JP3425193B2 - 遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法 - Google Patents
遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子の変異を検出す
るセンサ及びそのセンサを用いた診断する方法に関す
る。詳しくは、突然変異の遺伝子を高感度に検出するセ
ンサおよび検出方法に関する。
るセンサ及びそのセンサを用いた診断する方法に関す
る。詳しくは、突然変異の遺伝子を高感度に検出するセ
ンサおよび検出方法に関する。
【０００２】
１．遺伝子変異の検出方法
従来、遺伝子の挿入や欠失等の異常を検査およびＤＮＡ
診断には、サザンブロティング(Southern blotting)法
やＰＣＲ法を用いて遺伝子の断片の有無や断片の大きさ
を比較することによって診断している。サザンブロティ
ング法は、検出感度が高いが、操作が煩雑で長時間かか
る問題がある。検出には十分な検体量が必要であり、し
ばしばＰＣＲ法、ＬＣＲ法を用いて増幅される。ＰＣＲ
法は極めて感度が高いが、コンタミネーション及び操作
条件が複雑であるなど問題がある。
診断には、サザンブロティング(Southern blotting)法
やＰＣＲ法を用いて遺伝子の断片の有無や断片の大きさ
を比較することによって診断している。サザンブロティ
ング法は、検出感度が高いが、操作が煩雑で長時間かか
る問題がある。検出には十分な検体量が必要であり、し
ばしばＰＣＲ法、ＬＣＲ法を用いて増幅される。ＰＣＲ
法は極めて感度が高いが、コンタミネーション及び操作
条件が複雑であるなど問題がある。
【０００３】癌や多くの遺伝病では遺伝子の変異は点変
異が大半であり、それらに対しては上記の方法は無力で
あり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のハ
イブリダイゼーション、アールナーゼ(RNase)Ａによる
プローブ切断法、ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造）
法、直接塩基配列決定法、その他（化学修飾法、変性剤
濃度勾配ゲル電気泳動法、）などが用いられている。
異が大半であり、それらに対しては上記の方法は無力で
あり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のハ
イブリダイゼーション、アールナーゼ(RNase)Ａによる
プローブ切断法、ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造）
法、直接塩基配列決定法、その他（化学修飾法、変性剤
濃度勾配ゲル電気泳動法、）などが用いられている。
【０００４】ＡＳＯ法は、一塩基対のミスマッチでハ
イブリッド形成ができなくなることを利用して点突然変
異を検出する方法である。
イブリッド形成ができなくなることを利用して点突然変
異を検出する方法である。
【０００５】RNaseＡによるプローブ切断法は、ＲＮ
Ａをプローブとし、ＲＮＡ−ＤＮＡあるいはＲＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドのミスマッチ箇所でＲＮＡプローブを
RNaseＡ反応で切断する方法である。
Ａをプローブとし、ＲＮＡ−ＤＮＡあるいはＲＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドのミスマッチ箇所でＲＮＡプローブを
RNaseＡ反応で切断する方法である。
【０００６】ＳＳＣＰ法は、ＤＮＡ断片を一本鎖に変
性したときに取る高次構造が、一塩基の置換でも変化
し、この変化をポリアクリルアミドゲル電気泳動におけ
る移動度の差として検出する方法である。
性したときに取る高次構造が、一塩基の置換でも変化
し、この変化をポリアクリルアミドゲル電気泳動におけ
る移動度の差として検出する方法である。
【０００７】直接塩基配列決定法は、単離したＤＮＡ
断片の塩基配列をジデオキシチェインターミネーション
法で決定するこにより塩基置換を知る方法である。
断片の塩基配列をジデオキシチェインターミネーション
法で決定するこにより塩基置換を知る方法である。
【０００８】何れの方法にもそれぞれ検出限界の問題が
あったり、操作が面倒であったりした。アイソトープを
用いる方法もあり、これらは管理区域を設ける必要があ
り、取扱いが煩雑で、廃棄処理の問題もある。
あったり、操作が面倒であったりした。アイソトープを
用いる方法もあり、これらは管理区域を設ける必要があ
り、取扱いが煩雑で、廃棄処理の問題もある。
【０００９】（２）ＱＣＭ
水晶振動子マイクロバランス(Quartz Crystal Microbal
ance, ＱＣＭ)をＤＮＡアッセイに用いることが知られ
ている。それらの素子は、水晶板とその両面に形成した
電極とから構成される。それら２電極は、その水晶板の
持つ固有周波数で共振できるような外部発振回路と接続
される。その周波数は水晶の質量のみならず水晶と接触
している質量や粘性や粘弾性に関係している。
ance, ＱＣＭ)をＤＮＡアッセイに用いることが知られ
ている。それらの素子は、水晶板とその両面に形成した
電極とから構成される。それら２電極は、その水晶板の
持つ固有周波数で共振できるような外部発振回路と接続
される。その周波数は水晶の質量のみならず水晶と接触
している質量や粘性や粘弾性に関係している。
【００１０】一般に、共振周波数の変化は水晶と接触し
ている質量の変化と関係付けられている。接触している
層および／または物質が剛体として振る舞うと仮定する
と、質量変化はサウルベリー(Sauerbrey)の式により求
めることができる。
ている質量の変化と関係付けられている。接触している
層および／または物質が剛体として振る舞うと仮定する
と、質量変化はサウルベリー(Sauerbrey)の式により求
めることができる。
【００１１】(G.Z.Sauerbrey, Z.Phys.,155(1959)206)
Δｆ＝−２ｆ0 2Δｍ／Ａ（ρqμq）1/2 ・・・（１）
ここに、Δｆは周波数のシフト、ｆ0はその水晶の基本
周波数、Δｍは質量変化、Ａは電極の有効面積、ρq は
水晶の密度（２．６４８ｇcm-3）、μqはずれ振動定数
（ＡＴカット水晶では２．９４７×１０11dynecm-2）で
ある。
周波数、Δｍは質量変化、Ａは電極の有効面積、ρq は
水晶の密度（２．６４８ｇcm-3）、μqはずれ振動定数
（ＡＴカット水晶では２．９４７×１０11dynecm-2）で
ある。
【００１２】米国特許公報第4,999,284号およびジャー
ナル オブ アメリカン ケミカルソサイアティ(J.Ame
r.Chem.Soc.),(1988),110,8623-8628.においてアール
シー エバーソール(R.C.Ebersole)とエム ディ ワー
ド(M.D.Ward)は、水晶振動子に免疫物質を固定化して高
感度で測定する方法を開示している。ＤＮＡについても
言及しているが具体的な手法は示していない。
ナル オブ アメリカン ケミカルソサイアティ(J.Ame
r.Chem.Soc.),(1988),110,8623-8628.においてアール
シー エバーソール(R.C.Ebersole)とエム ディ ワー
ド(M.D.Ward)は、水晶振動子に免疫物質を固定化して高
感度で測定する方法を開示している。ＤＮＡについても
言及しているが具体的な手法は示していない。
【００１３】ジェイ シー アンドル(J.C.Andle)ら
は、センサ アンド アクチュエータ(Sensors and Act
uators)B,8(1992)191-198.において、圧電体板の表面に
櫛形電極を形成した、いわゆるＳＡＷデバイスのセンサ
を用いてＤＮＡを測ることを報告している。ＤＮＡの検
出感度は、位相０．５゜で質量感度０．１ナノグラムで
あった。
は、センサ アンド アクチュエータ(Sensors and Act
uators)B,8(1992)191-198.において、圧電体板の表面に
櫛形電極を形成した、いわゆるＳＡＷデバイスのセンサ
を用いてＤＮＡを測ることを報告している。ＤＮＡの検
出感度は、位相０．５゜で質量感度０．１ナノグラムで
あった。
【００１４】また、岡畑らは、ジャーナル オブ アメ
リカン ケミカル ソサイアティ(J.Amer.Chem.Soc.),
(1992),114,8299-8300.において、水晶発振子の金電極
表面にＳＨ基で修飾した１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ドを固定化してハイブリダイゼーションによる重量変化
を、水晶を発振させて得られる共振周波数変化から測定
する方法を示した。
リカン ケミカル ソサイアティ(J.Amer.Chem.Soc.),
(1992),114,8299-8300.において、水晶発振子の金電極
表面にＳＨ基で修飾した１０ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ドを固定化してハイブリダイゼーションによる重量変化
を、水晶を発振させて得られる共振周波数変化から測定
する方法を示した。
【００１５】これらの方法を用いて共振周波数の変化か
ら検出目的のＤＮＡを検出したり、定量的に測定が可能
となる。しかしながら、実際のＤＮＡ診断や検査として
用いるためには、１０-18モル以上の感度が必要であ
る。上述の方法ではＤＮＡの検出感度が０．１から１ナ
ノグラムオーダーであり、感度が低くすぎて実用になら
ない問題があった。また、理想的には一個のＤＮＡから
検出できることが望ましい。ＤＮＡ一個の検出できる方
法および装置が渇望されている。サンプルＤＮＡをヒト
遺伝子の様な巨大ＤＮＡで分子量１０9と仮定しても、
１分子当たりの質量は、(１０9/（６．０２×１０23）
＝)１．７×１０-15ｇであり、通常の方法では検出でき
ない。
ら検出目的のＤＮＡを検出したり、定量的に測定が可能
となる。しかしながら、実際のＤＮＡ診断や検査として
用いるためには、１０-18モル以上の感度が必要であ
る。上述の方法ではＤＮＡの検出感度が０．１から１ナ
ノグラムオーダーであり、感度が低くすぎて実用になら
ない問題があった。また、理想的には一個のＤＮＡから
検出できることが望ましい。ＤＮＡ一個の検出できる方
法および装置が渇望されている。サンプルＤＮＡをヒト
遺伝子の様な巨大ＤＮＡで分子量１０9と仮定しても、
１分子当たりの質量は、(１０9/（６．０２×１０23）
＝)１．７×１０-15ｇであり、通常の方法では検出でき
ない。
【００１６】また、岡畑らは、吸着によりＤＮＡ固定を
行っているため不安定さが残っており、精度の向上が困
難という問題があった。
行っているため不安定さが残っており、精度の向上が困
難という問題があった。
【００１７】
【発明が解決しようとする問題点】従来の変異遺伝子の
診断は、ＡＳＯ法、ＲＮａｓｅ法，ＳＳＣＰ法などが使
われるが、放射線標識や酵素、蛍光色素標識したプロー
ブをハイブリダイズしたのち電気泳動を行い分子鎖ごと
に分離解析する方法であったため、操作が複雑、煩雑、
時間がかかるという問題があった。
診断は、ＡＳＯ法、ＲＮａｓｅ法，ＳＳＣＰ法などが使
われるが、放射線標識や酵素、蛍光色素標識したプロー
ブをハイブリダイズしたのち電気泳動を行い分子鎖ごと
に分離解析する方法であったため、操作が複雑、煩雑、
時間がかかるという問題があった。
【００１８】一本鎖ＤＮＡを用いた遺伝子の検出方法
は、変性した一本鎖ＤＮＡが不安定という問題がある。
ＤＮＡ一個からの検出ができない問題があった。
は、変性した一本鎖ＤＮＡが不安定という問題がある。
ＤＮＡ一個からの検出ができない問題があった。
【００１９】前述のような放射線標識のＤＮＡ検査方法
にあっては、目的遺伝子を制限酵素で切断し必要部分を
増幅したり、放射線標識や酵素、蛍光色素標識したプロ
ーブをハイブリダイズしたのち電気泳動を行い分子鎖ご
とに分離解析する方法であったため、操作が複雑、煩
雑、時間がかかるという問題があった。
にあっては、目的遺伝子を制限酵素で切断し必要部分を
増幅したり、放射線標識や酵素、蛍光色素標識したプロ
ーブをハイブリダイズしたのち電気泳動を行い分子鎖ご
とに分離解析する方法であったため、操作が複雑、煩
雑、時間がかかるという問題があった。
【００２０】一方、水晶振動子電極法では、簡単なシス
テムで、その操作は容易であるが、感度が低すぎて実用
にならない問題があった。これら原理的な問題を解決す
るため、超高感度の測定手段を特願平４−２３８６０７
号に開示している。前述のアレル特異的オリゴヌクレオ
チド（ＡＳＯ）のハイブリダイゼーション法を応用して
突然変異遺伝子を検出できると考えられるが、点変異検
出については具体的に開示されていない。
テムで、その操作は容易であるが、感度が低すぎて実用
にならない問題があった。これら原理的な問題を解決す
るため、超高感度の測定手段を特願平４−２３８６０７
号に開示している。前述のアレル特異的オリゴヌクレオ
チド（ＡＳＯ）のハイブリダイゼーション法を応用して
突然変異遺伝子を検出できると考えられるが、点変異検
出については具体的に開示されていない。
【００２１】 本発明は、突然変異遺伝子を検出できる
遺伝子診断用センサおよびそのセンサを用いた検出方法
を提供することを目的とする。
遺伝子診断用センサおよびそのセンサを用いた検出方法
を提供することを目的とする。
【００２２】
【問題点を解決するための手段】本発明の遺伝子診断用
センサは 水晶振動子と、一端を水晶振動子表面に固定
し、他端を大きな分子量を持つ化学種（カチオン性脂質
を除く）で修飾し、診断を行おうとする遺伝子部分と同
じ塩基配列を持つ（例えばプライマー部分とセンス部分
を持つ）オリゴヌクレオチドを固定化したものからな
る。
センサは 水晶振動子と、一端を水晶振動子表面に固定
し、他端を大きな分子量を持つ化学種（カチオン性脂質
を除く）で修飾し、診断を行おうとする遺伝子部分と同
じ塩基配列を持つ（例えばプライマー部分とセンス部分
を持つ）オリゴヌクレオチドを固定化したものからな
る。
【００２３】 本発明の遺伝子検出方法は、水晶振動子
と、該水晶振動子に固定化された診断目的遺伝子とハイ
ブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌク
レオチドを修飾する化学種とから構成される遺伝子セン
サを用いて、水晶振動子の振動周波数を測定する工程
と、診断目的遺伝子をハイブリダイズする工程と、一本
鎖を特異的に切断する酵素を作用させる工程と、水晶振
動子の周波数を再度測定する工程と、周波数の変化から
変異遺伝子の存在を検出する工程からなるものである。
と、該水晶振動子に固定化された診断目的遺伝子とハイ
ブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌク
レオチドを修飾する化学種とから構成される遺伝子セン
サを用いて、水晶振動子の振動周波数を測定する工程
と、診断目的遺伝子をハイブリダイズする工程と、一本
鎖を特異的に切断する酵素を作用させる工程と、水晶振
動子の周波数を再度測定する工程と、周波数の変化から
変異遺伝子の存在を検出する工程からなるものである。
【００２４】 診断目的遺伝子をハイブリダイズする
と、診断目的遺伝子に突然変異が存在する場合、ハイブ
リダイズした時に相補結合が完成しない部分ができて一
本鎖の部分が発生することになる。一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素を作用させると、大きな分子量の化学
種を含む遺伝子部分が切断されてるため、大きな質量変
化が起きる。この質量変化は水晶振動子の共振周波数の
変化あるいは、水晶振動子の表面近傍の粘弾性の変化と
して検出ができる。かくの如く変異遺伝子を高感度に検
出できる遺伝子検出方法を提供する。
と、診断目的遺伝子に突然変異が存在する場合、ハイブ
リダイズした時に相補結合が完成しない部分ができて一
本鎖の部分が発生することになる。一本鎖ＤＮＡを特異
的に切断する酵素を作用させると、大きな分子量の化学
種を含む遺伝子部分が切断されてるため、大きな質量変
化が起きる。この質量変化は水晶振動子の共振周波数の
変化あるいは、水晶振動子の表面近傍の粘弾性の変化と
して検出ができる。かくの如く変異遺伝子を高感度に検
出できる遺伝子検出方法を提供する。
【００２５】図１に本発明の遺伝子センサ１０を示す。
遺伝子センサ１０は遺伝子の診断部位のＤＮＡと同一塩
基配列を持つオリゴヌクレオチド３が一端を水晶振動子
電極２の表面に固定化され、他端を高分子量の化学種４
で化学修飾されている。
遺伝子センサ１０は遺伝子の診断部位のＤＮＡと同一塩
基配列を持つオリゴヌクレオチド３が一端を水晶振動子
電極２の表面に固定化され、他端を高分子量の化学種４
で化学修飾されている。
【００２６】以上のようにして得られた遺伝子センサ１
０を用いて、変異遺伝子を検出する方法を図２を参照し
て説明する。
０を用いて、変異遺伝子を検出する方法を図２を参照し
て説明する。
【００２７】まず、正常な遺伝子２０（ａ−１）、挿入
の変異がある遺伝子２１（ａ−２）、欠失の変異がある
遺伝子２２（ａ−３）と点変異のある遺伝子２３（ａ−
４）の４種類の遺伝子を遺伝子センサ１０のオリゴヌク
レオチド３をハイブリダイズさせる。何らかの変異（挿
入、欠失、点変異の変異）があると一本鎖の部分２４
（ａ−２），２５（ａ−３），２６（ａ−４）ができる
が、正常な遺伝子では一本鎖の部分はできない（ａ−
１）。これらに、一本鎖を特異的に切断する酵素３０を
作用させると、ｂ−２、ｂ−３、ｂ−４に見られるよう
に、一本鎖があるものは一本鎖の部分から切断される。
このために、高分子量の化学種４が取れた状態になる。
すると、水晶振動子１の表面の質量が減少し、水晶振動
子１の共振周波数が増大する。
の変異がある遺伝子２１（ａ−２）、欠失の変異がある
遺伝子２２（ａ−３）と点変異のある遺伝子２３（ａ−
４）の４種類の遺伝子を遺伝子センサ１０のオリゴヌク
レオチド３をハイブリダイズさせる。何らかの変異（挿
入、欠失、点変異の変異）があると一本鎖の部分２４
（ａ−２），２５（ａ−３），２６（ａ−４）ができる
が、正常な遺伝子では一本鎖の部分はできない（ａ−
１）。これらに、一本鎖を特異的に切断する酵素３０を
作用させると、ｂ−２、ｂ−３、ｂ−４に見られるよう
に、一本鎖があるものは一本鎖の部分から切断される。
このために、高分子量の化学種４が取れた状態になる。
すると、水晶振動子１の表面の質量が減少し、水晶振動
子１の共振周波数が増大する。
【００２８】水晶振動子１の発振周波数の上昇は、例え
ば、図３に示す測定システムによって検知され、測定結
果が表示あるいは出力される。水晶振動子１は、発振回
路４０と接続されることによって水晶振動子固有の（共
振）周波数で発振する。発振周波数は、発振回路４０で
増幅されて周波数カウンター４１により周波数を計測
し、コンピュータ４２に送信する。
ば、図３に示す測定システムによって検知され、測定結
果が表示あるいは出力される。水晶振動子１は、発振回
路４０と接続されることによって水晶振動子固有の（共
振）周波数で発振する。発振周波数は、発振回路４０で
増幅されて周波数カウンター４１により周波数を計測
し、コンピュータ４２に送信する。
【００２９】そして、遺伝子検出操作の前後の共振周波
数の変化を比較し、周波数の上昇データから検出目的遺
伝子の存在を判定する。共振周波数の変化の大きさか
ら、予め測定しておいた検量線を用いて検出目的遺伝子
の濃度あるいは含有量を算出できる。これらの測定結果
は、ディスプレー装置４３、あるいは出力装置４４へ送
られ表示あるいは印字出力される。
数の変化を比較し、周波数の上昇データから検出目的遺
伝子の存在を判定する。共振周波数の変化の大きさか
ら、予め測定しておいた検量線を用いて検出目的遺伝子
の濃度あるいは含有量を算出できる。これらの測定結果
は、ディスプレー装置４３、あるいは出力装置４４へ送
られ表示あるいは印字出力される。
【００３０】遺伝子センサ１０の質量感度を増大するた
め電極面積を微小化することができる。（式１から）し
かしながら、面積を小さくすることは、電極抵抗を増大
することになり、発振回路の負抵抗値よりも大きくなる
と、もはや前述の発振法では測定できない。このような
場合、図４に示すような測定システムを使用することが
できる。遺伝子センサ１０のアドミッタンスの周波数依
存性をインピーダンス測定装置５０を用いて測定する。
測定結果をコンピュータ５１に送信する。アドミッタン
スの周波数スペクトルをコンダクタンスが最大となる周
波数が共振周波数を与えることを利用して、共振周波数
を算出することができるので、前述のように検出目的遺
伝子の存在を判定したり、同定することができる。
め電極面積を微小化することができる。（式１から）し
かしながら、面積を小さくすることは、電極抵抗を増大
することになり、発振回路の負抵抗値よりも大きくなる
と、もはや前述の発振法では測定できない。このような
場合、図４に示すような測定システムを使用することが
できる。遺伝子センサ１０のアドミッタンスの周波数依
存性をインピーダンス測定装置５０を用いて測定する。
測定結果をコンピュータ５１に送信する。アドミッタン
スの周波数スペクトルをコンダクタンスが最大となる周
波数が共振周波数を与えることを利用して、共振周波数
を算出することができるので、前述のように検出目的遺
伝子の存在を判定したり、同定することができる。
【００３１】オリゴヌクレオチド３を修飾している化学
種４の質量を検出目的ＤＮＡ２０，２１，２２，２３の
それより大きく、好ましくは水晶振動子１の検出感度の
限界以上の質量にしておくと、一分子のレベルでも異常
のある遺伝子があれば、変異遺伝子の検出および同定が
迅速にかつ容易に行うことができる。
種４の質量を検出目的ＤＮＡ２０，２１，２２，２３の
それより大きく、好ましくは水晶振動子１の検出感度の
限界以上の質量にしておくと、一分子のレベルでも異常
のある遺伝子があれば、変異遺伝子の検出および同定が
迅速にかつ容易に行うことができる。
【００３２】例えば、その質量が１pg以上である化学種
４でオリゴヌクレオチド３を修飾して用い、かつ、質量
変化に対する検出限界が１ｐｇ以上であるような水晶振
動子１を用いると、一分子でも変異のある遺伝子が存在
すれば、修飾化学種４を含む部分が外れ、その結果、大
きな質量減少となり、これを水晶振動子１で感知される
ところとなる。このように遺伝子の変異を１分子レベル
で検出できることが理解される。このとき、センサの応
答は、外れた切断されたオリゴヌクレオチドのの修飾さ
れた化学種４の個数に比例するので、デジタル量的に変
化する特徴がある。
４でオリゴヌクレオチド３を修飾して用い、かつ、質量
変化に対する検出限界が１ｐｇ以上であるような水晶振
動子１を用いると、一分子でも変異のある遺伝子が存在
すれば、修飾化学種４を含む部分が外れ、その結果、大
きな質量減少となり、これを水晶振動子１で感知される
ところとなる。このように遺伝子の変異を１分子レベル
で検出できることが理解される。このとき、センサの応
答は、外れた切断されたオリゴヌクレオチドのの修飾さ
れた化学種４の個数に比例するので、デジタル量的に変
化する特徴がある。
【００３３】遺伝子センサ１０に固定化されたオリゴヌ
クレオチド３は、相補的オリゴヌクレオチド３’と結合
させて２本鎖にしておくと、安定に保存できて好都合で
ある。使用する前にオリゴヌクレオチド対３、３’を解
離してから使用することもできるが、検出目的の遺伝子
を含む被検液に遺伝子センサ１０を接触させ、検出目的
遺伝子２０〜２３が遺伝子センサ１０に結合し易いよう
に、相補結合を形成している水素結合を弱めるために加
熱したり、および／または、電解質を添加したりするこ
とにより、ヌクレオチド対および検出目的遺伝子２０〜
２３の相補的結合が解離させる。その後、温度を徐々に
下げてアニールすることでオリゴヌクレオチド３と検出
目的遺伝子２０〜２３とが結合する。一本鎖を特異的に
切断する酵素３０を作用させると一本鎖があるものは一
本鎖の部分から切断される。このために、高分子量の化
学種４が取れた状態になる。水晶振動子１の表面の質量
が減少し、水晶振動子１の発振周波数が上昇する。この
周波数上昇によって被検液中の検出目的遺伝子２１〜２
３の存在が確認される。同時に電極２表面への非特異的
物質の吸着も起こるが、これら発振周波数を低下する方
向に作用するので、本発明の遺伝子センサ１０は非常に
選択性の高いものとなる。
クレオチド３は、相補的オリゴヌクレオチド３’と結合
させて２本鎖にしておくと、安定に保存できて好都合で
ある。使用する前にオリゴヌクレオチド対３、３’を解
離してから使用することもできるが、検出目的の遺伝子
を含む被検液に遺伝子センサ１０を接触させ、検出目的
遺伝子２０〜２３が遺伝子センサ１０に結合し易いよう
に、相補結合を形成している水素結合を弱めるために加
熱したり、および／または、電解質を添加したりするこ
とにより、ヌクレオチド対および検出目的遺伝子２０〜
２３の相補的結合が解離させる。その後、温度を徐々に
下げてアニールすることでオリゴヌクレオチド３と検出
目的遺伝子２０〜２３とが結合する。一本鎖を特異的に
切断する酵素３０を作用させると一本鎖があるものは一
本鎖の部分から切断される。このために、高分子量の化
学種４が取れた状態になる。水晶振動子１の表面の質量
が減少し、水晶振動子１の発振周波数が上昇する。この
周波数上昇によって被検液中の検出目的遺伝子２１〜２
３の存在が確認される。同時に電極２表面への非特異的
物質の吸着も起こるが、これら発振周波数を低下する方
向に作用するので、本発明の遺伝子センサ１０は非常に
選択性の高いものとなる。
【００３４】
【実施例】以下、本発明の実施例を示しながら、本発明
を詳細に説明する。
を詳細に説明する。
【００３５】
【実施例１】図１に遺伝子センサ１０の構造を示す。
【００３６】水晶基板１の両面には、発振励起用の直径
５mmの金円板電極２が形成されている。
５mmの金円板電極２が形成されている。
【００３７】金電極２の表面には、一端が化学種４で修
飾されたオリゴヌクレオチド３がシラン化合物６を介し
て固定化されている。
飾されたオリゴヌクレオチド３がシラン化合物６を介し
て固定化されている。
【００３８】水晶振動子基板１は、直径１２mm、厚さ
０．３３mmのＡＴカットの水晶円板を用い、高周波スパ
ッタ装置（日電アネルバ社製ＳＰＦ−２１０Ｈ）を用い
て金電極２を形成した。
０．３３mmのＡＴカットの水晶円板を用い、高周波スパ
ッタ装置（日電アネルバ社製ＳＰＦ−２１０Ｈ）を用い
て金電極２を形成した。
【００３９】水晶基板１とシランカップリング剤（γ−
グリシドキシプロピルシラン、ＳＨ６０４０，東レ・ダ
ウコーニング・シリコーン（株））を容れた容器と一緒
に真空チャンバーに入れて減圧下で２時間吸着したの
ち、常圧下で１５０℃、３０分間加熱して反応させるこ
とによってシラン化合物６を形成した。
グリシドキシプロピルシラン、ＳＨ６０４０，東レ・ダ
ウコーニング・シリコーン（株））を容れた容器と一緒
に真空チャンバーに入れて減圧下で２時間吸着したの
ち、常圧下で１５０℃、３０分間加熱して反応させるこ
とによってシラン化合物６を形成した。
【００４０】オリゴヌクレオチド３は、DNA/RNA SYNTHE
SIZERS 392型(Applied BiosystemsInc.社製）のＤＮＡ
シンセサイザーをもちいてポリスチレン（ＰＳ）微粒子
上の化学種を出発点にして合成したことによって、修飾
化学種としてポリスチレン微粒子を末端に持つオリゴヌ
クレオチド鎖３を調製した。
SIZERS 392型(Applied BiosystemsInc.社製）のＤＮＡ
シンセサイザーをもちいてポリスチレン（ＰＳ）微粒子
上の化学種を出発点にして合成したことによって、修飾
化学種としてポリスチレン微粒子を末端に持つオリゴヌ
クレオチド鎖３を調製した。
【００４１】次に、水溶性カルボジイミドを用いて水晶
振動子表面に固定化されたシラン化合物６のＯＨ基を活
性した後、該ヌクレオチド３と反応させて水晶基板の表
面に固定した。
振動子表面に固定化されたシラン化合物６のＯＨ基を活
性した後、該ヌクレオチド３と反応させて水晶基板の表
面に固定した。
【００４２】このようにして作製した遺伝子センサ１０
を図３に示す測定装置を用いて乾燥空気中で共振周波数
を測定した。共振周波数は、オリゴヌクレオチド３とＰ
Ｓ４を固定しないとき５００２２０１Hzであり、固定化
したときには、５００１９０６Hzであった。予め、共振
周波数と質量との関係を測定することによって、質量感
度は理論値に近い３．４ng/Hzが得られている。したが
って、オリゴヌクレオチドとＰＳの固定化量は、（５０
０１９０６−５００２２０１）×（−３．４）＝１００
０[ng］と分かった。平均０．５pgのポリスチレン粒子
を用いたので、約２×１０6個が固定化されたことが分
かった。
を図３に示す測定装置を用いて乾燥空気中で共振周波数
を測定した。共振周波数は、オリゴヌクレオチド３とＰ
Ｓ４を固定しないとき５００２２０１Hzであり、固定化
したときには、５００１９０６Hzであった。予め、共振
周波数と質量との関係を測定することによって、質量感
度は理論値に近い３．４ng/Hzが得られている。したが
って、オリゴヌクレオチドとＰＳの固定化量は、（５０
０１９０６−５００２２０１）×（−３．４）＝１００
０[ng］と分かった。平均０．５pgのポリスチレン粒子
を用いたので、約２×１０6個が固定化されたことが分
かった。
【００４３】
【実施例２】実施例１で作成した遺伝子センサの表面
に、正常な遺伝子を全量で１×１０5分子含む試料溶液
１００μlを接触させて、溶液温度を９３℃で１分間保
持したのち、ゆっくり降温しながらアニールを行いハイ
ブリダイズした。洗浄、乾燥後、Ｓ１ヌクレアーゼを１
ユニット/ml含む酵素液３０を加えて１０分間４℃で反
応させた。十分に水洗浄した後、燥空気中で発振周波数
を測定すると、５００１９０６Hzであった。質量変化が
ないことが分かり、正常遺伝子の場合、質量の変化がな
いことが確認された。
に、正常な遺伝子を全量で１×１０5分子含む試料溶液
１００μlを接触させて、溶液温度を９３℃で１分間保
持したのち、ゆっくり降温しながらアニールを行いハイ
ブリダイズした。洗浄、乾燥後、Ｓ１ヌクレアーゼを１
ユニット/ml含む酵素液３０を加えて１０分間４℃で反
応させた。十分に水洗浄した後、燥空気中で発振周波数
を測定すると、５００１９０６Hzであった。質量変化が
ないことが分かり、正常遺伝子の場合、質量の変化がな
いことが確認された。
【００４４】
【実施例３】次に挿入タイプの変異遺伝子を全量で１×
１０5分子含む資料溶液１００μlに接触させて、実施例
２と同様にしてハイブリダイズさせた後、Ｓ１ヌクレア
ーゼで処理すると、共振周波数は、１５Hzの上昇が観測
された。質量として１５×３．４＝５１ngが減少し、分
子数としては約１×１０5と算出できる。試料中の遺伝
子のほぼ全量が反応に預かったと考えられ、変異のある
遺伝子を検出することができた。
１０5分子含む資料溶液１００μlに接触させて、実施例
２と同様にしてハイブリダイズさせた後、Ｓ１ヌクレア
ーゼで処理すると、共振周波数は、１５Hzの上昇が観測
された。質量として１５×３．４＝５１ngが減少し、分
子数としては約１×１０5と算出できる。試料中の遺伝
子のほぼ全量が反応に預かったと考えられ、変異のある
遺伝子を検出することができた。
【００４５】
【実施例４】点変異タイプの遺伝子を全量で５×１０4
分子含む資料溶液１００μlを実施例１の遺伝子センサ
に接触させて、実験例１と同様にしてハイブリダイズさ
せた後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理すると、共振周波数
は、７Hzの上昇が観測された。質量として７×３．４＝
２３．８ngが減少し、分子数としては約５×１０4と算
出できる。試料中の遺伝子のほぼ全量が反応に預かった
と考えられ、変異のある遺伝子を検出することができ
た。。
分子含む資料溶液１００μlを実施例１の遺伝子センサ
に接触させて、実験例１と同様にしてハイブリダイズさ
せた後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理すると、共振周波数
は、７Hzの上昇が観測された。質量として７×３．４＝
２３．８ngが減少し、分子数としては約５×１０4と算
出できる。試料中の遺伝子のほぼ全量が反応に預かった
と考えられ、変異のある遺伝子を検出することができ
た。。
【００４６】
【実施例５】基本周波数が２５MHzである直径４mmの水
晶板に直径０．５mmの金電極形成したのち実施例１と同
様にして遺伝子センサを作製した。
晶板に直径０．５mmの金電極形成したのち実施例１と同
様にして遺伝子センサを作製した。
【００４７】共振周波数の変化を測定するのに図４に示
すようなインピーダンスアナライザー（ＨＰ４１９４
Ａ）を用いてコンダクタンス最大周波数から求めた以外
は実施例１と同様にして測定した。ＤＮＡを固定化しな
いときの質量感度は１．１pg/Hzであった。
すようなインピーダンスアナライザー（ＨＰ４１９４
Ａ）を用いてコンダクタンス最大周波数から求めた以外
は実施例１と同様にして測定した。ＤＮＡを固定化しな
いときの質量感度は１．１pg/Hzであった。
【００４８】実施例３と同様にして変異遺伝子を含む試
料で測定した結果、試料ＤＮＡ分子２個からの変異遺伝
子があれば検出が可能であることが分かった。
料で測定した結果、試料ＤＮＡ分子２個からの変異遺伝
子があれば検出が可能であることが分かった。
【００４９】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
は、放射標識や酵素等を用いないので取扱いが簡単か
つ、安全である。また、操作が簡単である。従来法に比
較して迅速測定が可能である。
は、放射標識や酵素等を用いないので取扱いが簡単か
つ、安全である。また、操作が簡単である。従来法に比
較して迅速測定が可能である。
【００５０】本発明によれば、正常遺伝子の一部の配列
が分かれば数個のレベルから突然変異を起こした遺伝子
ＤＮＡを検出することが可能である。遺伝子レベルでの
異常（点変異、欠失、挿入）を検出することができの
で、遺伝子レベルの病因の診断や治療に貢献できる。
が分かれば数個のレベルから突然変異を起こした遺伝子
ＤＮＡを検出することが可能である。遺伝子レベルでの
異常（点変異、欠失、挿入）を検出することができの
で、遺伝子レベルの病因の診断や治療に貢献できる。
【００５１】そして、癌遺伝子や癌抑制遺伝子を効率よ
く検出できるので、再発や発症の予防が可能になる。
く検出できるので、再発や発症の予防が可能になる。
【００５２】本発明遺伝子センサを複数配列して形成す
ることで同時に多種類検査ができることは自明のことで
ある。ハイリスク群のスクリーニング検査に好適であ
る。
ることで同時に多種類検査ができることは自明のことで
ある。ハイリスク群のスクリーニング検査に好適であ
る。
図１は、本発明の１実施例による遺伝子センサの断面構
造を示す。 図２は、本発明の変異遺伝子の検出原理を説明する図で
ある。 図３は、水晶振動子の発振周波数の上昇を検知する測定
システムのブロック図である。 図４は、共振周波数の変化を測定するためのシステムの
ブロック図である。
造を示す。 図２は、本発明の変異遺伝子の検出原理を説明する図で
ある。 図３は、水晶振動子の発振周波数の上昇を検知する測定
システムのブロック図である。 図４は、共振周波数の変化を測定するためのシステムの
ブロック図である。
１：水晶振動子
２：電極
３：オリゴヌクレオチド
４：高分子量の化学種
６：シラン化合物
１０：遺伝子センサ
２０：正常遺伝子
２１：挿入の変異がある遺伝子
２２：欠失の変異がある遺伝子
２３：点変異のある遺伝子
３０：酵素液
４０：発振回路
４１：周波数カウンター
４２，５１：コンピュータ
４３：ディスプレー装置
４４：出力装置
５０：インピーダンス測定装置
Claims (2)
- 【請求項１】 水晶振動子と、該水晶振動子に固定化さ
れた診断目的遺伝子とハイブリダイズ可能なオリゴヌク
レオチドと、該オリゴヌクレオチドを修飾する化学種
（カチオン性脂質を除く）とから構成されることを特徴
とする遺伝子センサ。 - 【請求項２】水晶振動子と、該水晶振動子に固定化され
た診断目的遺伝子とハイブリダイズ可能なオリゴヌクレ
オチドと、該オリゴヌクレオチドを修飾する化学種とか
ら構成される遺伝子センサを用いて、水晶振動子の振動
周波数を測定する工程と、診断目的遺伝子をハイブリダ
イズする工程と、一本鎖を特異的に切断する酵素を作用
させる工程と、水晶振動子の周波数を再度測定する工程
と、周波数の変化から変異遺伝子の存在を検出する工程
と、からなることを特徴とする遺伝子検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22152893A JP3425193B2 (ja) | 1993-09-07 | 1993-09-07 | 遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22152893A JP3425193B2 (ja) | 1993-09-07 | 1993-09-07 | 遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0775598A JPH0775598A (ja) | 1995-03-20 |
| JP3425193B2 true JP3425193B2 (ja) | 2003-07-07 |
Family
ID=16768133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22152893A Expired - Fee Related JP3425193B2 (ja) | 1993-09-07 | 1993-09-07 | 遺伝子センサおよびそれを用いた遺伝子検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3425193B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100517243B1 (ko) * | 1999-11-03 | 2005-09-28 | 인터내셔널 비지네스 머신즈 코포레이션 | 센서 시스템, ｐＨ 미터 및 타겟 물질 검출 방법 |
| US7077982B2 (en) | 2001-03-23 | 2006-07-18 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Molecular electric wire, molecular electric wire circuit using the same and process for producing the molecular electric wire circuit |
| US20020168756A1 (en) | 2001-03-23 | 2002-11-14 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Particle size variable reactor |
| JP4294946B2 (ja) | 2002-12-13 | 2009-07-15 | 富士フイルム株式会社 | 標的検出装置及び標的検出方法並びに標的検出用基材 |
| JP3920223B2 (ja) * | 2003-01-07 | 2007-05-30 | 日本碍子株式会社 | 反応性チップと、このチップを用いた標的物質の結合検出方法 |
| US7076127B2 (en) | 2003-01-14 | 2006-07-11 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Optical switch and safety apparatus using the same |
| JP5423681B2 (ja) * | 2008-10-07 | 2014-02-19 | 株式会社村田製作所 | 弾性波センサ及び弾性波センサを用いた検出方法 |
-
1993
- 1993-09-07 JP JP22152893A patent/JP3425193B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0775598A (ja) | 1995-03-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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