifugation was performed to associate the complementary strands of DNA bases, thereby binding the gold nanoparticles. A gold nanoparticle aggregate obtained by forming was obtained. The obtained aggregate is referred to as sample [7]. Appearances (photos) of the obtained sample [6] and sample [7] are shown in FIG.
  • Example 3 Molecular recognition by nucleic acid
  • a molecule obtained from Tsukuba Oligo Service Co., Ltd. in which the terminal of aptamer AS1411, which is one of nucleic acid preparations for lung cancer, is modified with a thiol group is adsorbed on the surface of the gold nanoparticle assembly produced in Example 9, and this is adsorbed onto lung cancer cells. (A549) was applied, and the Raman scattering spectra before and after the action were compared.
  • a 5 nM aptamer AS1411 solution was added to a gold nanoparticle assembly dispersion liquid prepared according to Example 9 (dispersed in a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)), and stirred at 40 ° C.
  • the AS1411 adsorbed-gold nanoparticle aggregate thus obtained was added to lung cancer cells previously cultured in a culture dish, and 20 uL was allowed to stand for 48 hours to be adsorbed to the cancer cells. Thereafter, the surface of the cancer cell was measured with a Raman spectroscopic device, and the Raman scattering spectra on the surface of the cancer cell before adsorption and the surface of the cancer cell after adsorption were compared.
  • FIG. 23 shows the Raman scattering spectrum of the AS1411 adsorption-gold nanoparticle aggregate
  • FIG. 24 shows the Raman scattering spectrum of the a549 cancer cell
  • Raman of the a549 cancer cell adsorbed with the AS1411 adsorption-gold nanoparticle aggregate shows the Raman scattering spectrum of the a549 cancer cell
  • the scattering spectrum is shown in FIG. As shown in FIGS. 24 to 25, the Raman scattering spectrum was greatly changed by allowing AS1411 adsorption-gold nanoparticle aggregates to act on cancer cells, and the gold nanoparticle aggregates produced in Example 9 were used. It was confirmed that molecular recognition was possible.
  • Example 4 Molecular recognition by nucleic acid
  • a molecule obtained from Tsukuba Oligo Service Co., Ltd. in which the terminal of aptamer AS1411 which is one of nucleic acid preparations for lung cancer is modified with a thiol group is adsorbed on the surface of the gold nanoparticle aggregate produced by the method shown in Example 3, This was allowed to act on lung cancer cells (a549) to attempt adsorption site mapping.
  • the AS1411 adsorbed-gold nanoparticle aggregate obtained was added to lung cancer cells previously cultured in a culture petri dish, and 20 uL was allowed to stand for 48 hours to be adsorbed to the cancer cells.
  • the surface of the cancer cell was measured with a Raman spectroscope, and the Raman spectrum related to the adsorption was measured, and the phosphoric acid-derived mapping of the cancer cell-derived DNA and the gold particle adsorption site were mapped and the micrographs were overlaid for comparison. As a result, it was confirmed that cancer cells were recognized.
  • the metal nanoparticle material for molecular sensing of the present invention is useful as a highly sensitive molecular recognition sensor, and can be used as a material suitable for micromolecular recognition, that is, sensing of a biological substance.
  • Electric field information emitted from gold nanoparticles to which single-strand DNA (b) is bound Position information of gold nanoparticles in the gold nanoparticle aggregate 14.
  • Electric field information emitted from gold nanoparticles in the gold nanoparticle aggregate 15.
  • Enhanced Raman scattering by gold nanoparticles in proximity in a gold nanoparticle assembly 16.
  • Enhanced Raman scattering by gold nanoparticles from which gold nano-aggregates by heating have been eliminated 18.
  • UV / visible absorption spectrum of gold nanoparticle dispersion on which thiol-terminated DNA 13 is adsorbed 20 UV / visible absorption spectrum of gold nanoparticle dispersion liquid adsorbed with thiol-terminated DNA14
  • UV / visible absorption spectrum of gold nanoparticle dispersion liquid adsorbed with thiol-terminated DNA14 UV / visible absorption spectrum of gold nanoparticle dispersion with adsorbed thiol-terminated DNA15

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

【課題】増強ラマン散乱用金属ナノ粒子において特にその増強電場強度を粒子間距離のコントロールによって制御し、非常に強いラマン散乱特性を付与することにより、高感度なラマン散乱センシングを提供する。 【解決手段】金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料並びに該分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法及び該分子センシング用金属ナノ粒子材料を用いた分子センシング。

Description

表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング
　本発明は表面プラズモン現象を応用した表面増強ラマン散乱法に用いる、分子センシング用金属ナノ粒子材料並びにその製造方法に関する。
　詳細には、可視光領域において表面プラズモン吸収を有する金属ナノ粒子同士をＤＮＡなどの有機分子により所定距離を設けて連結した金属ナノ粒子集合体よりなる分子センシング用金属ナノ粒子材料である。
　金属表面に吸着した有機分子に対して特異的に見出される特性として、表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｒａｍａｎ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＥＲＳ）がある。
　ＳＥＲＳとは、具体的には、金属粒子同士が近接することにより、該粒子表面上で共鳴効果により、局在表面プラズモンを誘起し、さらに局在表面プラズモンが増強電場を誘起し、該増強電場中に金属粒子に吸着して存在してなるラマン活性分子（ローダミン６Ｇなどの色素有機分子）からのラマン散乱が増強された現象をいう。
　このＳＥＲＳが注目される１つの理由には、単一分子や単一粒子からでも振動スペクトルを得ることができることにある。これにより生体分子認識など微量化学物質の検出が可能となるため、種々の研究が現在盛んに検討されている。（非特許文献１、２，３）
　そもそもラマン散乱は、その特性上、このような微量検出には全く不向きな物理現象である。その理由は次のように考えられる。
　ラマン散乱は測定分子とレーザー光から放出される光子（フォトン）の衝突に起因している。たとえば、１秒間に波長４８８ｎｍアルゴンレーザーから放出されるフォトン数は１Ｗ出力でおよそ２．５×１０18個と見積もることができる。このうち分子と衝突できるフォトンは１０13～１０15個程度で、大多数のフォトンは素通りする。このわずかに衝突するフォトンの衝突モードには、弾性衝突と非弾性衝突の２種類がある。前者は衝突の間に分子とフォトン間でのエネルギーの授受がないもので、この衝突モードで起こる散乱を「レイリー散乱」と呼んでいる。レイリー散乱ではフォトンと分子間のエネルギー授受が無いため散乱光の振動数はあくまでも入射光の波長に等しいことになる。上記のわずかに起こる分子とフォトンの衝突の大部分がこの弾性散乱であり、このため散乱光の大部分がレイリー散乱である。
　一方、非弾性散乱は弾性散乱とは逆にフォトンは分子と衝突し、そのエネルギーを分子へと移動する。このため散乱光の振動数は、レイリー散乱とは対照的に入射光の振動数とは異なってくる。このような散乱をラマン散乱と呼んでいる。特にラマン散乱光が入射光の振動数よりも大きい場合（フォトンが分子からエネルギーを得る場合）をアンチストークスラマン散乱、逆にフォトンが分子にエネルギーを与える場合をストークスラマン散乱と呼ぶ。このような非弾性衝突を起こすフォトンは衝突フォトン全体のおよそ１／１０7程度である。このように入射フォトン数に対して非弾性衝突を起こしラマン散乱を引き起こすフォトン数は非常に少ない。このため検出感度が低く、今まで分析手段として用いられることが少なかった。
　しかし、１９７０年代に入るとＷ．Ｈｏｌｚｅｒら（非特許文献４）による気体ハロゲン分子の共鳴ラマン散乱スペクトルの測定など多数の共鳴ラマンに関する研究が報告され始めた。この共鳴ラマン散乱による散乱強度の増大（通常共鳴ラマン効果による強度増強は１０3～１０5倍程度）に伴いラマン散乱は脚光を浴びるようになった。共鳴ラマンとは、ある分子の吸収帯に重なる波長の励起光を用いてラマン散乱を測定したときに、吸収帯の原因となる発色団部分の振動に由来するラマンバンドの強度が著しく増大する効果で、数μＭ程度の濃度の色素のラマンスペクトル測定を可能にした。
　その後１９７７年に更にＰ．Ｐ．Ｖａｎ　Ｄｕｙｎｅら（非特許文献５）とJ．Ａ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（非特許文献６）のグループが独立に表面増強ラマン散乱を見出した。実際は、それより３年前にＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎらのグループがこの現象を観測していたが、彼らは散乱断面積が共鳴ラマン効果同様に増大していることに気がつかなかったようである。
　ＳＥＲＳは一般には金属電極、ゾル、結晶、蒸着膜、半導体の表面上に吸着したある種の分子のラマン散乱強度が、その分子が溶液中にあるときよりも著しく増強される現象をいうが、現在でもその現象のメカニズムに関しては不明な点が多い。金、銀、銅、白金、ニッケルなどでＳＥＲＳは確認されているが、現在分かっているＳＥＲＳの特徴は、特に、銀や金において増強効果が大きいことである。その代表的物性は次のような依存性を示す。
１）金属表面の粗さがＳＥＲＳ発現に何らかの関与をしている。
２）ＳＥＲＳスペクトルは一般に明確な波長依存性を示す。
３）ＳＥＲＳ強度は金属表面に吸着した分子の配向に依存する。また、金属表面からの距離に依存する。
　ＳＥＲＳ発現のメカニズムは現在２つの考え方が提案されている。１つは表面プラズモンモデルである。このモデルは反射スペクトルを励起光が金属表面に当たることによって生じる表面プラズモンの吸収であるとみなし、吸着分子の分子振動とこの表面プラズモン励起とのカップリングによって発現するものと考えるものである。もう１つのモデルは、電荷移動モデルと呼ばれるもので、反射スペクトルを金属表面と分子が形成する錯体の吸収と考え、この吸収に起因する共鳴ラマン効果によりＳＥＲＳが発現するという考え方である。いずれにせよ、現在そのメカニズムはまだ解明されていないにしても、先に説明した共鳴ラマン条件とＳＥＲＳの条件が重なった表面増強ラマン散乱では散乱強度が１０11～１０14倍程度にも増大することが明らかとなり、単一分子分光の可能性が大きく広がったのである。この感度の高さゆえ微量定性分析には既に応用され始めている。
　これまで提案されたＳＥＲＳを応用したナノ粒子としては、例えば低分子芳香環化合物を直接静電相互作用によりナノ粒子表面に吸着させる方法や、チオール末端を有するローダミン、ナフタレン、キノリンなどレポーター分子をナノ粒子表面に吸着させるものなどが（非特許文献７）、分子認識センサーやｐＨセンサーとして応用されている（非特許文献８）。
　ＳＥＲＳ粒子の合成法としてはナノフレーク状金属複合体材料合成法（特許文献１参照）や、ナノ多孔質体表面にローダミン６Ｇなど色素（ラマン活性分子）を吸着させる方法（特許文献２参照）、また金ナノ粒子を応用した例では基板上に金ナノロッドを固定し、その表面分子の増強ラマン散乱を分析に用いるもの（特許文献３参照）などが知られている。
　また、複数の会合した粒子の表面、および複数の金属粒子が最初に接触した複数の接合部に吸着した、複数のラマン活性有機化合物を含む金属クラスターを形成する、いくつかの融合または会合した複数の金属粒子を含む複数の合成有機無機ナノクラスター（特許文献４参照）が開示されている。
特開２００９－０６１５８０号公報 特開２００８－１８４６７１号公報 特開２００５－２３３６３７号公報 特表２００７－５１４１６９号公報
ACS Nano 2(4) 612-616,(2008) Anal Chem, 79,6927-6932,(2007) Anal Chem, 77, 6134-6139, (2005) J.Chem.Phys. 52,399 (1970) J.Electroanal Chem.,84,1 (1977) J.Am.Chem.Soc.,99,5215,(1977) Langmuir 23,10539-10545(2007) Nano Lett. Vol7, Nｏ9 2819-2823(2007) J.Am.Chem.Soc. Vｏl131, 7518-7519 (2009)
　近年ＳＥＲＳは種々の応用が検討されているものの、使用できる基板や表面粗さに制限があるだけでなく、更にそのラマン強度はラマン活性分子の配向性に大きく依存することから、多くの場合測定箇所による大きなばらつきを生ずることとなり、定量性を求めた解析が非常に難しいなどの欠点がある。
　更に従来提案されている色素などの低分子系ラマン活性分子を用いた場合、該ラマン活性分子のナノ粒子への吸着プロセス（静電的吸着過程）において、ナノ粒子の表面電荷が変化し、粒子間の表面電荷反発が弱まるために起こるとされるナノ粒子の凝集が起きる点が問題となる。ナノ粒子の凝集は、ラマン活性分子の脱離を引き起こすだけでなく、分子認識前にラマン活性分子の吸着したナノ粒子の凝集が起こると、分子認識前にも関わらずＳＥＲＳ信号が出てしまうため誤認識につながる。特に生体環境下でこれら粒子を用いる場合、高塩濃度下での分散安定性確保は必須であり、凝集問題に対する対策が必要とされている。
　本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、金属ナノ粒子同士を有機分子を用いてあらかじめ一定間隔となるように連結させた金属ナノ粒子集合体を形成することにより、金属ナノ粒子の凝集や、金属ナノ粒子の濃度分布の偏りを抑制でき、金属ナノ粒子同士の近接界面に生成する増強電場から得られる表面増強ラマン散乱光を安定に検出できることを見出した。
　また本発明者らは、金属ナノ粒子同士を連結する有機分子として特にＤＮＡを用いることにより、金属ナノ粒子間の距離を所望の距離に為すことが容易にできるだけでなく、金属ナノ粒子の集合体を容易に製造することができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、第１観点として金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第２観点として、前記金属ナノ粒子が、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外光領域乃至赤外光領域に有する金属元素よりなる、第１観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第３観点として、前記金属ナノ粒子が、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均粒子径を有する粒子である、第１観点又は第２観点記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第４観点として、前記金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子がその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線上に結合されていない、第１観点乃至第３観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第５観点として、前記有機分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む、第１観点乃至第４観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第６観点として、前記有機分子が、３乃至４０の塩基数を有し、且つ、チオール基又はアミノ基を末端に有する核酸である、第５観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第７観点として、前記核酸がＤＮＡである、第６観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第８観点として、前記ラマン活性分子は前記有機分子に結合してなる、第１観点乃至第７観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第９観点として、前記金属ナノ粒子が、少なくとも１個以上の分子認識プローブ分子をその金属ナノ粒子表面に結合してなる、第１観点乃至第８観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第１０観点として、前記分子認識プローブ分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を介して分子認識プローブが結合された分子である、第１観点乃至第９観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
　第１１観点として、ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに、
前記ａ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
　第１２観点として、ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに
前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
　第１３観点として、前記ｄ）工程において、該一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）の１当量に対して、該一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を２当量用いて金属ナノ粒子集合体を製造する、第１２観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
　第１４観点として、前記一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、互いに相補性を有する部位を持たないものである、第１２観点又は第１３観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
　第１５観点として、さらに、ａ）乃至ｄ）のうちいずれかの工程において、
ｅ）核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブを有し、他方の末端にチオール基又はアミノ基を有する分子認識プローブ分子と、金属ナノ粒子とを反応させて、金属ナノ粒子表面に、チオール基又はアミノ基を介して末端に分子認識プローブ分子を結合させる工程
を含む、
第１２観点乃至第１４観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
　第１６観点として、第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料を、検体と接触させた後、検体のラマン散乱測定を行うことを特徴とする、分子センシング方法に関する。
　第１７観点として、前記分子センシング用金属ナノ粒子材料が基板上に固定されてなる、第１６観点に記載の分子センシング方法に関する。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、金属ナノ粒子が所定間隔で連結された金属ナノ粒子集合体からなるため、金属ナノ粒子の界面に形成される増強電場強度を一定にすることができ、従来技術で問題とされたＳＥＲＳ粒子の凝集や濃度部分布の偏りによる誤認検出を防止でき、また、表面状態によるＳＥＲＳ信号の変動を避けることができるため、表面増強ラマン散乱光の安定な検出につながる。
　また、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、該金属ナノ粒子集合体の金属ナノ粒子の表面にビオチンなどの分子認識プローブを連結させることにより、目的検体を認識することができる。
　そして、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料を用いることにより、通常のラマン散乱強度の１０の１１乗倍にも達する表面増強ラマン散乱の強度を安定に保つことが可能となるため、極めて濃度の薄い検体に対しても有効な検出が可能となる。
　さらに、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法によれば、表面増強ラマン散乱活性粒子である金、銀、銅、白金又はニッケルなどの金属ナノ粒子を、末端にチオール基又はアミノ基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖で修飾したものと、該ＤＮＡ鎖と相補鎖の関係にある末端にチオール基を有する別の一本鎖ＤＮＡで鎖修飾したものとを混ぜ合わせるだけで、容易に金属ナノ粒子間に結合が形成され、金属ナノ粒子集合体を製造できる。
　また、金属ナノ粒子間の距離は、ＤＮＡの塩基数を調整することにより自由にコントロールできるため、最も強い増強電場を発生させる距離に金属ナノ粒子同士を連結させた金属ナノ粒子集合体を製造できる。
　更に該金属ナノ粒子集合体中の金属ナノ粒子表面に、目的検体に対して強い相互作用を有する分子（分子認識プローブ分子）を連結させることにより、目的検体の認識が可能なＳＥＲＳ活性分子認識粒子が合成できる。
図１は、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造スキームを表す図である。 図２は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図３は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図４は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子状態の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図５は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’を固定した金ナノ粒子の原子間力顕微鏡像を示す図である。 図６は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の原子間力顕微鏡像を示す図である。 図７は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’を固定した金ナノ粒子の近接場顕微鏡による形状及び電場測定を示す図である。 図８は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の近接場顕微鏡による形状及び電場測定を示す図である。 図９は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。 図１０は、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の温度変化によるラマン散乱強度変化の説明図を示す図である。 図１１は、ビオチンをセンシングプローブとして表面に導入した５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’表面修飾金ナノ粒子と、５’－ＨＳ－Ｃ６－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’表面修飾金ナノ粒子によるストレプトアビジンの分子認識を示す図である。 図１２は、実施例１で得た特定間距離に連結した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図１３は、特定間距離に連結した金ナノ粒子を用いたストレプトアビジンの分子認識結果を示す図である。 図１４は、実施例２で得た特定間距離に連結した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図１５は、例８で得たチオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を示す図である。 図１６は、例８で得たチオール末端ＤＮＡ１１又はチオール末端ＤＮＡ１２をさらに吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１１：符号１７、ＤＮＡ１２：符号１８）を示す図である。 図１７は、例９で得たｓａｍｐｌｅ［１］溶液の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図１８は、例９で得たｓａｍｐｌｅ［２］溶液の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図１９は、例９で得た金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 図２０は、例１０で得たチオール末端ＤＮＡ１３、チオール末端１４又はチオール末端１５を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）を示す図である。 図２１は、例１０で得たｓａｍｐｌｅ［３］溶液（ＤＮＡ１３）、ｓａｍｐｌｅ［４］（ＤＮＡ１４）溶液又はｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ１５）の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）を示す図である。 図２２は、例１０で得られたｓａｍｐｌｅ［６］とｓａｍｐｌｅ［７］の外観（写真）を示す図である。 図２３は、ＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子粒子集合体の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。 図２４は、ａ５４９がん細胞の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。 図２５は、ＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子集合体を吸着させたａ５４９がん細胞の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。 図２６は、がん細胞由来ＤＮＡのリン酸由来のマッピングと、金粒子吸着部位のマッピングと、がん細胞の顕微鏡写真を示す図である。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、有機分子を介して金属ナノ粒子同士が連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合した構造を有する金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなるものである。
　本発明で用いる金属ナノ粒子としては特に限定されないが、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外線領域乃至赤外線領域に有する金属元素よりなり、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、アルミニウム等から選択される金属元素よりなる粒子を挙げることができる。中でも、金ナノ粒子を用いることが好ましい。
　上記金属ナノ粒子は、１ｎｍ乃至５００ｎｍの、好ましくは１ｎｍ乃至１００ｎｍの、より好ましくは５ｎｍ乃至１００ｎｍの、特に好ましくは５ｎｍ乃至２０ｎｍの平均粒子径を有することが望ましい。
　金属ナノ粒子同士の連結に用いる有機分子として、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素等の有機化合物からなる分子鎖を用いることができ、これら有機分子は金属ナノ粒子（表面）に結合するための基として、チオール基又はアミノ基を末端に有してなる。
　中でも核酸（特にＤＮＡ）は、塩基数を調整することで所望の分子鎖長を有する有機分子とすることができ、すなわち、金属ナノ粒子間の距離を所望の長さに調整することが容易であるために特に好ましい。この場合、核酸の塩基数の数値範囲は３塩基乃至４０塩基であることが好ましく、より好ましくは３乃至２０塩基であり、例えば１２塩基長のＤＮＡを用いることが好ましい。
　また前記有機分子には、金属ナノ粒子間の距離を所定間隔に調整するために用いられる化合物（ＤＮＡなど）に加え、前記ラマン活性分子（ラマンプローブとも称する）を結合してなることが好ましい。ラマン活性分子は、例えばローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、クリスタルバイオレット（ＣＲＶ）、クマリンなど色素有機分子に加え、芳香環が幾つか連結した縮合環化合物などが挙げられる。これらラマン活性分子は有機分子のいずれかの末端に導入される。
　前記有機分子によって連結される金属ナノ粒子の個数は、前述の通り、３乃至１０個であることが好ましい。これは、近接した２個の金属粒子間に誘起された増強電場は、２粒子の運動により方向が変化することから、常に最適な増強磁場を発する方向に向いているとは限らず、粒子が運動しても最適な増強電場を発生させるには、２粒子間に形成された有機分子による結合方向に対して、１８０°以下の角度を有する結合方向を持つ有機分子で更に粒子を結合させた３粒子以上の集合体の形態を為すことが望ましいためである。但し、これらの３粒子集合体に更に多くの有機分子と金属粒子からなる集合体を結合させても、検出場面でラベル化部分の濃度差が生じるために好ましくなく、金属粒子集合体は最大で１０粒子程度の金属粒子が有機分子で結合したものが好ましい。
　そして、金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子はその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線に結合されていないこと、すなわち、３個の金属ナノ粒子間の２つの有機分子は、１８０°以下、例えば１０乃至１６０°の角度を有して真ん中の金属ナノ粒子の結合されていることが好ましい。
　なお、前記金属ナノ粒子集合体における金属ナノ粒子（表面）は、目的検体を認識できる分子認識プローブ分子をさらに有していてもよい。これにより、検体を認識させた後にラマン散乱測定をすることにより、目的検体の検出が可能となる。
　分子認識プローブ分子は、例えば上述の有機分子として用いた核酸（ＤＮＡ）とは別の塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ）、ポリエチレングリコール、或いは炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブ（ビオチン等；検出部位ともいう）を導入し、他方の末端に金属ナノ粒子表面への結合能を有するチオール基、アミノ基などを導入した分子である。そして該チオール基等を介して、分子認識プローブ分子を金属ナノ粒子（表面）に結合させる。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法は以下のａ）乃至ｄ）工程を含みてなる。
ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法において、上記核酸はＤＮＡであることが望ましく、すなわち分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法は以下のａ）乃至ｄ）工程を含みてなる。
ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程。
　そしてさらに、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法において、前記ａ）乃至ｄ）工程に加え、前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）のいずれか一方、或いは、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む。
　上記工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、ＤＮＡ鎖（２）同士で互いに相補性を有することもできるが、好ましくはＤＮＡ鎖（２）同士が互いに相補性を有するものではないことが好ましい。これは金属ナノ粒子と反応させて一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を形成する際、ＤＮＡ鎖（２）が互いに相補性を有するものであると、粒子（１）同士の会合体が形成される虞があり、凝集の発生を防ぐためである。
　また、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）の分子鎖長（すなわち塩基鎖長）は異なっていてもよいが、等しい長さであることが好ましい。
　なお上記工程で用いる金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）に用いる金属は同一の金属種であっても異なる金属種であってもよいが、好ましくは同一の金属種を用いることが望ましい。
　上記ａ）工程において、基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）と会合させた２つのＤＮＡ鎖（２）の２つのチオール基間の距離は、ｂ）工程で得られる金属ナノ粒子（１）上に形成されるＤＮＡ鎖（２）の結合位置に対応する。
　ここで、金属ナノ粒子を挟んで互いに反対側の位置に２つのＤＮＡ鎖（２）が結合すると、３つの金属ナノ粒子、すなわち、金属ナノ粒子（１）と、その後のｄ）工程で該ＤＮＡ鎖（２）にＤＮＡ鎖（３）が会合して結合した２つの金属ナノ粒子（２）の３つの粒子が直線状に並ぶこととなる。すなわち、これら３つの金属ナノ粒子間に形成される２つの増強電場がなす角度が１８０°となり、前述した通り好ましくない。
　このため、ＤＮＡ鎖の鎖長や、金属ナノ粒子の大きさ（平均粒径）を調整し、３つの金属ナノ粒子の配列（角度）を好ましい角度に調整することが重要である。
　上記ｄ）工程、すなわち、金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）の混合による金属ナノ粒子集合体を製造する工程は、金属ナノ粒子（１）に対して過剰量の金属ナノ粒子（２）を添加することにより行われる。例えば金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）を１：２～１０程度の当量比で混合することにより、ＤＮＡ鎖（２）とＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させ、２個の金属ナノ粒子間に有機分子（ＤＮＡなど）による結合を形成する。
　例えば、２当量の一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を有する１つの金属ナノ粒子（１）と、１当量の一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を有する２つの金属ナノ粒子（２）を混合することによって得られる３つの金属ナノ粒子から構成される金属ナノ粒子集合体が好ましい。
　このようにして得られた、金属ナノ粒子同士が等間隔に連結された金属ナノ粒子集合体は表面増強ラマン散乱を発することのできる分子センシング金属ナノ粒子材料として機能する。
　以下に、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料に用いる金属ナノ粒子集合体の製造方法について、図１の具体例を用いて説明する。本方法は非特許文献９に示される方法に倣って実施可能である。
　図１中番号１、２、３に示す３種のＤＮＡ（以下、それぞれＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３と称する）を準備する。ＤＮＡ１とＤＮＡ２はそれぞれ相補鎖の関係にあるＤＮＡであり、ＤＮＡ３は中央部で２重鎖を組むがその両端はＤＮＡ１及びＤＮＡ２と相補鎖の関係にある塩基鎖である。またＤＮＡ１及びＤＮＡ２はその末端にチオール基を有する。
　これらＤＮＡ１、ＤＮＡ２、及びＤＮＡ３を混合し、図１中番号４に示すような変性ＤＮＡを合成する。合成された変性ＤＮＡ４は金ナノ粒子５　コロイド溶液と混合し、金ナノ粒子表面にチオール基を介して結合させ図１中番号６に示すＤＮＡが結合した金ナノ粒子となる。次に、溶液を加温（塩基数によって適宜温度を設定する）して２重鎖を解離させ、図１中番号７に示すＤＮＡ１とＤＮＡ２が結合した金ナノ粒子を合成する。
　これに対して、予め金ナノ粒子表面にチオール基を介して、ラマン活性分子を含むＤＮＡ１及びＤＮＡ２を結合させた金ナノ粒子８及び９を、図１中番号７に示す金ナノ粒子に加えることにより、ＤＮＡ同士で２重鎖を組ませ、図１中番号１０に示す金粒子接合が完成する。この場合、金粒子同士は完全に制御された位置に固定することが可能である。
　上述の本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、検体と接触させたのち、検体のラマン散乱測定を行うことにより、分子センシングとして有用な方法となる。
　このとき、前記分子センシング用金属ナノ粒子材料は、基板上に固定されていてもよい。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、前述したとおり、金属ナノ粒子を所定間隔で結合させた金属ナノ粒子集合体を用いることにより、金属ナノ粒子の界面に形成される増強電場をコントロールすることができ、すなわち、安定した増強電場を金属ナノ粒子表面に形成させることで一定のラマン鎖乱強度を安定化させることができる。したがって従来のようなラマン散乱の不安定さを改良する非常に有用な技術である。
　以下、本発明について、さらに具体的かつ詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以降の塩基配列における略号は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、チオール基（ＨＳ又はＳＨ）である。
［例１　金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定］
　先ず、相補鎖の関係にあるシングルストランドＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ準備した。
（ａ）５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ6－ＴＡＭＲＡ－３’
　塩基配列がＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣの１２塩基において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６のアルキル鎖を（Ｃ6）介して５’末端に結合させ、また、ラマン活性分子（ラマンプローブ）として色素であるローダミン（ＴＡＭＲＡ）を炭素原子数６のアルキル鎖（Ｃ6）を介して３’末端に結合させた。
（ｂ）５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’
　塩基配列がＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣの１２塩基において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６のアルキル鎖を（Ｃ6）介して５’末端に結合させた。
　これらシングルストランドＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ独立に金ナノ粒子溶液（金コロイド溶液）に添加することにより、金ナノ粒子表面に結合されるが、これらＤＮＡの末端チオール基は不安定であり、周囲のチオール基同士が結合して容易にＳ－Ｓ結合を形成してしまうため、ＤＮＡを金表面に固定化する前に、形成したＳ－Ｓ結合を還元剤によりチオールに戻しておく必要がある。この還元方法については特に限定するものではないが、一例として、今回は次の手順により用いてＳ－Ｓ結合を還元した。
　すなわち、１００ｐｍｏｌ／μＬの５’－チオール化ＤＮＡのＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液から５０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、２．５Ｍ　ＮａＣｌを２０μＬ、－２０℃に冷やしたエタノールを９５０μＬ添加し、－８０℃で２０分放置した。その後１２，０００回転、４℃で１０分間遠心し、上澄みを捨て、５０μＬのＴＥ溶液（トリス－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ～８）で再溶解させ、精製チオール化ＤＮＡとした。
　金ナノ粒子へのＤＮＡの固定（結合）化操作としては特に限定されるものではないが、今回は次の方法を用いて行った。
　すなわち、金ナノ粒子溶液１ｍＬに上述の方法にてＳ－Ｓ結合を還元した精製チオール化ＤＮＡ　５ｎｍｏｌを添加した。このときチオール化ＤＮＡの最終濃度は５μＬであった。
　添加後、容器をボルテックス・ミキサーを用いて５分間撹拌し、その後、５０℃恒温槽に４時間乃至２４時間放置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。このとき金ナノ粒子表面ではチオール基の結合だけでなく、ＤＮＡ塩基の吸着も起こるため、緻密な吸着状態にはなっていない。そこで、金ナノ粒子とチオール化ＤＮＡ溶液に、２．５Ｍ　ＮａＣｌを４０μＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液を２０μＬ添加して、ＮａＣｌ及びリン酸緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度０．１Ｍ及び１０ｍＭになるようにし、更に５０℃で４０時間放置した。
［例２　金ナノ粒子集合体の作製］
　上記手法により相補鎖同士のＤＮＡをそれぞれ固定した２種の金ナノ粒子溶液を、０．５ｍＬずつマクロチューブに測り取り、１４，０００ｒｐｍで２５分間遠心にかけ、その後、上澄み液を取り除き、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）で再分散させた。このとき、擬似的に凝集することがあるが、その場合は５０℃でしばらく暖め、再分散させた。この操作をもう一度繰り返し、上澄みを取り除いた後、０．０１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。
　このようにして得られた、表面にＤＮＡが結合した、２種の金ナノ粒子分散溶液を混ぜ合わせ、ＤＮＡの相補鎖を会合させることにより、金ナノ粒子間の結合を形成させ、金属ナノ粒子集合体を製造した。
　すなわち、先ずＰＣＲチューブに１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ（相補関係にある修飾粒子をそれぞれ５μＬ）、５Ｍ　ＮａＣｌ　４μＬを加え室温で１０分間放置し、なお金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後、卓上遠心器で軽く遠心し、得られた集合体を沈殿させた。
　なお、金ナノ粒子集合体は、先ずＰＣＲチューブに１％　ｔｗｅｅｎ－２　１μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ、前記修飾に用いたＤＮＡと相補鎖の関係にある１μＭ　ＤＮＡ　１０μＬ、５Ｍ　ＮａＣｌ　４μＬを加え、室温で１０分間放置し（金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後）、卓上遠心器で軽く遠心し、得られた集合体を沈殿させることによっても得られた。
［例３　金ナノ粒子集合体の解析（１）：集合体形成の解析］
　得られた金属ナノ粒子集合体について、透過型電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡により解析した。
　まず、前記シングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ6－ＴＡＭＲＡ－３’］が結合した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を図２に、シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’］が結合した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を図３に、そしてこれら金ナノ粒子を混合し、得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図４に、それぞれ示す。
　また、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’］が結合した金ナノ粒子の原子間力顕微鏡像を図５に、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子とシングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ6－ＴＡＭＲＡ－３’］が結合した金ナノ粒子を混合
し、得られた金ナノ粒子集合体の原子間力顕微鏡像を図６に、それぞれ示す。
　図４及び図６に示すように、単分散状態の２種の金ナノ粒子を混ぜ合わせることにより、集合体が形成できたことが、透過型電子顕微鏡像並びに原子間力顕微鏡像によって確認できた。
［例４　金ナノ粒子集合体の解析（２）：増強電場の測定］
　次に、隣接する金ナノ粒子の界面において形成される増強電場の計測と形状測定を近接場マイクロ顕微鏡を用いて同時に行った。
　前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ－３’］が結合した金ナノ粒子の近接場顕微鏡による像（位置情報、図７中　符号１１）とその表面近傍に形成される電場（図７中　符号１２）を図７に、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子とシングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’－ＨＳ－Ｃ6－ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ－Ｃ6－ＴＡＭＲＡ－３’］が結合した金ナノ粒子を混合し、得られた金ナノ粒子集合体の近接場顕微鏡による像（位置情報、図８中　符号１３）とその表面近傍に形成される電場（図８中　符号１４）を図８に、それぞれ示す。
　図７及び図８に示すように、金ナノ粒子集合体が形成されている粒子からは非常に強い増強電場が得られていることが確認され、この増強電場中に含まれるラマン活性分子からは非常に強いラマン散乱が得られることが期待できる結果となった。
［例５　金ナノ粒子集合体の解析（３）：ラマンスペクトル測定］
　続いて、得られた金ナノ粒子集合体（溶液）を石英製のキャピラリー管に封入し、このキャピラリー管内の溶液のラマンスペクトルを測定した。なお、本試験で用いた１２塩基ＤＮＡは９０℃以上の温度でＤＮＡの会合が解離し、シングルストランドＤＮＡに戻ることから、９０℃の温度下でのラマンスペクトルの測定も併せて行った。生体温度に相当する温度（およそ３４～３８℃）で測定したラマンスペクトル結果（金ナノ粒子集合体）を図９の符号１５に、９０℃の温度下でのラマンスペクトル結果（シングルストランドＤＮＡが結合した金ナノ粒子）を図９の符号１６に示す。
　図９より明らかなように、集合体が形成された金ナノ粒子からは、強いラマン散乱が観察された。これは図１０に示すような金ナノ粒子同士の集合（結合）・解離状態が温度変化によって可逆的に変化するために起こったものといえる。
［例６　分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体の作製及び分子認識］
　このようにして得られた金ナノ粒子集合体の金属ナノ粒子表面を、更に特定分子認識可能な分子認識プローブで修飾した。その方法は特に限定するものではないが、先に示したＤＮＡを金ナノ粒子表面に固定するときに予め混合しておくことが一般的である。
　すなわち、先ずＰＣＲチューブに１％ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ、前記ＤＮＡ修飾金ナノ粒子の修飾に用いたＤＮＡと相補鎖の関係にある１μＭ　ＤＮＡ　１０μＬ中に１０質量％の割合で片末端にアルキルアミンをもう片末端にビオチンを有するヘテロ２官能ＰＥＧ（分子量５，０００）混合した溶液、５Ｍ　ＮａＣｌ　４μＬを加え室温で１０分間放置し（金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後）、卓上遠心器で軽く遠心し集合体を沈殿させた。
　このようにして得られた分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体をストレプトアビジン・プレートに添加し、室温で数分間放置した後に、滅菌水で数回洗浄し、未固定の分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体を、浄水から金のプラズモン吸収が消えるまで充分に洗浄した。このようにして処理したストレプトアビジン・プレートをレーザーラマン顕微鏡で観察したところ、図１１に示すようなラマン散乱スペクトルが得られ、分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体による分子認識が出来たことが示された。
［実験例１　金ナノ粒子集合体の製造及び分子認識］
＜ＤＮＡの調製＞
　２種の一本鎖ＤＮＡを準備した。
　先ず、塩基配列がＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡ　ＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧの３３塩基の５’末端に対して金表面に固定する部位としてチオール基を炭素数６のアルキル鎖を介して結合させたＤＮＡを合成した。
　一方これとは別に塩基配列がＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧ　ＴＧＣの３３塩基の５’末端に対して金表面に固定する部位としてチオール基を炭素数６のアルキル鎖を介して結合させたＤＮＡを合成した。
　次に、上記一本鎖ＤＮＡの２つを金属ナノ粒子に固定するためのテンプレートとなる一本鎖ＤＮＡとして、上記一本鎖ＤＮＡに対して相補的な関係にある部位を有する塩基群と上記２つの一本鎖ＤＮＡの間隔をコントロールする塩基群からなる一本鎖ＤＮＡを準備した。
　すなわち、先に示されたＤＮＡと結合させる相補的ＤＮＡとして、５’末端からＣＴＧＡＧＧＴＡＧ　ＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣの６５塩基のＤＮＡを合成した。
　また後に示されたＤＮＡと結合させる相補的ＤＮＡとして、５’末端からＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣ　ＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣの６５塩基のＤＮＡを合成した。
　以上、合成したチオール末端３３塩基ＤＮＡと６５塩基ＤＮＡの構造は以下の通りである。
１：５’－ＨＳ－Ｃ6－ＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’
２：５’－ＨＳ－Ｃ6－ＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＧＣ－３’
３：５’－ＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡ　ＴＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣ－３’
４：５’－ＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧ　ＣＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣ－３’
＜二重鎖ＤＮＡの製造＞
　これら４種のＤＮＡをそれぞれ相補鎖の関係で二重鎖構造として結合させた。その手法は特に限定するのもではないが、今回は次の方法を用いて行った。
　すなわち、前記１から４のＤＮＡをそれぞれ別々に濃度１０μＭになるように純水に溶解し、溶解後、ＤＮＡ１：ＤＮＡ３=９：１０、及びＤＮＡ２：ＤＮＡ４=９：１０の体積割合でそれぞれマイクロチューブに入れ混合した。これに３００ｍＭのＮａＣｌを含有する３０ｍＭ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸（ｐＨ８）バッファーを添加して、最終濃度１００ｍＭ　ＮａＣｌになるように調整を行った。試料チューブを９０℃１０分間加熱放置した後、３０℃まで冷却速度－１℃／ｍｉｎで冷却し、会合したこれらＤＮＡを電気泳動法により分離精製した。
＜金粒子へのＤＮＡの吸着（１）：ＤＮＡを１つ吸着させた金ナノ粒子＞
　金ナノ粒子分散液（ブリティッシュ　バイオセル　インターナショナル製：粒子径：１５ｎｍ）１２０μＬに、予め調整した無水ビス（ｐ－スルホナトフェニル）フェニルフォスフィン２カリウム塩溶液（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液、ＢＳＰＰと称する）１２μＬをマイクロチューブ内で混合し、ＢＳＰＰにより表面をコートされた金ナノ粒子を形成した。この混合溶液を４℃、１時間２１，６００Ｇで遠心分離し、上澄みを捨て、最終的に１０μＬとした。
　この濃縮した金ナノ粒子分散液を２μＬのトリス－ボレート－ＥＤＴＡ（ＴＢＥと称する）バッファー（０．５×ＴＢＥ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ含有）と混合した。
　この溶液４μＬに対して２μＬのチオール末端ＤＮＡ（２μＭ）（先に示したＤＮＡ１若しくはＤＮＡ２）を加え混合した。混合後、０．５×ＴＢＥ（１００ｍＭＮａＣｌ含有）で最終体積を８μＬに調整し、この混合溶液を室温で（２２℃）で２４時間放置した。放置後、ＢＳＰＰ（０．２５ｍg／ｍＬ溶液）２５０μＬを混合し、４℃、１時間、２１，６００Ｇで遠心沈降させ、上澄み液を捨て、未反応ＤＮＡを除去した。
＜金粒子へのＤＮＡの吸着（２）：ＤＮＡを２つ吸着させた金ナノ粒子＞
　上記（１）と同様の方法を用いてＢＳＰＰコート１５ｎｍ金ナノ粒子を調製した。前出の＜二重鎖ＤＮＡの製造＞で合成した二重鎖構造の精製ＤＮＡを、モル比（金ナノ粒子溶液）：（ＤＮＡ溶液）＝５：１にて、０．５×ＴＢＥバッファー（ＢＳＰＰ：１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ　１６６ｍＭ）中で混合した。混合後室温で２４時間放置し、金粒子表面にＤＮＡを固定した。その後、ＢＳＰＰ溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ溶液）の希釈溶液中で４０℃に保つことにより、２重鎖を解裂させ、遠心精製（４℃、１時間、２１，６００Ｇ）により精製した。
＜金ナノ粒子集合体の調製＞
　金ナノ粒子へのＤＮＡの吸着（１）及び（２）で調製したＤＮＡ吸着金ナノ粒子分散液（ａ：ＤＮＡ１吸着金ナノ粒子、ｂ：ＤＮＡ２吸着金ナノ粒子、ｃ：ＤＮＡ１及びＤＮＡ２吸着金ナノ粒子）をａ：ｂ：ｃ＝１：１：１０の体積比で混合し、室温２４時間放置した。放置後遠心精製（－４℃、１０分、１０，０００Ｇ）し、未固定金ナノ粒子を除去した。得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図１２に示す。
　これによると、金ナノ粒子が３個結合していることが確認された。すなわち、ｃ粒子を過剰に加え、ａ粒子－ｃ粒子－ｂ粒子が非直線状に３個結合した集合体が得られた。このとき得られた金ナノ粒子の粒子界面に形成された電場は先の例４の試験で得られた結果と同等の強度でを有していた。
＜分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体の製造及び分子認識＞
　上述の得られた金ナノ粒子集合体溶液に対して１０質量％の割合にて、片末端にアルキルアミンをもう片末端にビオチンを有するヘテロ２官能ＰＥＧ（分子量５，０００、１００ｍＭ）を分子認識プローブ分子として混合し、室温で２時間放置した。その後、遠心精製により未吸着のセンシングプローブを除去した。
　こうして得られた分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体をストレプトアビジン・プレートに添加し、室温で数分間放置した後に、滅菌水で数回洗浄し、未固定の分子認識プローブ含有金ナノ粒子を洗浄し、洗浄水から金のプラズモン吸収が消えるまで充分に洗浄を行った。このようにして処理したストレプトアビジン・プレートをレーザーラマン顕微鏡で観察したところ、図１３に示すようなラマン散乱スペクトルが得られ、分子認識プローブ含有金ナノ粒子による分子認識が出来たことが確認された。
［実施例２］
　以下に示す３種のＤＮＡ（ＤＮＡ５，６，７，８，９，１０）を準備した。
ＤＮＡ５；５’－ＨＳ－ＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴ－３’
ＤＮＡ６；５’－ＨＳ－ＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３’
ＤＮＡ７；５’－ＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣ－３’
ＤＮＡ８；５’－ＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣ－３’
ＤＮＡ９；５’－ＨＳ－ＴＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ－３’
ＤＮＡ１０；５’－ＨＳ－ＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡ－Ｃ６－ＴＡＭＲＡ-３’
　これを上記［実施例１］に示したものと同様の方法を用いてＤＮＡ７とＤＮＡ８を会合させて中央部分が二重鎖となったＤＮＡ鎖（図１中、中央部分が二重鎖となったＤＮＡ３に相当する）とし、さらにこのＤＮＡ鎖の両末端の一本鎖部分にＤＮＡ５及びＤＮＡ６を作用させ二重鎖を組ませた（図１中、変性ＤＮＡ４に相当する）。二重鎖を組ませる条件は全て実施例１に従って行った。
　この二重鎖ＤＮＡ鎖の５ｎｍｏｌを金ナノ粒子溶液１ｍＬに添加した。添加後、容器をボルテックス・ミキサーを用いて５分間撹拌し、その後、５０℃恒温槽に４時間乃至２４時間放置し、金ナノ粒子表面へのチオール基を介した二重鎖ＤＮＡ鎖の固定化を促進させ、ＤＮＡが結合した金ナノ粒子（図１中、金ナノ粒子６に相当する）を形成した。次にこの金ナノ粒子含有溶液を９０℃で５時間に加熱し、２重鎖を解離させた（図１中、金ナノ粒子７に相当する）。
　一方予め前記記載の方法でそれぞれ独立に準備しておいたＤＮＡ９及び１０が吸着した金ナノ粒子（図１中、金ナノ粒子８及び金ナノ粒子９に相当する）を上記金ナノ粒子含有溶液に添加し、金ナノ粒子集合体（図１中、金ナノ粒子集合体１０に相当する）を得た。
　得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図１４に示す。図１４に示すように、非直線状に粒子が３個結合した集合体が得られた。
［例７　核酸（ＤＮＡ）の調製］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ＜ＤＮＡの調製及び精製＞
　まず、相補鎖の関係にあるシングルストランドＤＮＡ１１及びＤＮＡ１２を準備した（表１参照）。
　続いて、これらＤＮＡ１１及びＤＮＡ１２において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６の直鎖アルキル基（Ｃ6）を介して５’末端に結合させた。
　続いて、合成したチオール末端のＤＮＡ１１（又はＤＮＡ１２）に、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）をＤＮＡに対して２００倍量となるように加え、さらにＴＥ溶液（トリス－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ～８）で溶解させた。ピペッティング、ボルテックスで溶液を攪拌後、常温で２時間反応させた。この操作により、ＳＨ化ＤＮＡの一部がＳ－Ｓ結合した部分を切断した。
　その後、ＤＴＴ処理した上記ＤＮＡ溶液に、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液をＤＴＴ処理したＤＮＡ溶液に対して１／１０倍量となるように加えた。さらにあらかじめ４℃に冷やしておいた冷エタノールを、ＤＮＡ溶液に対して２．５倍量となるように加えた。その後、－２０℃フリーザーに６時間以上静置し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ；７，７４０Ｇ、３０分間）により回収した。これらエタノール沈殿－遠心分離による精製即ち、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加えるところから沈殿精製させるところまでのサイクルをさらに２回行った。
［例８　金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定］
　金ナノ粒子分散液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ビービーインターナショナル)製造：粒子径：１０ｎｍ）１ｍＬに、例７でＳ－Ｓ結合を還元（切断）、精製したチオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１１若しくはＤＮＡ１２）を５ｎＭ添加し、ピペッティング、ボルテックスで１分間攪拌後、５０℃で１２時間静置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。
　１２時間静置後、ＵＶ測定により金ナノ粒子の分散、凝集状態を確認した。図１５にチオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を示す。
　各金ナノ粒子分散液に２．５Ｍ　ＮａＣｌを４０μＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を２０μＬ添加し、更に５０℃で４０時間静置した。この操作により、金表面のマイナス（－）電荷をＮａＣｌが奪い、溶液中に金ナノ粒子表面に未吸着の状態で残存しているチオール末端ＤＮＡをさらに金ナノ粒子表面に吸着させた。
　４０時間静置後、ＵＶ測定により金ナノ粒子の分散、凝集状態を確認した。図１６にチオール末端ＤＮＡ１１（図１６中、符号１７）及びチオール末端ＤＮＡ１２（図１６中、符号１８）を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトルを示す。
［例９　金ナノ粒子集合体の作製］
　上記手法により相補鎖同士のＤＮＡ（ＤＮＡ１１、ＤＮＡ１２）をそれぞれ固定した２種の金ナノ粒子溶液を、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、金ナノ粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、上澄み液を取り除いた後、０．０１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。
　ＤＮＡ１１を用いて調製した金ナノ粒子分散液をｓａｍｐｌｅ［１］溶液、ＤＮＡ１２を用いて調製した金ナノ粒子分散液をｓａｍｐｌｅ［２］溶液と称する。それぞれのｓａｍｐｌｅ溶液を透過型電子顕微鏡で観察した結果をそれぞれ図１７及び図１８に示す。
　このようにして得られた、表面にＤＮＡが結合した、２種の金ナノ粒子分散溶液をまぜ合わせ、ＤＮＡの相補鎖を会合させることにより、金ナノ粒子間の結合を形成させ、金ナノ粒子集合体を製造した。
　すなわち、先ず１．５ｍＬマイクロチューブに、１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、ｓａｍｐｌｅ［１］溶液　１０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［２］溶液　１０μＬ、５Ｍ　ＮａＣl  ４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
　１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分間静置後、軽く遠心分離を行い、得られた集合体を沈殿させた。
　得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を図１９に示す。
［例１０　塩基数の異なるＤＮＡによる金粒子表面の修飾］
＜ＤＮＡの調製＞
　下記表２に示す３種のＤＮＡ（ＤＮＡ１３～ＤＮＡ１５）のそれぞれについて、次の処理を行った。
　チオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１３～ＤＮＡ１５）にＤＴＴ（ジチオトレイトール）をＤＮＡに対して２００倍量となるように加え、さらにＴＥ溶液（トリス－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ～８）で溶解させた。ピペッティング、ボルテックスで溶液を攪拌後、常温で２時間反応させた。
　その後、ＤＴＴ処理した上記ＤＮＡ溶液に、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液をＤＴＴ処理したＤＮＡ溶液に対して１／１０倍量となるように加えた。さらにあらかじめ４℃に冷やしておいた冷エタノールを、このＤＮＡ溶液のＤＮＡ溶液に対して２．５倍量となるように加えた。その後、－２０℃フリーザーに６時間以上静置し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ；７，７４０Ｇ、３０分間）により回収した。これらエタノール沈殿－遠心分離による精製即ち、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加えるところから沈殿精製させるところまでのサイクルをさらに２回行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定＞
　金ナノ粒子分散液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ビービーインターナショナル）製造：粒子径：１０ｎｍ）１ｍＬに前記工程で精製したチオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１３乃至ＤＮＡ１５）を５ｎＭ添加し、ピペッティング、ボルテックスで１分間攪拌後、５０℃で２４時間静置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。
　１２時間静置後、各金ナノ分散液に２．５Ｍ　ＮａＣｌを４０μＬ、２００ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７）を５０μＬ添加し、さらに５０℃で４５時間静置した。静置後の各チオール末端ＤＮＡを吸着させた金ナノ粒子分散液（図中、ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を図２０に示す。
　上記３種のＤＮＡ（ＤＮＡ１３～ＤＮＡ１５）をそれぞれ固定した３種の金ナノ粒子溶液を、その後、１４，０００ｒｐｍ（１８，７００Ｇ）で３０分間遠心にかけ、金ナノ粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、上澄み液を取り除いた後、０．０１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。
　ＤＮＡ１３を用いて調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［３］溶液、ＤＮＡ１４を用いて調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［４］溶液、ＤＮＡ１５で調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［５］溶液と称する。それぞれのｓａｍｐｌｅ溶液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を図２１（図中、ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）に示す。
＜金ナノ粒子集合体の作製（１）：ｓａｍｐｌｅ［３］溶液とｓａｍｐｌｅ［５］溶液＞
　１．５ｍＬマイクロチューブに、１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、ｓａｍｐｌｅ［３］溶液（ＤＮＡ鎖長：４２ｍｅｒ）　１０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ鎖長：１５ｍｅｒ）　１０μＬ、５Ｍ　ＮａＣｌ　４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
　１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分静置後、軽く遠心分離を行い、ＤＮＡ塩基の相補鎖を会合させることにより金ナノ粒子間の結合を形成させて得られた金ナノ粒子集合体を得た。得られた集合体をｓａｍｐｌｅ［６］と称する。
＜金ナノ粒子集合体の作製（２）：ｓａｍｐｌｅ［４］溶液とｓａｍｐｌｅ［５］溶液＞
　１．５ｍＬマイクロチューブに、１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、ｓａｍｐｌｅ［４］溶液（ＤＮＡ鎖長：２７ｍｅｒ）　１０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ鎖長：１５ｍｅｒ）　１０μＬ、５Ｍ　ＮａＣｌ　４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
　１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分静置後、軽く遠心分離を行い、ＤＮＡ塩基の相補鎖を会合させることにより金ナノ粒子間の結合を形成させて得られた金ナノ粒子集合体を得た。得られた集合体をｓａｍｐｌｅ［７］と称する。
　得られたｓａｍｐｌｅ［６］とｓａｍｐｌｅ［７］の外観（写真）を図２２に示す。
［実施例３　核酸による分子認識］
　肺がんに対する核酸製剤の１つであるアプタマーＡＳ１４１１の末端をチオール基で修飾した分子（つくばオリゴサービス株式会社より入手）を、例９で製造した金ナノ粒子集合体表面に吸着させ、これを肺がん細胞（ａ５４９）に作用させ、作用前後のラマン散乱スペクトルを比較した。
　詳細には、例９に従って製造した金ナノ粒子集合体分散液（１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散）に５ｎＭのアプタマーＡＳ１４１１溶液を添加し、４０℃で２４時間攪拌した。その後１４，０００ｒｐｍ（１８，７００Ｇ）で３０分間遠心にかけ、粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ上澄み液を取り除いた後、０．０１％　ｔｗｅｅｎ－２０　１μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ　ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。
　こうして得られたＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子集合体を予め培養シャーレで培養した肺がん細胞に２０ｕＬ添加し、４８時間放置しがん細胞へ吸着させた。その後ラマン分光装置によりがん細胞表面を測定し、吸着させる前のがん細胞表面と吸着後のがん細胞表面のラマン散乱スペクトルを比較した。ＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子粒子集合体のラマン散乱スペクトルを図２３に、ａ５４９がん細胞のラマン散乱スペクトルを図２４に、そしてＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子集合体を吸着させたａ５４９がん細胞のラマン散乱スペクトルを図２５に、それぞれ示す。
　図２４～図２５に示すように、ＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子集合体をがん細胞に作用させることでラマン散乱スペクトルが大きく変化しており、例９で製造した金ナノ粒子集合体を用いた分子認識が可能であることが確認された。
［実施例４　核酸による分子認識］
　肺がんに対する核酸製剤の１つであるアプタマーＡＳ１４１１の末端をチオール基で修飾した分子（つくばオリゴサービス株式会社より入手）を、実施例３に示す方法で製造した金ナノ粒子集合体表面に吸着させ、これを肺がん細胞（ａ５４９）に作用させ、吸着サイトのマッピングを試みた。
　得られたＡＳ１４１１吸着－金ナノ粒子集合体を予め培養シャーレで培養した肺がん細胞に２０ｕＬ添加し、４８時間放置しがん細胞へ吸着させた。その後ラマン分光装置によりがん細胞表面を測定し、吸着に係わるラマンスペクトルに関して測定を行いがん細胞由来ＤＮＡのリン酸由来のマッピングと金粒子吸着部位のマッピング更に顕微鏡写真を重ね合わせ比較を行った結果、がん細胞が認識されていることが確認された。
　本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、高感度分子認識センサーとして有用であり、微量分子認識、即ち、生体関連物質のセンシングには好適な材料として使用できる。
１．チオール末端一本鎖ＤＮＡ１
２．ＤＮＡ１と相補鎖の関係にある一本鎖ＤＮＡ２
３．中央部が二本鎖ＤＮＡであり、その両端に１および２で示した一本鎖ＤＮＡを配したＤＮＡ３
４．ＤＮＡ３の両末端にＤＮＡ１及びＤＮＡ２が会合したＤＮＡ４
５．金ナノ粒子
６．表面にＤＮＡ４をチオール基を介して結合させた金ナノ粒子
７．加温により２重鎖を解離させて分離した後の金ナノ粒子
８．一本鎖ＤＮＡ１が吸着した金ナノ粒子
９．相補鎖ＤＮＡ２が吸着した金ナノ粒子
１０．金ナノ粒子集合体
１１．シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子の位置情報
１２．シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子から発せられる電場情報
１３．金ナノ粒子集合体における金ナノ粒子の位置情報
１４．金ナノ粒子集合体における金ナノ粒子から発せられる電場情報
１５．金ナノ粒子集合体における近接状態にある金ナノ粒子による増強ラマン散乱
１６．加温による金ナノ集合体が解消された金ナノ粒子による増強ラマン散乱
１７．チオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
１８．チオール末端ＤＮＡ１２を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
１９．チオール末端ＤＮＡ１３を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
２０．チオール末端ＤＮＡ１４を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
２１．チオール末端ＤＮＡ１５を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル

Claims (17)

  1. 金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  2. 前記金属ナノ粒子が、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外光領域乃至赤外光領域に有する金属元素よりなる、請求項１に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  3. 前記金属ナノ粒子が、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均粒子径を有する粒子である、請求項１又は請求項２記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  4. 前記金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子がその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線上に結合されていない、請求項１乃至請求項３のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  5. 前記有機分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む、請求項１乃至請求項４のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  6. 前記有機分子が、３乃至４０の塩基数を有し、且つ、チオール基又はアミノ基を末端に有する核酸である、請求項５に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  7. 前記核酸がＤＮＡである、請求項６に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  8. 前記ラマン活性分子は前記有機分子に結合してなる、請求項１乃至請求項７のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  9. 前記金属ナノ粒子が、少なくとも１個以上の分子認識プローブ分子をその金属ナノ粒子表面に結合してなる、請求項１乃至請求項８のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  10. 前記分子認識プローブ分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を介して分子認識プローブが結合された分子である、請求項１乃至請求項９のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
  11. ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
    ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
    ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
    ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
    さらに、
    前記ａ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
    請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
  12. ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
    ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０～１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
    ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
    ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
    さらに、
    前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
    請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
  13. 前記ｄ）工程において、該一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）の１当量に対して、該一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を２当量用いて金属ナノ粒子集合体を製造する、請求項１２に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
  14. 前記一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、互いに相補性を有する部位を持たないものである、請求項１２又は請求項１３に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
  15. さらに、ａ）乃至ｄ）のうちいずれかの工程において、
    ｅ）核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブを有し、他方の末端にチオール基又はアミノ基を有する分子認識プローブ分子と、金属ナノ粒子とを反応させて、金属ナノ粒子表面に、チオール基又はアミノ基を介して末端に分子認識プローブ分子を結合させる工程
    を含む、
    請求項１２乃至請求項１４のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
  16. 請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料を、検体と接触させた後、検体のラマン散乱測定を行うことを特徴とする、分子センシング方法。
  17. 前記分子センシング用金属ナノ粒子材料が基板上に固定されてなる、請求項１６に記載の分子センシング方法。
PCT/JP2011/063589 2010-06-15 2011-06-14 表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング WO2011158829A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11795734.0A EP2584345A4 (en) 2010-06-15 2011-06-14 METAL PARTICLES FOR RAM SPREADING WITH EXTENDED SURFACE AND MOLECULAR COLLECTION
KR1020137000390A KR101886064B1 (ko) 2010-06-15 2011-06-14 표면 증강 라만 산란용 금속 입자 및 분자 센싱
US13/704,427 US8896829B2 (en) 2010-06-15 2011-06-14 Metal particles for surface-enhanced raman scattering and molecular sensing
JP2012520456A JP5835584B2 (ja) 2010-06-15 2011-06-14 表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010136137 2010-06-15
JP2010-136137 2010-06-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011158829A1 true WO2011158829A1 (ja) 2011-12-22

Family

ID=45348228

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/063589 WO2011158829A1 (ja) 2010-06-15 2011-06-14 表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8896829B2 (ja)
EP (1) EP2584345A4 (ja)
JP (1) JP5835584B2 (ja)
KR (1) KR101886064B1 (ja)
TW (1) TWI519774B (ja)
WO (1) WO2011158829A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014238384A (ja) * 2013-05-08 2014-12-18 有限会社マイテック ラマン定量用バイオチップ
WO2015133408A1 (ja) * 2014-03-01 2015-09-11 福岡隆夫 ナノビーコンおよびそれを用いた偽造防止技術
JP2016021883A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 日産化学工業株式会社 ヒト大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５に特異的に結合する核酸
CN105372222A (zh) * 2014-08-22 2016-03-02 中国科学院生态环境研究中心 一种二价重金属检测方法
WO2017221981A1 (ja) * 2016-06-21 2017-12-28 日産化学工業株式会社 ラマン散乱による簡易センシング法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI481858B (zh) 2013-06-05 2015-04-21 Ind Tech Res Inst 拉曼散射增強基板
CN104568895B (zh) * 2013-10-23 2018-05-29 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 表面增强拉曼散射探针及其制造方法
WO2016182348A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Samsung Electronics Co., Ltd. Needle for biosensor and bio sensor including the same
KR101777852B1 (ko) 2015-09-24 2017-09-13 한국표준과학연구원 투명기판의 제조방법 및 이를 이용한 표면증강 라만산란 기판의 제조방법
WO2017200295A1 (ko) 2016-05-17 2017-11-23 충남대학교산학협력단 표면증강 라만산란 기판, 이를 포함하는 분자 검출용 소자 및 이의 제조방법
KR101888080B1 (ko) 2017-08-18 2018-08-13 한국표준과학연구원 투명기판의 제조방법 및 이를 이용한 표면증강 라만산란 기판의 제조방법
CN109470678A (zh) * 2017-09-08 2019-03-15 清华大学 分子检测的方法
CN111678911B (zh) * 2020-07-10 2023-12-29 中国科学院烟台海岸带研究所 一种基于毛细管印迹sers传感器及其制备方法和应用
CN114509421B (zh) * 2021-12-31 2024-04-09 电子科技大学 一种密接有序的表面增强拉曼基底及其制备方法
CN115194175B (zh) * 2022-07-01 2023-10-20 西安交通大学 一种高纯超细银纳米线及其大规模制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005519622A (ja) * 2002-03-14 2005-07-07 インテル・コーポレーション ラマン散乱によりヌクレオチド・シグナルを増強する方法
JP2005233637A (ja) 2004-02-17 2005-09-02 Japan Science & Technology Agency 金ナノロッド薄膜によるラマン分光分析
JP2007514169A (ja) 2003-12-29 2007-05-31 インテル・コーポレーション 合成有機無機ナノクラスター
JP2007537450A (ja) * 2004-05-12 2007-12-20 ナノスフェアー　インコーポレイテッド バイオバーコードに基づく標的検体の検出
JP2008184671A (ja) 2007-01-31 2008-08-14 Tohoku Univ ナノ多孔質金属及びその製造方法
JP2008224274A (ja) * 2007-03-09 2008-09-25 Japan Science & Technology Agency 銀微粒子と核酸の複合体及びその製造方法
JP2009061580A (ja) 2007-08-09 2009-03-26 National Institute For Materials Science ナノフレーク状金属複合材料、その製造方法および表面増強ラマン散乱活性基板

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060040286A1 (en) 2001-03-28 2006-02-23 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
CN102811943B (zh) * 2009-12-11 2015-08-19 韩国化学研究院 以位于粒子间的结合部的拉曼活性分子标记的二聚体核壳纳米结构、其用途及制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005519622A (ja) * 2002-03-14 2005-07-07 インテル・コーポレーション ラマン散乱によりヌクレオチド・シグナルを増強する方法
JP2007514169A (ja) 2003-12-29 2007-05-31 インテル・コーポレーション 合成有機無機ナノクラスター
JP2005233637A (ja) 2004-02-17 2005-09-02 Japan Science & Technology Agency 金ナノロッド薄膜によるラマン分光分析
JP2007537450A (ja) * 2004-05-12 2007-12-20 ナノスフェアー　インコーポレイテッド バイオバーコードに基づく標的検体の検出
JP2008184671A (ja) 2007-01-31 2008-08-14 Tohoku Univ ナノ多孔質金属及びその製造方法
JP2008224274A (ja) * 2007-03-09 2008-09-25 Japan Science & Technology Agency 銀微粒子と核酸の複合体及びその製造方法
JP2009061580A (ja) 2007-08-09 2009-03-26 National Institute For Materials Science ナノフレーク状金属複合材料、その製造方法および表面増強ラマン散乱活性基板

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS NANO, vol. 2, no. 4, 2008, pages 612 - 616
ANAL CHEM, vol. 77, 2005, pages 6134 - 6139
ANAL CHEM, vol. 79, 2007, pages 6927 - 6932
FELDHEIM D.: "Assembly of Metal Nanoparticle Arrays Using Molecular Bridges", INTERFACE, 2001, pages 22 - 25, XP001083543 *
HUDSON S.D. ET AL.: "Bioanalytical applications of SERS (surface-enhanced Raman spectroscopy)", ANAL BIOANAL CHEM, vol. 394, 2009, pages 679 - 686, XP019702765 *
J. AM. CHEM. SOC., vol. 131, 2009, pages 7518 - 7519
J. AM. CHEM. SOC., vol. 99, 1977, pages 5215
J. CHEM. PHYS., vol. 52, 1970, pages 399
J. ELECTROANAL CHEM., vol. 84, 1977, pages 1
LANGMUIR, vol. 23, 2007, pages 10539 - 10545
LIM D.-K. ET AL.: "Nanogap-engineerable Raman-active nanodumbbells for single-molecule detection", NATURE MATERIALS, vol. 9, January 2010 (2010-01-01), pages 60 - 67, XP055073693 *
NANO LETT. VOL., vol. 7, no. 9, 2007, pages 2819 - 2823
See also references of EP2584345A4

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014238384A (ja) * 2013-05-08 2014-12-18 有限会社マイテック ラマン定量用バイオチップ
JP2014238382A (ja) * 2013-05-08 2014-12-18 有限会社マイテック 癌関連物質の定量方法
WO2015133408A1 (ja) * 2014-03-01 2015-09-11 福岡隆夫 ナノビーコンおよびそれを用いた偽造防止技術
JP2016021883A (ja) * 2014-07-17 2016-02-08 日産化学工業株式会社 ヒト大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０５に特異的に結合する核酸
CN105372222A (zh) * 2014-08-22 2016-03-02 中国科学院生态环境研究中心 一种二价重金属检测方法
WO2017221981A1 (ja) * 2016-06-21 2017-12-28 日産化学工業株式会社 ラマン散乱による簡易センシング法
JPWO2017221981A1 (ja) * 2016-06-21 2019-04-11 日産化学株式会社 ラマン散乱による簡易センシング法

Also Published As

Publication number Publication date
US20130141719A1 (en) 2013-06-06
TW201221941A (en) 2012-06-01
KR101886064B1 (ko) 2018-08-07
US8896829B2 (en) 2014-11-25
EP2584345A4 (en) 2015-11-18
TWI519774B (zh) 2016-02-01
KR20130095718A (ko) 2013-08-28
EP2584345A1 (en) 2013-04-24
JPWO2011158829A1 (ja) 2013-08-19
JP5835584B2 (ja) 2015-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5835584B2 (ja) 表面増強ラマン散乱用金属粒子及び分子センシング
Zhou et al. Simultaneous surface-enhanced Raman spectroscopy detection of multiplexed microRNA biomarkers
Zhou et al. Liposome–quantum dot complexes enable multiplexed detection of attomolar DNAs without target amplification
Niu et al. Near-infrared-fluorescent probes for bioapplications based on silica-coated gold nanobipyramids with distance-dependent plasmon-enhanced fluorescence
Aslan et al. Fast and slow deposition of silver nanorods on planar surfaces: application to metal-enhanced fluorescence
CN102066941B (zh) 用于生物传感器的新型Au/Ag核-壳复合材料
Li et al. Fluorescent metal nanoclusters: from synthesis to applications
Nie et al. Applications of gold nanoparticles in optical biosensors
Xu et al. Gold nanobipyramids as dual-functional substrates for in situ “turn on” analyzing intracellular telomerase activity based on target-triggered plasmon-enhanced fluorescence
Nima et al. Applications of surface-enhanced Raman scattering in advanced bio-medical technologies and diagnostics
Yaraki et al. Recent advances in metallic nanobiosensors development: colorimetric, dynamic light scattering and fluorescence detection
Ma et al. Label-free detection of sequence-specific DNA based on fluorescent silver nanoclusters-assisted surface plasmon-enhanced energy transfer
US7723100B2 (en) Polymer coated SERS nanotag
Ou et al. Plasmonic gold nanostructures for biosensing and bioimaging
KR102153948B1 (ko) 이방성 이중금속 나노스타, 이의 나노클러스터 구조체, 제조방법 및 이의 응용
Ji et al. Dual-emissive near-infrared carbon dot-based ratiometric fluorescence sensor for lysozyme
Zhao et al. Chiroplasmonic assemblies of gold nanoparticles as a novel method for sensitive detection of alpha-fetoprotein
Wang et al. Biomolecular sensing via coupling DNA-based recognition with gold nanoparticles
Li et al. Gold nanoparticles as a biosensor for cancer biomarker determination
Wang et al. Detection of IL-8 in human serum using surface-enhanced Raman scattering coupled with highly-branched gold nanoparticles and gold nanocages
Tian et al. Highly sensitive surface-enhanced Raman scattering detection of adenosine triphosphate based on core–satellite assemblies
Wu et al. DNA enzyme mediated ratiometric fluorescence assay for Pb (II) ion using magnetic nanosphere-loaded gold nanoparticles and CdSe/ZnS quantum dots
Soundharraj et al. Facile synthesis of biomass silica-silver colloidal nanoparticles and its application as highly sensitive fluorescent biosensor
Treerattrakoon et al. Detection of a miRNA biomarker for cancer diagnosis using SERS tags and magnetic separation
El-Dessouky et al. Silver nanostructures: Properties, synthesis, and biosensor applications

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11795734

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012520456

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13704427

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137000390

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011795734

Country of ref document: EP