JP2005519622A - ラマン散乱によりヌクレオチド・シグナルを増強する方法 - Google Patents

ラマン散乱によりヌクレオチド・シグナルを増強する方法 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示した方法および装置は、増強ラマン分光法による核酸配列の決定に関係する。本発明の或る実施形態として、ヌクレオチドをラマン標識に共有結合させた後、これを核酸１３に組み込む。この標識核酸１３をエキソヌクレアーゼ１５で処理すると、標識ヌクレオチド１６、１３０が遊離し、これをラマン分光法により検出する。本発明の別の実施形態として、エキソヌクレアーゼ１５処理により核酸１３から遊離したヌクレオチド１６、１３０を、銀もしくは金ナノ粒子１４０に共有結合で架橋した後、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）および／またはコヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）によって検出する。本発明のその他の実施形態は、核酸配列決定用の装置１０、１００、２１０に関する。

Description

本発明の方法および装置は、分子生物学およびゲノム解析の分野に関する。より詳細には、本方法および装置は、核酸配列決定に関する。
遺伝情報は、染色体の形に構成された極めて長いデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として保存されている。ヒト・ゲノムは、約３０億塩基のＤＮＡ配列を含んでいる。このＤＮＡ配列情報によって各個体の多様な特質が決定されている。通常疾患の多くは、少なくとも部分的にＤＮＡ配列の変異に基づいている。
ヒト・ゲノムの全配列を決定することは、このような疾患の遺伝的根拠を特定する基礎となる。しかしながら、各疾患と関連付けられる遺伝的変異を特定するには、今後行うべき多くの研究が残されている。これらの研究では、このような各疾患を示す個体もしくはファミリーの染色体の一部のＤＮＡ配列を決定して、その疾患を促進するＤＮＡ配列の特異的な変化を特定することが必要であると考えられる。また、遺伝情報処理の介在分子であるリボ核酸（ＲＮＡ）の配列を決定することによっても種々の疾患の遺伝的根拠を特定する事が出来る。
サイズにより分別した蛍光標識核酸の検出に基づく既存のＤＮＡ配列決定法は、配列の決定を行う事が出来る核酸の長さによって制約を受けている。通常、一度に決定できる核酸配列は、わずか５００乃至１，０００塩基に過ぎない。これは、遺伝子と呼ばれ、長さが何万もしくは何十万塩基のこともあるＤＮＡの機能単位の長さと比べると、はるかに短いものである。現行の方法を用いて完全な遺伝子配列を決定するには、遺伝子の多数のコピーを作製し、部分的に重なり合う断片に切断して配列を決定し、その後この重なり合うＤＮＡ配列を元の完全な遺伝子に構築できることが必要である。このプロセスは、面倒で、費用と時間がかかり、非効率である。
添付の図面は本明細書の一部を構成するものであり、本発明で開示した実施形態の特定の態様をさらに明示するために含まれている。本発明の実施形態は、本明細書に提示した本発明の個別の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の１つ以上を参照することによってさらに理解を深める事が出来る。
本明細書に開示した方法および装置は、核酸１３の迅速で自動化された配列決定のために利用できる。本発明の特定の実施形態として、本方法および装置１０、１００、２１０は、長さが１，０００塩基超、２，０００塩基超、５，０００塩基超、１０，０００塩基超、２０，０００塩基超、５０，０００塩基超、１００，０００塩基超またはそれ以上の極めて長い核酸分子の配列を得るのに好適である。従来の方法に対する利点としては、単一の配列決定工程で長い核酸１３の配列を読み取る事が出来ること、配列データを入手する速度が速くなること、配列決定のコストが低下すること、および配列データの単位当たりの必要オペレータ時間における効率が増大することが挙げられる。
本発明の種々の実施形態として、単一の核酸分子１３を用い、１回の配列決定工程で配列情報を得る事が出来る。本発明の他の実施形態として、核酸分子１３の多数のコピーの配列決定を並行して、もしくは逐次的に行うことにより、この核酸配列を確認したり完全な配列データを得たりする事が出来る。本発明の別の実施形態として、核酸分子１３とその相補性ストランドの両者について配列決定を行うことにより当該配列情報の精度を確認する事が出来る。
本発明の或る実施形態では、配列決定の対象とする核酸分子１３はＤＮＡであるが、ＲＮＡもしくは合成ヌクレオチド類似体を含むその他の核酸１３についても同様に配列決定する事が出来るものと考えられる。以下の詳細な説明では、本発明で開示した実施形態をより完全に理解できるように多くの具体的な細目が記載されている。しかしながら、本発明の実施形態は、こうした具体的な細目が示されなくても実施できることは、当業者には明瞭に理解されよう。その他の場合として、当該分野でよく知られている装置、方法、手順および個々のコンポーネントについては、本明細書で詳細を示していない。
図１に例示したように、本発明の種々の実施形態として、ヌクレオチドをラマン標識に共有結合させることによって、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）、コヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）その他の公知のラマン検出法により検出されるラマン・シグナルを増強する事が出来る。本発明の或る実施形態では、このような標識ヌクレオチドは、標準的な核酸重合法を用いて新規に合成された核酸ストランド１３に組み入れる事が出来る。通常、特定配列のプライマもしくは１種以上の任意のプライマを鋳型核酸とハイブリッド形成させる。これにポリメラーゼと標識ヌクレオチドを添加すると、当該ラマン標識ヌクレオチドがこのプライマの３’末端と共有結合して、配列が鋳型と相補性の標識核酸ストランド１３が形成される。
合成した標識核酸ストランド１３は、１種以上のエキソヌクレアーゼ１５で消化する事が出来る。本明細書に開示した方法が、エキソヌクレアーゼ１５そのものに限定されるものではなく、核酸１３の少なくとも一端からヌクレオチド１６、１３０を逐次的に除去することが可能な任意の酵素、その他の試薬が利用できることは、当業者に理解されよう。本発明の或る実施形態として、ラマン標識ヌクレオチド１６、１３０は、標識核酸１３の３’末端１７から逐次的に放出される。標識核酸１３から分離されたラマン標識ヌクレオチド１６、１３０は、検出ユニット１８、１８０、３００によって検出する。逐次的に検出した標識ヌクレオチド１６、１３０の情報は、当該鋳型ストランドの配列と相補性である標識核酸１３の配列を集約（ｃｏｍｐｉｌｅ）するために用いられる。
本発明の或る実施形態として、標識核酸１３を非標識鋳型鎖および組み込まれなかったヌクレオチドから分離した後、エキソヌクレアーゼ１５で処理する事が出来る。これは、例えば、表面１４に架橋したプライマ、またはビオチン、もしくは表面１４に結合させる事が出来る同様な基を含むプライマを用いることによって遂行する事が出来る。ビオチン標識プライマは、アビジンもしくはストレプトアビジンにより共有結合的に修飾した表面１４に結合させる事が出来る。標識核酸１３は、公知の手法により非標識鋳型ストランドから分離する事が出来る。
本発明の或る実施形態として、４つのタイプのヌクレオチドのそれぞれを識別可能なラマン標識に結合させる事が出来る。本発明のその他の実施形態として、プリン・ヌクレオチド（シトシンおよび／またはチミジンおよび／またはウラシル）のみを標識する事が出来る。例示的な一実施形態として、当該標識ヌクレオチドは、ビオチン標識デオキシシチジン−５’−三リン酸（ビオチン−ｄＣＴＰ）およびジゴキシゲニン標識デオキシウリジン−５’−三リン酸（ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ）を含む事が出来る。
図２に示したように、本発明の別の実施形態として、ラマン・シグナルは、ヌクレオチド１６、１３０をナノ粒子１４０に共有結合させることによって増強する事が出来る。本発明の或る実施形態として、このような結合は、図１に開示したように、核酸１３のエキソヌクレアーゼ１５による処理を伴うことになる。本発明の或る実施形態として、ナノ粒子１４０は銀もしくは金であるが、表面増強ラマン・シグナルをもたらすことが知られている他のタイプのナノ粒子１４０であっても良い。ナノ粒子１４０は、単一のナノ粒子１４０、もしくはナノ粒子１４０の凝集体、または単一および凝集ナノ粒子１４０の混合物とであっても良い。本発明の或る実施形態として、リンカー化合物を用いてヌクレオチド１６、１３０をこのナノ粒子１４０に結合させる事が出来る。本発明の種々の実施形態として、このリンカー化合物は、長さを１乃至１００ナノメートル（ｎｍ）、２乃至９０ｎｍ、３乃至８０ｎｍ、４乃至７０ｎｍ、５乃至６０ｎｍ、１０乃至５０ｎｍ、１５乃至４０ｎｍ、もしくは２０乃至３０ｎｍとする事が出来る。本発明の或る実施形態として、当該リンカー化合物の長さを１乃至５０、１乃至５、２乃至１０、１０乃至２０ｎｍもしくは約５ｎｍとする事が出来る。本発明のその他の実施形態として、リンカー化合物を用いて２つ以上のナノ粒子１４０を互いに結合させる事が出来る。
共有結合させたナノ粒子−ヌクレオチド複合体１５０は、フロースルー・セル１７０、２９０を通過させ、このセルにおいて検出ユニット１８、１８０、３００を用いるＳＥＲＳ、ＳＥＲＲＳおよび／またはＣＡＲＳによって検出する事が出来る。本発明の或る実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０は非修飾とする事が出来るが、他の代替的な実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０は１つ以上のラマン標識で修飾する事が出来る。本発明の或る実施形態として、各タイプのヌクレオチド１６、１３０は識別可能なラマン標識に結合させる事が出来る。その他の実施形態として、ピリミジン１６、１３０のみを標識する事が出来る。
定義
本明細書の英文明細書の名詞に冠される”ａ”もしくは”ａｎ”は、「１つ以上」を意味する。
本明細書に用いている「作動可能なように結合した」とは、２つ以上のユニット間に機能的な相互作用が存在することを意味する。例えば、検出器２１、３１０は、ヌクレオチド１６、１３０などの被分析物がフロースルー・セル１７０、２９０を通過するとき、これを検出する事が出来るように検出器２１、３１０が配置されている場合、このフロースルー・セル１７０、２９０と「作動可能なように結合された」とする事が出来る。
「核酸」１３は、１本鎖、２本鎖もしくは３本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらの化学的修飾体を包含する。核酸１３の殆ど任意の修飾体についても企図している。本明細書に用いている１本鎖核酸１３は接頭語「ｓｓ」、２本鎖核酸１３は接頭語「ｄｓ」、３本鎖核酸１３は接頭語「ｔｓ」で示すことがある。
「核酸」１３は、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００もしくはそれ以上の塩基から完全長の染色体ＤＮＡ分子１３まで、ほとんどあらゆる長さのものとする事が出来る。
「ヌクレオシド」１６、１３０は、デオキシリボース、リボースなどのペントース糖またはペントース糖の誘導体もしくはアナログに共有結合した、プリンもしくはピリミジン塩基（アデニン−「Ａ」、シトシン−「Ｃ」、グアニン−「Ｇ」、チミン−「Ｔ」もしくはウラシル−「Ｕ」）あるいはこれらの任意の化学的修飾体または構造アナログを含む分子である。
「ヌクレオチド」１６、１３０とは、ペントース糖に共有結合した少なくとも１つのリン酸基をさらに含むヌクレオシド１６、１３０のことを意味する。本発明の或る実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０は、リボヌクレオシド一リン酸１６、１３０もしくはデオキシリボヌクレオシド一リン酸１６、１３０であるが、ヌクレオチド二リン酸もしくは三リン酸１６、１３０を作製し、検出する事も出来ることを想定している。本発明のその他の実施形態として、ヌクレオシド１６、１３０を核酸１３から遊離させる事が出来る。ヌクレオチド１６、１３０の構造については、これらがポリメラーゼ作用によって核酸１３中に組み込まれ、エキソヌクレアーゼ１５もしくはこれに相当する試薬によって遊離させる事が出来る限り、種々の置換または修飾を行う事が出来るものと考えられる。１つ以上のタイプのヌクレオチド１６、１３０に１種以上の標識を結合する本発明の実施形態として、標識が核酸１３の重合および／または消化を妨害しない限り、ヌクレオチド１６、１３０に対し、その塩基、糖もしくはリン酸基またはこれらのアナログなどの任意の部分に当該標識を結合させる事が出来る。「ヌクレオチド」および「標識ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド−ナノ粒子複合体およびヌクレオチド−標識複合体など全ての非天然型ヌクレオチド複合体を包含するが、これらに限定されるものではない。
「ラマン標識」は、検出可能なラマン・シグナルを生じる事が出来る任意の有機もしくは無機分子、原子、複合体または構造体とすることができ、例えば、合成分子、染料、フィコエリトリンなどの天然色素、Ｃ６０、バッキーボールおよびカーボン・ナノチューブなどの有機ナノ構造体、金もしくは銀ナノ粒子またはナノプリズムなどの金属ナノ構造体、ならびに量子ドットなどのナノスケール半導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ラマン標識の数々の例を以下に開示するが、こうした例が限定的なものではなく、「ラマン標識」が、ラマン分光法により検出できる、当該分野で公知であるあらゆる有機もしくは無機原子、分子、複合体または構造体を包含するものであることは、当業者に理解されよう。
核酸
配列決定の対象とする核酸分子１３は、当該分野で知られている任意の技術によって調製する事が出来る。本発明の或る実施形態として、核酸１３は天然型ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。略任意の天然型核酸１３を本明細書に開示した方法により調製し、配列を決定することができ、このような核酸としては、染色体、ミトコンドリアおよび葉緑体ＤＮＡならびにリボソーム、転移、ヘテロ核およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。種々の形態の核酸１３を調製し、単離する方法が知られている。（例えば、ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング・テクニークス（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）、キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＮＹ、１９８７年；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）、第２版、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、コールド・スプリング・ハーバー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８９年参照）。これらの引用文献に開示されている方法は、例示的なものに過ぎず、当該分野で知られているどんな変法も使用する事が出来る。１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）１３の配列を決定する場合、任意の公知の方法により二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）からｓｓＤＮＡ１３を調製する事が出来る。このような方法は、ｄｓＤＮＡを加熱してストランドを分離させるものであるか、あるいはＭ１３へのクローニングなど公知の増幅もしくは複製法によりｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡ１３を調製するものとする事が出来る。このような公知の方法は全て、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ１３の調製に用いる事が出来る。
本発明の或る実施形態は天然型核酸１３の調製に関するものであるが、エキソヌクレアーゼまたはこれに相当する試薬の基質となる略任意のタイプの核酸１３の配列を決定することが可能で有る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ（登録商標））増幅法などの種々の増幅技術により調製された核酸１３の配列を決定することができている。（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号参照）。一方、配列決定の対象とする核酸１３は、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ（細菌人工染色体）もしくはＹＡＣ（酵母人工染色体）などの標準的なベクターを用いてクローニングする事が出来る。（例えば、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）、キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）、１９８７年； サンブルックほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）１９８９年参照。）核酸挿入断片１３は、例えば、適当な制限エンドヌクレアーゼで切り出した後、アガロースゲル電気泳動にかけることによって、ベクターＤＮＡから単離する事が出来る。挿入核酸１３の単離方法は、よく知られている。
単一核酸分子の単離
本発明の或る実施形態として、配列決定の対象とする核酸分子１３はｓｓＤＮＡもしくはｓｓＲＮＡの単一分子である。単一核酸分子１３を選択し操作するには種々の方法、例えば、流体力学的絞り込み法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ）、マイクロマニピュレータ・カップリング法、光トラップ法（ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ）またはこれらと類似の方法との組合せを用いる事が出来る。（例えば、グッドウィンほか（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．）２９：ｐ６０７−６１９；米国特許第４，９６２，０３７号、第５，４０５，７４７号、第５，７７６，６７４号、第６，１３６，５４３号、第６，２２５，０６８号参照。）
本発明の或る実施形態として、マイクロフルイディクスもしくはナノフルイディクスを用いて核酸分子１３を選別し、単離する事が出来る。流体力学を利用してマイクロ・チャネル、マイクロキャピラリーもしくはミクロポア中への核酸分子１３の移動を操作する事が出来る。本発明の一実施形態として、流体力を利用して、櫛構造を横切るように核酸分子１３を移動させ、単一核酸分子１３を分離する事が出来る。核酸分子１３を分離すれば、流体力学的絞り込み法により分子１３を反応チャンバ１１、２２０内に配置する事が出来る。また、熱ポテンシャル、電位、圧力もしくは真空状態を利用して核酸１３処理のための駆動力を得る事も出来る。本発明の例示的な実施形態として、配列決定のための核酸１３の処理は、微細加工チャネルおよび一体化されたゲル物質を採用するチャネルブロック・デザインを用いたものとする事が出来る（米国特許第５，８６７，２６６号および第６，２１４，２４６号参照）。
本発明の別の実施形態として、核酸分子１３を含有するサンプルは、希釈した後に、固定用表面１４に結合させる事が出来る。本発明の例示的な実施形態として、この固定用表面１４は、磁性もしくは非磁性ビーズ、またはその他の個別構造単位の形を取る事が出来る。希釈を適切に行えば、各ビーズ１４はゼロ個もしくは１個の核酸分子１３を結合する統計的確率を有することになる。核酸分子１３が１個結合したビーズ１４については、例えば、蛍光染料およびフローサイトメータ・ソーティングもしくは磁気ソーティングにより確認する事が出来る。ビーズ１４および核酸１３の相対的サイズおよび均一性にもよるが、磁気フィルターおよび質量分離により、単一結合核酸分子１３を含むビーズ１４を分離することは可能であろう。本発明のその他の実施形態として、単一ビーズその他の固定用表面１４に結合させた多数の核酸１３について、配列決定を行う事が出来る。
本発明の別の実施形態として、コーティングしたファイバー・チップ１４を用いて単一分子の核酸１３を得、配列決定する事が出来る（例えば、米国特許第６，２２５，０６８号）。その他の代替的実施形態として、固定用表面１４は、アビジンその他の架橋剤の単一分子を含むように調製する事が出来る。このような表面１４は、配列決定の対象とする単一のビオチン化核酸分子１３を結合することができる。この実施形態は、アビジン−ビオチン結合系に限定されるものではなく、あらゆる既知の結合系に適合させる事が出来る。
その他の代替的実施形態として、光トラップ法を用いて単一分子の核酸１３を操作し、配列を決定する事が出来る。（例えば、米国特許第５，７７６，６７４号）。光トラップ装置としては、例えば、セル・ロボティクス社（Ｃｅｌｌ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）（アルバカーキ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ）、ニューメキシコ）、Ｓ＋Ｌ社（Ｓ＋Ｌ ＧｍｂＨ）（ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）およびＰ．Ａ．Ｌ．Ｍ．社（Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ．ＧｍｂＨ）（ウォルフラーツハウゼン（Ｗｏｌｆｒａｔｓｈａｕｓｅｎ）、ドイツ）から市販されているものがある。
ラマン標識
本発明の或る実施形態は、ヌクレオチド１６、１３０に標識を結合させて検出ユニット１８、１８０、３００による測定を容易にするものである。ラマン分光法に用いることができる標識の例としては、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンヅ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、テキサス・レッド色素、フタール酸、テレフタール酸、イソフタール酸、クレシルバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、サクシニルフルオレセイン、およびアミノアクリジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記その他のラマン標識は、市販元（例えば、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン）から入手する事が出来る。
当該分野で知られているように、多環式芳香族化合物はラマン標識として機能する事が出来る。本発明の個々の実施形態に利用できるその他の標識としては、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リンおよび硫黄が挙げられる。本発明の或る実施形態として、ラマン標識にカーボン・ナノチューブを用いる事が出来る。ラマン分光法において標識を使用することについては公知である（例えば、米国特許第５，３０６，４０３号および第６，１７４，６７７号）。使用したラマン標識が識別可能なラマンスペクトルを生じ、種々のタイプのヌクレオチド１６、１３０と特異的に結合もしくは会合する事が出来ることは、当業者に理解されよう。
標識は、ヌクレオチド１６、１３０に直接結合させることができ、あるいは種々のリンカー化合物を介して結合させる事が出来る。本明細書に開示した方法に利用できる架橋試薬およびリンカー化合物については、さらに以下に説明する。また、ラマン標識に共有結合させるヌクレオチドについては、普通の市販元（例えば、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ社（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ；プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン）；アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）、オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス；アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー）から入手できる。ヌクレオチド１６、１３０などの他の分子と共有結合反応するように設計された反応基を有するラマン標識も市販されている（例えば、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン）。標識ヌクレオチドを調製し、これを核酸１３に組み込む方法については公知である（例えば、米国特許第４，９６２，０３７号、第５，４０５，７４７号、第６，１３６，５４３号および第６，２１０，８９６号）。
ナノ粒子
本発明の或る実施形態は、ナノ粒子１４０を用いて、ヌクレオチド１６、１３０から得られるラマン・シグナルを増強するものである。本発明の或る実施形態として、ナノ粒子１４０は、銀もしくは金ナノ粒子１４０であるが、表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ）シグナルをもたらす事が出来る任意のナノ粒子１４０を用いる事が出来る。本発明の別の実施形態として、ナノ粒子１４０はナノプリズムとする事が出来る（ジンほか（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２９４：ｐ１９０２−３、２００１年）。本発明の種々の実施形態として、径が１ｎｍ乃至２マイクロメートル（μｍ）のナノ粒子１４０を用いる事が出来る。本発明の別の実施形態として、径が２ｎｍ乃至１μｍ、５ｎｍ乃至５００ｎｍ、１０ｎｍ乃至２００ｎｍ、２０ｎｍ乃至１００ｎｍ、３０ｎｍ乃至８０ｎｍ、４０ｎｍ乃至７０ｎｍまたは５０ｎｍ乃至６０ｎｍのナノ粒子１４０を企図している。本発明の或る実施形態として、平均径が１０乃至５０ｎｍ、５０乃至１００ｎｍまたは約１００ｎｍのナノ粒子１４０を企図している。ナノ粒子１４０は形状をほぼ球状、棒状、鋭角状、ファセット状または先鋭状とする事が出来るが、あらゆる形状または不規則形状のナノ粒子１４０も使用できる。ナノ粒子を調製する方法については公知である（例えば、米国特許第６，０５４，４９５号；第６，１２７，１２０号；第６，１４９，８６８号；リー（Ｌｅｅ）、マイセル（Ｍｅｉｓｅｌ）、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．）８６：ｐ３３９１−３３９５、１９８２年；ジンほか（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．）、２００１年）。ナノ粒子は市販元（例えば、ナノプローブズ社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）、ヤップハンク（Ｙａｐｈａｎｋ）、ニューヨーク；ポリサイエンシズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ウォリントン、ペンシルバニア）からも入手する事が出来る。
本発明の或る実施形態として、ナノ粒子１４０は、単一ナノ粒子１４０および／またはナノ粒子１４０の任意の凝集体（コロイド状ナノ粒子１４０）とする事が出来る。本発明のその他の実施形態として、ナノ粒子１４０を架橋させて、二量体、三量体、四量体その他の凝集体のようなナノ粒子１４０の特定の凝集体を作製する事が出来る。本発明の或る別の実施形態では、異なるサイズの凝集体の不均一な混合物を使用する事が出来るが、他の実施形態では、ナノ粒子１４０の均一な集合体を使用する事が出来る。本発明の或る実施形態として、選ばれた数のナノ粒子１４０を含む凝集体（二量体、三量体など）は、スクロース溶液中での遠心など公知の技術により濃縮または精製する事が出来る。本発明の種々の実施形態として、サイズもしくは大きさが約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００乃至１，０００ｎｍのナノ粒子１４０凝集体を企図している。
ナノ粒子１４０を架橋する方法については公知である（例えば、フェルトハイム（Ｆｅｌｔｈｅｉｍ）、「分子ブリッジを用いた金属ナノ粒子アレイの構築（Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅｓ）」ザ・エレクトロケミカル・ソサエティ・インターフェース（Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、２００１年秋季号、ｐ２２−２５）。金ナノ粒子１４０については、例えば、末端チオールもしくはスルフヒドリル基を有する二官能性リンカー化合物を用いて架橋させる事が出来る。このリンカーは、金ナノ粒子１４０と反応すると、当該リンカーの長さだけ離隔されたナノ粒子１４０二量体を形成する。本発明のその他の実施形態として、チオール基を３個、４個もしくはそれ以上有するリンカーを用いて多数のナノ粒子１４０に同時結合させる事が出来る（フェルトハイム（Ｆｅｌｔｈｅｉｍ）、２００１年）。リンカー化合物に対して過量のナノ粒子１４０を用いると、多数の架橋の形成およびナノ粒子１４０の析出を防止できる。銀ナノ粒子１４０の凝集体については、当該分野で公知である標準的な合成法により形成する事が出来る。
本発明の別の実施形態として、ナノ粒子１４０は、種々の反応基を含むように修飾した後に、リンカー化合物に結合させる事が出来る。ナノ粒子１４０の修飾体は、例えば、ナノプローブズ社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）、（ヤップハンク（Ｙａｐｈａｎｋ）、ニューヨーク）からＮａｎｏｇｏｌｄ（ナノゴールド）（登録商標）ナノ粒子１４０が市販されている。Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子１４０は、ナノ粒子１４０の１個当たり１個もしくは複数個のマレイミド、アミンその他の基を結合して得る事が出来る。また、このＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子１４０は、正または負に荷電した形で入手できる。このようなナノ粒子１４０修飾体を種々の既知リンカー化合物に結合させて、ナノ粒子１４０の二量体、三量体その他の凝集体を得る事が出来る。
使用するリンカー化合物のタイプは、これが溶液中に析出しないナノ粒子１４０の微細な凝集体の生成をもたらす限り、限定的なものではない。本発明の或る実施形態として、このリンカーのグループは、フェニルアセチレンポリマーを含む事が出来る（フェルトハイム（Ｆｅｌｔｈｅｉｍ）、２００１年）。あるいは、リンカーのグループは、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレンその他の既知ポリマーを含む事が出来る。利用できるリンカー化合物は、ポリマーに限定されるものではなく、シラン、アルカン、誘導体化シランもしくは誘導体化アルカンなど他のタイプの分子も含む事が出来る。
本発明の種々の実施形態として、ナノ粒子１４０は、ヌクレオチド１６、１３０に共有結合させる事が出来る。本発明の別の実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０は、ナノ粒子１４０に直接結合させることができ、あるいはナノ粒子１４０に共有もしくは非共有結合させたリンカー化合物に結合させる事が出来る。本発明のこのような実施形態では、２つ以上のナノ粒子を互いに架橋させるのではなく、当該リンカー化合物を用いてナノ粒子１４０もしくはナノ粒子１４０凝集体にヌクレオチド１６、１３０を結合させる事が出来る。本発明の特定の実施形態として、ナノ粒子１４０は、誘導体化シランでコーティングする事が出来る。このような修飾シランは、標準的な方法を用いてヌクレオチド１６、１３０に共有結合させる事が出来る。また、以下に説明する表面１４に核酸１３を架橋するための公知の種々の方法を用いて、ナノ粒子１４０にヌクレオチド１６、１３０を結合する事が出来る。ヌクレオチド１６、１３０に結合させるために使用するリンカー化合物は、約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６０、８０、９０から１００ｎｍもしくはそれ以上の範囲のほぼあらゆる長さのものとする事が出来ると考えられる。本発明の或る実施形態では、不均一な長さのリンカーを用いる事が出来る。
本発明のその他の実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０は、ナノ粒子１４０の表面に吸着させることができ、あるいはナノ粒子１４０に近接（約０．２乃至１．０ｎｍ）させる事が出来る。ＳＥＲＳ、ＳＥＲＲＳもしくはＣＡＲＳによりラマン・シグナルを増強させるのにヌクレオチド１６、１３０をナノ粒子１４０に共有結合させる必要はないことは、当業者に理解されよう。
図２に開示した本発明の例示的な実施形態として、ヌクレオチド１３０は、マイクロフルイディク・チャネル１６０に沿って移動して行く時に、ナノ粒子１４０に結合してヌクレオチド−ナノ粒子複合体を形成する。本発明の或る実施形態として、架橋反応を生じるのに必要な時間の長さを極めて短くする事が出来る。このような実施形態では、急速な反応速度を示す反応性の高い基、例えば、エポキシド基、アジド基、アリールアジド基、トリアジン基またはジアゾ基を利用する事が出来る。本発明の或る実施形態として、これらの架橋基は、レーザなどの強い光線を照射することによって光活性化する事が出来る。例えば、ジアゾもしくはアジド化合物を光活性化すると、それぞれ、高度に反応性のカルベンおよびニトレン部分が形成される。本発明の或る実施形態として、これらの反応基を選択することにより、ナノ粒子１４０を互いに架橋させるのではなく、専らナノ粒子１４０をヌクレオチド１６、１３０に結合させるようにする事が出来る。ヌクレオチド１６、１３０に結合させる事が出来る反応性架橋基の選択および調製については、当該分野で公知である。本発明の別の実施形態として、ヌクレオチド１６、１３０自体を、例えば、金ナノ粒子１４０に結合可能なスルフヒドリル基によって共有結合的に修飾する事が出来る。
本発明の或る実施形態として、マイクロフルイディクス、ナノフルイディクス、流体力学的絞り込み法もしくは電気浸透法のような当該分野で知られている任意の方法により、ナノ粒子１４０をマイクロフルイディク・チャネル１２０、１６０、２７０、２８０中に導くよう操作する事が出来る。本発明の或る実施形態として、荷電リンカー化合物もしくは荷電ナノ粒子１４０を使用すると、電気勾配によりナノ粒子１４０の操作を容易にする事が出来る。
核酸の固定化
本発明の或る実施形態として、図１に例示したように、機能化ガラス、ケイ素、ケイ酸塩、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、銀その他の金属被覆表面、石英、プラスチック、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、ナイロン、ニトロセルロース、ガラスビーズ、電磁ビーズ、核酸分子１３と共有結合を形成できるニトレン、カルベンおよびケチル基などの光反応性化学種を含む感応性樹脂（米国特許第５，４０５，７６６号および第５，９８６，０７６号参照）、またはアミノ、カルボキシル、チオール、ヒドロキシルもしくはディールス・アルダー反応物などの官能基を表面１４に取り込む事が出来る、当該分野で公知の全ての物質などの表面１４に対し、１つ以上の核酸分子１３を結合させる事が出来る。
本発明の或る実施形態として、核酸分子１３とエキソヌクレアーゼ１５および／またはポリメラーゼとの間で、立体障害を生じることなく結合相互作用が起こるように、当該表面の官能基を架橋化合物に共有結合させる事が出来る。典型的な架橋基としては、エチレングリコールオリゴマーおよびジアミンが挙げられる。結合は、共有結合または非共有結合によるものとする事が出来る。核酸分子１３を表面１４に結合する方法については、種々のものが当該分野で公知であり、これらを使用する事が出来る。本発明の或る実施形態として、遊離ヌクレオチド１６、１３０を検出ユニット１８、１８０、３００を通過させて移送する流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿ったマイクロ流体中に、核酸分子１３を所定の位置に固定して浸す。このマイクロ流体は、例えば、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿って大量に流れる溶媒によるものとする事が出来るが、これに限定されるものではない。
本発明の別の実施形態として、この大量のメジウムは極ゆっくりと移動するか全く移動しないが、この溶液内の（負に荷電したヌクレオチド１６、１３０のような）荷電化学種は、外部からかけた電場に反応して、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿って移動する。
核酸分子１３の固定化は、公知の種々の方法によって達成する事が出来る。本発明の例示的な実施形態として、固定化は、表面１４をストレプトアビジンもしくはアビジンでコーティングし、その後、ビオチン化核酸１３を結合させることにより達成できる（ホームストロムほか（Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２０９：ｐ２７８−２８３、１９９３年）。また、固定化は、ケイ素、ガラスその他の表面１４をポリ−Ｌ−Ｌｙｓ（リジン）もしくはポリＬ−Ｌｙｓ，Ｐｈｅ（フェニルアラニン）でコーティングした後、二官能性架橋試薬を用いてアミノもしくはスルフヒドリルで修飾した核酸１３を共有結合させることによっても達成する事が出来る（ランニングほか（Ｒｕｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．）、バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）８：ｐ２７６−２７７、１９９０年；ニュートンほか（Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２１：ｐ１１５５−６２、１９９３年）。アミン残基は、アミノシランを用いることによって表面１４にコーティングする事が出来る。
固定化は、化学的に修飾した表面１４に５’−リン酸化核酸１３を直接共有結合させても行う事が出来る（ラスマッセンほか（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１９８：ｐ１３８−１４２、１９９１年）。核酸１３と表面１４との共有結合は、水溶性カルボジイミドとの縮合によって形成する事が出来る。この方法は、５’−リン酸エステルを介して核酸１３の主に５’−結合を容易にする。
通例、ＤＮＡ１３は、先ずガラス表面１４をシラン処理し、次いでカルボジイミドもしくはグルタルアルデヒドで活性化することによってガラスに結合させる。別の方法では、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）もしくはアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）のような試薬とＤＮＡ１３を、このＤＮＡの３’もしくは５’末端に組み込んだアミノ・リンカーを介して結合させたものを用いる事が出来る。ＤＮＡ１３は、紫外線照射により膜表面１４に直接結合させる事が出来る。核酸１３の固定化技術の他の例として、米国特許第５，６１０，２８７号、第５，７７６，６７４号および第６，２２５，０６８号に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
二官能性架橋試薬は、核酸分子１３の表面１４への結合などの、本発明の種々の実施形態において利用する事が出来る。当該二官能性架橋試薬は、その官能基の特異性によって、例えば、アミノ、グアニジノ、インドールもしくはカルボキシル特異性基に分類できる。分子を架橋する方法の例については、米国特許第５，６０３，８７２号および第５，４０１，５１１号に開示されている。架橋試薬としては、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドが挙げられる。
核酸合成
ポリメラーゼ
本発明の或る実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼなどの合成試薬をプライマ分子に結合させ、このプライマの３’末端にラマン標識ヌクレオチドを付加するものである。ポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。「校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）」作用ならびにプライマおよびプロモータ配列に対する必要性の有無の点からみたこれらのポリメラーゼ間の相違については、当該分野で公知である。ＲＮＡポリメラーゼを当該ポリメラーゼとして用いる場合、配列決定の対象とする鋳型分子は二本鎖ＤＮＡとする事が出来る。ポリメラーゼの例としては、好熱性海洋細菌（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍｅ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉｔａｑＦＳ（アンプリタクＦＳ）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑｕｅｎａｓｅ（タケナーゼ）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（サーモシーケナーゼ）（登録商標）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｑｂｅｔａ（キューベータ）（登録商標）レプリカーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
いくつかのポリメラーゼは市販されており、これらのものとしては、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ）；Ｂｓｔポリメラーゼ（バイオ−ラド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア）；ＩｓｏＴｈｅｒｍ（イソターム）（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター・テクノロジーズ社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン）；モロニー・ムリン・リューケミア・ウイルス・リバース・トランスクリプターゼ（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、エイビアン・ミエロブラストーシス・ウイルス・リバース・トランスクリプターゼ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、サームス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼおよびサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン）；ＲＡＶ２リバース・トランスクリプターゼ、ＨＩＶ−１リバース・トランスクリプターゼ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、サームス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ＋／−３’→５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）「遍在性（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）」ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼＩ（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー）が挙げられる。標識ヌクレオチドの鋳型依存性重合を行う事が出来る、当該分野で知られているポリメラーゼは全て用いる事が出来る。（例えば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、ティッピン（Ｔｉｐｐｉｎ）、ネイチャー・レビューズ・モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）１（２）：ｐ１０１−９、２０００年；米国特許第６，０９０，５８９号参照。）ポリメラーゼを用いて標識ヌクレオチドから核酸１３を合成する方法については公知である（例えば、米国特許第４，９６２，０３７号；第５，４０５，７４７号；第６，１３６，５４３号；第６，２１０，８９６号）。
プライマ
プライマの長さは、一般に１０乃至２０塩基であるが、より長いプライマも使用する事が出来る。本発明の或る実施形態として、プライマは、鋳型核酸分子の既知の部分に対して配列が相補性となるように設計する。既知のプライマ配列は、例えば、既知の不変の染色体配列に隣接する配列変異体を特定するためのプライマを選ぶ場合、未知の核酸配列を既知配列のベクターに挿入する場合、または野性型核酸の配列が部分的に決定されている場合に用いる事が出来る。任意の配列のプライマについて該合成方法が公知である。本発明の他の実施形態は、既知のプライマ結合部位がない場合に核酸１３の配列を決定するものである。このような場合、ランダム六量体、ランダム・オリゴマーなどのランダム・プライマを用いて重合を開始させることが可能な場合がある。
核酸の消化
図１に示した本発明の或る実施形態として、核酸１３の配列決定方法は、エキソヌクレアーゼ１５もしくはこれの相当する試薬を核酸分子１３の遊離端１７に結合させ、ヌクレオチド１６、１３０を１つずつ除去するものである。利用し得る核酸消化酵素１５の例としては、大腸菌エキソヌクレアーゼＩ、ＩＩＩ、ＶもしくはＶＩＩ、Ｂａｌ ３１エキソヌクレアーゼ、マング・ビーン・ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩホロ酵素もしくはクレノーフラグメント、ＲｅｃＪ、エキソヌクレアーゼＴ、Ｔ４もしくはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＴ７遺伝子６、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＧＢ−Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ラムダ・エキソヌクレアーゼ、黄色ブドウ球菌ミクロコッカス・ヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、リボヌクレアーゼＡ、Ｔ１ミクロコッカス・ヌクレアーゼ、または当該分野で公知のその他のエキソヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。エキソヌクレアーゼ１５は、ニュー・イングランド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ）、アマーシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー）、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）（マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン）、シグマ・ケミカルス社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ）またはベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルス社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ）などの市販元から入手可能である。
エキソヌクレアーゼ１５活性を有する酵素によって核酸１３の５’末端もしくは３’末端または両端からヌクレオチド１６、１３０を除去できることは、当業者により理解されよう。このような酵素は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡ１３の両者に特異性を示す事が出来る。その活性は、１本鎖または２本鎖核酸１３の使用に依拠する事が出来る。これらの酵素は、塩濃度、温度、ｐＨ、もしくは二価カチオンによって異なる影響を受ける。エキソヌクレアーゼ１５の上記およびその他の特性については当該分野で公知である。本発明の或る実施形態として、エキソヌクレアーゼ１５の作用速度は、検出ユニット１８によるヌクレオチド１６、１３０の分析の最適速度と一致するように操作する事が出来る。エキソヌクレアーゼ１５の作用速度を調節する方法については、反応チャンバ１１、２２０内の温度、圧、ｐＨ、塩もしくは二価カチオン濃度を調節する方法など、種々のものが知られている。
ヌクレオシド一リン酸１６、１３０は通常、エキソヌクレアーゼ１５の作用によって核酸３から遊離するが、本発明の実施形態は、特定の形態の遊離ヌクレレオチドもしくはヌクレオシド１６、１３０の検出にも限定されるものではなく、核酸１３から遊離させる事が出来る全てのモノマー１６、１３０をも包含するものである。
反応チャンバおよび一体型チップ
図１に例示したように、本発明の或る実施形態は、水性の環境で固定用表面１４、核酸分子１３、エキソヌクレアーゼ１５およびヌクレオチド１６、１３０を含むように設計された反応チャンバ１１、２２０を備える装置１０、１００、２１０に関する。本発明の或る実施形態として、反応チャンバ１１、２２０は、例えば、ペルティエ素子を組み込んだり、当該分野で公知のその他の方法によって温度調節を行ったりする事が出来る。低容量液に対して温度を調節する方法については公知である。（例えば、米国特許第５，０３８，８５３号、第５，９１９，６２２号、第６，０５４，２６３号および第６，１８０，３７２号参照。）
本発明の或る実施形態として、反応チャンバ１１、２２０および全ての関連流体チャネル、例えば、流路１２、マイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０、もしくは廃液口、核酸１３挿入口、ナノ粒子貯蔵部位３７０、エキソヌクレアーゼ１５の供給源その他の流体コンパートメントに接続するチャネル１２０、２３０、２４０、２７０、３５０、３６０は、コンピュータ・チップ製造および／またはマイクロキャピラリー・チップ製造の分野で知られているようなバッチ製造工程で製造する。本発明の或る実施形態として、反応チャンバ１１、２２０、および流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０などの装置１０、１００、２１０の他のコンポーネントは、単一の一体型チップとして製造する事が出来る。このようなチップは、フォトリソグラフィおよびエッチングなどの、当該分野で公知の方法により製造する事が出来る。但し、この製造方法は、限定的なものではなく、レーザアブレーション、射出成形、注型、分子線エピタキシー、ディップペン・ナノリソグラフィ、化学気相蒸着（ＣＶＤ）製造、電子ビームもしくは集束イオンビーム技術またはインプリンティング技術など、当該分野で公知のその他の方法を用いる事も出来る。本発明の或る実施形態にはナノ電気力学システムの製造方法を用いる事が出来る。（例えば、クライグヘッド（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２９０：ｐ１５３２−３６、２０００年参照。）超小型チップは、例えば、キャリパー・テクノロジーズ社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア）およびＡＣＬＡＲＡバイオサイエンシーズ社（ＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア）から市販されている。
検出ユニット１８、１８０、３００によるヌクレオチド１６、１３０の検出を容易にするために、流路１２もしくはフロースルー・セル１７０、２９０を構成する材質は、検出ユニット１８、１８０、３００に使用する励起および放射周波数の電磁放射線に対して透過性であるように選ぶ事が出来る。ガラス、ケイ素、および通常ラマン分光法に用いる波長で透過性である物質は全て用いる事が出来る。本発明の或る実施形態として、検出ユニット１８、１８０、３００に向かい合う流路１２もしくはフロースルー・セル１７０、２９０の表面は、銀、金、プラチナ、銅、アルミニウムその他の、検出ユニット１８、１８０、３００に対して相対的に不透明な物質でコーティングする事が出来る。その位置では、この不透明な物質は、検出ユニット１８、１８０、３００の機能を妨害しないと同時に、例えば、ＳＥＲＳによりラマン・シグナルを増強するのに有効である。あるいは、流路１２もしくはフロースルー・セル１７０、２９０は、銀、金、プラチナ、銅、アルミニウムその他のラマン・シグナル増強金属を含有するメッシュを含む事が出来る。
流路およびマイクロフルイディク・チャネル
本発明の或る実施形態として、核酸１３から遊離したヌクレオチド１６、１３０は、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿って移動させて検出ユニット１８、１８０、３００を通過させる。ヌクレオチド１６、１３０を移送する技術の例としてはマイクロフルイディク技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０は、マイクロキャピラリィ（例えば、ＡＣＬＡＲＡバイオサイエンシーズ社（ＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニアから市販）もしくはリキッド・インテグレーテッド・サーキット（ｌｉｑｕｉｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｉｒｃｕｉｔ）（例えば、キャリパー・テクノロジーズ社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）、カリフォルニアから市販）を含む事が出来る。
本発明の或る実施形態として、検出対象のヌクレオチド１６、１３０は、溶媒の大きな流れにより流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿って移動する。本発明のその他の実施形態として、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿ってヌクレオチド１６、１３０を移送するためにマイクロキャピラリィ電気泳動法を用いる事が出来る。一般に、マイクロキャピラリィ電気泳動法は細いキャピラリもしくはチャネルを用いるものであり、細いキャピラリもしくはチャネル内に、特定の分離メジウムを充填しても良いし、充填しなくても良い。負に荷電したヌクレオチド１６、１３０のような適切に荷電した分子種は、装置１０、１００、２１０の反応チャンバ１１、２２０側を負、検出ユニット１８、１８０、３００側を正としてかけた電場に反応して電気泳動を示す。電気泳動は、当該マイクロキャピラリィに同時に添加される成分の混合物をサイズ分離するのに用いられることが多いが、核酸１３から逐次的に遊離する同様なサイズのヌクレオチド１６、１３０を移送するのにも用いる事が出来る。プリン・ヌクレオチド（Ａ、Ｇ）１６、１３０はピリミジンヌクレオチド（Ｃ、Ｔ、Ｕ）１６、１３０より大きく、従って移動速度もより緩慢なはずであるので、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０の長さ、および対応する検出ユニット１８、１８０、３００通過時間は、移動性の差が核酸１３から遊離するヌクレオチド１６、１３０の順序を混乱させないように、最小に保つ事が出来る。あるいは、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に沿ったプリンおよびピリミジンヌクレオチド１６、１３０の移動速度が同様または同一となるように、当該マイクロキャピラリィを満たすメジウムを選択する事が出来る。マイクロキャピラリィ電気泳動法については、例えば、ウーリ（Ｗｏｏｌｌｅｙ）、マチス（Ｍａｔｈｉｅｓ）（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ）ＵＳＡ９１：ｐ１１３４８−３５２、１９９４年）によって述べられている。
本発明の或る実施形態として、流路１２および／またはマイクロフルイディク・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０は、グリセロール溶液などの比較的高粘度の水溶液を含む事が出来る。このような高粘度溶液は、当該流速を減少させ、例えば、ヌクレオチド１６、１３０をナノ粒子１４０に架橋させるのに有効な反応時間を増加させるのに役立たせる事が出来る。
マイクロキャピラリィ電気泳動デバイスなどのマイクロフルイディク・デバイスの微細加工法については、例えば、ジェコブセンほか（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）（アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２０９：ｐ２７８−２８３、１９９４年）；エッフェンハウゼザーほか（Ｅｆｆｅｎｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．）（アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６６：ｐ２９４９−２９５３、１９９４年）；ハリソンほか（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２６１：ｐ８９５−８９７、１９９３年）および米国特許第５，９０４，８２４号に開示されている。これらの方法は、標準的な光リソグラフィもしくは集束イオンビーム技術により作製したシリコーン原盤を用いる微細成形技術、あるいはシリカ、シリコーンその他の結晶基質もしくはチップ上へのミクロンスケールのチャネルの光リソグラフィ・エッチングを含む事が出来る。こうした技術は、本明細書に開示した方法および装置に使用するのに容易に適合させる事が出来る。本発明の或る実施形態として、当該マイクロキャピラリィは、当該分野で公知の技術を用いて、反応チャンバ１１、２２０の加工に使用したのと同じ材料から加工する事が出来る。
検出ユニット
本発明の種々の実施形態として、検出ユニット１８、１８０、３００は、ラマン分光法によりヌクレオチド１６、１３０を検出し定量するように設計される。ラマン分光法によりヌクレオチド１６、１３０を検出する方法については当該分野で公知である。（例えば、米国特許第５，３０６，４０３号；第６，００２，４７１号；第６，１７４，６７７号参照）。表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）およびコヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）の変法についても開示されている。銀、金、プラチナ、銅もしくはアルミニウム表面などの金属粗面に近接した分子では、ラマン検出感度が１０６倍以上増強される。
ラマン検出ユニット１８、１８０、３００の例としては、米国特許第６，００２，４７１号に開示されているものが挙げられるが、これに限定されるものではない。励起ビーム２０、３３０は、波長５３２ｎｍの倍周波数Ｎｄ：ＹＡＧレーザ１９、３２０か、波長３６５ｎｍの倍周波数Ｔｉ：サファイアレーザ１９、３２０によって発生させる。パルス・レーザビーム２０、３３０または連続レーザビーム２０、３３０を用いる事が出来る。励起ビーム２０、３３０は、共焦点光学系（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｏｐｔｉｃｓ）および顕微鏡対物レンズ（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を通過させ、流路１２および／またはフロースルー・セル１７０、２９０上に集束させる。ヌクレオチド１６、１３０からのラマン放射光は、顕微鏡対物レンズおよび共焦点光学系によって集められた後、単色分光器に連結されてスペクトルが分離される。この共焦点光学系は、２色性フィルター、バリアーフィルター、共焦点ピンホール、レンズ、および背景シグナルを減少させるためのミラーの組合せを含む。共焦点光学系に加えて全視野の光学系も用いる事が出来る。ラマン発光シグナルは、このシグナルをカウントしてデジタル処理するコンピュータにインターフェースで接続したアバランシェ・フォトダイオードを含むラマン検出器２１、３１０によって検出する。
ガリウム−ヒ素光電管（ＲＣＡモデルＣ３１０３４もしくはバール・インダストリーズ（Ｂｕｒｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）モデルＣ３１０３４０２）が単光子計数方式で動作するスペックス・モデル（Ｓｐｅｘ Ｍｏｄｅｌ）１４０３ダブル−グレイティング（ｄｏｕｂｌｅ−ｇｒａｔｉｎｇ）分光光度計２１、３１０を含む、ラマン検出ユニット１８、１８０、３００の別の例が米国特許第５，３０６，４０３号に開示されている。励振源１９、３２０は、スペクトラフィジクス社（ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓ）社製の５１４．５ｎｍライン・アルゴン−イオンレーザ１９、３２０、モデル１６６、および６４７．１ｎｍラインのクリプトン−イオンレーザ１９、３２０（イノバ（Ｉｎｎｏｖａ）７０、コヒレント社（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ））を含む。
別の励振源１９、３２０としては、３３７ｎｍの窒素レーザ１９、３２０（レーザ・サイエンス社（Ｌａｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．））および３２５ｎｍのヘリウム−カドミウムレーザ１９、３２０（リコノックス社（Ｌｉｃｏｎｏｘ））（米国特許第６，１７４，６７７号）、発光ダイオード１９、３２０、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ１９、３２０、および／または種々のイオンレーザ１９、３２０および／または色素レーザ１９、３２０が挙げられる。励起ビーム２０、３３０は、帯域通過フィルター（コリオン（Ｃｏｒｉｏｎ））でスペクトル的に純化することができ、６Ｘ対物レンズ（ニューポート社（Ｎｅｗｐｏｒｔ）、モデルＬ６Ｘ）を用いて流路１２および／またはフロースルー・セル１７０、２９０上に集束させる事が出来る。この対物レンズを用いてヌクレオチド１６、１３０を共に励起し、ホログラフィック・ビーム・スプリッタ（カイザー・オプティカル・システムズ社（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）モデルＨＢ６４７−２６Ｎ１８）によりラマン・シグナルを集め、励起ビーム２０、３３０と発光ラマン・シグナルに直角の形をとらせる事が出来る。レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱線を減少させるのにホログラフィック・ノッチフィルター（カイザー・オプティカル・システムズ社（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用する事が出来る。他のラマン検出器２１、３１０としては、レッド増強増倍型電荷結合素子（ｒｅｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システムを装備したＩＳＡＨＲ−３２０分光器（プリンストン・インストルメンツ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）が挙げられる。（マイケルソン干渉計をベースとした）フーリエ変換分光器、電荷注入（ｃｈａｒｇｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）装置、フォトダイオード・アレイ、ＩｎＧａＡｓ検出器、電子増幅型（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ）ＣＣＤ、増倍型ＣＣＤおよび／または光トランジスタ・アレイのような他のタイプの検出器２１、３１０も用いる事が出来る。
当該分野で公知の任意の好適な形態もしくは構成のラマン分光法または関連の技術を、ヌクレオチド１６、１３０の検出に使用する事が出来る。これらのものとしては、標準ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増強ラマン散乱、表面増強共鳴ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導ゲイン（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇａｉｎ）ラマン分光法、ハイパーラマン散乱、モレキュラー・オプティカル・レーザ・エグザミナー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｌａｓｅｒ ｅｘａｍｉｎｅｒ）（ＭＯＬＥ）もしくはラマン・マイクロプローブもしくはラマン・マイクロスコピーもしくは共焦点マイクロスペクトロメトリー、三次元もしくは走査（ｓｃａｎｎｉｎｇ）ラマン、ラマン・サチュレーション分光法、時間分解（ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）共鳴ラマン、ラマン・デカップリング分光法またはＵＶ−ラマン・マイクロスコピーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
情報処理および制御システムならびにデータ解析
本発明の或る実施形態として、核酸配列決定装置１０、１００、２１０は、情報処理システムを含む事が出来る。本明細書で開示した方法および装置１０、１００、２１０は、使用する情報処理システムのタイプについて限定しない。例示的な情報処理システムは、情報を伝達するバスおよび情報を処理するプロセッサを含むコンピュータを組み込む事が出来る。本発明の一実施形態として、このプロセッサは、インテル社（Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐ．）（サンタクララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）、カリフォルニア）から入手可能なペンティアム（登録商標）系のプロセッサから選ぶことができ、これらのものとしては、ペンティアム（登録商標）ＩＩ系、ペンティアム（登録商標）ＩＩＩ系およびペンティアム（登録商標）４系のプロセッサが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の別の実施形態として、当該プロセッサは、セレロン（Ｃｅｌｅｒｏｎ）（登録商標）、アイテニアム（Ｉｔａｎｉｕｍ）（登録商標）もしくはペンティアム（登録商標）・ジオン（登録商標）プロセッサ（インテル社（Ｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐ．）（サンタクララ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ））とする事が出来る。本発明の種々の実施形態として、当該プロセッサは、インテル（Ｉｎｔｅｌ）（登録商標）ＩＡ−３２もしくはインテル（登録商標）ＩＡ−６４アーキテクチャなどのインテル（登録商標）アーキテクチャに基づく事が出来る。あるいは、その他のプロセッサを使用する事も出来る。さらに、情報処理および制御システムは、メモリー、ディスプレイ、キーボードおよび／またはその他のデバイスなど、当該分野で知られているあらゆる周辺デバイスを含む事が出来る。
本発明の特定の実施形態として、検出ユニット１８、１８０、３００は、当該情報処理システムと作動可能なように接続する事が出来る。検出ユニット１８、１８０、３００からのデータは、当該プロセッサによって処理し、データをメモリーに記憶させる事が出来る。また、標準的なヌクレオチド１６、１３０の発光プロフィルに関するデータもメモリーに記憶させる事が出来る。当該プロセッサにより流路１２および／またはフロースルー・セル１７０、２９０内のヌクレオチド１６、１３０からの発光スペクトルを比較して、核酸分子１３から遊離したヌクレオチド１６、１３０のタイプを特定する事が出来る。また、メモリーに核酸分子１３から遊離したヌクレオチド１６、１３０の配列を記憶させる事が出来る。当該プロセッサにより検出ユニット１８、１８０、３００からのデータを解析し、核酸分子１３の配列を決定する事が出来る。また、当該情報処理システムにより、重複シグナル検出時の背景シグナルの除去および「ベース−コーリング（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ）」決定などの標準的なプロシージャを実行する事が出来る。
本明細書に開示した方法は、プログラミングしたプロセッサの制御下に実施する事が出来るが、本発明の別の実施形態として、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、ＴＴＬ論理回路、もしくは特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などのプログラム可能またはハードコードされた論理回路によって、この方法を完全または部分的に実行する事が出来る。さらに、本明細書に開示した方法は、プログラミングした汎用コンピュータ・コンポーネントおよび／またはカスタム・ハードウェア・コンポーネントの任意の組合せによって遂行する事が出来る。
このデータ収集操作の後、通常、データはデータ解析部に伝えられる。この解析操作を容易にするために、通常、検出ユニット１８、１８０、３００により得られたデータは、上記のようなデジタルコンピュータを用いて解析される。一般的に、このコンピュータは、検出ユニット１８、１８０、３００からのデータの受信および記憶、ならびにこの収集データの解析および伝送に適切なようにプログラミングされる。
本発明の或る実施形態として、検出ユニット１８、１８０、３００から得られたデータを解析するのにカスタムデザイン・ソフトウェアパッケージを用いる事が出来る。本発明の別の実施形態として、情報処理システムおよび入手可能な公開のソフトウェアパッケージを用いてデータの解析を行う事が出来る。ＤＮＡ配列の解析用に入手可能なソフトウェアの例としては、ＰＲＩＳＭ（プリズム）（登録商標）ＤＮＡシーケンシング・アナリシス・ソフトウェア（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）、ＣＡ）、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（シーケンチャー）（登録商標）（ジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ＭＩ）、およびウェブサイトｗｗｗ．ｎｂｉｆ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／１．４．１．ｐｈｐのナショナル・バイオテクノロジー・インフォメーション・ファシリティ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）から入手可能な種々のソフトウェアパッケージが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ラマン標識ヌクレオチドを用いた核酸配列の決定：図１に例示した本発明の或る実施形態は、反応チャンバ１１、２２０内の固定用表面１４に結合し、分解反応で分解する個々の１本鎖核酸分子１３について配列決定するものである。本発明のこのような実施形態では、反応チャンバ１１、２２０は、核酸分子１３の非結合末端１７からヌクレオチド１６、１３０を１個ずつ逐次的に除去する１種以上のエキソヌクレアーゼ１５を含む。
ヌクレオチド１６、１３０は、遊離すると、流路１２に沿って移動し、検出ユニット１８、１８０、３００を通過する。検出ユニット１８、１８０、３００は、励起ビーム２０、３３０を放出するレーザなどの励振源１９、３２０を含む。この励起ビーム２０、３３０は、遊離ヌクレオチド１６、１３０と相互作用して電子をより高いエネルギー状態へ励起する。次いで、分光器、単色光分光器もしくはＣＣＤカメラなどの電荷結合素子（ＣＣＤ）のようなラマン分光検出器２１、３１０によって、電子が低エネルギー状態に戻る時に生じるラマン発光スペクトルを検出する。
反応チャンバおよび流路の作製
ボロフロート・ガラス基板（プレシージョン・グラス・アンド・オプティックス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ ＆ Ｏｐｔｉｃｓ）、サンタアナ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ）、カリフォルニア）を濃ＨＦ（フッ化水素酸）溶液で短時間、前エッチングし、洗浄した後、プラズマ助長化学気相蒸着（ＰＥＣＶＤ）系（ＰＥＩＩ−Ａ、テクニクス・ウエスト（Ｔｅｃｈｎｉｃｓ Ｗｅｓｔ）、サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）、カリフォルニア）を用いアモルファスシリコーン犠牲層を蒸着させる。基板は、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）で下塗りし、フォトレジスト（シップレイ（Ｓｈｉｐｌｅｙ）１８１８、モールバラ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ）、ＭＡ）でスピンコートした後、ソフトベークされる。コンタクト・マスク・アライナー（ｃｏｎｔａｃｔ ｍａｓｋ ａｌｉｇｎｅｒ）（クウィンテル社（Ｑｕｉｎｔｅｌ Ｃｏｒｐ．）、サンノゼ（Ｓａｎ ｊｏｓｅ）、カリフォルニア）を用いて、１つ以上のマスクデザインを有するフォトレジスト層を焼き付け、マイクロポジット濃縮現像液（Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）（シップレイ）と水との混合液を用いてその焼き付けたフォトレジストを除去する。次いで、現像した基板をハードベークし、ＰＥＣＶＤ反応器内でＣＦ４（四フッ化炭素）プラズマを用いて、焼き付けたアモルファスシリコーンを除去する。次に、基板を濃ＨＦ液で化学的にエッチングして反応チャンバ１１、２２０および流路１２を作製する。その後、残存フォトレジストをはがし、アモルファスシリコーンを除去する。この方法を用いると、約５０乃至１００μｍ径のマイクロ・チャネルを作製する事が出来る。このマイクロ・チャネルの内側をコーティングして径を狭くするか、ナノリソグラフィ、集束電子ビーム、集束イオンビームまたは集束原子レーザ技術を用いるなどの公知の方法により、さらに径の小さなチャネルを作製する事が出来る。
上記のエッチングした基板に、ダイアモンド・ドリル用ビット（クリスタライト（Ｃｒｙｓｔａｌｉｔｅ）、ウェスタービル（Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ）、オハイオ）で穴をあけてアクセスホールを設ける。完成したチップは、プログラム制御できる真空炉（センチュリオン（Ｃｅｎｔｕｒｉｏｎ）ＶＰＭ、ジェイ・エム・ナイ（Ｊ．Ｍ．Ｎｅｙ）、ユカイパ（Ｙｕｃａｉｐａ）、カリフォルニア）内で２枚の相補的な、エッチングして穴をあけた板を互いに熱的に結合させることによって作製する事が出来る。反応チャンバ１１、２２０および流路１２を組み込んだチップを作製する別の方法の例が米国特許第５，８６７，２６６号および第６，２１４，２４６号に開示されている。本発明の或る実施形態として、エキソヌクレアーゼ１５が反応チャンバ１１、２２０から離脱するのを防止するために、反応チャンバ１１、２２０と流路１２との間に分画分子量２，５００のナイロン・フィルターを挿入する。
核酸調製およびエキソヌクレアーゼ処理
ヒト染色体ＤＮＡは、サンブルックほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）（１９８９年）の方法によって精製される。Ｂａｍ Ｈ１で消化した後、このゲノムＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ピーブルースクリプト）（登録商標）ＩＩファージミド・ベクター（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、ラ・ホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア）の多重クローニング部位中に挿入し、大腸菌中で増やす。アンピシリン含有アガロースプレートで平板培養した後、配列決定のために、単一コロニーを選択して増殖させる。次いで、ヘルパーファージを同時感染させることにより、ゲノムＤＮＡ挿入断片の１本鎖ＤＮＡコピーを回収（ｒｅｓｃｕｅ）する。このＤＮＡは、プロテイナーゼＫ：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液で消化した後、フェノール抽出し、次いで、酢酸ナトリウム（ｐＨ６．５、約０．３Ｍ）と０．８容の２−プロパノールを加えて沈殿させる。このＤＮＡ含有沈殿物をトリス−ＥＤＴＡバッファー中に再懸濁し、使用時まで−２０℃で保存する。アガロースゲル電気泳動によって精製ＤＮＡの単一バンドが示される。
当該ゲノムＤＮＡ挿入断片に隣接して位置させる、既知のピーブルースクリプト（登録商標）配列と相補性のＭ１３順方向プライマは、ミッドランド・サーティファイド・リエージェント社（Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ）、テキサス）から購入する。当該プライマを共有結合により修飾して、このオリゴヌクレオチドの５’末端に結合したビオチン部分を含むようにする。このビオチン基は、（ＣＨ２）６スペーサを介して当該プライマの５’−リン酸に共有結合させる。ビオチン標識プライマは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターから調製したｓｓＤＮＡ鋳型分子とハイブリッド形成させる。次いで、ドーレほか（Ｄｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．）（バイオイメージング（Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ）５：ｐ１３９−１５２、１９９７年）の方法によって、得られたプライマ−鋳型複合体をストレプトアビジン被覆ビーズ１４に結合させる。ＤＮＡを適当に希釈して、単一のプライマ−鋳型複合体を単一のビーズ１４に結合させる。次いで、配列決定装置１０、１００、２１０の反応チャンバ１１、２２０中に、単一のプライマ−鋳型複合体を含むビーズ１４を挿入する。
当該プライマ−鋳型複合体は、改変Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）、クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）、オハイオ）と共にインキュベートする。この反応混液は、非標識のデオキシアデノシン−５’三リン酸（ｄＡＴＰ）およびデオキシグアノシン−５’三リン酸（ｄＧＴＰ）、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン−５’三リン酸（ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ）ならびにローダミン標識デオキシシチジン−５’三リン酸（ローダミン−ｄＣＴＰ）を含む。これを３７℃で２時間重合反応させる。ジゴキシゲニンおよびローダミン標識核酸１３を合成させた後、この標識核酸１３から当該鋳型ストランドを分離し、鋳型ストランド、ＤＮＡポリメラーゼおよび組み込まれなかったヌクレオチドを反応チャンバ１１、２２０から洗い出す。
反応チャンバ１１、２２０にエキソヌクレアーゼＩＩＩ １５を添加することによってエキソヌクレアーゼ１５作用を開始させる。この反応混液は、３７℃、ｐＨ８．０に維持される。核酸１３の３’末端１７から遊離したヌクレオチド１６、１３０は、流路１２に沿ったマイクロフルイデックの流れによって移送され、検出ユニット１８、１８０、３００を通過する。
標識ヌクレオチドの検出
検出ユニット１８、１８０、３００は、レーザ１９、３２０およびラマン検出器２１、３１０を含む。励起ビーム２０、３３０は、近赤外波長（７５０乃至９５０ｎｍ）のチタン−サファイアレーザ１９、３２０（スペクトラ−フィジックス社（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）のツナミ（Ｔｓｕｎａｍｉ））、または７８５ｎｍもしくは８３０ｎｍのガリウム・アルミニウム・ヒ素ダイオードレーザ（プロセス・インストルメンツ社（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のＰＩ−ＥＣＬシリーズ）によって発生させる。パルス・レーザビーム２０、３３０もしくは連続ビーム２０、３３０を用いる事が出来る。励起ビーム２０、３３０は、ダイクロックミラー（カイザー・オプティカル社（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ）のホログラフィック・ノッチフィルターまたはクロマ社（Ｃｈｒｏｍａ）もしくはオメガ・オプティカル社（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ）の干渉フィルター）によって集束ビームに対し共線的な形に反射させる。反射したビームは、顕微鏡対物レンズ（ニコン（Ｎｉｋｏｎ）ＬＵシリーズ）を通過し、標的ヌクレオチド１６、１３０が位置するマイクロ−ウェル流路（マイクロ−チャネル）１２もしくはフロースルー・セル１７０、２９０上に集束する。この標的ヌクレオチド１６、１３０からのラマン散乱光は、同じ顕微鏡対物レンズによって集められ、当該ダイクロックミラーを通ってラマン検出器２１、３１０に達する。ラマン検出器２１、３１０は、集束レンズ、分光器、およびアレイ検出器を含む。当該集束レンズは、この分光器の入射スリットを通してラマン散乱光を集束させる。当該分光器（ロッパーサイエンティフィック社（ＲｏｐｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））は、この光をその波長によって分散させる回析格子を含む。分散された光の像は、アレイ検出器（ロッパーサイエンティフィック社の背面受光型深空乏型（ｂａｃｋ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ ｄｅｅｐ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）ＣＣＤカメラ）上に捕捉させる。当該アレイ検出器は、コントローラ回路に接続し、この回路は、データを伝送し、検出器２１、３１０の機能を制御するコンピュータに接続する。
ラマン検出器２１、３１０は、この検出器２１、３１０を通過するｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ローダミン−ｄＣＴＰおよびジゴキシゲニン−ｄＵＴＰの単一ヌクレオチド１６、１３０を検出し同定する事が出来る。標識ヌクレオチド検出の時間経過に関するデータを集計、分析して核酸１３の配列を得る。
ナノ粒子への共有結合を利用した核酸配列決定：図２に本発明の別の例示的な実施形態を示す。エキソヌクレアーゼ１５の作用により核酸１３からヌクレオチド１６、１３０を遊離させる。本発明の或る実施形態では、ヌクレオチド１６、１３０は標識しない。このような実施形態は、プライマおよびポリメラーゼを用いて標識核酸を相補性ストランド１３に組み込むものではない。むしろ、任意の器官、組織および／または細胞サンプルから直接精製した、または公知のクローニング方法により得られた核酸１３について直接配列決定を行う。本発明の或る実施形態として、１本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ１３の単一分子を表面１４に結合させた後、エキソヌクレアーゼ１５で処理する事が出来る。遊離したヌクレオチド１６、１３０は、流路１２に沿って移動する。この流路１２は、マイクロフルイデック・チャネル１１０、１６０、２６０、２８０に隣接するか、これと同一とする事が出来る。
反応チャンバ１１、２２０からのヌクレオチド１６、１３０は、金および／または銀ナノ粒子１４０と混合する。銀ナノ粒子１４０は、リー（Ｌｅｅ）とマイセル（Ｍｅｉｓｅｌ）（ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．）８６：ｐ３３９１−３３９５、１９８２年）の方法によって調製する。金ナノ粒子１４０はポリサイエンシズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）（ウォリントン（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、ペンシルバニア）から購入する。５、１０、１５、２０、４０および６０ｎｍサイズの金ナノ粒子１４０がポリサイエンシズ社から入手可能である。本実施例では、６０ｎｍの金ナノ粒子１４０を使用するが、これに限定されるものではない。
表面を修飾したナノ粒子１４０は、ヌクレオチド１６、１３０に接触させる前に、反応性リンカー化合物である３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）などのシランでコーティングする。ＧＯＰは、末端に高度に反応性のエポキシド基を含む。ナノ粒子１４０に対し、ヒドロキシル基を含むように修飾することによりＧＯＰを共有結合させる事が出来る。このシラン処理したナノ粒子１４０をヌクレオチド１６、１３０と混合してこのヌクレオチド１６、１３０と共有結合を形成させる。ヌクレオチド−ナノ粒子複合体１５０は、フロースルー・セル１７０、２９０を通過し、ラマン検出ユニット１８、１８０、３００を利用するＳＥＲＳ、ＳＥＲＲＳおよび／またはＣＡＲＳによって特定する事が出来る。ヌクレオチド１６、１３０がナノ粒子１４０に極めて近接するため、ラマン・シグナルが大きく増強され、フロースルー・セル１７０、２９０を通過する単一のヌクレオチド１６、１３０を検出することが可能になる。
核酸配列決定用装置：図３は、本発明の別の例示的な実施形態を示すものである。ＤＮＡ配列決定装置１０、１００、２１０は、流入チャネル２３０および流出チャネル２４０と流体連通している反応チャンバ１１、２２０を含む。流体の移動は、１つ以上のバルブ２５０を用いることによって制御する事が出来る。また、マイクロフルイデック・チャネル１３０、２６０も、反応チャンバ１１、２２０と流体連通している。エキソヌクレアーゼ１５の作用によって１つ以上の核酸１３から遊離したヌクレオチド１６、１３０は、マイクロフルイデック・チャネル１１０、２６０を通って反応チャンバ１１、２２０から出て行く。このヌクレオチド１６、１３０は、マイクロフルイデック・チャネル１１０、２６０と流体連通しているナノ粒子チャネル１２０、２７０を通って移動するナノ粒子１４０と混合される。ヌクレオチド１６、１３０のナノ粒子１４０への共有結合は、結合チャネル１６０、２８０内で起こる。この共有結合したヌクレオチド−ナノ粒子複合体１５０は、フロースルー・セル１７０、２９０を通過し、このセルでヌクレオチド１６、１３０がラマン検出ユニット１８、１８０、３００によって同定される。この検出ユニット１８、１８０、３００は、レーザ１９、３２０およびラマン検出器２１、３１０を含む。このレーザは、フロースルー・セル１７０、２９０内でヌクレオチド１６、１３０を励起する励起ビーム２０、３３０を放出する。励起されたヌクレオチド１６、１３０は、ラマン・シグナルを発し、これをラマン検出器２１、３１０が検出する。
本発明の或る実施形態として、ナノ粒子１４０はリサイクル・チャンバ３４０で回収する事が出来る。このナノ粒子は、例えば、酸性溶液で化学的に処理した後、洗浄して結合ヌクレオチド１６、１３０、リンカー化合物およびその他の結合もしくは吸着分子を除去する。ナノ粒子１４０は、リサイクル・チャネル３６０を介してナノ粒子貯蔵部位３７０へ再循環させる事が出来る。本発明の或る実施形態として、ナノ粒子１４０は、リサイクル・チャネル３６０および／またはナノ粒子貯蔵部位３７０内で、ＧＯＰなどのリンカー化合物によりコーティングする事が出来る。廃液は、廃液チャネル３５０を介してリサイクル・チャンバ３４０から除去する。
本明細書に開示し、特許請求した方法および装置は全て、本明細書の開示内容と照らし合わせて不当に負担の厳しい実験を行わなくても、作製し、実施する事が出来る。本特許請求の範囲に記載した対象の概念、意義および範囲から逸脱することなしに、本明細書に開示した方法および装置に変更を加える事が出来ることは、当業者に明瞭に理解されよう。より詳細には、化学的のみならず生理学的にも関連する物質を本明細書に記載した物質に置き換えることができ、その際、同一もしくは同様な結果が得られるであろうことは、明瞭に理解されよう。当業者には明白なこのような類似の代替および修正は全て、本特許請求の範囲に記載された対象の意義、範囲および概念に含まれると判断される。
ラマン標識に共有結合させたヌクレオチド１６を用いる、核酸１３の配列決定のための例示的な装置１０（縮尺は一定の比率になっていない）および方法を示す。 遊離ヌクレオチド１３０をナノ粒子１４０に共有結合させた後、表面増強ラマン分光法により検出する、核酸１３の配列決定のための例示的な装置１００（縮尺は一定の比率になっていない）および方法を示す。 核酸１３の配列決定のための別の例示的な装置２１０（縮尺は一定の比率になっていない）を示す。

Claims (30)

  1. ａ）少なくとも１つの核酸の一端からヌクレオチドを逐次的に除去する段階と、
    ｂ）各ヌクレオチドを少なくとも１つのナノ粒子に結合する段階と、
    ｃ）前記ヌクレオチドを同定する段階と、
    ｄ）前記核酸の配列を決定する段階と
    を含む方法。
  2. 前記核酸が表面に結合されている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ナノ粒子が１種以上のリンカー化合物で修飾されている、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ヌクレオチドが前記リンカー化合物に共有結合している、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ヌクレオチドが、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）および／またはコヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）によって同定される、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ナノ粒子が金および／または銀を含む、請求項１に記載の方法。
  7. 各ヌクレオチドが単一ナノ粒子もしくはナノ粒子凝集体に結合している、請求項６に記載の方法。
  8. 前記核酸分子から前記ヌクレオチドを分離する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
  9. 前記ヌクレオチドをレーザにより励起する段階を更に含む、請求項５に記載の方法。
  10. 前記ヌクレオチドの同定に電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いる、請求項９に記載の方法。
  11. 各ヌクレオチドの同定、および各ヌクレオチドが同定された時間を記録する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ヌクレオチドを前記核酸から除去するのにエキソヌクレアーゼを使用する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ナノ粒子の径が２ｎｍ乃至２μｍである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記ナノ粒子の径が約１００ｎｍである、請求項１３に記載の方法。
  15. ａ）ラマン標識に結合しているヌクレオチドを入手する段階と、
    ｂ）標識ヌクレオチドを含む核酸を合成する段階と、
    ｃ）前記核酸の一端からヌクレオチドを除去する段階と、
    ｄ）ラマン分光法によりヌクレオチドを同定する段階と、
    ｅ）前記核酸の配列を決定する段階と
    を含む方法。
  16. 前記核酸から除去されたヌクレオチドを金属被覆チャネルに通過させる段階を更に含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 各タイプのヌクレオチドが識別可能なラマン標識で標識される、請求項１５に記載の方法。
  18. ピリミジンヌクレオチドのみがラマン標識で標識される、請求項１５に記載の方法。
  19. （ｉ）少なくとも１種の鋳型核酸分子を入手する段階と、
    （ｉｉ）前記鋳型核酸分子をプライマとハイブリッド形成する段階と、
    （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを添加して前記核酸を合成する段階と
    を更に含む、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記ヌクレオチドがエキソヌクレアーゼの作用により前記核酸から除去される、請求項１５に記載の方法。
  21. エキソヌクレアーゼの作用を受ける核酸が一度に１個のみである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記標識ヌクレオチドが、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）および／またはＣＡＲＳによって同定される、請求項１５に記載の方法。
  23. 前記ヌクレオチドをナノ粒子に結合させる段階を更に含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ａ）反応チャンバと、
    ｂ）前記反応チャンバと流体連通している第１のチャネルと、
    ｃ）前記第１のチャネルと流体連通している第２のチャネルと、
    ｄ）前記第１および前記第２のチャネルと流体連通しているフロースルー・セルと、
    ｅ）前記フロースルー・セルに作動可能なように結合している検出ユニットと
    を備える装置。
  25. 前記検出ユニットがラマン検出器を備える、請求項２４に記載の装置。
  26. 前記検出ユニットがレーザおよびＣＣＤカメラを備える、請求項２５に記載の装置。
  27. 前記第１のチャネルがヌクレオチドを含み、前記第２のチャネルがナノ粒子を含む、請求項２４に記載の装置。
  28. 前記ヌクレオチドが前記ナノ粒子に共有結合している、請求項２７に記載の装置。
  29. 前記ヌクレオチドが前記チャネル内で前記ナノ粒子と共有結合するようになされる、請求項２８に記載の装置。
  30. 前記ヌクレオチドが前記ナノ粒子へ共有結合することによりラマン・シグナルが増強される、請求項２８に記載の装置。
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