TW200307753A - Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering - Google Patents

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Description

200307753 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明之方法和裝置係關於分子生物學和基因組的領 域。更特定而言，該方法和裝置係關於核酸定序。 【先前技術】 以極長分子的脫氧核糖核酸（DNA)之形式儲存遺傳資 訊，組織化至染色體内。人類基因組含有大約3兆個鹼基的 DNA序列。該DNA序列資訊決定每個個體的多種特徵。許 多普通的疾病，至少部分是以在DNA序列中的變化為基礎。 判定人類基因組的完整序列，已經提供了確認這類疾病 之遺傳基礎的根據。然而，大量的工作仍待進行，以便確 認與每種疾病有關之遺傳變化。這將需要在顯露出每種這 類疾病的個體或家族中，定出部分染色體的DNA序列，以 便確認在DNA序列中助長該疾病的獨特改變。亦可定序核 糖核酸（RNA)，一種進行中之遺傳資訊的中間分子，以便確 認各種疾病的遺傳基礎。 現存的核酸定序方法，是以檢測以螢光標示的核酸為基 礎，其已經藉著尺寸來區分，但受限於可進行定序之核酸 的長度。通常一次僅可判定500至1，000個鹼基的核酸序列。 這比DNA之功能單位，稱為基因的長度短很多，它可能是 數萬或甚至是數十萬個鹼基長。使用目前的方法，判定完 整的基因序列需要產生許多基因副本，切成重疊的片段並 定序之，隨後可將重疊的DNA序列裝配成完整的基因。該 過程是辛苦、昂貴、無效率且耗費時間的。 83951 200307753 【發明内容】 所揭示之方法和裝置，可用來快速、自動地定序核酸丨3。 在本發明特定的具體實施例中，方法和裝置1〇、1〇〇、21() 適合用來獲得長度為1，000個以上、2,000個以上、5 〇〇〇個以 上、10,000個以上、20,000個以上、50,000個以上、100 〇〇〇 個以上，或甚至更多個鹼基的極長核酸分子丨3之序列。勝 過先前技藝之方法的優點，包括在一次定序的行程中，閲 讀長核酸13序列的能力，獲得序列資料的速度較快，降低 足序的成本，且在每單位序列資料所需之操作時間上是較 有效率的。 在本發明的各種具體實施例中，可在單一定序行程的期 間内，使用一個核酸分子13，獲得序列資訊。在本發明其 他的具體實施例中，可平行或連續地定序核酸分子13的多 個副本，證實核酸序列或獲得完整的序列資料。在本發明 另外的具體實施例中，可定序核酸分子13及其互補股兩 者’證實序列資訊的精確性。 在本發明的某些具體實施例中，待定序之核酸13為 DNA、雖然企圖使其也能同樣地定序其他的核酸13，包括 RNA或合成的核苷酸類似物。以下的詳細說明含有極多特 疋的細即，以便對本發明揭示之具體實施例，提供更徹底 的瞭解…：而，熟讀此蟄者將瞭解本發明之具體實施例可 能未實行這些特定的細節。在其他的例子中，在本文中不 再秤細說明此項技藝中已熟知的設備、方法、程序和個別 組份。 83951 200307753 在本發明的各種具體實施例中，在圖1中舉例說明，可將 核答酸與拉曼標記共價附接，以便增強由表面增強之拉曼 光譖學（SERS)、表面增強之共振拉曼光譜學（SERRS)，相干 反-斯托克斯拉曼光譜學（CARS)，或其他已知之拉曼檢測技 術檢測的拉曼訊號。在本發明的一些具體實施例中，可使 用標準核酸聚合技術，將這類已標示的核甞酸併入新近合 成的核酸股13内。通常，容許特定序列的引子，或一或多 個隨機引子與模板核酸雜交。當加入聚合酶和已標示之核 知I時’拉曼標示之核甞酸便與引子的3，端附接，結果形成 在序列中與該模板互補的已標示之核酸股13。 在合成之後，可利用一或多個核酸外切酶15消化已標示 <核酸股13。熟諳此藝者將了解所揭示之方法不限於核酸 外切酶15本身，但可利用任何酵素或其他能夠從核酸13的 至少一端，連續移除核甞酸16、13〇的試劑。在本發明的某 些具體實施例中，從已標示核酸13的3，端17，連續釋放出拉 曼標示的核甞酸16、130。在與已標示之核酸13分開之後， 藉著檢/則元件18、180、300檢測拉曼標示之核甞酸16、13〇。 使用在連續檢測之已標示核甞酸16、130上的資訊，編輯已 標示核酸13的序列，其是與模板股之序列互補的。 在本叙明的一些具體實施例中，可在以核酸外切酶15處 、如先將已標示之核酸股13與未標示之模板股和未併 、核知I刀開。這可藉著，例如使用已經與表面14交聯， 或含有可與表面14附接之生物素或類似基團的引子來完 成以生物素標示之引子，可附接於已經利用抗生物素蛋 83951 200307753 白或鏈黴菌抗生物素蛋白共價修改的表面14上。可藉著已 知的技術，將已標示之核酸13與未標示之模板股分開。 在本發明的某些具體實施例中，可將四種核苷酸分別附 接在可區別的拉曼標記上。在本發明其他的具體實施例 中，可僅標示嘌呤核甞酸（胞嘧啶及/或胸腺嘧啶及/或尿嘧 哫）。在一個代表性的具體實施例中，已標示之核苷酸可包 括生物素-標示之脫氧胞甞-5，-三磷酸（生物素_dCTp)和毛地 買毒苷_標示之脫氧尿甞_5，_三磷酸（毛地黃毒甞_dUTp)。 在本發明另外的具體實施例中，在圖2中舉例說明，可藉 著將核苷酸16、130與奈米顆粒14〇共價附接，增強拉曼訊 號。在本發明的某些具體實施例中，這類附接將伴隨著以 核酸外切酶15處理核酸13,如同在圖丨中揭示的。在本發明 的一些具體實施例中，該奈米顆粒14〇是銀或金，但亦期待 已知可^供表面增強之拉曼訊號的其他類型之奈米顆粒 140。奈米顆粒140可能是單一的奈米顆粒140,奈米顆粒14〇 的聚集體，或單一和凝集之奈米顆粒14〇的一些混合物。在 本發明的某些具體實施例中，可使用交聯劑化合物將核苷 故16 與奈米顆粒140附接。在本發明的各種具體實施 例中’父聯劑化合物的長度可以在1至1 〇〇毫微米（奈 米）（nm)、2至 90 nm、3 至 8〇 nm、4至 7〇 nm、5至 6〇 nm、1〇 土 50 nm、15至40 nm或20至30 nm之間。在本發明的某些具 體實施例中，交聯劑化合物的長度可以在1至5〇、1至5、2 土 10、10至20 nm之間，或大約5 nm。在本發明其他的具體 實施例中，可使用交聯劑化合物，將二或多個奈米顆粒140 83951 200307753 附接在一起。 在共價附接之後，可使奈米顆粒-核甞酸複合物150通過 流通池170、290，在那裏藉著SERS、SERRS及/或CARS檢 測它們，使用檢測元件18、180、300。在本發明一些另外 的具體實施例中，核苷酸16、13 0可以是未經修改的，而在 本發明其他的代替具體實施例中，可利用一或多個拉曼標 記修改核苷酸16、130。在本發明的某些具體實施例中，將 每種類型的核甞酸16、130附接到可區別的拉曼標記上。在 其他的具體實施例中，可僅標示嘧淀16、130。 定義 當在本文中使用π—”時，可意指一或一個以上的項目。 當在本文中使用π以可操作之方式偶聯”時，意指在二或 多個元件之間，有功能上的交互作用。例如，若安置檢測 器21、310，使其得以在分析物，像是核苷酸16、130通過 流通池170、290時檢測它們，則該檢測器21、3 10便可能是 ’’以可操作之方式偶聯”流通池170、290的。 ’’核酸π 13包括DNA、RNA、單股、雙股或三股的，以及 其任何化學修改。期待核酸13的任何修改。當在本文中使 用時，可藉字首’’ssn代表單股的核酸13，藉字首’’ds’’代表雙 股的核酸13，並藉字首"tsM代表三股的核酸13。 ’’核酸’’ 13可具有幾乎任何的長度，從10、20、30、40、 50、60、75、100、150、200、250、300、400、500、600、 700 、 800 > 900 、 1000 ^ 1500 > 2000 > 2500 - 3000 - 3500 ^ 4000^ 4500^ 5000 > 6000 > 7000 > 8000- 9000- 10,000 > 15?000 ^ 83951 -10- 200307753 20.000、 30,〇〇〇、40,000、50,〇〇〇、75,000、1 〇〇,〇〇〇、15〇,〇0〇、 200.000、 500,000、1，_，000、l55〇〇,〇〇〇、2 〇〇〇，_、5，_，_ 或甚至更多個驗基，高達全長的染色體DNA分子13。 核甞’’ 16、130是包括嘌呤和嘧啶鹼基的分子（腺嘌呤 •’A”，胞嘧啶_”c”，鳥嘌呤_”G”，胸腺嘧啶々”，或尿嘧啶 U )或其任何化學修改或結構類似物，與諸如脫氧核糖、 核糖之類的戊糖，或戊糖之衍生物或類似物共價附接。 核知酸’’ 16、130意指進一步包括至少一個與戊糖共價附 接之磷酸鹽基團的核甞16、13〇。在本發明的一些具體實施 例中，核苷酸16、13〇是核糖核苷單嶙酸16、13〇，或脫氧 核糖核苷單磷酸16、130，雖然期望能夠產生並檢測核甞二 瑪酸或二磷酸16、130。在本發明其他的具體實施例中，可 從核酸分子13中釋放出核苷16、130。期待可在核苷酸16、 130的結構中，進行各種取代或修改，只要它們能夠藉著聚 口酶活性而被併入核酸13内，並藉著核酸外切酶15或相等 試劑釋放即可。在涉及將一或多個標記與一或多種類型之 核菩酸16、130附接的本發明之具體實施例中，可將標記附 接至】核甘故16、130的任何邵分，像是驗基、糖或磷酸鹽基 團’或其類似物，只要該標記不干擾核酸13的聚合作用及/ 或消化作用即可。名詞”核苷酸”和”已標示之核甞酸”，包括 但不限於所有非-天然的核甞酸複合物，像是核甞酸_奈米顆 &複合物或核甞酸-標記複合物。 拉曼標記”可以是任何能夠產生可檢測之拉曼訊號的有 機或典機分子、原子、複合物或結構，包括但不限於合成 83951 -11 - 200307753 的分子、染料、天然存在的色素，像是藻紅蛋白、有機奈 米結構，像是C60、巴克球（buckyballs)和奈米碳管（carb〇n nanotubes)，金屬奈米結構，像是金或銀奈米顆粒或奈米棱 晶，以及奈米-規模的半導體，像是量子點（quantum dots)。 在下文中描述許多拉曼標記的實例。熟諳此藝者將了解這 類實例不是限制性的，且’’拉曼標記’’包括任何此項技藝中 已知，可藉著拉曼光譜學檢測的有機或無機原子、分子、 化合物或結構。 核酸 可藉著此項技藝中已知的任何技術，來製備欲定序之核 酸分子13。在本發明的某些具體實施例中，核酸13是天然 存在的DNA或RNA分子。幾乎任何天然存在的核酸13，均 可藉著所揭示之方法製備並定序，包括但不限於染色體、 粒線體和葉綠體DN A，以及核糖體RN A、轉移RN A、核不 均一 RNA和信使RNA (mRNA)。製備和分離各種形式之核酸 13的方法是已知的。（參見，例如Guide to Molecular Cloning Techniques.編輯 Berger 和 Kimmel，Academic Press，New York，NY，1987; Molecular Cloning： A Laboratory Manual.第 2版，編輯 Sambrook，Fritsch和 Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在提及之參考文獻中 揭示的方法僅為代表性的，並可使用此項技藝中已知的任 何變化。在其中欲定序單股DNA (ssDNA) 13的案例中，可 藉著任何已知的方法，從雙股DNA (dsDNA)製備ssDNA 13。這類方法可能涉及加熱dsDNA，並容許股分開，或可 83951 -12- 200307753 另行涉及藉著已知的擴大或複製方法，像是選殖到M13 内，從dsDNA來製備ssDNA 13。可使用任何這類已知的方 法，製備 ssDNA或 ssRNA 13。 雖然本發明的某些具體實施例，係關於製備天然存在的 核酸13，但幾乎可作為核酸外切酶15或相等試劑之受質的 任何類型的核酸13，都有可能將其定序。例如，可定序藉 著各種擴大技術製備的核酸13，像是聚合酶連鎖反應 (PCRtm)擴大作用。（參見美國專利第4,683,195號、4,683,2〇2 號和4,800，159號）。或者，可將欲定序的核酸13選殖到標準 載體内，像是質體、黏接質體、BACs (細菌的人造染色體） 或YACs (酵母菌的人造染色體）。（參見，例如Berger和 Kimmel，1987; Sambrook等人，1989)。可從載體 DNA 中，分 離核酸插入物13，例如，藉著以適當的核酸限制内切酶切 下，接著進行瓊脂糖凝膠電泳。分離插入之核酸13的方法 為已熟知的。 單一核酸分子的分離 在本發明的某些具體實施例中，欲定序之核酸分子13是 ssDNA或ssRNA的單一分子。可使用各種選擇和操縱單一核 酸分子13的方法，例如流體動力學聚焦、顯微操縱器偶聯、 光學截留，或這些及類似方法的組合（參見，例如Goodwin 等人，1996，Acc. Chem. Res. 29.607-619;美國專利第 4,962,037 號；5,405,747 號；5,776,674 號；6，136,543 號； 6,225,068號）。 在本發明的某些具體實施例中，可使用微流體動力學 83951 -13 - 200307753 (microfluidics)或奈米流體動力學（nanofluidics)來分類，並 分離核酸分子13。可使用流體動力學操縱核酸13的移動， 至微通道、微毛細管或微孔内。在本發明的一個具體實施 例中，可使用流體動力學聚焦，移動核酸分子13跨越梳狀 結構’分開單一的核酸分子13。一旦已經分開核酸分子13， 便可使用流體動力學聚焦，將分子13置於反應室11、22〇 内。亦可使用熱勢或電位、壓力或真空，提供操縱核酸13 的動力。在本發明代表性的具體實施例中，為了定序而操 縱核酸13，可能涉及通道阻斷設計，合併顯微製造之 (microfabricated)通道和整合凝膠材料的使用（參見美國專 利第 5,867,266號和 6,214,246號）。 在本發明另一個具體實施例中，可在與固定表面14偶聯 之則，先稀釋含有核酸分子13的試樣。在本發明代表性的 具體實施例中，該固定表面14可以是磁性或無磁性小珠， 或其他不同結構元件之形式。在適當的稀釋下，每個小珠 14將具有與0或丨個核酸分子13結合的統計或然性。可使用 例如，螢光染料和流動細胞分類或磁性分類，確認與丨個核 酸分子13附接的小珠14。依據小珠14和核酸分子13的相對 尺^和均一性，有可能使用磁性濾器和質量分離，分開含 =單-結合之核酸分子13的小珠14。在本發明其他的具體 實施例中，可定序與單-小珠或其他固定表面_接的多 個核酸13。 在本發明另外的具體實施例中，可使用塗覆纖維尖㈣ 產生可供定序的單-分子核酸13 (參見美國專利第 83951 -14- 200307753 6,225,068號）。在另外的代替具體實施例中，可製備含有抗 生物素蛋白或其他交聯劑之單一分子的固定表面14°可將 這類的表面14，附接欲定序之單一生物素基化的核酸分子 13。該具體實施例並不限於抗生物素蛋白-生物素結合系 統，並可改編為任何已知的偶聯系統。 在本發明另外的代替具體實施例中，可使用光學截留來 操縱欲定序的單一分子核酸分子13 (例如美國專利第 5，776,674號）。代表性的光學截留系統，可購自Cell Robotics， Inc. (Albuquerque, NM) - S+L GmbH (Heidelberg, Germany) 和 P.A.L.M. Gnbh (Wolfratshausen，Germany) o 拉曼標記 本發明的某些具體實施例，可能涉及將標記附接到核甞 酸16、130上，而有助於藉著檢測元件18、180、300來測量 它們。可供拉曼光譜學使用之該標記的非-限制性實例，包 括TRIT (四甲基若丹明異硫醇）、NBD (7-硝苄-2·哼_1，3_二 咬）、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、異苯二 甲酸、甲酚堅牢紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對-胺基苯甲酸、 赤蘚紅、生物素、毛地黃毒甞、5-羧基-4，，5’-二氯-2，,7，-二甲 氧基螢光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯螢光素、5-羧基螢光素、 5·羧基若丹明、6-羧基若丹明、6_羧基四曱基胺基酞菁、偶 氮甲驗、花青、黃嘌+、琥珀酿螢光素和胺基吖淀。可從 商業來源（例如Molecular Pr〇bes，Eugene, OR)獲得這些及其 他的拉曼標記。 多環芳香族化合物可能具有拉曼標記的功能，如同此項 83951 -15 · 200307753 技藝中已知的。可供本發明之特殊具體實施例使用的其他 標記，包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在本 發明的某些具體實施例中’可使用奈米碳管作為拉曼標 記。在拉曼光譖學中使用的標記是已知的（例如美國專利第 5,306,403號和6，174,677號）。熟讀此藝者將了解所使用的拉 曼標記，應產生可區別的拉曼光譜，並專一地與不同種類 的核替酸16、13 0結合或缔合。 可直接將標記與核替酸16、130附接，或可經由各種交聯 劑化合物附接。在下文中進一步描述在所揭示之方法中使 用的交聯劑和交聯劑化合物。或者，將核甞酸與得自標準 商業來源（例如 Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis， IN; Promega Corp·，Madison，WI; Ambion，Inc·，Austin，TX; Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的拉曼標記共 價附接。可買到含有經過設計，可與其他分子，像是核甞 酸16、130共價附接之反應基團的拉曼標記（例如Molecular Probes，Eugene，OR)。製備已標示之核嘗酸，並將其併入核 酸13内的方法是已知的（例如美國專利第4,962,037號， 5,405,747號；6，136,543號；6,210,896號）° 奈米顆粒 本發明的某些具體實施例涉及奈米顆粒140的使用，以便 增強獲自核甞酸16、130的拉曼訊號。在本發明的一些具體 實施例中，奈米顆粒140是銀或金奈米顆粒140，雖然可使用 任何能夠提供表面增強拉曼光譜學（SERS)訊號的奈米顆粒 140。在本發明另外的具體實施例中，奈米顆粒140可以是 83951 -16- 200307753 奈米棱晶（Jin等人，Science 294:1902-3, 2001)。在本發明的 各種具體實施例中，可使用直徑在1 nm到2微米（μπι)之間的 奈米顆粒140。在本發明另外的具體實施例中，期待直徑在 2 nm至 1 μπι、5 nm至 500 nm、10 nm至 200 nm、20 nm至 100 nm、30 nm至 80 nm、40 nm至 70 nm，或 50至 60 nm之間的奈 米顆粒140。在本發明的某些具體實施例中，期待平均直徑 為10至5 0 nm、5 0至10 0 nm，或大約10 0 nm的奈米顆粒14 0。 奈米顆粒140的形狀可以是約略球狀的、類似-棒狀的、銳 利的、有刻面的或尖的，雖然可使用任何形狀或不規則形 狀的奈米顆粒140。製備奈米顆粒的方法是已知的（例如美 國專利第 6,054,495 號；6,127，120 號；6，149,868 號；Lee和 Meisel，J· Phys. Chem. 86:3391-3395, 1982; Jin等人，2001)。 亦可自商業來源（例如Nanoprobes Inc·，Yaphank，NY; Polysciences，Iric·，Warrington，PA)，獲得奈米顆粒。 在本發明的某些具體實施例中，奈米顆粒140可以是單一 的奈米顆粒140，及/或奈米顆粒140的隨機聚集體（膠體的奈 米顆粒140)。在本發明其他的具體實施例中，可交聯奈米 顆粒140，產生奈米顆粒140的特殊聚集體，像是二聚體、 三聚體、四聚體或其他聚集體。本發明的某些替代具體實 施例，可使用不同尺寸之聚集體的異質混合物，而其他的 替代具體實施例則可使用奈米顆粒140的均質族群。在本發 明的某些具體實施例中，聚集體含有選定數目的奈米顆粒 140 (二聚體、三聚體等等），可藉著已知的技術增強或純化 之，像是在蔗糖溶液中的超離心。在本發明的各種具體實 83951 -17- 200307753 施例中，期待尺寸約為100、200、300、400、500、600、 700、800、900至1000 nm，或更大的奈米顆粒140。 交聯奈米顆粒140的方法是已知的（例如Feldheim，’’使用 分子橋組裝金屬奈米顆粒陣列（Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges)11 The Electrochemical Society Interface, Fall，2001，第22_25頁）。可使用，例如雙重功能， 攜帶終端硫醇或硫氫基團的交聯劑化合物，交聯金奈米顆 粒140。當與金奈米顆粒140反應時，可藉著交聯劑的長度 分開形成奈米顆粒140二聚體的交聯劑。在本發明其他的具 體實施例中，可使用具有三、四或更多硫醇基團的交聯劑， 同時附接多個奈米顆粒140 (Feldheim，2001)。對交聯劑化合 物使用過量的奈米顆粒140，防止多重交聯和奈米顆粒140 沉澱的形成。可藉著此項技藝中已知的標準合成方法，形 成銀奈米顆粒140的聚集體。 在本發明另外的具體實施例中，可修改奈米顆粒140，使 其在與交聯劑化合物附接之前，含有各種反應基團。經過 修改的奈米顆粒140是市售的’像是得自Nanoprobes，Inc. (Yaphank，NY)的Nanogold⑧奈米顆粒140。可使每個奈米顆 粒140附接單一或多個順丁烯二醯亞胺、胺或其他基團，而 獲得Nanogold®奈米顆粒140。亦可獲得帶正電或帶負電形 式的Nanogold®奈米顆粒140。可將這類經過修改的奈米顆 粒140，與各種已知的交聯劑化合物附接，提供奈米顆粒140 的二聚體、三聚體或其他聚集體。 不限制所使用之交聯劑化合物的類型，只要它結果產生 83951 -18 - 200307753 奈米顆粒140的小聚集體，不會在溶液中沉澱即可。在本發 明的一些具體實施例中，交聯劑基團可包括苯乙炔聚合物 (Feldheim，2001)。或者，交聯劑基團可包括聚四氟乙烯、 聚乙缔吨洛燒酮、聚苯乙烯、聚丙晞、聚丙烯醯胺、聚乙 缔’或其他已知的聚合物。所使用之交聯劑化合物不限於 聚合物’亦可包括其他類型的分子，像是矽烷類、鏈烷類、 付生之碎燒類或衍生之鏈燒類。 在本發明的各種具體實施例中，可將奈米顆粒14〇與核甞 酸16、130共價附接。在本發明另外的具體實施例中，可將 核菩酸16、130直接與奈米顆粒14〇附接，或可將其與交聯 劑化合物附接，再使其以共價或非共價之方式，與奈米顆 粒140結合。在本發明的這類具體實施例中，不願使二或多 個奈米顆粒140交聯在一起，可使用交聯劑化合物將核甞酸 16、130附接至奈米顆粒14〇或奈米顆粒聚集體。在本發明 特足的具體實施例中，可以衍生之矽烷類塗佈奈米顆粒 140。可使用標準方法，將這類經過修改的矽烷類與核首酸 16、130共價附接。亦可使用在下文中討論，使核酸13與表 面附接的各種已知方法，將核苷酸16、i3〇附接至奈米顆 粒140上。預期用來附接核甞酸16、130的交聯劑化合物幾 乎可以是任何長度的，範圍從大約0.05、0。1、0.2、0.5、〇.75、 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 、 10 、 1卜 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 27 、 30 、 35 、 40、45、50、55、60、65、70、80、90至 100 nm，或甚至更 長。本發明的某些具體實施例可使用長度不等的交聯劑。 83951 -19- 200307753 二广月其他的具體實施例中，可將核加6、13。吸附 =私140的表面上，或可以非常接近奈米顆粒14〇 (在 之間）。熟諳此藝者將了解為了藉著刪、 ^或⑽，產生增強的拉曼訊號n需要讓 〇與奈米顆粒140的共價附接。 2㈣於圖2中揭示的代表性之具體實施例中，當核嘗 沿著微流通道160行進時，其與奈米顆粒140附接，形 成^酸_奈米顆粒複合物15()。在本發明的某些具體實施 歹'中，發生交聯反應所用的時間長度，可能是極有限的。 -類具體實施例可使用高度反應性交聯基團，具有快速的 二應速率’、像是環氧化物基團、疊氮基團、芳#氮基團、 二p井基團或重氮基團。在本發明的某些具體實施例中，交 I基團可以是精著暴露在強光，像是在激光下，而被光激 ，上彳如重氮或豐氮化合物的光激活作用，結果分別 =成而反應性的碳埽或氮缔部分。在本發明的某些具體實 ㈣中’可選擇反應性基團’使得它們寧可僅附接奈米顆 = 140與核甘酸16、13G，也不願使奈米顆粒⑷彼此交聯。 能夠與核誓酸16、130結合之反應性交聯基團的選擇和製 備為此項技藝中已知的。在本發明另外的具體實施例中， 可利用例如，可附接金奈米顆粒140的硫氫基團，共價修改 核苷酸16、130本身。 、在本發明的某些具體實施例中，可藉著此項技藝中已知 的任何方法，像是微流體動力學、奈米流體動力學、流體 動力學聚焦或電_滲透作用，操縱奈米顆粒14。至微流通^ 83951 -20- 200307753 120、160、270、280内。在本發明的一些具體實施例中， 使用帶電荷的交聯劑化合物，或帶電荷的奈米顆粒14〇，有 助於經由使用電梯度，操縱奈米顆粒140。 核酸的固定 在本發明的某些具體實施例中，如同在圖1中舉例說明 的，可將一或多個核酸分子13與表面14附接，像是官能化 的玻璃、矽、矽酸鹽、PDMS (聚二甲基矽氧烷）、聚偏二氟 乙缔（PVDF)、銀或其他金屬塗覆的表面、石英、塑料、PTFE (聚四氟乙烯）、PVP (聚乙晞吡咯烷酮）、聚（氯乙缔）、聚（異 丁烯酸甲酯）、聚（二甲基矽氧烷）、聚苯乙烯、聚丙晞、聚 丙晞S盛胺、膠乳、尼龍、謂基纖維素、玻璃小珠、磁性小 珠、含有光反應性物種的光聚合物，像是氮烯、碳晞，以 及能夠與核酸分子13形成共價連接的羰游基基團（參見美 國專利第5,405,766號和5,986,076號），或任何此項技藝中已 知的’能夠在其表面14上併入諸如胺基、羧基、硫醇、輕 基或Diels-Alder反應劑之類官能基的其他材料。 在本發明的一些具體實施例中，可使表面官能基與交聯 化合物共價附接，使得在核酸分子13與核酸外切酶15及/或 聚合酶之間發生結合交互作用，沒有位阻現象。典型的交 聯基團包括乙二醇低聚物和二胺。可藉著共價或非-共價結 合來附接。各種附接核酸分子13與表面14的方法，為此項 技#中已知的，並可使用之。在本發明的某些具體實施例 中，可將核酸分子13固定在適當的地方，並浸入微流體中， 7見下氚路12及/或微流通道110、160、260、280，其運送已 83951 -21 - 200307753 經釋放的核甞酸16、130通過檢測元件18、ι8〇、3〇〇。在非 -限制性的實例中，微流體流可起因於大量的溶劑流下流路 12及/或微流通道 11〇、16〇、260、280。 在本發明另外的具體實施例中，大部分介質僅緩慢地或 一點也不移動，但在溶液中帶電荷的物種（像是帶負電的核 知S艾16、13 0)，對外邵施加的電場反應，而向下移動至流 路12及/或微流通道11〇、160、260、280。 可藉著各種已知的方法，完成核酸分子13的固定。在本 發明代表性的具體實施例中，可藉著以鏈黴菌抗生物素蛋 白或抗生物素蛋白塗覆表面14，接著與生物素基化的核酸 13附接’而完成固定（H〇lmstrom等人，Anal. Biochem. 209:278_283, 1993)。亦可藉著以聚_L-Lys(離胺酸）或聚L_Lys，
Phe (苯丙胺酸）塗覆矽、玻璃或其他表面14，接著使用雙重 功说的X聯劑’共價附接胺基-或硫氫基-修改的核酸13，而 發生固定（Running等人，BioTechniques 8:276-277，1990; Newton等人，Nucleic Acids Res. 21:1155-62，1993)。可經由 使用胺基矽烷，在表面14上塗覆胺殘基。 可藉著5’-磷酸化核酸13與以化學方式修改之表面14的直 接共價附接’發生固定作用（Rasmussen等人，Anal. Biochem. 198:138-142，1991)。可藉著以水溶性碳化二醯亞胺縮合， 形成在核酸13與表面14之間的共價鍵結。該方法經由其5，_ 磷酸鹽，有助於核酸13的優先5’-附接。 藉著先矽烷基化玻璃表面14，然後以碳化二醯亞胺或戊 二酸激活，通常使DNA 13與玻璃結合。另一種程序可使用 83951 -22- 200307753 諸如3-縮水甘油氧基（glycidoxy)丙基三甲氧基碎燒（GOP)或 胺丙基三甲氧基矽烷（APTS)之類的試劑，與DNA13經由併 入該分子3’或5’端的胺基交聯劑連接。可使用紫外線輻射， 使DNA 13與膜表面14直接結合。在美國專利第5,610,287號 、5,776,674號和6,225,068號中，揭示核酸13之固定技術的 其他非-限制性實例。 可在本發明的各種具體實施例中，使用雙重功能的交聯 劑，像是使核酸分子13與表面14附接。可根據其官能基團 的專一性，例如胺基、胍基、吲嗓或幾基專一的基團，將 雙重功能的交聯劑分類。在美國專利第5,603,872號和 5，401，511號中，揭示交聯分子的代表性方法。交聯劑包括 戊二醛（GAD)、雙重功能的環氧乙烷（〇xr)、乙二醇二環氧 甘油醚（EGDE)和碳化二醯亞胺類，像是1-乙基_3_(3_二甲胺 基丙基）碳化二醯亞胺（EDC)。 核酸合成 聚合酶 本發明的某些具體實施例涉及合成試劑的結合，像是 DNA聚合酶與引子分子，並在引子的3’末端加入拉曼標示之 核苷酸。聚合酶的非限制性實例包括DNA聚合酶、RNA聚 合酶、逆轉錄酶和RNA-依賴性RNA聚合酶。從其"校對’’活 性，以及需要或不需要引子和啟動基因序列的觀點來看， 在這些聚合酶之間的差異為此項技藝中已知的。在使用 RNA聚合酶作為聚合酶之處，欲定序之模板分子可以是雙 股的DNA。聚合酶的非限制性實例，包括海洋棲熱孢菌 83951 •23 - 200307753 (Thermatoga maritima) DNA聚合酶、AmplitaqFSTMDNA聚合 酶、TaquenaseTMDNA聚合酶、ThermoSequenaseTM，TaqDNA 聚合酶、QbetaTM複製酶（replicase)、T4 DNA聚合酶、嗔熱 棲熱菌（Thermus thermophilus) DNA聚合酶、RNA-依賴性 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。 許多聚合酶是市售的，包括Pwo DNA聚合酶（Boehringer Mannheim Bio chemicals, Indianapolis, IN) ； Bst 聚合酶 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ; IsoTliermTM DNA聚合 酶（Epicentre Technologies，Madison, WI);莫洛尼氏白血病 病毒逆轉錄酶、Pfu DNA聚合酶、禽骨髓胚細胞過多症病毒 逆轉錄酶、黃色棲熱菌（Thermus flavus) (Tfl) DNA聚合酶和 里托棲熱球菌（Thermococcus litoralis) (Tli) DNA 聚合酶 (Promega Corp·，Madison，WI) ; RAV2逆轉錄酶、HIV-l逆轉 錄酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、 大腸桿菌（E· coli)RNA聚合酶、水生棲熱菌（Thermus aquaticus)DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶+/_3’—5’核酸外切 酶、DNA聚合酶I之Klenow片段、棲熱菌1到處都有的· DNA 聚合酶，以及DNA聚合酶I (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，NJ)。可使用在此項技藝中已知的，任何能夠進 行已標示核苷酸之模板依賴性聚合作用的聚合酶。（參見， 例如 Goodman和 Tippin，Nat. Rev· Mol· Cell Biol. 1(2)，101-9, 2000;美國專利第6,090,589號）。使用聚合酶，從已標示之 核甞酸合成核酸13的方法是已知的（參見美國專利第 4,962,037號；5,405,747號；6,136,543號；6,210,896號）。 83951 -24- 200307753 引子 通系’引子的長度是在10至20個鹼基之間，雖然也可使 用車乂長的引子。在本發明的某些具體實施例中，設計序列 與模板核酸分子之已知部分互補的引子。可使用已知的引 子序列，例如，在選擇引子以便確認與已知的不變染色體 序列相鄰的序列變體之處，在將未知核酸序列插入已知序 列的載體内之處，或是在已經部分地定序天然核酸之處。 口成具有任何序列之$子的方法是已知的。本發明的其他 具體實施例涉及在缺乏已知引子-結合的位置，定序核酸 u。在這類案例中，可能使用隨機引子，像是隨機的六聚 體或隨機的低聚物，開始聚合作用。 核酸消化作用 在本發明的某些具體實施例中，在圖1中舉例說明，核酸 13定序的方法，涉及使核酸外切酶15或相等的試劑，與核 S艾分子13的自由端17結合，並一次移除1個核苷酸16、13〇。 可能使用之核酸消化酵素15的非限制性實例，包括大腸桿 菌核酸外切酶I、III、V或VII、Bal 31核酸外切酶、綠豆核 酸酶（nuclease)、S1核酸酶、大腸桿菌]0]^人聚合酶〗全酶或 Klenow片段、RecJ、核酸外切酶τ、T4或T7 DNA聚合酶、 Taq聚合酶、核酸外切酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾臟 磷酸二酯酶、里托棲熱球菌DNA聚合酶、焦球菌屬 (Pyrococcus sp·) GB-D DNA聚合酶、λ核酸外切酶、金黃色 葡萄球菌（S. aureus)微球菌核酸酶、DNA酶I、核糖核酸酶 A、T1微球菌核酸酶，或其他此項技藝中已知的核酸外切 -25- 83951 200307753 酶。核酸外切酶15可獲自商業來源，像是New England Biolabs (Beverly， ΜΑ) 、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway，NJ)、Promega (Madison，WI)、Sigma Chemicals (St. Louis，MO)，或 Boehringer Mannheim (Indianapolis，IN) o 熟諳此藝者將了解具有核酸外切酶15活性的酵素，可從 核酸分子13的5’端、3’端或任一端，移除核甞酸16、130。 它們可顯示出對RNA、DNA或RNA和DNA 13兩者的專一 性。它們的活性，可視使用單或雙股的核酸13而定。可藉 著鹽濃度、溫度、PH值或二價陽離子，有差別地影響它們。 核酸外切酶15的這些及其他特性，為此項技藝中已知的。 在本發明的某些具體實施例中，可操縱核酸外切酶15活性 的速率，使其與由檢測元件18、180、300分析核甞酸16、 13 0的最佳速率一致。已知各種調整核酸外切酶15活性之速 率的方法，包括調整在反應室11、220中的溫度、壓力、PH 值、鹽或二價陽離子濃度。 雖然通常可藉著核酸外切酶15之活性，從核酸13中釋放 核苷單磷酸16、130，但本發明之具體實施例不限於檢測任 何特定形式的自由核嘗酸或核替16、13 0，還包括任何可從 核酸13中釋放出的單體16、13〇。 反應室和整合晶片 如同在圖1中舉例說明的，本發明的一些具體實施例係關 於裝置10、100、210，包括反應室11、220，設計成在含水 的環境中，含有固定表面14、核酸分子13、核酸外切酶15 和核苷酸16、130。在本發明的一些具體實施例中，反應室 83951 -26- 200307753 11、220是可以控制溫度的，例如藉著併入派勒提（PeHetier) 元件，或此項技藝中已知的其他方法。控制低體積液體之 溫度的方法是已知的。（參見’例如美國專利第5,038,853 號；5,919,622號；6,054,263號和 6，180,372號）。 在本發明的某些具體實施例中，在一批製造的過程中， 製造反應室11、220和任何連接的流體通道，例如流路12、 微流通道 110、160、260、280，或通道 120、230、240、270、 350、3 60，提供與廢物出口、與核酸13裝載口、與奈米顆 粒儲存器370、與核酸外切酶15之來源或其他流體隔間的連 接點，如同在電腦晶片製造及/或微毛細管晶片製造之領域 中已知的。在本發明的一些具體實施例中，可將反應室11、 220和裝置10、100、210的其他組件’像是流路12及/或微流 通道120、160、260、280，製成單一的整合晶片。可藉著 此項技藝中已知的方法來製造這類晶片，像是藉著照相平 版法和蝕刻法。然而，不限制製造方法，並可使用此項技 藝中已知的其他方法，像是雷射漉鍍（laser ablation)、注射 模塑法（injection molding)、燒鑄（casting)、分子束取向生長 (epitaxy)、蘸水筆奈米照相平版法（dip-pen nanolithograpy) 、化學氣相沉積（chemical vapor deposition)(CVD)製造、電 子束或離子束聚焦（focused ion beam)技術，或壓印 (imprinting)技術。至於本發明的某些具體實施例，可使用 製造奈米電機系統的方法。（參見，例如Craighead，Science 290:1532-36，2000)。顯微製造的晶片可購自例如Caliper
Technologies Inc. (Mountain View， CA)和 ACLARA 83951 -27- 200307753
BioSciences Inc.(Mountain View，CA) 〇 欲使得藉檢測元件18、180、300檢測核苷酸16、130變得 更容易，可選擇在檢測元件18、180、300所使用的激發和 發射頻率下，對電磁輻射是透明的材料，包括流路12或流 通池170、290。可使用玻璃、石夕，以及任何在拉曼光譜學 所使用之波長下通常是透明的其他材料。在本發明的一些 具體實施例中，流路12或流通池170、290與檢測元件18、 180、300相對的表面，可塗覆銀、金、鉑、銅、鋁或其他 物質，其對檢測元件18、180、300而言是相對上較不透明 的。在那個位置，可利用不透明的材料增強拉曼訊號，例 如藉著SERS，而不干擾檢測元件18、180、300的功能。或 者，流路12或流通池170、290可含有包括銀、金、鉑、銅、 鋁或其他增強拉曼訊號之金屬的網孔。 流路和微流通道 在本發明的某些具體實施例中，從核酸13中釋放出的核 苷酸16、130向下移動至流路12及/或微流通道110、160、 260、280，通過檢測元件18、180、300。運送核苷酸16、 130之技術的非-限制性實例，包括微流體技術。流路12及/ 或微流通道110、160、260、280可包括微毛細管（例如，得 自 ACLARA BioSciences Inc·，Mountain View，CA)或液態積 體電路（例如，Caliper Technologies Inc.，Mountain View， CA)。 在本發明的某些具體實施例中，待檢測的核甞酸16、130 可隨著大量的溶劑流，向下流至流路12及/或微流通道110、 83951 -28- 200307753 160 260 在本發明其他的具體實施例中，可使用微 毛細管電泳，運送核菩酸16、130向下至流路12及/或微流通 道:10 16G、26G、28G。微毛細管電泳通常涉及使用薄毛 細f或通道’其可以或可以沒有充滿特殊的分離介質。帶 有適當電荷之物種，像是帶負電之核苷酸16、13〇的電泳， 反映強加於其上，對裝置1〇、1〇〇、21〇之反應室u、22〇侧 為負私，並對檢測元件18、18〇、3〇〇侧為正電的電場而發 生。雖然經常使用電泳，進行組份之混合物的顆粒離析， 同時加上微毛細管，但亦可用來運送隨後從核酸13中釋放 出之類似尺寸的核甞酸16、13〇。因為嘌呤核甞酸（AG)16、 130比嘧哫核甞酸（c，T，u)16、13〇更長，並將因此而較慢地 移動’可將流路12及/或微流通道no、ι6〇、260、280的長 度，和通過檢測元件18、18〇、3〇〇的相對應通過時間維持 在最低點，避免差示移動使從核酸13中釋放核甞酸16、13〇 的順序混合。或者，可選擇充滿介質的微毛細管，使得鳴 呤和嘧啶核甞酸16、130向下通過流路12及/或微流通遒 110、160、260、280的移動速率是類似或相同的。已經由 例如 Woolley 和 Mathies (Proc. Natl Acad. Sci. USA 9111348-352, 1994)，揭示了微毛細管電泳的方法。 在本發明的某些具體實施例中，流路12及/或微流通遒 110、160、260、280可含有具有相對上較高之黏性的含水 溶液’像是甘油溶液。這類高黏性溶液可用來降低流速， 並增加可用來，例如使核甞酸16、130與奈米顆粒140交聯 的反應時間。 83951 -29- 200307753 已經在例如 Jacobsen 等人（Anal. Biochem. 209:278-283, 1994) ; Effenhauser等人（Anal· Chem· 66:2949-2953，1994); Harrison 等人（Science 261:895-897，1993)和美國專利第 5,904,824號中，揭示了微觀流體設備的顯微製造，包括微 毛細管電泳的設備。這些方法可包括微型成型 (micromolding)技術，利用主要使用標準照相平版法或離子 束聚焦製造的碎，或在珍石、珍或其他結晶受質或晶片上， 以照相平版法刻蝕微米規模的通道。可輕易地改編這類技 術，以便在所揭示之方法和裝置中使用。在本發明的一些 具體實施例中，可用與製造反應室11、220所用之材料相同 的材料，使用此項技藝中已知的技術，來製造微毛細管。 檢測元件 在本發明的各種具體實施例中，設計檢測元件18、180、 300，藉著拉曼光譜學來檢測並定量核甞酸16、130。藉著 拉曼光譜學檢測核嘗酸16、13 0的方法是已知的。（參見， 例如美國專利第 5,306,403 號；6,002,471 號；6，174,677號）。 已經揭示了在表面增強之拉曼光譜學（SERS)、表面增強之 共振拉曼光譜學（SERRS)，及相干反-斯托克斯拉曼光譜學 (CARS)上的變化。藉著1〇6或更多與粗糙金屬表面，像是 銀、金、銘、銅或銘表面相鄰之分子的因數’增強拉曼檢 測的敏感性。 在美國專利第6,002,471號中揭示了拉曼檢測元件18、 180、300的非-限制性實例。由頻率加倍之Nd:YAG雷射19、 320在532¾微米波長處’或頻率加倍之Ti監寶石雷射19、 83951 -30- 200307753 320在365毫微米波長處，產生激發光束20、330。可使用脈 衝雷射光束20、330或連續雷射光束20、330。激發光束20、 330通過共焦的光學系統和顯微鏡物鏡，並集中在流路12及 /或流通池170、290。藉著顯微鏡物鏡和共焦的光學系統收 集來自核甞酸I6' 130的拉曼發射光，並與單色儀偶聯，以 便進行光譜解離。共焦的光學系統包括二色性濾光器、阻 擋濾光器、共焦的針孔、透鏡和降低背景訊號的鏡子。可 使用標準全視野光學系統，以及共焦的光學系統。藉著拉 曼檢測器21、310檢測拉曼發射訊號，其包括與電腦形成界 面之雪崩型感光二極體（avalanche photodiode)，可供計算和 訊號的數位化。 在美國專利第5,306,403號中揭示了拉曼檢測元件18、180 、300的其他實例，包括Spex 1403型雙光柵（double-grating) 分光光度計21、310，帶有以單一-光子計數之模式操作的 鎵-坤化物光電倍增管（RAC C31034型，或Burle Industries C3103402型）。激發光源 19、320 包括得自 SpectraPhysics，166 型的514.5毫微米之直線氬-離子雷射19、320，以及647.1毫 微米直線的氪-離子雷射19、320 (Innova 70，Coherent)。 另一種激發光源19、320，包括337毫微米的氮雷射19、 320 (Laser Science Inc·)，和 325 毫微米的氦·鎮雷射 19、320 (Liconox)(美國專利第6，174,677號），光發射二極體19、320， Nd.YLF雷射19、320，及/或各種離子雷射19、320，及/或 染料雷射19、320。利用通頻帶滤光器（bandpass filter) ，以分光譜純化激發光束20、330，並使用6X物鏡（Newport， 83951 -31- 200307753 L6X型），使其集中在流路12及/或流通池170、290上。可使 用物鏡激發核苷酸16、130，並收集拉曼訊號，藉著使用全 息圖光束導流板（holographic beam splitter)(Kaiser Optical Systems，Inc·，HB647-26N18型），對激發光束 20、330產生直 角幾何學和發射的拉曼訊號。可使用全息圖凹口濾波器 (holographic notch filter)(Kaiser Optical Systems，Inc·)，P·低 瑞利（Rayleigh)散射的輻射。另一種拉曼檢測器21、310，包 括裝設有紅-增強之積分式電荷隸合裝置（red-enhanced intensified charge-coupled device)(RE-ICCD)檢測系統 (Princeton Instruments)的 ISA HR-320光譜儀。可使用其他類 型的檢測器21、310，像是傅里葉變換光譜儀（Fourier-transform spectrographs)(以邁克生（Michaelson)干涉儀為基 礎）、帶電注射裝置（charged injection devices)、感光二極體 陣列、InGaAs檢測器、電子·增加（electron-multiplied) CCD、 積分式CCD，及/或光晶體三極管陣列（phototransistor arrays) 〇 可使用任何適合形式或組態的拉曼光譜學，或此項技藝 中已知的相關技術，來檢測核甞酸16、13 0，包括但不限於 正常的拉曼散射、共振拉曼散射、表面增強之拉曼散射、 表面增強之共振拉曼散射、相干反-斯托克斯拉曼光譜學 (CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光譜學、受激增益拉曼光 譜學、過度-拉曼散射、分子光學雷射審查員（MOLE)，或拉 曼微探針或拉曼顯微術，或共焦的拉曼顯微光譜學、三維 或掃瞄拉曼、拉曼飽和光譜學、時間分辨共振拉曼、拉曼 83951 -32· 200307753 解偶聯光譜學或uv-拉曼顯微術。 資訊處理和控制系統和資料分析 在本發明的某些具體實施例中，核酸定序裝置10、100、 210可含有資訊處理系統。所揭示的方法和裝置1 〇、1 〇〇、 210並不限制所使用之資訊處理系統的類型。代表性的資訊 處理系統可併入電腦，包括傳達資訊的匯流線和用來處理 資訊的處理器。在本發明的一個具體實施例中，該處理器 選自Pentium®家族的處理器，包括但不限於可獲自Intel Corp· (Santa Clara，CA)的 Pentium® II家族、Pentium® III 家族 和Pentium⑧4家族的處理器。在本發明另外的具體實施例 中，處理器可以是 Celeron®、Itanium®、或 Pentium Xeon®處 理器（Intel Corp·，Santa Clara, CA)。在本發明各種其他的具 體實施例中，處理器可以Intel® IA-64體系結構為基礎，像 是Intel® IA-32或Intel® IA-64體系結構。或者，亦可使用其 他的處理器。資訊處理和控制系統，可進一步包括任何此 項技藝中已知的周邊設備，像是記憶體、顯示器、键盤及/ 或其他設備。 在本發明特定的具體實施例中，檢測元件18、180、300 可以可操作之方式與資訊處理系統偶聯。可由處理器處理 得自檢測元件18、180、300的資料，並將資料儲存在記憶 體中。亦可將在標準核嘗酸16、130之發射輪廓上的資料儲 存在記憶體中。處理器可比較在流路12及/或流通池170、290 中，得自核苷酸16、130的發射光譜，以便確認從核酸分子 13中釋放出之核苷酸16、130的類型。記憶體亦可儲存從核 83951 -33 - 200307753 酸分子13中釋放出之核菩酸16、130的序列。處理器可分析 得自檢測元件18、180、300的資料，判定核酸13的序列。 資訊處理系統亦可進行標準程序，像是扣除背景訊號和’’基 礎_呼叫（base-calling)n，判定何時檢測到重疊訊號。 雖然可在經過編窝程式之處理器的控制之下，進行所揭 示之方法，但在本發明另外的具體實施例中，可藉著任何 可編窝程式的（programmable)或寫死的（hardcoded)邏輯，像 是場效可編窝程式之閘矩陣（Field Programmable Gate Arrays)(FPGAs)、TTL邏輯，或特殊應用積體電路 (Application Specific Integrated Circuits)(ASICs)，全部或部 分地實行該方法。此外，亦可藉著已編窝程式之多用途電 腦組件，及/或訂製硬體組件的組合，進行所揭示的方法。 在資料蒐集操作之後，通常將資料報告給資料分析操 作。欲使分析操作更容易，通常將使用數位電腦，像是上 述的那些，分析藉著檢測元件18、180、300獲得的資料。 通常將替電腦適當地編寫程式，以便收到並儲存得自檢測 元件18、180、300的資料，並分析和報告所蒐集的資料。 在本發明的某些具體實施例中，可使用訂製設計的套裝 軟體，分析獲自檢測元件18、180、300的資料。在本發明 另外的具體實施例中，可使用資訊處理系統和可公開獲得 的套裝軟體，進行資料分析。可供DNA序列分析使用之軟 體的非-限制性實例，包括PRISM™ DNA定序分析軟體 (Applied Biosystems，Foster City，CA)，Sequencher1M套裝軟 體（Gene Codes，Ann Arbor，MI)，以及可經由在網址 83951 -34- 200307753 www.nbif.org/links/1.4.1.php處之國家生物技術資訊設施 (National Biotechnology Information Facility)獲得的各種套 裝軟體。 【實施方式】 實例 實例1 :使用拉曼標示之核苷酸進行核酸定序
本發明的某些具體實施例，在圖1中舉例說明，涉及個別 單股之核酸分子13的定序，在反應室11、220中，將其附接 於固定表面14上，並在解構（deconstruction)反應中拆卸。在 本發明的這類具體實施例中，反應室11、220含有一或多個 核酸外切酶15，接著從核酸分子13的未附接末端17，一次 移除一個核甞酸16、130。
當釋放出核甞酸16、130時，它們向下移動至流路12，通 過檢測元件18、180、300。檢測元件18、180、300包括激 發光源19、320，像是雷射，其放出激發光束20、330。激 發光束20、330與已釋放之核甞酸16、130產生交互作用， 而得以將電子激發至較高的能態。藉著拉曼光譜檢測器 21、310，像是分光計、單色儀或電荷偶聯設備（CCD)，像 是CCD攝影機，來檢測由於電子回到較低能態所產生的拉 曼發射光譜。 反應室和流路的製備 在濃縮的HF (氫氟酸）中，預先-餘刻溴浮玻璃（borofloat glass)薄片（Precision Glass & Optics，Santa Ana，CA)—段短 時間，並在在電聚輔助化學氣相沉積（plasma-enhanced 83951 -35- 200307753 chemical vapor deposition)(PECVD)系統（PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中，非晶形碎犧牲層（sacrificial layer)的 沉積之前，將其弄乾淨。以六甲基二矽氮烷（HMDS)謗發薄 片，以光阻（Shipley 1818，Marlborough，MA)旋轉-塗佈，並 軟烤（soft-bake)。使用接觸式光罩對準機（contact mask aligner)(Quintel Corp. San Jose，CA)，使光阻層暴露在一或 多個蔽罩設計圖下，並使用Microposit顯影劑濃縮物 (Shipley)和水的混合物，移除經過暴露的光阻。將經過顯 影的薄片硬烤（hard-bake)，並在PECVD反應器中，使用CF4 (四氟化碳）電漿，移除經過暴露的非晶形矽。利用濃縮的 HF，以化學方式蝕刻薄片，產生反應室11、220和流路12。 提除剩下的抗光蝕劑，並移除非晶形矽。使用這些方法， 可製備直徑大約50至100微米的微通道。可藉著已知的方 法，製備更小直徑的通道，像是塗覆微通道的内側使直徑 變窄，或使用奈米照相平版法、電子束聚焦、離子束聚焦 或聚焦原子雷射技術。 利用鑽石鐵頭（Crystalite，Westerville，OH)，在已餘刻之 薄片上鑽出進出孔。藉著在可編窝程式的真空火爐 (Centurion VPM，J.M. Ney，Yucaipa，CA)上，加熱使兩個互 補的已蝕刻和已鑽孔的板互相結合，製備完成的晶片。在 美國專利第5,867,266號和6,214,246號中揭示了另，種製造 晶片的代表性方法，是併入反應室11、220和流路12。在本 發明的某些具體實施例中，在反應室11、220和流路12之 間，插入具有2,500道爾呑之分子量截止值的尼龍濾紙，以 83951 •36- 200307753 避免核酸外切酶15離開反應室11、220。 核酸製備和核酸外切酶處理 根據Sambrook等人（1989)純化人類染色體DNA。在以Bam HI消化之後’將基因組DNA片段插入pBluescript® II嗜菌體 質體載體（Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)之多重選殖位置 内，並在大腸桿菌中長大。在平舖於含有氨苄青黴素之瓊 脂培養盤上之後，選出單一的菌落，並為了定序使其長大。 藉著與協助者噬菌體共同-感染，解救基因組DNA插入物的 單股DNA副本。在蛋白酶K :十二烷基硫酸鈉（SDS)的溶液 中消化之後，以酚萃取DNA，然後藉著加入醋酸鈉（pH 6.5， 約0.3 Μ)和0·8倍體積的2-丙醇，使其沉澱。將含有DNA的 小球再懸浮於Tris-DETA緩衝溶液中，並儲存在-20°C下直到 使用為止。瓊脂糖凝膠電泳顯示經過純化之DNA的單一譜 帶。 從 Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)購得 M13前進引子，其與位在基因組DNA插入物旁邊之已知的 pBluescript®序列互補。以共價之方式修改引子，使其含有 附接在寡核苷酸之5’端的生物素部分。生物素基團，經由 (CH2)6間隔基，與引子之5’-嶙酸鹽共價連接。容許經生物素 -標示之引子，與從pBluescript®載體中製備的ssDNA模板分 子雜交。然後根據Dorre 等人（Bioimaging 5.13 9-152, 1997)， 使引子-模板複合物附接在已塗覆鏈黴菌抗生物素蛋白的 小珠14上。按照適當的DNA稀釋，使一個引子-模板複合物 與一個小珠14附接。將含有一個引子-模板複合物的小珠 83951 -37- 200307753 14，插入定序裝置10、100、210的反應室11、220内。 將引子-模板與經過修改的T7 DNA聚合酶（United States Biochemical Corp.，Cleveland, OH)—起培養。該反應混合物 含有未標示的脫氧腺甞-5’-三磷酸（dATP)和脫氧鳥苷-5’-三 磷酸（dGTP)、毛地黃毒：y：-標示之脫氧尿苷-5’-三磷酸（毛地 黃毒甞-dUTP)和若丹明-標示之脫氧胞甞-5’-三磷酸（若丹明 -dCTP)。容許聚合反應在37 〇C下進行2小時。在合成毛地黃 毒甞和若丹明標示的核酸13之後，將模板股與已標示之核 酸13分開，並將模板股、DNA聚合酶和未併入的核甞酸洗 出反應室11、220。 藉著將核酸外切酶III 15加至反應室11、220，發動核酸 外切酶15活性。將反應混合物維持在PH 8.0和37 °C下。當從 核酸13的3’末端17釋放出核苷酸16、130時，藉著微流體流 將其向下運送至流路12，通過檢測元件18、180、300。 已標不之核菩酸的檢測 檢測元件18、18 0、3 0 0包括雷射19、3 2 0和拉曼檢測器21、 310。藉著鈦：藍寶石雷射19、320 (Tsunami，經由 Spectra-Physics)，在近·紅外波長（750-950毫微米）處，或鎵 鋁坤化物二極體雷射19、320(PI-ECL系列，經由Process Instruments)，在785毫微米或830毫微米處，產生激發光束 20、330。可使用脈衝雷射光束20、300或連續光束20、330。 藉著二色性鏡（全息圖凹口濾波器，經由Kaiser Optical，或 干涉濾波器，經由Chroma或Omega Optical)，反射激發光束 20、330，形成集合光束之共線幾何。反射的光束通過顯微 83951 -38- 200307753 鏡物鏡（Nikon LU系列），並集中在標靶核苷酸16、130所位 在的微-孔，流路（微-通道）12或流通池170、290上。藉著相 同的顯微鏡物鏡收集得自標靶核甞酸16、130的拉曼散射 光，並通過二色性鏡，至拉曼檢測器21、3 10。拉曼檢測器 包括聚焦透鏡、光譜儀和陣列檢測器。聚焦透鏡集中拉曼 散射光，通過光譜儀的入口狹缝。光譜儀（RoperScientific) 包括以其波長分散光的光柵。經過分散的光在陣列檢測器 (背後照明的深度·耗盡（back-illuminated deep-depletion) CCD攝影機，經由R0perScientific)上呈像。該陣列檢測器與 控制電路連接，後者與電腦連接，以便轉移資料，並控制 檢測器21、310之功能。 拉曼檢測器21、3 10能夠檢測和確認移動通過檢測21、310 之dATP、dGTP、若丹明-dCTP和毛地黃毒苷-dUTP的單一核 菩酸16、130。針對已標示核甞酸檢測，編輯並分析在時間 進行上的資料，獲得核酸13的序列。 實例2 :使用與奈米顆粒之共價附接的核酸定序 在圖2中揭示本發明的另一個代表性具體實施例。藉著核 酸外切酶15活性，從核酸13中釋放核甞酸16、130。在本發 明的某些具體實施例中，核：y：酸丨6、130是未經標示的。這 類具體實施例不涉及使用引子和聚合酶，將已標示之核苷 酸併入互補股13内的作用。改而從任何器官、組織及/或細 胞試樣中直接純化，或藉著已知可直接定序的選殖方法獲 得核酸13。在本發明的一些具體實施例中，可將單股rnA 或DN A 13的單一分子附接在表面14上，並以核酸外切酶15 83951 -39- 200307753 處理。釋放出的核苷酸16、130向下行進至流路12。流路12 可與微流通道110、160、260、280相鄰，或就是微流通道 110 ^ 160 ^ 260 ^ 280 ° 將得自反應室11、220的核苷酸16、130與金及/或銀奈米 顆粒 140 混合。根據 Lee 和 Meisel (J. Phys Chem. 86:3391-3395, 1982)製備銀奈米顆粒140。金奈米顆粒則購 自 Polysciences. Inc. (Warrington，PA)° 獲自 Polysciences，Inc. 的金奈米顆粒，尺寸為5、10、15、20、40和60毫微米。在 非-限制性的本實例中，使用60毫微米的金奈米顆粒140。 在暴露於核苷酸16、130下之前，以矽烷塗覆表面-經過 修改的奈米顆粒140，像是3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基矽 燒（GOP)，一種反應性交聯劑化合物。GOP含有終端高反應 性的環氧化物基團。可修改奈米顆粒140，使其含有羥基基 團，容許與GOP共價附接。將矽烷化的奈米顆粒140與核甞 酸16、130混合，並容許與核甞酸16、130形成共價交聯。 使核苷酸·奈米顆粒複合物150通過流通池170、290,並使用 拉曼檢測元件18、180、300，由SERS、SERRS及/或CARS 確認。因為核苷酸16、130非常接近奈米顆粒140，故大大 地增強了拉曼訊號，容許通過流通池170、290檢測單一核 苷酸16、】30。 實例3 :核酸定序的裝置 圖3顯示本發明的另一個代表性具體實施例。DNA定序裝 置10、100、210包括反應室11、220，以流體與流入通道230 和流出通道240連絡。可經由一或多個活門250的使用，控 83951 -40- 200307753 制流體的移動。微流通道110、260亦以流體與反應室11、 2 2 0連絡。藉著核酸外切酶15活性，從一或多個核酸13中釋 放出的核苷酸16、130，經由微流通道no、260離開反應室 11、220。將核甞酸16、130與奈米顆粒140混合，其移動通 過奈米顆粒通道120、270，以流體與微流通道no、260連 絡。核甞酸16、130與奈米顆粒140的共價附接，發生在附 接通道160、280内。共價附接的核苷酸_奈米顆粒複合物15〇 通過流通池170、290，在那裏藉著拉曼檢測元件18、ι8〇、 300確★忍核甘故16、130。拉曼檢測元件丨8、ι8〇、3〇〇包 括田射19、320和拉曼檢測器21、31〇。雷射發出激發光束 20、330，其在流通池17〇、29〇中激發核甞酸16、13〇。被 激發之核首酸16、13〇放出拉曼訊號，藉著拉曼檢測器21、 310檢測之。 在本發明的某些具體實施例中，可在再循環室34〇中回收 奈米顆粒14G。以化學方式處理奈米顆粒，例如以酸性溶液 處里”、、後冲洗’以便移!^已結合的核^：酸、別、交聯 ，化合物，以及任何其他附接或吸附的分子。可經由再循 = = 360’將奈米顆粒刚再循環至奈米顆粒儲存器別。 =明的-些具體實施例中，可在再循環通道则及/或 ^太 器370中，利用諸如G〇P之類的交聯劑化合物 /I π米顆粒140。從再循環室34〇中， 除廢液。 、'二由廢物通道350移 蓉於本發明之揭示内容， 提出申請的所有方法和裝置 可進行或實行在本文中揭示及 ，不需過度的實驗。對熟諳此 83951 -41 - 200307753 藝者而言，顯然可對在本文中描述的方法和裝置，施加不 运背提出申請之主題的概念、精神和範圍的改變。更特定 而言，顯然可用在化學上和在生理學上相關的製劑，取代 在本文中描述的製劑，而將獲得相同或類似的結果。熟諳 此藝者顯然認為所有這類類似的取代物和修改，均在提出 申請之主題的概念、精神和範圍内。 【圖式簡單說明】 下列的圖式形成本說明書的一部分，並將其納入，以便 進一步證實本發明揭示之具體實施例的某些觀點。可藉著 參考這些圖式中的-或多個，與在本文中提供之本發明的 特疋具體實施例之詳細說明一起，更徹底地瞭解本發明之 具體實施例。 圖1解釋代表性之核酸13定序的裝置10 (不是對刻度而言 和方法，使用核甞酸16與拉曼標記共價附接。 ’ 丄圖2解釋代表性之核酸13定序的裝置1〇〇 (不是對刻度而 )和方去其中在藉著表面增強之拉曼光譜學（SeRs)⑽ =測之前，先將釋放出的核苷酸13〇與奈米顆粒14〇共價附 圖3解釋另一個代表性之核酸13定序的裝置( 刻度而言）的方法。 、 【圖式代表符號說明】 10 DNA定序裝置 11 反應室 12 流路 83951 -42- 核酸 表面 核酸外切酶 核甞酸 未附接末端（自由端） 拉曼檢測元件 雷射 激發光束 拉曼檢測器 DNA定多裝置 微流通道 奈米顆粒通道 核甞酸 奈米顆粒 核苷酸奈米顆粒複合物 微流通道 流通池 拉曼檢測元件 DNA定序裝置 反應室 流入通道 流出通道 活門 微流通道 -43 - 奈米顆粒通道 附接通道 流通池 拉曼檢測元件 拉曼檢測器 雷射 激發光束 再循環室 廢物通道 再循環通道 奈米顆粒儲存器 -44-

Claims (1)

  1. 200307753 拾、申請專利範園： 1. 一種方法’包括： a) 從至少一個核酸的一端，渔絡 ^連績移除核苷酸； b) 將每個核苷酸與至少一個太 τ太顆粒附接； c) 確認該核苷酸；並 d) 判定該核酸之序列。 2. 根據申請專利範圍第1項乏女、土 " 万凌’其中將該核酸與表面附 接。 3·根據申請專利範圍第1項士士、+ 万法，其中以一或多個交聯劑 化合物修改該奈米顆粒。 4 根據申請專利範圍第3项$女、i 万法’其中將該核苷酸與該交 聯劑化合物共價附接。 5·根據申請專利範圍第1項凌女 ,< 万法，其中藉著表面增強之拉 曼光If學（SERS)、表面辦、 共振拉曼光譜學（SERRS)， 及/或相干反-斯托克斯j上田 兄4拉艾光譜學（CARS)確認該核甞酸。 6. 根據申請專利範圍第1項少、、| 只 < 万法，其中該奈米顆粒包括金 及/或銀。 7. 根據申請專利範圍第6項凌士土 * & — ^ 万法，其中每個核答酸分別與 單一的奈米顆粒或牟夹 、 又丁、木顒粒聚集體附接。 8. 根據申请專利範圍第1 j爸、 心n心 弟1員〈方法，更進一步包括將該核苷 酸與該核酸分子分開。 9根據申請專利範園第、、+ 、 万法，更進一步包括以雷射激 發該核甞酸。 10根據申請專利範圍第Q 、 固弟91《方法，其中使用電荷_合裝置 83951 200307753 (CCD)攝影機來確認該核苷酸。 11. 12. 13 14. 15. 16. 17. 18. 19. 根據申請專利範圍第丨項之方法，更進一步包括記綠每個 核嘗酸之身份，和確認每個核苷酸的時間。 根據申請專利範圍第1項之方法，其中使用核酸外切酶從 該核酸中移除該核甞酸。 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該奈米顆粒的直徑 是在2毫微米到2微米之間。 根據申請專利範圍第13項之方法，其中該奈米顆粒之直 徑是大約100毫微米。 一種方法，包括： a) 獲得與拉曼標記附接的核苷酸； b) 合成包括已標示之核苷酸的核酸； c) 從核酸的一端移除核甞酸； d) 藉著拉曼光譜學確認該核甞酸；並 e) 判定該核酸之序列。 根據申請專利範圍第15項之方法，更進一步包括使從該 核酸中移除之核苷酸，通過金屬塗覆的通道。 根據申請專利範圍第15項之方法，其中以可區別的拉曼 標記標示每種類型的核甞酸。 根據申請專利範圍第15項之方法，其中僅以拉曼標記標 示喊淀核答酸。 根據申請專利範圍第15項之方法，更進一步包括：⑴獲 得至少一個模板核酸分子；（ii)使該模板核酸分子與引子 球交，並（iii)加入DNA聚合酶，以便合成該核酸。 83951 200307753 20.根據申請專利範圍第15項之方法’其中藉著核酸外切酶 活性，從該核酸中移除該核甞酸。 21·根據申請專利範圍第20項之方法，其中一次只有一個核 fet暴路在核fet外切酶活性之下。 22.根據申請專利範圍第15項之方法，其中藉著表面增強之 拉曼光譜學（SERS)、表面增強之共振拉曼光譜學 (SERRS)，及/或cars確認該已標示之核苷酸。 23根據申請專利範圍第22項之方法，更進一步包括使該核 答酸與奈米顆粒附接。 24· —種裝置，包括： a) 反應室； b) 第一個通道，以流體與該反應室連絡； c) 第二個通道，以流體與該第一個通道連絡； d) 流通池，以流體與該第一和第二個通道連絡，·和 e) 檢測元件，以可操作之方式與該流通池偶聯。 25. 根據申請專利範圍第則之裝置，其中該檢測元件包括 拉曼檢測器。 26. 根據申請專利範圍第25項之裝置’其中該檢測元件包括 雷射和CCD攝影機。 27根射請專利範圍第則之裝置，其中該第—個通道含 有核答酸，而該第二個通道含有奈米顆粒。 28根據申請專利範圍第27項乏裝w ^ 靶囷罘裝置，其中該核苷酸與該奈 米顆粒共價附接。 Μ根㈣請專利範圍第_之裝置，其中該核料在該通 83951 200307753 道内，成為與該奈米顆粒共價附接的。 30.根據申請專利範圍第28項之裝置，其中該核甞酸與該奈 米顆粒的共價附接，提供了增強的拉曼訊號。 83951
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