PT103730A - Método colorimétrico e estojo de detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos através de nanopartículas metálicas funcionalizadas com oligonucleótidos modificados - Google Patents

Abstract

O PRESENTE INVENTO RELACIONA-SE COM UM MÉTODO COLORIMÉTRICO DE DETECÇÃO DE SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS, INCLUINDO MUTAÇÕES OU POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO ÚNICO EM SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS, ATRAVÉS DA AGREGAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS FUNCIONALIZADAS COM OLIGONUCLEÓTIDOS MODIFICADOS INDUZIDA POR UM AUMENTO DA FORÇA IÓNICA DO MEIO. OUTRO ASPECTO DO PRESENTE INVENTO RELACIONA-SE COM O DESENVOLVIMENTO DE UM ESTOJO QUE AO APLICAR A METODOLOGIA OBJECTO DA PRESENTE INVENÇÃO, PERMITE A RÁPIDA E FÁCIL DETECÇÃO DE SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS, INCLUINDO MUTAÇÕES OU POLIMORFISMOS DE NUCLEÓTIDO ÚNICO EM SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO COLORIMÉTRICO E ESTOJO DE DETECÇÃO DE SEQUÊNCIAS ESPECÍFICAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS ATRAVÉS DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS FUNCIONALIZADAS COM OLIGONUCLEÓTIDOS MODIFICADOS"

Domínio Técnico da Invenção O presente invento refere-se a um novo método colorimétrico e a um estojo, baseado nesse mesmo método, para a detecção molecular de sequências especificas de ácidos nucleicos (detecção e quantificação) e possíveis diferenças na sequência alvo (polimorfismos e mutações) , utilizando nanopartículas metálicas funcionalizadas com oligonucleótidos modificados (doravante denominadas "nanossondas") com aplicação em várias áreas da biotecnologia, farmácia, farmacogenómica e medicina.

Sumário do Invento 0 método do presente invento baseia-se na caracterização de alterações colorimétricas de uma solução contendo as nanossondas e ácidos nucleicos, cuja alteração colorimétrica se encontra relacionada com a presença ou ausência de ácidos nucleicos com sequência complementar à sequência da nanossonda. A alteração colorimétrica da solução descrita é fácil e rapidamente visível a olho nu ou por recurso a métodos de colorimetria e/ou espectroscopia no UV/visível. 0 referido método poderá ser aplicado como parte integrante de um estojo para uma detecção rápida e barata de mutações/polimorfismos em ácidos nucleicos. As nanossondas podem ser funcionalizadas com oligonucleótidos complementares a quaisquer sequências específicas de ácidos nucleicos, como por 2 exemplo sequências associadas a doença ou alteração de susceptibilidade a determinadas doenças (por exemplo, cancro, diabetes) ou a diferenças de metabolismo de determinados xenobióticos, tendo aplicação em várias áreas da biotecnologia, farmácia, farmacogenómica e medicina.

Estado da arte

Actualmente as técnicas de rotina utilizadas em diagnóstico clinico e laboratorial para detecção de sequências especificas de ácidos nucleicos requerem pessoal especializado, devido à elevada complexidade das técnicas empregues que necessitam de treino e equipamento altamente dispendioso e são apenas susceptiveis de serem levadas a cabo em ambiente laboratorial. CJrge assim o desenvolvimento de processos mais simples, de baixo custo, rápidos e fiáveis, com a possibilidade de portabilidade.

Os ácidos nucleicos constituem o material genético de qualquer organismo vivo, contendo informação especifica que permite a sua completa caracterização. É possível identificar sequências características de cada ser vivo, permitindo obter informação relevante: identificação de sequências; identificação de mutações causadoras de doença; detecção de agentes patogénicos tais como bactérias e vírus, etc. [1].

As características de um determinado organismo são o resultado de uma complexa interacção entre genoma e ambiente. A maioria das alterações desta interacção, por muito subtis que sejam, origina alterações de expressão génica e, como tal, diferentes comportamentos do organismo em determinado envolvimento ambiental. 3

Posto isto, a caracterização de sequências de ADN no Homem reveste-se de particular importância devido à influência que o genoma e suas alterações têm no estado de saúde de um indivíduo. As alterações mais comuns no Homem são as variações de um único nucleótido numa determinada sequência, seja codificante de gene ou não. Estas alterações denominam-se polimorfismos, mais concretamente Polimorfismos de Nucleótido Único (SNP). Os SNP são apenas um dos vários tipos de alteração da sequência do genoma humano. Outras alterações incluem, mas não se encontram limitadas a, inserções e/ou deleções de um ou mais nucleótidos, duplicações, etc.

Os SNP são os polimorfismos mais frequentes no genoma humano, constituindo cerca de 68% de todas as alterações de sequências detectadas. Para alguns exemplos podem ser consultados: Celera's Human RefSNP (www.celera.com), NCBI dbSNP (www.ncbi.nlm.nih.qov/SNP/index.html) , Human Genome Variation Database-HGVbase (http://hgvbase.cgb.ki.se) , The Human Gene Mutation Database-HGMD (http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmdO.html) e HGBASE - Human Genic Bi-Allelic Sequences (http://hgbase.interactiva.de).

Os SNP encontram-se dispersos por todo o genoma humano - em regiões codificantes para proteínas, onde podem alterar as propriedades dessa proteína e sua expressão; nas regiões não-codificantes, onde podem alterar parâmetros de expressão e modificar fenómenos essenciais à expressão génica (excisão de exões - splicing) enquanto outros não provocam qualquer alteração na proteína, mas poderão alterar a estabilidade e maturação do ARN mensageiro e sua localização. 4

Outros SNP encontram-se afastados das regiões codificantes e, à semelhança dos anteriores, podem afectar e modular a expressão de um ou mais genes localizados na sua vizinhança ou em regiões genómicas que interagem com a região que alberga estes polimorfismos. Podem, ainda, alterar disponibilidade de promotores e sequências potenciadoras e silenciadoras de determinados genes [2, 3, 4, 5]. Deste modo, a variabilidade inter-individual tem vindo a ser associada à susceptibilidade individual a diversas doenças multifactoriais como o cancro, a diabetes, bem como a outras alterações relacionadas com o metabolismo endógeno ou de xenobióticos [6, 7]. A literatura descreve várias metodologias moleculares para a caracterização de sequências de ácidos nucleicos para detecção de organismos patogénicos, como por exemplo agentes de várias doenças cujo hospedeiro é o Homem: tuberculose, doença do legionário, malária, etc. [8, 9, 10]. A maioria destas aplicações são pouco sensíveis necessitando de métodos morosos de extracção e purificação de ácidos nucleicos. Outras baseiam-se na amplificação enzimática de sequências de ADN por reacção de polimerização em cadeia (Polymerase Chain Reaction - PCR) [11] como processo preparativo prévio com o intuito de aumentar a sensibilidade do método analítico utilizado. hibridação

Existem várias aplicações da técnica de PCR para a detecção directa de sequências especificas de ácidos nucleicos sem necessidade de métodos analíticos subsequentes. Todavia, todos estes métodos são muito complexos, necessitando de mão-de-obra qualificada e equipamentos dispendiosos para a análise de resultados. A maioria das técnicas de caracterização de sequências de ácidos nucleicos baseia-se na 5 selectiva e específica de um pequeno oligonucleótido (sonda) com a sequência do ácido nucleico complementar (alvo).

Actualmente, os métodos de fluorescência ou radioactivos são os mais utilizados para a detecção de sequências específicas por hibridação. Contudo, verifica-se que estas técnicas são de elevado custo e demasiado lentas [12, 13] . Para além disso, as técnicas de hibridação necessitam de uma quantidade apreciável de matéria-alvo para se obter um sinal. Deste modo, normalmente só são passíveis de ser aplicadas após um processo de amplificação da amostra do ácido nucleico em questão, através de técnicas de PCR. A PCR permite obter uma amplificação do número de cadeias de ácido nucleico disponível, mimetizando o que sucede na multiplicação das células de um organismo.

Novas técnicas de amplificação em tempo real (por ex., Real-Time PCR) oferecem um elevado nível de automação e diminuem o tempo necessário para amplificação e detecção. Com a utilização destas técnicas, é também possível a obtenção de resultados quantitativos. Porém, apesar do elevado preço do equipamento e custo por teste associado, existe uma grande desvantagem nestas tecnologias que impossibilita um uso mais alargado nos laboratórios - o manuseamento das amostras, visto ser necessário amostras altamente purificadas, o que, consequentemente, requer laboratórios e pessoal altamente especializado [14, 15].

Mais recentemente, os chips (micro-conjuntos de sensores integrados) de ácidos nucleicos têm ganho alguma popularidade. A sua maior aplicação tem sido em estudos de expressão génica, onde os chips oferecem simultaneidade de análise de vários 6 genes para uma única amostra. Basicamente esta técnica baseia-se em hibridação de um elevado número de amostras em simultâneo, recorrendo a quantidades mínimas de amostra. Porém, o passo de amplificação continua a ser necessário. Adicionalmente, o conteúdo do chip é ainda um problema por resolver, sendo que esta é também uma tecnologia dispendiosa uma vez que estes chips não são reutilizáveis [16].

Actualmente, a detecção de SNP e/ou mutações é levada a cabo através de técnicas baseadas em enzimas de restrição, marcadores radioactivos ou fluorescentes (Sistema de

Amplificação Refractária de Mutações - ARMS, Análise

Conformacional do Polimorfismo em Cadeia Simples - SSCP, Análise do Polimorfismo pelo Tamanho de Fragmentos de Restrição RFLP, espectroscopia de massa, chips-ADN, sequenciação, etc.), que na sua maioria recorrem à amplificação da sequência alvo por PCR [17]. Estas técnicas são, por norma, complexas, morosas e dispendiosas. Entre elas podemos destacar os chips-ADN e a sequenciação directa, sendo esta última a técnica de referência. A tecnologia de chips-ADN tornou possível a análise simultânea em larga escala de diferentes SNP, mas, como já foi referido, os custos elevados dos equipamentos e reagentes impedem a sua aplicação em análises de rotina, colocando-a fora do alcance da maioria dos laboratórios de diagnóstico molecular. A sequenciação directa continua a ser um processo dispendioso, que requer mão-de-obra e equipamento especializado, pelo que deverá ser apenas utilizada como complemento de forma a confirmar resultados obtidos por outras técnicas menos dispendiosas (ou seja, técnicas de rastreio). 7 Vários métodos colorimétricos de detecção de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidos [18, 19, 20]. Alguns destes métodos baseiam-se nas propriedades ópticas (ressonância plasmónica) de nanoparticulas de ouro ou outros metais [21, 22], função da sua forma e tamanho. Estas nanoparticulas de ouro ou outro metal, tal como prata ou ligas prata-ouro, são extremamente sensíveis às alterações do meio, apresentando uma variação de cor, de vermelho para azul no caso do ouro. A variação de cor pode ser o resultado da aproximação de várias partículas, por exemplo por acção de uma cadeia complementar de um determinado ADN/ARN. A mudança de cor é uma resposta macroscópica que é oriunda dos fenómenos que ocorrem numa escala nanométrica, onde o ácido nucleico pode reagir de forma complementar ou não complementar. Para cada uma destas reacções existe uma resposta diferente de absorção da luz incidente. Deste modo, a hibridação de sondas de ADN ligadas a partículas de ouro para a identificação de sequências específicas é uma técnica de baixo custo e fácil de realizar, podendo vir a ser uma alternativa aos métodos convencionais.

Foram descritos vários métodos para síntese de nanoparticulas de metais nobres, nomeadamente de nanoparticulas de ouro coloidal. Entre os métodos mais utilizados, encontra-se o método da redução do HAuC14 pelo citrato de sódio, do conhecimento de qualquer um especialista na arte. É possível controlar o tamanho das partículas resultantes de modo a que a média de tamanhos se situe entre 13 e 17 nm. Estas partículas apresentam-se estabilizadas pelas moléculas de citrato, que evitam que as nanoparticulas se aproximem e agreguem, acabando por precipitar. A distância inter-partícula é assim mantida 8 pela repulsão entre as cargas das moléculas de citrato que funciona como um agente de revestimento (capping agent). Qualquer alteração das caracteristicas dielétricas do meio poderá modificar as cargas potenciando a aproximação das nanoparticulas e sua agregação. As soluções de nanopartícuias de ouro coloidal apresentam uma coloração vermelha devido à intensa absorção a 525 nm, resultante de fenómenos de ressonância de superfície do plasmão. A agregação das nanoparticulas provoca um deslocamento da banda de ressonância de superfície do plasmão para comprimentos de onda superiores (entre 600 e 700 nm), resultando numa alteração da coloração da solução contendo as nanoparticulas de vermelho para azul. A agregação pode ser induzida por vários tipos de alteração de caracteristicas do meio: concentração salina/força iónica, pH, temperatura, etc.

Em nanoparticulas de ouro coloidal sintetizadas como descrito supra, pode substituir-se a camada de revestimento de citrato por oligonucleótidos de ADN funcionalizados com um grupo tiol na extremidade 3' ou 5' . As moléculas de ADN ficam ligadas à superfície das nanoparticulas através do grupo tiol, que possui grande afinidade para o ouro.

Esta alteração foi descrita por Mirkin e colegas em 1996 [23], que funcionalizaram nanoparticulas de ouro coloidal com oligonucleótidos nas extremidades 3' e 5' (denominando-se nanossondas) , em que as sequências eram complementares de uma forma cabeça-com-cauda com uma sequência alvo e foram utilizadas em experiências de caracterização de sequências de ADN alvo. Quando ocorre hibridação entre as duas sequências de ADN ligadas às nanoparticulas de ouro e a molécula alvo de ADN, 9 há uma aproximação das nanoparticulas (formação de uma rede por reticulação) e consequente agregação das nanoparticulas próximas. Esta agregação provoca a mudança de cor da solução de vermelho para azul, consistindo no método de detecção colorimétrico de sequências de ADN. Mediante controlo de temperatura, é possível detectar emparelhamento de apenas uma base.

Outros métodos utilizando uma abordagem semelhante foram descritos. Especial interesse tem o método relatado por Sato e colaboradores que descrevem um método de detecção especifico de sequências de ADN baseado na hibridação de uma única nanossonda com a molécula alvo, seguido de uma reacção de extensão de um nucleótido para a detecção de SNP [24]. 0 aumento da força iónica do meio provoca apenas a agregação dos complexos alvo-nanossondas complementares, levando ao aparecimento da cor azul. Este método é independente da temperatura e reporta-se a uma complementaridade total (em tamanho e sequência de nucleótidos) entre as sequências da nanossonda e do ADN alvo. 0 método do presente invento utiliza uma abordagem diferente, em que se recorre a uma única nanossonda ligada directamente à nanoparticula de ouro, que apresenta em solução uma coloração vermelha. A agregação destas nanossondas por aumento da força iónica do meio, provoca a alteração de cor para azul. A presença de uma sequência de ADN alvo totalmente complementar à sequência da nanossonda, evita esta agregação e a solução mantém-se vermelha. Esta mudança de cor entre soluções de nanossondas na presença ou ausência de sequências de ADN complementares constitui a base molecular do método descrito neste invento. 10

Este principio foi já aplicado com sucesso na detecção de ADN de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose humana, em amostras clinicas, com grande sensibilidade e na detecção da presença de sequências de ARN mensageiro especificas, permitindo a sua aplicação em estudos de expressão génica [20, 25]. O método é altamente sensível por si só, sem necessidade de posterior aumento e potenciação de sinal, permitindo discriminar entre sequências totalmente complementares e com apenas um nucleótido não complementar, podendo assim estender-se a sua aplicação ao diagnóstico de mutações e SNP.

Actualmente existem vários documentos que abordam técnicas relacionadas com esta área:

Assim, o documento CN1321776 descreve um método de detecção de moléculas biológicas (i.e. ADN ou proteínas) utilizando grânulos de ouro como agente repórter da ocorrência de hibridação específica. Após hibridação, os grânulos ficam imobilizados numa superfície, à qual é posteriormente aplicado um reagente para amplificação de sinal do agente repórter. Este processo difere substancialmente do invento proposto, nomeadamente na forma de detecção da molécula biológica em que a hibridação com a nanossonda é directamente observável a olho nu pela alteração colorimétrica verificada aquando do aumento da força íóníca do meio, enquanto que o processo divulgado no documento CN1321776 obriga a leitura microgravimétrica dos resultados através de uma microbalança de cristal de quartzo.

Os documentos WO03033735, W02004042084 e CN1354258 referem-se ao processo de detecção e/ou determinação de sequências 11 especificas de ácidos nucleicos através da sua hibridação em tiras cromatográficas, utilizando nanopartículas de ouro, funcionalizadas com oligonucleótidos, como agente repórter. 0 processo não explora assim as propriedades de alteração de cor das nanopartículas de ouro para detecção de ácidos nucleicos. O documento JP2004329096 descreve um método de testar a complementaridade entre um ácido nucleico imobilizado numa superfície de um substrato e um ácido nucleico alvo, utilizando nanopartículas de ouro como agente repórter. Este método é bem distinto do presente invento pela sua estrutura e método de detecção, nomeadamente no presente invento a detecção realiza-se em meio líquido sem necessidade de funcionalizar quaisquer superfícies ou de recorrer a estruturas imobilizadas e o resultado de detecção da molécula biológica é directamente observável a olho nu pela alteração colorimétrica verificada aquando do aumento da força iónica do meio. 0 documento US2004185462 descreve um sistema de chip baseado em eléctrodos de ouro funcionalizados com oligonucleótidos de diversas sequências. A aplicação de uma corrente eléctrica permite assim detectar e analisar mutações pontuais e SNP em ADN de cadeia dupla. O recurso a corrente eléctrica não é considerado no presente invento que para a detecção de mutações e SNP utiliza um processo colorimétrico sem recorrer a aparelhagem extra. 0 documento JP2004275187 refere-se ao método de detecção de um ADN alvo em solução, já aqui descrito como o método de Sato e colegas [24]. Difere do invento aqui proposto pela metodologia utilizada, que é mais simples, e que se reflecte também no 12 resultado de detecção final, que é divergente e menos susceptivel a falsos negativos (i.e. a formação de agregados neste documento verifica-se apenas quando ocorre hibridação total do ADN alvo complementar com a nanossonda, enquanto que no presente invento a formação de agregados é observável apenas para os casos em que não ocorre hibridação total do ADN alvo com a nanossonda). 0 presente invento apresenta também a vantagem de não se encontrar limitado a ácidos nucleicos alvo com sequências de tamanho igual ao da sequência da nanossonda, tal como acontece com o método de detecção descrito neste documento, possibilitando assim a sua aplicação de forma prática e directa a ácidos nucleicos de diferentes tamanhos. 0 documento US2006222595 refere-se à produção de nanoparticulas de ouro, entre outros metais, para uso terapêutico. Descreve também um método de diagnóstico por ressonância magnética, rádio-imagem, raios-X ou infravermelhos, podendo as nanoparticulas serem utilizadas como agente contrastante. O presente invento não contempla o uso das nanoparticulas, ou nanossondas, para fins de agente contrastante, mas como sistema de detecção de sequência por diferenciação colorimétrica. 0 documento JP2005227154 descreve um método de detectar um gene especifico e variações monobase, ou outras semelhantes, nesse mesmo gene. Para tal o método recorre a um eléctrodo onde se encontra o gene imobilizado e a nanoparticulas de ouro modificadas com apenas um nucleótido, tendo uma actividade electroquimica diferente para cada uma das quatro bases do código genético. Estas nanoparticulas modificadas são então hibridadas sequencialmente com o gene imobilizado, ao mesmo tempo que são feitas medições electroquimicas para detectar as 13 variações no gene. O recurso a meios electroquimicos não é contemplado no presente invento, para a detecção específica, mas apenas a verificação de alteração de cor da solução. 0 documento US2005208592 refere-se a um método de detectar microorganismos utilizando um eléctrodo, que poderá ser recoberto com nanopartícuias de ouro, e um contra-eléctrodo. 0 recurso a meios electroquimicos não é contemplado no presente invento, sendo apenas a verificação de alteração de cor da solução suficiente para efectuar a detecção. O documento US2006029969 refere-se a um método de sequenciação de ácidos nucleicos por Espectroscopia de Raman de Ressonância (SERS), mediada por nanoparticulas de ouro ou prata. 0 presente invento não recorre a quaisquer espectroscopias de Raman (i.e. SERS, SERFS, CARS), mas apenas à verificação de alteração de cor da solução perceptível a olho nu. 0 documento W02006021091 refere-se à detecção de moléculas farmacológicas através de espectroscopia de impedância. Neste processo, nanoparticulas de ouro recobertas de ADN, são depositadas num eléctrodo de ouro por forma a obter uma amplificação de sinal. 0 presente invento não recorre a espectroscopia de impedância, mas apenas à verificação de alteração de cor da solução perceptível a olho nu. 0 documento CN1392269 refere-se a um método de detecção de ácidos nucleicos por chip. 0 processo inclui a extracção do gene alvo, marcação do gene alvo com um antigénio e hibridação com o chip. Posteriormente, nanoparticulas de ouro modificadas com anticorpos complementares aos antigénios de marcação do 14 gene alvo são aplicadas no chip. O sinal é ainda amplificado por um reagente de prata e detectado por uma câmara de CCD. Este processo em nada tem a ver com o presente invento, na medida em que se trata de um sistema imobilizado num chip, utiliza nanoparticulas de ouro funcionalizadas com antigénios, ao invés de oligonucleótidos, e não tira proveito de alterações colorimétricas das nanoparticulas de ouro, mas das suas propriedades redutoras sobre iões prata. 0 documento CN1464070 reporta um método de detecção de ADN através da combinação de uma microbalança de cristal de quartzo e nanoparticulas de ouro. 0 presente invento não contempla o uso de microbalança de cristal de quartzo, mas a verificação de alteração de cor da solução perceptivel a olho nu. 0 documento US2003013096 descreve um método de detecção de ADN em que nanoparticulas de ouro são colocadas à superfície de um substrato para posteriormente serem funcionalizadas com oligonucleótidos modificados com um grupo tiol. De seguida, o processo de detecção é levado a cabo por ADN de cadeia simples modificados com uma molécula fluorescente. 0 presente invento não recorre a marcadores fluorescentes, mas a nanoparticulas de ouro coloidal. 0 documento EP0667398 reporta um método de detecção de ADN através de nanossondas de ouro e recorrendo a espectroscopia de Raman. Uma solução contendo ADN alvo e a nanossonda de ouro é submetida a diferentes temperaturas para fomentar a desnaturação e hibridação do ADN alvo com a nanossonda. Caso o ADN alvo contenha uma sequência complementar à sequência da nanossonda, ocorre hibridação e forma-se uma cadeia dupla à 15 superfície da nanossonda, caso contrário, a cadeia simples de ADN da nanossonda é mantida inalterada. Recorrendo a espectroscopia de Raman é possível identificar se ocorreu hibridação ou não. 0 presente invento não contempla o uso de espectroscopia de Raman para detecção do ADN alvo, mas à verificação de alteração de cor da solução perceptível a olho nu.

0 documento US2002127574 descreve um método de detecção de ácidos nucleicos recorrendo a um, ou mais, tipos de nanopartícuias funcionalizadas com oligonucleótidos. Numa parte do método, nanopartícuias de ouro são funcionalizadas com oligonucleótidos de sequências complementares a porções contíguas à sequência do ácido nucleico alvo (nanossondas). A hibridação dos dois tipos de nanossondas de sequências contíguas com o ácido nucleico alvo, vai provocar uma mudança de cor devido à aproximação induzida entre as nanopartículas. Este processo difere largamente do presente invento, na medida em que não recorre ao emparelhamento de duas nanossondas para detectar o ADN alvo por mudança de cor e também porque descreve um processo completamente distinto que dá origem à respectiva mudança de cor. 0 documento descreve também um método de detecção de ácidos nucleicos em que oligonucleótidos com parte da sequência complementar à sequência alvo se encontram imobilizados numa superfície, e a outra parte complementar da sequência alvo constitui a sequência de oligonucleótidos funcionalizados em nanoparticulas de ouro (nanossonda). Desta forma, os ácidos nucleicos a serem detectados e analisados hibridam parcialmente com os respectivos oligonucleótidos imobilizados e, simultaneamente, parcialmente com a respectiva nanossonda de ouro, num processo designado por "Sandwich". A 16 presença de nanossonda em determinados pontos da superfície reporta a sequência alvo a ser detectada. Opcionalmente, pode-se dar ainda um processo de amplificação de sinal utilizando um reagente de prata. Neste processo, e em todas as suas variantes, não se tira partido de alterações colorimétricas para detecção da moléculas alvo, pelo que difere largamente do presente invento, uma vez que este assenta na detecção colorimétrica. 0 documento US2002127574 descreve ainda processos de fabricar nanomateriais e nanoestruturas, e processos de purificação de ácidos nucleicos, que não são contemplados, nem objecto de interesse, no presente invento. 0 documento W02006104979 descreve um método de identificação de proteínas recorrendo a um processo de "código de barras". Dois tipos de partículas são aplicados: micropartícuias magnéticas funcionalizadas com um anticorpo específico para a proteína alvo a detectar; e nanopartículas de ouro funcionalizadas com anticorpos específicos para a mesma proteína alvo e um largo número de oligonucleótidos que estão hibridados com os seus oligonucleótidos complementares. Este oligonucleótidos complementares funcionam como um "código de barras" biológico, servindo de marcador para uma determinada proteína. Os dois tipos de partículas são então misturados na solução contendo a proteína alvo a detectar. Ambas a partículas ligam-se apenas com a sua respectiva proteína alvo. Os complexos formados de partículas e proteína alvo são posteriormente capturadas por um campo magnético, enquanto que as restantes proteínas e nanopartículas não complexadas são descartadas por lavagem da solução. Seguidamente, os "códigos de barra" são liberados das nanopartículas e analisadas para identificar a proteína alvo. 0 método de análise dos "códigos de barra" encontra-se descrito 17 no documento US2002127574. O presente invento não contempla a detecção de proteínas e difere em larga escala do método descrito no documento US2002127574, uma vez que se baseia em alterações colorimétricas para detectar e identificar o alvo. 0 documento WO03048769 refere-se a um método de monitorização em tempo real de uma amplificação por PCR, recorrendo a nanossondas de ouro. 0 método conjuga o processo de amplificação por PCR com o método de detecção de ácidos nucleicos por emparelhamento de duas nanossondas de ouro. Desta forma, à medida que se vão formando mais cadeias de ADN (produto da reacção de amplificação), as duas nanossondas complementares contiguamente à sequência amplificada vão hibridando com elas e, por conseguinte, ocorre uma alteração de cor que pode ser medida em tempo real através de um aparelho de espectroscopia. 0 presente invento não recorre ao emparelhamento de duas nanossondas para detectar o ADN alvo por mudança de cor, ocorrendo esta por fenómenos de hibridação específica ou de não hibridação, que dá origem à respectiva mudança de cor por aumento da força iónica. 0 documento CN1661094 relaciona-se com um método de detecção colorimétrico de mutações génicas através da combinação da amplificação de alelos específicos com nanopartícuias de ouro e um electrólito. Quando existe em solução um ADN alvo com a mutação complementar ao oligonucleótido iniciador da reacção de amplificação de alelos específicos, esse mesmo oligonucleótido iniciador é consumido para levar a cabo a reacção e, por conseguinte, forma-se uma cadeia dupla de ADN (solução A). Quando o ADN alvo está ausente, ou não é complementar ao oligonucleótido iniciador, a reacção de amplificação não ocorre 18 e o oligonucleótido iniciador não é consumido, ficando em solução na sua forma de cadeia simples (solução B) . Após a adição de um electrólito à solução, apenas no caso da solução A vai ocorrer uma mudança de cor vermelha para azul. No caso da solução B a cor mantém-se inalterada. O processo descrito difere substancialmente do aqui apresentado na medida em que não utiliza nanoparticulas de ouro funcionalizadas com oligonucleótidos modificados. Por outro lado, o resultado colorimétrico difere do obtido através do método aqui proposto, na medida em que num resultado positivo (i.e. detecção do ADN alvo complementar ao oligonucleótido iniciador) verifica-se mudança de cor, enquanto que no método descrito no presente documento a cor se mantém inalterada quando se detecta um alvo complementar. 0 processo aqui descrito é também dependente de uma reacção de amplificação de alelos específicos, enquanto que no presente invento, tal reacção de amplificação é um passo opcional.

Testes de amostras biológicas, como por exemplo, no caso específico de ADN/ARN e proteínas são já utilizados num campo variado de aplicações.

Existem alguns estojos com base nas tecnologias acima descritas, diferentes do método aqui proposto, para a detecção de mutações/SNP. Nomeadamente, tirando partido de marcadores fluorescentes existe o sistema de detecção AcycloPrime-FP SNP (Perkin Elmer), o sistema SNaPshot Multiplex (Applied Biosystems) , o sistema de genotipagem SNPlex (Applied Biosystems) e o sistema LightTyper (Roche Applied Science); tirando partido da Real-Time PCR existe o sistema TaqMan (Applied Biosystems); e tirando partido da tecnologia de chips 19 existe o sistema GeneChip Custom SNP (Affymetrix). Contudo, todos estes estojos/sistemas requerem mão-de-obra especializada, reagentes e equipamentos dispendiosos e de difícil portabilidade, inviabilizando a sua execução no local de aplicação {poínt-of-care).

Assim, um estojo baseado no método colorimétrico do presente invento tem a vantagem de poder detectar mutações/SNP em ácidos nucleicos de uma forma fácil e barata, directamente no local de aplicação (point-of-care), sem necessidade de recorrer a equipamento e pessoal especializados.

Descrição Geral da Invenção 0 presente invento refere-se a um processo nanotecnológico para a detecção específica e ultra-sensível de mutações/SNP em sequências de ácidos nucleicos, de uma forma simples, rápida e barata, não comprometendo a qualidade. 0 método baseia-se na utilização de nanopartículas de ouro coloidal funcionalizadas com oligonucleótidos (nanossondas) para a detecção da presença de mutações/SNP em sequências de ácidos nucleicos. 0 mecanismo de detecção baseia-se nas propriedades ópticas desta solução, ao mudar o máximo de absorção em função da proximidade entre nanopartículas, em função da presença ou ausência de sequências de ácidos nucleicos complementares, após variação da força iónica do meio (adição de sal).

A mudança de cor é uma resposta macroscópica que é oriunda dos fenómenos que ocorrem numa escala nanométrica, onde o ADN/ARN 20 pode reagir de forma complementar ou não complementar com o oligonucleótido, de sequência conhecida, funcionalizado nas nanopartícuias. Para cada uma destas reacções existe uma resposta diferente de absorção da luz incidente. A nanossonda de ácidos nucleicos é formada por nanoparticulas de ouro coloidal ligadas a uma sequência de ADN conhecida. Esta solução possui nanoparticulas com diâmetros médios de 17 nm, ou mais, onde o pico de absorção se situa aproximadamente nos 520 nm em virtude da ressonância plasmónica, apresentando uma coloração vermelha.

As nanoparticulas de ouro coloidal são sintetizadas por métodos correntes na prática de quem é especialista na arte, como por exemplo o método de redução de um sal de ouro (por ex., HAuC14) com um sal de citrato. É possível controlar o tamanho das partículas resultantes por alteração das proporções citrato/ HAuC14 de modo a que a média de tamanhos se situe nos 13 a 17 nm.

Estas partículas apresentam-se estabilizadas pelas moléculas de citrato, que evitam que as nanoparticulas se aproximem e agreguem, acabando por precipitar. A distância inter-partícuias é assim mantida pela repulsão entre as cargas dos iões citrato. A alteração das características dieléctricas do meio poderá modificar as cargas potenciando a aproximação das nanoparticulas e sua agregação.

As soluções de nanoparticulas de ouro coloidal, cujas partículas apresentam um diâmetro entre 13 e 17 nm, apresentam uma coloração vermelha devido à intensa absorção a 525 nm, 21 resultante de fenómenos de ressonância de superfície do plasmão. A agregação das nanopartículas provoca um deslocamento da banda de ressonância de superfície do plasmão para comprimentos de onda superiores (cerca dos 600 a 700 nm) , resultando numa alteração da coloração da solução contendo as nanopartículas de vermelho para azul. A agregação pode ser induzida por vários tipos de alteração de caracteristicas do meio: concentração salina e força iónica, pH, temperatura, etc.

As nanopartículas de ouro coloidal podem ser funcionalizadas com cadeias simples de ácidos nucleicos através de um grupo tiol na extremidade 3' ou 5' da molécula de ADN. As moléculas de ADN ficam ligadas à superfície das nanopartículas através do grupo tiol, que possui grande afinidade para o ouro. A molécula de cadeia simples de ADN pode ainda ter n grupos alquilo intermediários à ligação com o grupo tiol. As nanopartículas funcionalizadas por ADN de cadeia simples - nanossondas permanecem estabilizadas em solução devido à forte repulsão entre as cargas negativas das cadeias de fosfato da molécula de ADN, que podem ser em número cerca de 200 ou mais e que substituíram os iões citrato. Deste modo, a solução de nanossondas a pH 7,0 - 8,0 encontra-se vermelha e estável, com um máximo de absorção característico a 520-525 nm. A agregação das nanossondas pela alteração das caracteristicas dieléctricas do meio (pH, força iónica, concentração salina, temperatura), provoca um deslocamento do máximo de absorção para comprimentos de onda superiores (aproximadamente 600 a 700 nm) e a solução torna-se azul. 22 A amostra biológica contendo a sequência de ADN/ARN alvo a ser analisada é desnaturada pelo calor conjuntamente com a respectiva nanossonda. Após arrefecimento, durante o qual poderá ocorrer a hibridação entre as cadeias de ADN da nanossonda e da molécula ADN/ARN alvo caso exista complementaridade, é adicionado um electrólito para revelação instantânea do resultado final. Este electrólito pode ser, mas não se encontra limitado a, NaCl, MgCl2, NíC12, NaBr, ZnCl2, MnCl2, BrCl, CdCl2, CaCl2, CoCl2, C0CI3, CuCl2, CuCl, PbCl2, PtCl2, PtCl4, KC1, RbCl, AgCl, SnCl2, BrF ', LiBr, KBr, AgBr, NaN02, NH3PO4/ Na2HP04, NaH2P04, kh2po4, K2HP04, e que é responsável pelo aumento de força iónica do meio. Desta forma, caso a amostra em análise contenha uma sequência 100% complementar à nanossonda utilizada, a cor vermelha inicial manter-se-á após adição do electrólito, porque a presença de uma sequência de ácidos nucleicos alvo totalmente complementar à sequência da nanossonda, leva à hibridação especifica, evitando a agregação das nanoparticulas aquando o aumento da força iónica e a solução mantém-se vermelha.

Caso não exista uma sequência complementar, ou haja uma mutação pontual relativamente à nanossonda utilizada, visualizar-se-á uma mudança da cor inicial vermelha para azul, não há o efeito protector descrito anteriormente e as nanossondas agregam, provocando a alteração de cor para azul.

Esta mudança de cor entre soluções de nanossondas na presença ou ausência de sequências de ácidos nucleicos complementares constitui a base molecular do método descrito neste invento. Este método é altamente sensível por si só, sem necessidade de posterior aumento e potenciação de sinal, permitindo 23 discriminar entre sequências totalmente complementares e com apenas um nucleótido não complementar. É, pois, possível discriminar sequências totalmente complementares de sequências com um ou mais nucleótidos não-complementares, por pequenas alterações de estabilidade das nanossondas em solução, ou seja, a maior resistência à agregação para a mesma força iónica é tanto maior quanto maior for a complementaridade entre sequências. Os nucleótidos não-complementares destabilizam o complexo nanossonda-molécula alvo, diminuindo a repulsão e provocando uma agregação lenta e gradual que pode ser monitorizada e constitui a base para a detecção de SNP e mutações em ácidos nucleicos. 0 método consiste na adição da amostra de ácidos nucleicos a uma solução contendo a nanossonda numa concentração final em nanopartícuias de ouro de 2,5 nM.

Cada teste tem por base três ensaios - Branco, sem ácidos nucleicos; Negativo, com um ADN/ARN não-complementar à nanossonda; Positivo, com um ADN/ARN complementar à nanossonda. Estes ensaios (branco, negativo, positivo) constituem o controlo da reacção.

Em paralelo ao controlo da reacção é/são efectuado(s) um (ou mais) ensaio (s) com o ácido nucleico alvo a ser testado para uma (ou mais) mutação(ões)/SNP específico(s). A hibridação é levada a cabo por arrefecimento até uma temperatura ambiente entre 10 e 30°C após um pré-aquecimento para desnaturação completa da hélice dupla de ADN da amostra ou de estruturas secundárias do ARN. Após o período de 24 arrefecimento, que pode ir dos 0 minutos até 24 horas, adiciona-se uma solução salina para alteração da força iónica. 0 ácido nucleico alvo encontra-se numa concentração entre 0 e 100 ug/ml, com um óptimo de reacção para valores entre 18 e 36 ug/ml. A alteração da força iónica poderá ser levada a cabo através da adição de soluções salinas de NaCl, MgCl2, NiCl2, NaBr, ZnCl2/ MnCl2, BrCl, CdCl2, CaCl2, CoCl2, C0CI3, CuCl2, CuCl, PbCl2, PtCl2, PtCl4, KC1, RbCl, AgCl, SnCl2, BrF, LiBr, KBr, AgBr, NaN02, Na3P04, Na2HP04, NaH2P04, ΚΗ2Ρ04, K2HP04, ou outras. Também a alteração das soluções de hibridação e/ou de ressuspensão das nanossondas poderão ter efeito de agregação discriminatória das nanossondas. Cada uma destas alterações poderá ainda ter correlação com o valor de pH do meio.

Para a mesma força iónica do meio, pH e temperatura, as moléculas cuja alteração nucleotidica for na posição 3' da sequência das nanossondas têm um efeito mais destabilizador, relativamente às localizadas no interior da sequência das nanossondas.

Para além das alterações colorimétricas serem visíveis a olho nu, pode-se recorrer a um simples espectrofotómetro para análise de desvio do pico máximo de absorção. Este método pode ser introduzido em sistemas de análise em paralelo por meio de um leitor de microplacas que determine os máximos de absorção das amostras. A diferença colorimétrica da solução contendo as nanossondas, na presença ou ausência de uma sequência complementar, é fácil 25 e rapidamente visível a olho nu sem necessidade de instrumentação adicional. Esta mudança de cor, de vermelho para azul, deve-se a alterações na ressonância plasmónica superficial das nanoparticulas de ouro, caracteristica da sua forma, tamanho e meio envolvente.

Os resultados mostram dois máximos de absorção com um comportamento de função gaussiana, nomeadamente: centrado a 525 nm, que representa a interacção entre a sonda e ADN/ARN cuja sequência é totalmente complementar; centrado nas baixas energias, aproximadamente 600 nm, que representa as reacções não complementares, onde apenas um nucleótido não complementar pode causar a variação de agregação (ver Figura 2). O método permite efectuar um diagnóstico rápido de mutações e polimorfismos genéticos responsáveis por doença ou alteração de susceptibilidade a determinadas doenças (por exemplo, cancro) ou a determinados xenobióticos (farmacogenómica).

As nanoparticulas de metais nobres (geralmente em soluções coloidais) perspectivam excelentes potencialidades para aplicação na detecção química e biológica devido às suas propriedades ópticas e eléctricas únicas. Para além disso, a sua síntese comporta baixos custos e é de fácil produção. O facto de ser um método colorimétrico permite que o resultado seja rapidamente obtido sem necessidade de recorrer a aparelhos de detecção volumosos e dispendiosos, possibilitando a sua execução fora do ambiente laboratorial. 26 A rapidez, simplicidade, portabilidade e especificidade do método, associado ao seu baixo custo, são caracteristicas únicas e relevantes que potenciam a sua aplicação em ambiente clinico e hospitalar, como método de diagnóstico no local de aplicação (point-of-care) . Este processo possibilita a detecção in si tu e em tempo real, permitindo diminuir os tempos para obtenção de resultados e custos associados. 0 método proposto tem assim um elevado potencial de se tornar rapidamente numa importante e imprescindível ferramenta para os profissionais da saúde, entre outros.

Análises de amostras biológicas, como por exemplo no caso específico de ADN e proteínas, são utilizadas na análise forense, nos mercados de diagnóstico clínico e laboratorial e em investigação. Actualmente estas técnicas são utilizadas para o diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, embora o diagnóstico de cancro e a genética (investigação) representem áreas relevantes de aplicação.

As principais indústrias que actualmente utilizam métodos de detecção de amostras biológicas, como por exemplo no caso específico de ADN/ARN e proteínas são: • Organizações de Defesa: questões ligadas à bio-segurança têm provocado o aumento na procura de soluções fiáveis e rápidas para testes de ADN/ARN, especialmente nos Estados Unidos. • Instituições Médicas: são utilizados para diagnóstico médico, nomeadamente para o rastreio de doenças genéticas ou identificação de agentes patogénicos. 27 • Organizações de I&D: vários testes moleculares são efectuados recorrendo à detecção de ADN/ARN para efeitos de investigação. • Centros de saúde e laboratórios para rasteio e análise de doenças infecto-contagiosas. • Organização Mundial da Saúde • Organizações Governamentais e Não Governamentais de apoio ao combate, detecção e erradicação de doenças patogénicas e ligadas à pobreza (malária, tuberculose, VIH)

Para além destas indústrias, que actualmente já utilizam métodos de detecção de amostras biológicas, como por exemplo, no caso específico de ADN/ARN e proteínas, novos segmentos poderão também recorrer a estes testes, tais como: • Indústria alimentar, para controlo de qualidade dos produtos, através de amostragem dos produtos e análises laboratoriais. • Indústria farmacêutica, para testes de quantificação da acção medicamentosa. • Indústria Veterinária/Agrícola, para detecção de agentes patogénicos, nomeadamente no caso da indústria agrícola, para a detecção de organismos geneticamente modificados. 0 método proposto poderá ainda ser reproduzido num dispositivo, como por exemplo num estojo, para a detecção de mutações/SNP em sequências de ácidos nucleicos no local de aplicação (point-of-care) . Este estojo é assim composto por uma ou mais soluções com nanossondas para determinadas mutações/SNP de interesse, uma solução tampão de hibridação, uma solução de revelação e uma ou mais soluções de controlo contendo ácidos nucleicos não- 28 complementares e complementares à(s) nanossonda(s). Estas soluções são depois misturadas em poços, de uma ou mais microplacas, seguindo o procedimento do método, permitindo assim visualizar-se directamente a olho nu os resultados obtidos ou, opcionalmente, efectuar uma leitura por espectroscopia de UV/visível.

Breve descrição das figuras

Figura 1 - Esquema do método

Cada teste tem por base três ensaios que constituem o controlo da reacção - Branco (A), nanossonda (1) sem ácidos nucleicos; Negativo (B), nanossonda (1) com um ADN/ARN que sabemos ser não complementar à nanossonda (2); Positivo (C), com um ADN/ARN que sabemos ser complementar à nanossonda (3). Em paralelo ao controlo da reacção é/são efectuado(s) um (ou mais) ensaio(s) (D) com o ácido nucleico alvo (4) a ser testado para uma (ou mais) mutação(ões)/SNP especifico(s). A hibridação (5) é levada a cabo por aquecimento e arrefecimento das soluções, sem que haja qualquer alteração colorimétrica. Após arrefecimento, adiciona-se uma solução salina para alteração da força iónica (6) e regista-se a alteração colorimétrica de cada ensaio a olho nu, ou recorrendo a um aparelho de espectroscopia de UV/visivel.

Figura 2 - Exemplo de detecção de mutações pontuais relacionadas com beta talassémia

Espectros no visível dos ensaios efectuados, adquiridos 15 minutos após adição de NaCl ([NaCl]= 2M). Nanossonda com ADN de um gene HBB normal ( (C) - linha sólida) ; nanossonda com ADN contendo uma mutação pontual IVS1, ntl no gene HBB ((Dl) 29 linha tracejada); nanossonda com ADN contendo uma mutação pontual IVSl, nt2 no gene HBB ((D2) - linha traço-ponto-traço); nanossonda com ADN contendo uma mutação pontual IVSl, nt6 no gene HBB ((D3) - linha pontuada). A posição de cada mutação(T) relativamente à nanossonda pode ser visualizada no esquema do lado direito, juntamente com as fotografias antes e 15 minutos depois (->·) de adicionar o sal.

Descrição detalhada da invenção 1. Preparação das nanossondas e nanoparticulas de ouro As nanoparticulas de ouro coloidal são sintetizadas por métodos correntes na prática de quem é especialista na arte, como por exemplo o método de redução de um sal de ouro (por ex., HAuC14) com um sal de citrato.

Sucintamente, a uma solução de HAUCI4 (lmM; 500mL) em refluxo e sob agitação magnética vigorosa, adiciona-se uma solução de citrato de sódio (38,8 mM; 50mL), verificando-se uma mudança de cor na solução de amarelo para vermelho. Após esta mudança de cor, mantém-se a solução em refluxo durante mais 15 minutos e posteriormente deixa-se arrefecer à temperatura ambiente, armazenando seguidamente ao abrigo da luz. É possível controlar o tamanho das partículas resultantes por alteração das proporções citrato/HAuCl4 de modo a que a média de tamanhos se situe entre 13 e 17 nm.

Estas partículas apresentam-se estabilizadas pelas moléculas de citrato, que evitam que as nanoparticulas se aproximem e agreguem, acabando por precipitar. As soluções de nanoparticulas de ouro coloidal, cujas partículas apresentam um 30 diâmetro de 13 a 17 nm, apresentam uma coloração vermelha devido à intensa absorção a 525 nm resultante de fenómenos de ressonância de superfície do plasmão.

As nanopartículas de ouro coloidal são derivatizadas com cadeias simples de ADN através de um grupo tiol na extremidade 3' ou 5' da molécula de ADN. Sucintamente, uma solução coloidal de nanopartículas de ouro com um diâmetro médio de 13 nm (17 nM em nanopartículas; 5 mL) é derivatizada com oligonucleótidos tiolados numa concentração final de 3,61 μΜ. Após 16 horas em repouso, procede-se à adição de tampão de fosfato 50mM (pH7), 0,5M NaCl, até uma concentração final de fosfato lOmM, NaCl 0,1M. Após 48 horas em repouso, a solução é centrifugada durante 25 minutos a 14.000 rpm e o sobrenadante é descartado. 0 precipitado resultante é lavado com 5mL de tampão fosfato lOmM (pH7), 0,1M NaCl, re-centrifugado e posteriormente ressuspendido em 5 mL de tampão fosfato lOmM (pH7), 0,1M NaCl, sendo armazenado a 4°C e ao abrigo da luz.

As moléculas de ADN ficam assim ligadas à superfície das nanopartículas através do grupo tiol, que possui grande afinidade para o ouro. A molécula de cadeia simples de ADN pode ainda ter n grupos alquilo intermediários à ligação com o grupo tiol. As nanopartículas funcionalizadas por ADN de cadeia simples - nanossondas - permanecem estabilizadas em solução devido à forte repulsão entre as cargas negativas das cadeias de fosfato da molécula de ADN, que podem ser em número cerca de 200 ou mais e que substituíram os iões citrato. Deste modo, a solução de nanossondas a pH 7,0 - 8,0 encontra-se vermelha e estável, com um máximo de absorção característico a 520-525 nm. 31 2. Preparação das amostras-alvo

As amostras do ácido nucleico alvo podem ser preparadas por qualquer método corrente na prática de quem é especialista na arte, ou recorrendo a qualquer estojo de extracção e purificação de ácidos nucleicos disponível no mercado, podendo posteriormente sofrer amplificação por PCR da região de interesse, ou por qualquer outra amplificação isotérmica de ácidos nucleicos (ex. LAMP - amplificação isotérmica mediada por ansa - Loop-mediated isothermal amplicification) . 3. Hibridação das nanossondas e Detecção colorimétrica

Cada teste tem por base três ensaios que constituem o controlo da reacção - Branco: nanossonda sem ácidos nucleicos; Negativo: nanossonda com um ADN/ARN que sabemos ser não-complementar à nanossonda; Positivo: com um ADN/ARN que sabemos ser complementar à nanossonda. Em paralelo ao controlo da reacção é/são efectuado(s) um (ou mais) ensaio(s) com o ácido nucleico alvo a ser testado para uma (ou mais) mutação (ões)/SNP específico (s). 0 método consiste na adição de uma amostra de ácido nucleico alvo a uma solução de nanossonda numa concentração final em nanopartícuias de ouro de 2,5 nM. O ácido nucleico alvo encontra-se numa concentração entre 0 e 100 ug/ml, com um óptimo de reacção para valores entre 18 e 36 ug/ml. A hibridação é levada a cabo por arrefecimento até uma temperatura ambiente entre 10 e 30°C, após um pré-aquecimento para desnaturação completa da hélice dupla de ADN ou de estruturas secundárias do ARN da amostra. 32

Após o período de arrefecimento, que pode ir até 24 horas, adiciona-se uma solução salina para alteração da força iónica. A alteração da força iónica poderá ser levada a cabo através da adição de soluções salinas de NaCl, MgCl2, NiCl2, NaBr, ZnCl2, MnCl2, BrCl, CdCl2, CaCl2, CoCl2, C0CI3, CuCl2, CuCl, PbCl2, PtCl2, PtCl4, KC1, RbCl, AgCl, SnCl2, BrF, LiBr, KBr, AgBr, NaN02, Na3P04, Na2HP04, NaH2P04, KH2P04, K2HP04, ou outras. Também a alteração das soluções de hibridação e/ou de ressuspensâo das nanossondas poderão ter efeito de agregação discriminatória das nanossondas. Cada uma destas alterações poderá ainda ter correlação com o valor de pH do meio.

Para além das alterações colorimétricas serem visíveis a olho nu, pode-se recorrer a um simples espectrofotómetro para análise de desvio do pico máximo de absorção. Este método pode ser introduzido em sistemas de análise em paralelo por meio de um leitor de microplacas que determine os máximos de absorção das amostras. 5. Interpretação dos resultados

Os resultados mostram dois máximos de absorção com um comportamento de função gaussiana, nomeadamente: centrado a 525 nm, que representa a interacção entre a sonda e o ácido nucleico cuja sequência é totalmente complementar; centrado nas baixas energias, aproximadamente 600 nm, que representa as reacções não complementares, onde apenas um nucleótido não-complementar pode causar a variação de agregação.

Desta forma, caso a amostra em análise contenha uma sequência 100% complementar à nanossonda utilizada, a cor vermelha inicial manter-se-á após adição do electrólito, porque a 33 presença de uma sequência do ácido nucleico alvo totalmente complementar à sequência da nanossonda, leva à hibridação especifica, evitando a agregação das nanoparticulas aquando o aumento da força iónica e a solução mantém-se vermelha.

Caso não exista uma sequência complementar, ou haja uma mutação pontual relativamente à nanossonda utilizada, visualizar-se-á uma mudança da cor inicial vermelha para azul, não há o efeito protector descrito anteriormente e as nanossondas agregam, provocando a alteração de cor para azul.

Esta mudança de cor entre soluções de nanossondas na presença ou ausência de sequências de ADN/ARN complementares constitui a base molecular do método descrito neste invento. Este método é altamente sensível por si só, sem necessidade de posterior aumento e potenciação de sinal, permitindo discriminar entre sequências totalmente complementares e com apenas um nucleótido não complementar. É, pois, possível discriminar sequências totalmente complementares de sequências com um ou mais nucleótidos não-complementares, por pequenas alterações de estabilidade das nanossondas em solução, ou seja, a maior resistência à agregação para a mesma força iónica é tanto maior quanto maior for a complementaridade entre sequências. Os nucleótidos não-complementares destabilizam o complexo nanossonda-molécula alvo, diminuindo a repulsão e provocando uma agregação lenta e gradual que pode ser monitorizada e constitui a base para a detecção de SNP e mutações em ADN (ver Figura 2). 6. Estojo para detecção de mutações/SNP em sequências de ácidos nucleicos 34 0 estojo é constituído por uma ou mais soluções com nanossondas para determinadas mutações/SNP de interesse, uma solução tampão de hibridação, uma solução de revelação e uma ou mais soluções de controlo contendo ácidos nucleicos não-complementares e complementares à(s) nanossonda(s). A solução contendo a nanossonda pode ser proporcionada em poços de uma, ou mais, microplaca(s) , ou em recipientes para posterior aplicação em poços de microplaca(s) e deverá ser armazenada a 4°C e ao abrigo da luz. A solução tampão de hibridação poderá ser proporcionada juntamente com a nanossonda, ou separadamente em recipiente próprio para posterior aplicação nos poços da(s) microplaca(s) contendo a(s) nanossonda(s).

As restantes soluções de revelação; solução controlo com um ácido nucleico não-complementar às nanossondas; e uma ou mais soluções de controlo contendo um ácido nucleico complementar à(s) nanossonda(s); deverão ser proporcionadas separadamente em recipientes independentes.

As amostras do(s) ácido(s) nucleico(s) alvo a analisar podem ser preparadas de acordo com o descrito supra no ponto 2 do método -"Preparação das amostras-alvo".

Cada teste será efectuado nos poços de microplaca(s) de acordo com o descrito supra no ponto 3 do método - "Hibridação das nanossondas e Detecçâo colorimétrica". 35

Sucintamente, a(s) amostra(s) de ácido(s) nucleico(s) é(são) adicionada(s) à mistura da solução de nanossonda(s) com a solução tampão de hibridação nos respectivos poços da microplaca. A microplaca é selada e submetida a aquecimento e posterior arrefecimento por forma a promover hibridação do(s) ácido(s) nucleico(s) alvo com a(s) nanossonda(s). Seguidamente, é adicionada a solução de revelação a cada um dos poços da(s) microplaca(s) e o resultado da alteração colorimétrica é registado visualmente a olho nu ou, opcionalmente, recorrendo a um leitor de microplacas para análise de espectroscopia de absorção de UV/visivel. A interpretação dos resultados será feita de acordo com o descrito supra no ponto 5 do método - "Interpretação dos resultados".

Exemplos 0 presente invento é ilustrado adicionalmente pelo seguinte exemplo especifico.

Exemplo 1

Detecção de mutações pontuais relacionadas com beta talassémia 0 método foi já aplicado com sucesso na detecção de mutações pontuais no gene da beta globina. Nomeadamente, sintetizou-se uma nanossonda derivatizando nanoparticulas de ouro com 13nm de diâmetro com um oligonucleótido tiolado na extremidade 5', cuja sequência de 15pb abrange três das mutações mais frequentes na população portuguesa e mediterrânea, relacionadas com beta talassémia (IVSl, ntl; IVS1, nt2; IVS1, nt6) [26]. Posteriormente, num volume total de 60 pL, efectuaram-se 36 diversos ensaios misturando a solução de nanossonda numa concentração final em nanoparticulas de ouro de 2,5 nM com um amplicão contendo uma das mutações pontuais referidas acima, numa concentração final de 36 pg/mL (ver Figura 1 - "D") . Paralelamente, foram preparados um controlo positivo - com ADN complementar (ver Figura 1 - "C"); um controlo negativo - com ADN não complementar (ver Figura 1 - "B") e um Branco - substituindo o ADN alvo por tampão fosfato lOmM (pH8) (ver Figura 1 - "A") . Após 10 minutos de desnaturação a 95°C, as misturas permaneceram em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos, ao fim dos quais se adicionou uma solução de NaCl 5M até perfazer uma concentração final 2M em NaCl. Passado 15 minutos à temperatura ambiente registou-se o resultado das soluções obtidas por fotografia e espectroscopia de UV/visivel (ver Figura 2) . Observando visualmente a olho nu, ou por espectroscopia de UV/visivel, é possível constatar que após o aumento da força iónica do meio por adição de NaCl, as soluções cujo ADN alvo continha uma mutação pontual relativamente à sequência da nanossonda mudaram de cor de vermelho para azul (ver Figura 2 - "D") , enquanto que a solução com ADN alvo complementar (controlo positivo) manteve a sua cor inicial (ver Figura 2 - "C") . Mais ainda, uma só nanossonda permitiu a detecção de três mutações pontuais diferentes (ver Figura 2 -"Dl", "D2" e ”D3"). 37

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Lisboa, 4 de Maio de 2007

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1- Método colorimétrico de detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos, incluindo mutações ou polimorfismos de nucleótido único em sequências de ácidos nucleicos caracterizado por ser realizado através da agregação de nanopartículas funcionalizadas com oligonucleótidos modificados induzida por um aumento da força iónica do meio, compreendendo ainda um ensaio branco, um controlo positivo, um controlo negativo e um ou mais ensaios com a amostra de ácidos nucleicos alvo, sendo que cada ensaio compreende um passo de desnaturação, um passo de hibridação, um passo de revelação e um passo de registo de resultado, sequencialmente por esta ordem.

2- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as nanopartículas serem de metal, como por exemplo, de ouro, prata, liga de ouro/prata ou liga de ouro com outro metal, ou uma combinação de um ou mais tipos destas nanopartículas.

3- Método colorimétrico, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por as nanopartículas serem esféricas, cilíndricas, triangulares, cúbicas, prismáticas, em forma de bastonete, ou apresentarem qualquer outra forma geométrica, do tipo maciço ou oco, e de dimensões entre 1 e 2 OOnm.

4- Método colorimétrico, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por as nanopartículas serem funcionalizadas com oligonucleótidos de ADN ou de ARN entre 10 2 a 100 nucleótidos modificados com um grupo tiol na extremidade 3' ou 5' , através do qual se ligam às nanoparticulas por uma ligação quasi-covalente.

5- Método colorimétrico, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por as nanoparticulas estarem ressuspendidas em água destilada ou tampão fosfato, citrato, Tris, Hepes (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), TAPS (ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]3-aminopropanosulfónico) , MOPS (ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico), PIPES (ácido 1,4-piperazinadietanosulfónico), hipersolutos (por exemplo, manosilglicerato), ou qualquer outra solução tampão, cujo pH varia entre 1 e 14.

6- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o tampão conter um, ou mais, sais, tais como NaCl, MgCl2, NiCl2, NaBr, ZnCl2, MnCl2, BrCl, CaCl2, KC1, AgCl, LiBr, KBr, AgBr, ou outro, numa concentração final entre 0 e 2 M.

7- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por os oligonucleótidos conterem um, ou mais, grupos alquilo contendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, ou mais carbonos, entre o grupo tiol e os nucleótidos.

8- Método colorimétrico, de acordo com as reivindicações 7, caracterizado por oligonucleótidos serem constituídos por uma sequência especifica, ou pela combinação de uma, ou mais, sequências especificas diferentes, contendo cada uma delas uma 3 sequência complementar à sequência do ácido nucleico alvo, ou um, ou mais, nucleótidos não complementares à sequência do ácido nucleico alvo, entre as extremidades 3' e 5' do oligonucleótido.

9- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os nucleótidos não complementares serem nucleótidos relacionados com polimorfismos de nucleótido único, mutações pontuais, ou outro tipo de mutação do genoma animal, humano ou de patogéneos.

10- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ensaio branco compreender uma solução contendo as nanoparticulas funcionalizadas de acordo com a reivindicação 4.

11- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ensaio positivo compreender uma solução contendo as nanoparticulas funcionalizadas, de acordo com a reivindicação 4, mais um ácido nucleico complementar à sequência funcionalizada nessas mesmas nanoparticulas.

12- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ensaio negativo compreender uma solução com as nanoparticulas funcionalizadas, de acordo com a reivindicação 4, mais um ácido nucleico não complementar à sequência funcionalizada nessas mesmas nanoparticulas.

13- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de desnaturação consistir na desnaturação dos ácidos nucleicos presentes em solução por 4 temperatura, agentes desnaturantes, pH ou enzimas, ou por uma combinação destes.

14- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de hibridação consistir na hibridação dos oligonucleótidos das nanopartículas funcionalizadas, da reivindicação 4, com as respectivas cadeias complementares dos ácidos nucleicos alvo presentes em solução, decorrendo por um período de 0 minutos a 24 horas, ou mais, à temperatura ambiente, ou entre os 4 °C e os 80 °C.

15- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o passo de hibridação compreender o uso de um tampão de hibridação, tal como tampão fosfato, citrato, Tris, Hepes (ácido 4- (2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico) , SSC (tampão citrato salino de sódio), TAPS (ácido N-[tris(hidroximetil)metil]3-aminopropanosulfónico) , MOPS (ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico) , PIPES (ácido 1,4- piperazinadietanosulfónico), hipersolutos (por exemplo, manosilglicerato), ou qualquer outra solução tampão, podendo conter agentes desnaturantes, sais, polímeros inertes, surfactantes, entre outros.

16- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de revelação consistir na adição de um electrólito, como por exemplo, NaCl, MgCl2, NiCl2, NaBr, ZnCl2, MnCl2, BrCl, CdCl2, CaCl2, CoCl2, CoCl3, CuCl2, CuCl, PbCl2, PtCl2, PtCl4, KC1, RbCl, AgCl, SnCl2, BrF, LiBr, KBr, AgBr, NaN02, Na3PC>4, Na2HP04, NaH2P04, KH2P04, k2hpo4, entre outros, numa concentração final entre 0 e 6 M, ou mais, durante 0 minutos a 1 hora, ou mais, à solução de hibridação. 5

17- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo de registo dos resultados consistir na observação a olho nu das alterações colorimétricas dos diferentes ensaios, de acordo com as reivindicações 10, 11 e 12, ou recorrendo a espectroscopia de absorção no visível, ultravioleta ou infravermelhos.

18- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por no passo de registo de resultados a manutenção da cor inicial dos ensaios, de acordo com a reivindicação 10, 11 e 12, representar a presença de um, ou mais, ácidos nucleicos alvo complementares às nanopartículas funcionalizadas da reivindicação 4.

19- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por no passo de registo de resultados a mudança da cor inicial dos ensaios, de acordo com as reivindicações 10, 11 e 12, representar a presença de um ou mais ácidos nucleicos alvo, não complementares às nanopartículas funcionalizadas da reivindicação 4, ou a presença de uma mutação ou polimorfismo de nucleótido único na sequência do ácido nucleico alvo ou ainda a ausência de qualquer ácido nucleico alvo em solução.

20- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por no passo de registo de resultados a razão do pico de absorção inicial, e após o passo de revelação, da reivindicação 16, das nanopartículas funcionalizadas, da reivindicação 4, constituir uma medida de quantificação dos ácidos nucleicos alvo em solução, ou uma forma de identificação da mutação ou polimorfismo de nucleótido único na sequência do ácido nucleico alvo. 6

21- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os ácidos nucleicos alvo serem ADN genómico, ADN de cadeia simples, ADN de cadeia dupla, plasmideo, cosmideo, BAC, YAC, HAC, ARN total, ARN mensageiro, ARN ribossomal, ARN de transferência, ADN sintetizados, ARN sintetizados, entre outros.

22- Método colorimétrico, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por os ácidos nucleicos alvo serem previamente ampliados enzimaticamente por PCR ou através de uma reacção isotérmica como o LAMP (amplificação isotérmica mediada por ansa), entre outras.

23- Utilização do método colorimétrico, de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizada por se destinar à detecção de sequências especificas de ácidos nucleicos através de nanoparticulas metálicas funcionalizadas com oligonucleótidos modificados.

24. Estojo para detecção de sequências especificas de ácidos nucleicos, incluindo mutações ou polimorfismos de nucleótido único em sequências de ácidos nucleicos, de acordo com o método das reivindicações 1 a 22, caracterizado por conter: a) uma ou mais soluções que compreendem as nanoparticulas funcionalizadas de acordo com a reivindicação 4; b) uma solução de tampão de hibridação de acordo com a reivindicação 15; c) uma solução de revelação de acordo com a reivindicação 16; 7 d) uma ou mais soluções de controlo contendo ácidos nucleicos complementares e/ou não-complementares às nanoparticulas funcionalizadas de acordo com a reivindicação 4; que são depositadas numa microplaca ou num sistema microfluidico ou ainda num outro tipo de recipiente adequado à execução do método das reivindicações 1 a 22.

25. Utilização do estojo para detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por se destinar á detecção de sequências específicas de ácidos nucleicos, incluindo mutações ou polimorfismos de nucleótido único, em sequências de ácidos nucleicos, de acordo com o método das reivindicações 1 a 22. Lisboa, 4 de Maio de 2007