JP5519088B2 - 核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 - Google Patents
核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5519088B2 JP5519088B2 JP2004281000A JP2004281000A JP5519088B2 JP 5519088 B2 JP5519088 B2 JP 5519088B2 JP 2004281000 A JP2004281000 A JP 2004281000A JP 2004281000 A JP2004281000 A JP 2004281000A JP 5519088 B2 JP5519088 B2 JP 5519088B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- base sequence
- target nucleic
- mass
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 137
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 137
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 63
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 20
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 8
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 claims 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229910052451 lead zirconate titanate Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 2
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101000889812 Enterobacteria phage T4 Endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108090000621 Ribonuclease P Proteins 0.000 description 1
- 102000004167 Ribonuclease P Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNSWULZVUKFJHK-UHFFFAOYSA-N [Sr].[Bi] Chemical compound [Sr].[Bi] VNSWULZVUKFJHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- BADXJIPKFRBFOT-UHFFFAOYSA-N dimedone Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(=O)C1 BADXJIPKFRBFOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010032819 exoribonuclease II Proteins 0.000 description 1
- 108010079502 exoribonuclease T Proteins 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- HFGPZNIAWCZYJU-UHFFFAOYSA-N lead zirconate titanate Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Ti+4].[Zr+4].[Pb+2] HFGPZNIAWCZYJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside phosphate ester Chemical class 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108010066527 ribonuclease U Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010897 surface acoustic wave method Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000011032 tourmaline Substances 0.000 description 1
- 229940070527 tourmaline Drugs 0.000 description 1
- 229910052613 tourmaline Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明は、核酸分子の塩基配列を決定するための技術に関する。より詳しくは、切断処理を施した核酸分子の質量変化情報に基づいて、核酸分子の塩基配列を決定するための方法及び装置に関する。
近年、ＤＮＡなどの核酸分子の塩基配列を決定する技術が幾つか提案されており、その自動化、高速化、並びに高精度化などが進展している。以下、主要な塩基配列決定技術を簡潔に説明する。
まず、サンガーらによって提案されたジデオキシ法（ＮeiＮeoxy chain termination methoＮ）は、サンガー法あるいはチェーンターミネーター法とも称される方法である。この方法は、一本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定する方法であり、目的の１本鎖ＤＮＡを鋳型としてクレノー断片（Klenow fragment）と４種のデオキシリボヌクレオチドを用いて相補ＤＮＡを合成する際、４種のうち１種のジデオキシリボヌクレオチドを加えてＤＮＡ合成を阻害し、様々な長さのフラグメントを合成する。この反応をそれぞれ上記の４種類について行って、１塩基の差で分けられる分解能を有するポリアクリルアミド電気泳動装置で分離して、ＤＮＡ配列を決定するという技術である。この技術は、数百塩基程度の長さのＤＮＡ断片の塩基配列決定に適していると考えられている。
次に、全ゲノムショットガン法（Whole-Genome Shotgun Sequencing , whole genome shotgun sequencing ）は、ゲノムの長鎖ＤＮＡの塩基配列決定法であり、すべてのＤＮＡを制限酵素によって適当な断片に切断する。各々のＤＮＡ断片の両端の塩基配列を読んで、わずかな配列の重なりをコンピューターでつなぎ合わせていく方法である。現在、微生物のゲノム塩基配列決定では主流の方法になっており、最近では、この方法によって、Celera Genomic社がショウジョウバエのゲノム解析を達成したとの報告がある。
階層化ショットガン法（clone-by-clone shotgun sequencing）もゲノムの長鎖ＤＮＡの塩基配列決定法の一つであり、ＤＮＡを切断して断片化し、複数の制限酵素による切断部位の位置を決定して、ゲノムＤＮＡの地図を作成し、これらのＤＮＡ断片をさらに細かくして配列を決定するという方法である。この方法は、解読速度が全ゲノムショットガン法よりも遅く、また、労力もかかるという課題を抱えるが、解読精度が高いので、ヒトゲノム解析、イネゲノム解析などに用いられている。
その他、核酸分子が係わる反応などを質量変化に基づいて検出する技術が開示された文献として、次の特許文献１〜３がある。より詳しくは、特許文献１は、供給されたｄＮＴＰがＤＮＡサンプルに結合したときの質量変化を圧電素子の共振数変化として検出し、プライマーが伸長した否かを分析する技術であり、特許文献２は、ハイブリダイゼーションの有無をカンチレバーの固有振動数変化で検出する技術である。また、特許文献３には、読み取り目的のＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって生ずる弾性波素子特性の変化を測定して、当該ＤＮＡ中の塩基配列を読み取る装置が開示されている。
特開２００４−１６１７１号公報。
特開２００４−１２５７０６号公報。
特開平６−２４５７５４号公報。
本発明は、従来の塩基配列決定技術とは、全く異なる手法によって、核酸分子の塩基配列を確実に決定可能な新規技術を提供することを課題とする。
本発明の核酸分子の塩基配列決定方法では、圧電素子に一末端部位が固定化された対象核酸分子を、遊離末端側から一核酸分子単位で切断する第１工程と、第１工程前の核酸分子の質量（Ｍ １ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ ２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ １ −Ｍ ２ ）に対応する前記圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を測定する第２工程と、前記第２工程で求めた振動数変化量（ΔＦ）を、塩基種ごとのリファレンスデータと比較又は照合して、前記第１工程で切断された一核酸分子の塩基種を特定する第３工程と、を少なくとも行う。
なお、本発明において、「対象核酸分子」とは、塩基配列解読の対象とされるヌクレオチド鎖を意味し（以下、同様）、この対象核酸分子は、一本鎖、二本鎖のどちらか一方に狭く限定されず、鎖長（塩基数）も限定されない。
本発明に係る上記方法は、塩基種の異なる核酸一分子が、それぞれに特有の質量を持つことに基づいて、対象核酸分子の質量（Ｍ１とする）と核酸分子が切断された後の核酸分子の質量（Ｍ２とする）の質量変化（質量差分）Δｍ（＝Ｍ１−Ｍ２）を検出可能な測定を実行し、この測定データ（Δｍ）から当該核酸分子の塩基種あるいは塩基配列に係わる情報を得ることを基本的な特徴としている。
本発明では、特に長いヌクレオチド鎖の対象核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）について、上記の第１工程から第３工程を必要回数繰り返すことによって、対象核酸分子の全塩基配列を効率よく決定することが可能となる。
対象核酸分子の切断を担う前記第１工程では、切断部位が制御可能な条件や構成により、対象核酸分子の切断を行うことができる方法であれば採用可能である。例えば、この切断は、酵素分解反応を用いて行うことができ、より具体的には、末端側から切断するエキソヌクレアーゼ（exonuclease）などの核酸分解酵素（nuclease）を用いて行うことができる。
上記第１工程での対象核酸分子の切断は、例えば、対象核酸分子の末端側から一核酸分子単位で順次切断していき、逐次その切断前後の質量変化を測定して、各測定で得られた質量差分データΔｍから切断された核酸分子の塩基種や塩基配列を決定していくようにする。
次に、本発明では、対象核酸分子を一切断片化せず、初期鎖長のままで第１工程にかけてもよいが、必要に応じて、この対象核酸分子を、たとえば制限酵素等を用いて断片化処理した後に前記第１工程へ移行したり、断片化処理しながら前記第１工程を行ったりするようにしてもよい。
更には、断片化された複数の核酸分子を同時並行的に測定にかけ、各断片化核酸分子の各塩基配列を同時並行的に決定していくことによって、塩基配列解読時間の高速化を図ってもよい。このような手法では、最終的には、断片化された各核酸分子の塩基配列を所定の順番に並べて、前記対象核酸分子の全塩基配列を特定する。
本発明に係る方法や装置を実施するに際し、塩基種の異なる核酸一分子のそれぞれに特有の質量に相関する測定データを得ておき、これらの測定データを、対象核酸分子の塩基配列の解読のためのリファレンスデータとして利用することができる。
例えば、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子（ＤＮＡであれば、ＡＡＡＡ・・・、ＴＴＴＴ・・・、ＧＧＧＧ・・・、ＣＣＣＣ・・・）、あるいはポリ核酸分子をリファレンスデータ作成用の対象核酸分子として採用する。この対象核酸分子を第１工程及び第２工程にかけて得られた測定情報から、それぞれの塩基種に対応する一核酸分子単位の質量差分データを予め得ておき、この質量差分データと測定データ（検出データ）とを比較又は照合することによって、塩基の種類や塩基の組み合わせ等を自動判定する手順を実行することにより、対象核酸分子の塩基配列の解読を行なうことができる。
より具体的には、塩基Ａ，Ｇ、Ｃ、Ｔそれぞれのデオキシリボ核酸一分子単位の質量差分データが、それぞれΔｍａ、Δｍｇ、Δｍｃ、Δｍｔであったと仮定し、さらに、塩基配列が未知である対象核酸分子を一核酸分子単位で切断する毎に得られた質量変化（質量差分）が、時系列でΔｍａ、Δｍｃ、Δｍｔ、Δｍｇ、Δｍｃ、Δｍｔであったと仮定すれば、当該対象核酸分子の塩基配列は、「ＡＣＴＧＣＴ」であったと決定することができる。
本発明では、対象核酸分子の一末端部位を固相表面に固定化しておくようにしておけば、例えば、第１工程前後の質量差分の測定を、水晶発振子、表面弾性波素子などの圧電素子（piezoelectric element）の共振周波数変化を測定することによって、対象核酸分子の塩基配列を解読することができる（以下の装置においても同様）。
次に、本発明では、反応領域中に存在する対象核酸分子の切断に用いる物質を、前記反応領域へ供給する物質供給部と、前記対象核酸分子の質量に対する前記切断処理後の核酸分子の質量変化を検出するための検出部と、前記検出部で得られた検出データを解析するデータ解析部と、前記解析部の解析結果を出力する出力部と、を少なくとも備える塩基配列決定装置を提供する。
前記データ解析部は、予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと前記検出データとを比較対照し、その結果から、対象核酸分子から切断された核酸分子の塩基種を特定する構成としてもよい。また、前記検出部は、前記対象核酸分子を固定化可能な端面構成を備えるカンチレバーの振動振幅を検出する構成であってもよい。
なお、本発明において「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
本発明によれば、切断処理前後の核酸分子（ヌクレオチド鎖）の質量変化を測定することによって、当該核酸分子の塩基配列を正確かつ迅速に決定することができる。
以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な概念や実施形態の一例を示したものであって、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
まず、添付した図１は、本発明に係る方法を構成する第１工程の基本的な概念の一例を示す図である。
この第１工程の好適な例は、所定長のヌクレオチド鎖からなる対象核酸分子（ここでは、説明の便宜上１０分子）Ｎの末端部位が、固相表面Ｆに固定化された状態を、公知の固定化技術を用いて予め形成しておき、続いて、この対象核酸分子Ｎの遊離末端側から、適宜選択した核酸分解酵素を用いて、切断部位を制御しながら対象核酸分子を切断する。
ここで、前記した公知の固定化技術の例を挙げれば、ストレプトアビジンによって表面処理された検出表面の場合では、ビオチン化されたＤＮＡプローブ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された検出表面の場合では、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｎをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
図１において符号Ｎで示された対象核酸分子の切断は、この図１に示されている例のように、核酸分解酵素の一種であるエキソヌクレアーゼ（exonuclease、図示せず。）を用いて、一核酸分子ずつ、遊離末端側から分解していく工程又は手段を採用することができる。
図１中の符号Ｎ１は、末端の一核酸分子ｎ１が切断（分解）され、開始時の対象核酸分子Ｎよりも一核酸分子少ない、計９分子から構成された核酸分子残基が生成している様子を模式的に示している。さらに、図１中の符号Ｎ２は、さらに一核酸分子Ｎ２が切断され、開始時の対象核酸分子Ｎよりも二核酸分子少ない、計８分子から構成された核酸分子残基を示している。なお、本発明では、対象核酸分子Ｎの塩基数（分子数）は、特に限定されない。
対象核酸分子Ｎの切断過程（分解過程）において、開始時の対象核酸分子Ｎの初期質量ＭＮは、切断された一核酸分子ｎ１の質量だけ減少したＭＮ１へ変化し、続いて、切断された核酸分子ｎ１とＮ２の質量和分だけ減少したＭＮ２へ変化する。
核酸分子は、その塩基種に応じた固有の質量を有することから、質量変化の各過程で得られる質量差分Δｍを、適宜の手段で逐次又は順次測定することによって、切断産物（分解産物）である核酸分子ｎ１、ｎ２の塩基種を決定することが可能となる。
例えば、対象核酸分子ＮがＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である場合を想定すれば、その塩基成分は、基本的には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種類である。本発明では、各塩基種に対応する切断産物（分解産物）であるデオキシリボヌクレオチド一分子をｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴと便宜上表記する。なお、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴは、核酸分解酵素の種類によって、５’末端にリン酸基を持つものと、３’末端にリン酸基を持つ場合があるが、本発明では、これらのいずれも排除しない。
また、デオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量をＭｄＡ、ＭｄＧ、ＭｄＣ、ＭｄＴと便宜上表記すれば、測定によって取得された質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＡに対応するデータであれば、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドはｄＡであると決定できる。
同様に、測定によって取得された質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＧに対応するデータであれば、切断産物であるデオキシリボヌクレオチドはｄＧであり、質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＣに対応するデータであれば、切断産物である核酸分子はｄＣであり、質量差分Δｍに係わるデータが前記ＭｄＴに対応するデータであれば、切断産物である核酸分子はｄＴであると決定できる。
対象核酸分子Ｎの切断処理を、酵素分解処理により行う場合において、核酸分解酵素は、本発明の解釈にあたり、狭く限定されない。対象核酸分子Ｎの種類、性状（例えば、一本鎖、二本鎖）あるいは切断処理の構成や測定系の内容に応じて、ＤＮＡに作用するデオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮＡに作用するリボヌクレアーゼ、両方に作用するヌクレアーゼ、主として二本鎖のＤＮＡやＲＮＡに作用するＮＮアーゼＩ、ＮＮアーゼＩＩ、ＡＴＰ依存性ＮＮアーゼ、ＲＮアーゼＩＩＩ、あるいは、一本鎖のＤＮＡやＲＮＡに作用するヌクレアーゼＳ１、ヌクレアーゼＰ１、エキソＮＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＩＩ、あるいは、特定の塩基を認識して分解する塩基特異的なＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＡ、Ｔ4-エンドヌクレアーゼなど、核酸の高次構造を認識すると考えられるＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＰ、あるいは制限酵素などを広く利用できる。
また、上記した例では、対象核酸分子Ｎを一核酸分子ずつ切断（分解）していく方法又は手段を代表例として説明したが、複数の核酸分子を切断単位とする工程や手段を目的に応じて採用するのは自由である。また、対象核酸分子Ｎの切断方法又は切断手段は、核酸分解酵素を用いる酵素分解の例に限定されず、本発明の目的に沿うように対象核酸分子Ｎを切断できればよい。
次に、切断処理が施される前後の対象核酸分子Ｎの質量変化を測定する工程（第２工程）の好適な例を説明する。
この工程は、塩基配列解読対象の対象核酸分子Ｎの質量変化を高精度に測定することができる方法や手段であれば採用可能であり、特に限定されない。現在において採用可能な代表例を挙げるとすれば、圧電素子（圧力-電気変換を直接に行う素子）の共振周波数変化を測定することによって、対象核酸分子Ｎの質量変化を測定する方法又は手段である。
水晶、ロッシェル塩、電気石などの結晶に電圧を加えて電気分極させると、その結晶は歪みを生じ、逆に圧力を加えて結晶を歪ませると、電気分極が生じて電圧を発生する。このような現象は、圧電効果(piezoelectric effect)と呼ばれている。特に水晶（石英、quartz ;SiO2）が、圧電特性、化学的性質、熱的安定性に優れていることが知られている。
従って、この圧電効果を利用して水晶板の両面に電極を取り付けたものに電圧をかけてひずみを生じさせた後に印加電圧を解除すると、水晶板はずり振動を生じてから元に戻る現象を示す。このときの印加電圧を交流電場としてずり方向の共振周波数に同期させると、水晶板は発振子としてその水晶板のもつ固有振動数で共振振動する。
このような水晶発振子は、該水晶発振子の電極上への物質の付着が振動数の減少を引き起こし、この振動数変化と付着物質の質量との関係は、以下の数式（数１）の「Sauerbrey式」によって表される。このSauerbrey式に基づけば、電極上での質量変化は、振動数変化と比例関係にあることがわかる。なお、下記数式１中のΔｍは質量変化、ΔＦは基本振動数の変化量、Ｆ０は基本振動数、Ａは電極面積、μｑは水晶の剪断応力（2.947×1010ｋｇｍ-１ｓ-１）、ρｑは水晶の密度（2648ｋｇｍ−３）を示している。
例えば、基本振動数Ｆ０(Ｈｚ)が２７ＭＨｚの水晶発振子では、電極１ｃｍ２あたりに約０．６２ｎｇの物質が付着すると１Ｈｚ振動数が減少することが確かめられている。この測定原理は、原子の単分子層吸着をも測定できるほどの高感度であることから微量天秤もしくはＱＣＭ(Quartz-crystal microbalance)と呼ばれており、原理的に、一核酸分子レベルの質量変化を検出することが可能である。
従って、本発明では、水晶発振子の表面（図１の固相表面Ｆに対応）に、塩基配列解読のターゲットとなる対象核酸分子Ｎの末端部位を予め固定化しておき（図１参照）、該表面上の領域において上記第１工程を進行させることによって、該対象核酸分子Ｍの質量変化Δｍを、振動数変化（ΔＦ）として測定するという方法又は手段を採用できる。
即ち、対象核酸分子Ｎの質量変化（Δｍ）は、図２に示すような振動数変化（ΔＦ）として測定することができる。上記したように、一核酸分子単位で対象核酸分子を切断していくような実施形態の場合では、順次測定される振動数変化（ΔＦ）は、切断された一核酸分子分の質量変化（質量減少）に対応する振動数変化である。
図２に示したような振動数変化ΔＦ１、ΔＦ２、ΔＦ３、ΔＦ４が、順に、切断されたデオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量に相当する振動数変化であると仮定するならば、この測定データ情報によって得られた塩基配列情報は、ＡＧＣＴである。なお、このように測定データ情報に基づいて、切断されたデオキシリボヌクレオチドなどの核酸分子の塩基情報を取得する工程は、本発明に係る第３工程に相当する。
本発明では、所定のヌクレオチド鎖長の対象核酸分子Ｎ（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）について、上記の第１工程から第３工程を必要回数繰り返すことによって、対象核酸分子Ｎの全塩基配列を効率よく、決定することができる。
更には、断片化処理を施した複数の核酸分子の各塩基配列を同時並行的に決定していくことによって、塩基配列解読時間の高速化を図ることもできる。このような手法では、最終的には、断片化された各核酸分子の塩基配列を所定の順番につなぎ合わせて、前記対象核酸分子の全塩基配列を特定する。
次に、図３は、本発明に係る塩基配列決定装置Ｕの基本構成を示すブロック図である。
この塩基配列決定装置Ｕは、反応領域（固相表面Ｆ上の領域）に存在する対象核酸分子、例えば、固相表面Ｆにその末端が固定化されている対象核酸分子Ｎの切断に用いる物質Ｅ（例えば、核酸分解酵素）を、前記反応領域Ｒへ供給する物質供給部１と、前記対象核酸分子Ｎの質量に対する前記切断処理後の核酸分子の質量変化を検出するための検出部２と、該検出部２で得られた検出データを解析するデータ解析部３と、このデータ解析部３の解析結果を出力する出力部と、を少なくとも備えている。
ここで、前記データ解析部３は、該解析部３の記憶部に予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと前記検出データとを比較対照することによって、対象核酸分子Ｎから切断された核酸分子ｎの塩基種を特定する。
ここで、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子又はポリ核酸分子を対象核酸分子Ｎとして採用し、これらの対象核酸分子Ｎから得られた測定情報から各塩基種に対応する一核酸分子単位の質量変化に相関する測定データ（例えば、振動数変化）を予め求めておき、これをリファレンスデータとして、装置Ｕを構成するデータ解析部３の記憶部に予め記憶しておくようにする。
例えば、デオキシリボヌクレオチドｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴのそれぞれに固有の質量に相当する振動数変化である、ΔＦｄＡ、ΔＦｄＧ、ΔＦｄＣ、ΔＦｄＴを求めておき、これらのリファレンスデータと測定によって得られたデータ（ΔＦ１、ΔＦ２、ΔＦ３、ΔＦ４）とを、自動的に比較対照判定することによって、対象核酸分子の塩基配列決定を行うようにしてもよい。
また、本発明では、対象核酸分子の質量変化（Δｍ）を、固有振動数変化を測定可能なカンチレバー手段を用いて行うようにしてもよい。好適に採用できるカンチレバー５は、図４に示すような形態をなすものであり、その端面５１には圧電素子材料からなる振動子を有し、この振動子の表面に対象核酸分子Ｎを固定化できる構成を備える。さらに、このカンチレバー５を振動励起する駆動源（図示せず。）を設け、該カンチレバー５の振動振幅を検出部２（図３参照）で検出する。
例えば、カンチレバー５の駆動源となる交流電源によって周波数を変化させながらカンチレバー５を振動励起する。そして、共振振幅に関連した電流を抵抗で電圧変換し、この電圧を電圧計（図示せず。）で計測する。なお、カンチレバー５の共振振幅は、交流電源の周波数が該カンチレバー５の固有振動数と一致したときに最大となる。
なお、カンチレバーとしては、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛（ＰＺＴ）やタンタル酸ストロンチウムビスマス（ＳＢＴ）等の圧電性を有する強誘電体を用いることができる。
本発明は、核酸分子（ヌクレオチド鎖）の塩基配列を解読するための技術（方法、装置、システム）として利用することができる。
１ 物質供給部
２ 検出部
３ データ解析部
４ 出力部
５ カンチレバー
Ｆ 固相表面（例えば、水晶板など）
Ｎ 対象核酸分子
ｎ（ｎ１，ｎ２）切断（分解）された一核酸分子
ΔＦ 振動数変化
Ｕ 塩基配列決定装置
２ 検出部
３ データ解析部
４ 出力部
５ カンチレバー
Ｆ 固相表面（例えば、水晶板など）
Ｎ 対象核酸分子
ｎ（ｎ１，ｎ２）切断（分解）された一核酸分子
ΔＦ 振動数変化
Ｕ 塩基配列決定装置
Claims (11)
- 圧電素子に一末端部位が固定化された対象核酸分子を、遊離末端側から一核酸分子単位で切断する第１工程と、
第１工程前の核酸分子の質量（Ｍ １ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ ２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ １ −Ｍ ２ ）に対応する前記圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を測定する第２工程と、
前記第２工程で求めた振動数変化量（ΔＦ）を、塩基種ごとのリファレンスデータと比較又は照合して、前記第１工程で切断された一核酸分子の塩基種を特定する第３工程と、
を少なくとも行う核酸分子の塩基配列決定方法。 - 前記第１工程から第３工程を繰り返すことによって、前記対象核酸分子の全塩基配列を決定することを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 前記第１工程を、核酸分解酵素（nuclease）を少なくとも用いて行うことを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 前記核酸分解酵素は、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）であることを特徴とする請求項３記載の塩基配列決定方法。
- 前記対象核酸分子は、一本鎖核酸分子であることを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 前記対象核酸分子を断片化した後に、前記第１工程へ移行することを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 断片化核酸分子の各塩基配列を、同時並行的に決定することを特徴とする請求項６記載の塩基配列決定方法。
- 予め、同一の塩基種のみからなるオリゴ核酸分子又はポリ核酸分子を対象として前記第１工程及び第２工程を行って、各塩基種に対応する一核酸分子単位の質量変化に相関する振動数変化を求めておき、これを塩基種ごとのリファレンスデータとして用いるとを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 前記圧電素子は、水晶発振子であることを特徴とする請求項１記載の塩基配列決定方法。
- 圧電素子の反応領域中に固定化された対象核酸分子を一核酸分子単位で切断する物質を、前記反応領域へ供給する物質供給部と、
切断前の核酸分子の質量（Ｍ １ ）と切断後の核酸分子の質量（Ｍ ２ ）との質量差分（Δｍ＝Ｍ １ −Ｍ ２ ）に対応する圧電素子の振動数変化量（ΔＦ）を検出するための検出部と、
予め記憶されている塩基種ごとのリファレンスデータと、前記検出部で検出された振動数変化量（ΔＦ）とを比較又は照合して、前記対象核酸分子から切断された一核酸分子の塩基種を特定するデータ解析部と、
前記解析部の解析結果を出力する出力部と、
を少なくとも備える塩基配列決定装置。 - 前記圧電素子は、前記対象核酸分子を固定化可能な端面構成を備えるカンチレバーであり、前記検出部は、該カンチレバーの振動振幅を検出することを特徴とする請求項１０記載の塩基配列決定装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004281000A JP5519088B2 (ja) | 2004-09-28 | 2004-09-28 | 核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 |
| US11/231,998 US7371532B2 (en) | 2004-09-28 | 2005-09-22 | Method and apparatus for determining base sequence of nucleic acid molecule |
| CNB2005101087183A CN100389208C (zh) | 2004-09-28 | 2005-09-28 | 用于测定核酸分子碱基序列的方法和设备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004281000A JP5519088B2 (ja) | 2004-09-28 | 2004-09-28 | 核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006094707A JP2006094707A (ja) | 2006-04-13 |
| JP5519088B2 true JP5519088B2 (ja) | 2014-06-11 |
Family
ID=36235113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004281000A Expired - Fee Related JP5519088B2 (ja) | 2004-09-28 | 2004-09-28 | 核酸分子塩基配列の決定方法及び決定装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7371532B2 (ja) |
| JP (1) | JP5519088B2 (ja) |
| CN (1) | CN100389208C (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100463973C (zh) * | 2006-09-30 | 2009-02-25 | 东南大学 | 分子印章测序装置和测序方法 |
| JP2020533951A (ja) * | 2017-09-15 | 2020-11-26 | イルミナ インコーポレイテッド | 配列検出システムの調整および較正の特徴 |
| AU2018331533B2 (en) * | 2017-09-15 | 2021-10-28 | Illumina, Inc. | Sequence-detection system |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06245754A (ja) | 1993-02-19 | 1994-09-06 | Terumo Corp | 塩基配列読み取り装置 |
| US6074823A (en) * | 1993-03-19 | 2000-06-13 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| WO1994021822A1 (en) * | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Sequenom, Inc. | Dna sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation |
| TWI316964B (ja) * | 2000-10-30 | 2009-11-11 | Takara Bio Inc | |
| US6972173B2 (en) * | 2002-03-14 | 2005-12-06 | Intel Corporation | Methods to increase nucleotide signals by raman scattering |
| US6982165B2 (en) * | 2001-09-24 | 2006-01-03 | Intel Corporation | Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction |
| JP4094289B2 (ja) * | 2001-12-26 | 2008-06-04 | オリンパス株式会社 | 塩基配列決定装置および塩基配列決定方法 |
| US20030215816A1 (en) * | 2002-05-20 | 2003-11-20 | Narayan Sundararajan | Method for sequencing nucleic acids by observing the uptake of nucleotides modified with bulky groups |
| JP2004016171A (ja) * | 2002-06-19 | 2004-01-22 | Hitachi Ltd | Ｄｎａ分析方法およびｄｎａ分析装置 |
| JP4329322B2 (ja) | 2002-10-04 | 2009-09-09 | ソニー株式会社 | 相互反応作用検出方法及びバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ用基板 |
-
2004
- 2004-09-28 JP JP2004281000A patent/JP5519088B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-09-22 US US11/231,998 patent/US7371532B2/en active Active
- 2005-09-28 CN CNB2005101087183A patent/CN100389208C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN100389208C (zh) | 2008-05-21 |
| CN1754965A (zh) | 2006-04-05 |
| US7371532B2 (en) | 2008-05-13 |
| US20060115833A1 (en) | 2006-06-01 |
| JP2006094707A (ja) | 2006-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5552274A (en) | Method for detecting target sequences by oscillation frequency | |
| US8105780B2 (en) | Device and method of detecting mutations and polymorphisms in DNA | |
| EP1297484B1 (en) | Method for sequence analysis | |
| US7078167B2 (en) | Arrays having background features and methods for using the same | |
| WO2007121489A3 (en) | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing | |
| US20090042735A1 (en) | Methods and Compositions Related to Nucleic Acid Detection | |
| WO2003100413A2 (en) | Surface acoustic wave sensors and methods for detecting target analytes | |
| Zhang et al. | Sequence specific label-free DNA sensing using film-bulk-acoustic-resonators | |
| JP2020031557A (ja) | 生体分子分析装置 | |
| US7371532B2 (en) | Method and apparatus for determining base sequence of nucleic acid molecule | |
| Furusawa et al. | Kinetic characterization of small DNA-binding molecules interacting with a DNA strand on a quartz crystal microbalance | |
| JP3425193B2 (ja) | 遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法 | |
| Hianik et al. | DNA-duplexes containing abasic sites: correlation between thermostability and acoustic wave properties | |
| WO2002020832A1 (en) | Microsensors and method for detecting target analytes | |
| WO2010030035A1 (en) | Impedance spectroscopy measurement of dna | |
| EP1887089A1 (en) | Method of detecting hybridization by using intercalator | |
| De Lucrezia et al. | Investigation of de novo totally random biosequences, part III: RNA Foster: a novel assay to investigate RNA folding structural properties | |
| HUT69947A (en) | Detection of nucleotide sequences using simple sequence repeats and oligonucleotide ligation | |
| JP2005245369A (ja) | 生体物質の構造決定方法及び装置 | |
| Minunni | Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA | |
| CN1099036C (zh) | 组合靶基因自动检测仪 | |
| Kurus et al. | A QCM-based rupture event scanning technique as a simple and reliable approach to study the kinetics of DNA duplex dissociation | |
| JP4345427B2 (ja) | ヌクレオチド鎖の切断方法 | |
| JPH06245754A (ja) | 塩基配列読み取り装置 | |
| WO2021050565A1 (en) | Crispr-mediated capture of nucleic acids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070903 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100720 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100921 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110415 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110510 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20110603 |
|
| R155 | Notification before disposition of declining of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R155 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140403 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5519088 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |