DE19742227A1

DE19742227A1 - Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls

Info

Publication number: DE19742227A1
Application number: DE19742227A
Authority: DE
Inventors: Juergen Prof Dipl Phys Wolfrum
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-09-25
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 1999-04-01
Also published as: WO1999015543A2; US6225068B1; WO1999015543A3; EP1017708A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren beim Sequen zieren einzelner Makromoleküle, insbesondere einzelner DNA- und RNA-Moleküle.

Seit einigen Jahren wird weltweit versucht, einzelne DNA-Moleküle bzw. -Stränge zu sequenzieren. Die Sequenzie rung eines DNA-Einzelstrangs umfaßt dabei die folgenden Schritte:

(a) Ausgehend von dem zu sequenzierenden DNA-Molekül, dem sog. Template, welches in großer Anzahl vorliegt, werden DNA-Moleküle als komplementäre Kopien synthetisiert, bei denen an wenigstens einem Teil der Nukleotide Farbstoff- Moleküle gekoppelt sind. Diese DNA-Moleküle werden häu fig als markierte DNA bezeichnet. Die Synthese geschieht mit Hilfe einer Polymerase. Im Ergebnis erhält man mar kierte Doppelstränge oder, bei Bedarf, nach Denaturie rung markierte Einzelstränge.
(b) Aus den markierten DNA-Strängen wird ein einzelner an einen Träger gebunden.
(c) Der Träger wird in eine Detektionsapparatur überführt; in der Detektionsapparatur werden die einzelnen, teil weise markierten Nukleotide durch eine Exonuklease suk zessiv abgebaut, d. h. vom DNA-Strang abgespalten.
(d) Die abgespaltenen und markierten Mononukleotide werden in der Detektionsapparatur detektiert und identifiziert. Dies kann mit Hilfe von spektral oder zeitlich aufgelö ster Fluoreszenzspektroskopie oder anderen Nukleotid spezifischen Verfahren, wie beispielsweise Massenspek trometrie, erfolgen.

Schritt (b) wird bisher in der Weise durchgeführt, daß Mikrokügelchen mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 µm mit Avidin oder Streptavidin beschichtet werden. An das 5'- Ende des DNA-Strangs wird Biotin gekoppelt. Taucht man die beschichteten Mikrokügelchen in eine Lösung, die die bio tinylierten DNA-Stränge enthält, so binden die DNA-Stränge an die Mikrokügelchen. Ist die Konzentration der DNA-Stränge in der Lösung sehr klein, so binden in statistischer Weise lediglich 0, 1, 2 oder mehr DNA-Stränge an die Kügelchen, im Mittel jedoch nur zwischen keinem und einem DNA-Strang. Mit Hilfe einer optischen Pinzette wird daraufhin ein Mi krokügelchen gesucht, welches aufgrund des gebundenen DNA- Strangs ein Fluoreszenzsignal zeigt. Auf diese Weise findet man mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit ein Mikrokügel chen, an das genau ein DNA-Strang gebunden ist.

Damit die Fluoreszenz des an das Mikrokügelchen gebunde nen DNA-Strangs trotz der Brownschen Bewegung des Mikrokü gelchens gesehen werden kann, muß der DNA-Strang mit einem Anregungslicht hoher Leistung bestrahlt werden. Dies kann zu einer Zerstörung derjenigen Farbstoffe führen, mit denen der DNA-Strang gefärbt ist. Hinzu kommt, daß die Farbstoff-Mole küle in einem hochmarkierten DNA-Strang aufgrund verschie dener Fluoreszenz-Löschprozesse nur schlecht fluoreszieren.

Die Abspaltung und Detektion der Mononukleotide in Schritt (d) geschieht häufig in Flußsystemen (J. Biomolecu lar Struc. & Dynamics, Band 7 (1989) S. 301). Durch ein ge eignetes Ausbilden eines Strömungssystems fließen die mar kierten und abgespaltenen Mononukleotide an einer Detekti onsapparatur vorbei. Diese arbeitet mit einem relativ großen Detektionsvolumen im Bereich von Pikolitern. Entsprechend groß ist das Hintergrundsignal durch Verunreinigungen und Raman-Streuung. Ferner bedingt das Flußsystem einen relativ großen Abstand der Sammeloptik vom Detektionsvolumen, wo durch die Sammeleffizienz sinkt.

Aufgabe der Erfindung ist es, das Verfahren zum Sequen zieren eines einzelnen DNA-Moleküls zu verbessern.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird für den eingangs genann ten Schritt (b) der Einzelstrang-Sequenzierung ein Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluoreszenzfähigem Ma kromoleküls aus einem Fluid angegeben, welches dadurch ge kennzeichnet ist,
daß ein einen Durchmesser von höchstens wenigen Mikrome tern aufweisender Bereich einer Spitze einer Faser mit Mole külen beschichtet wird, wobei die Moleküle so ausgewählt werden, daß sie mit dem Material der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül eine Bindung eingehen kön nen;
daß die beschichtete Faserspitze in das das fluoreszenz fähige Makromolekül enthaltende Fluid eingetaucht wird, wobei der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungs wellenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird;
daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faser spitze detektiert wird; und
daß die Faserspitze aus dem Fluid entfernt wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet.

Dadurch, daß eine Faser mit einer äußerst kleinen Spitze verwendet wird, und auch nur ein Bereich dieser Spitze mit Molekülen beschichtet wird, die eine Bindung zwischen der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül her stellen können, besteht nur eine sehr kleine Oberfläche, an die das fluoreszenzfähige Makromolekül anbinden kann. Da durch, daß die Oberfläche so klein ist, wird die Wahrschein lichkeit wesentlich erhöht, daß nur ein einziges Molekül an die Faserspitze bindet.

Außerdem wird eine online-Überwachung der Bindung eines fluoreszenzfähigen Makromoleküls an die Faserspitze er reicht. Sobald eine vorgegebene Erhöhung der Intensität des detektierten Lichts festgestellt wird, kann mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit von einer Bindung eines fluoreszenzfähi gen Makromoleküls an die Faserspitze ausgegangen werden. Die Faserspitze wird anschließend sofort aus dem Fluid entfernt.

Bei der Online-Überwachung steht für die Fluoreszenzde tektion des an die Faserspitze gebundenen fluoreszenzfähigen Makromolekül, das nicht mehr diffundieren kann, eine ver hältnismäßig lange Zeit zur Verfügung. Deshalb kann die Anregungsintensität entsprechend klein gewählt werden. Da durch wiederum sinkt die Wahrscheinlichkeit einer photo chemischen Zerstörung der Fluoreszenzfähigkeit des Makromo leküls.

Wird die Konzentration der fluoreszenzfähigen Makromole küle im Fluid derart gewählt, daß es nur in größeren zeit lichen Abständen zu einer Bindung an die Faserspitze kommt, so ist die Wahrscheinlichkeit, daß zwei fluoreszenzfähige Makromoleküle gleichzeitig an die Faserspitze binden, sehr klein. Demzufolge ist wenn das Fluoreszenzlicht eine vorge gebene Intensität überschreitet, die Wahrscheinlichkeit sehr groß, daß nur ein einziges fluoreszenzfähiges Makromolekül an die Faserspitze gebunden hat.

Das an eine Faserspitze gebundene fluoreszenzfähige Ma kromolekül kann mit Hilfe der Faserspitze aus dem Fluid entfernt und zu beliebigen anderen Apparaturen transportiert werden.

Das angegebene Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Makromoleküls aus einem Fluid ist dabei nicht auf DNA-Moleküle beschränkt. Es kann ganz allgemein für beliebige fluoreszenzfähige Makromoleküle eingesetzt werden, sofern eine Bindung zwischen den Makromolekülen und der Faserspitze vermittelt werden kann. Auch kann das Ver fahren sowohl in Gasen als auch in Flüssigkeiten eingesetzt werden.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird die Beschichtung der Faserspitze mit Molekülen dadurch erreicht, daß die Oberfläche der Faserspitze mit Photobio tin-Molekülen beschichtet wird; daß ein räumlich einge grenzter Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit Licht im Wellenlängenbereich von ca. 300 bis 360 nm derart belichtet wird, daß die Photobiotin-Moleküle im belichteten Bereich an die Faserspitze gebunden werden; daß die nicht gebundenen Photobiotin-Moleküle danach von der Faserspitze abgewaschen werden; und daß die Faserspitze danach mit einer Avidin oder Streptavidin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird.

Ist Biotin am fluoreszenzfähigen Makromolekül gebunden, so bietet sich aufgrund der starken Bindung zwischen Biotin und Avidin oder Streptavidin eine Beschichtung der Faser spitze mit diesen Molekülen an. Dieses Verfahren stellt eine besonders elegante Möglichkeit dar, eine Beschichtung mit Avidin oder Streptavidin in einem möglichst kleinen Bereich der Faserspitze zu erreichen. Die Beschichtung der Faser spitze kann durch den Einsatz von fokussiertem Licht in einem flächenmäßig auf Bruchteile eines µm² beschränkten Bereich erreicht werden. Eine aus Glas oder PMMA gefertigte Faserspitze wird für die Beschichtung mit Photobiotin in bekannter Weise vorbehandelt.

Bei einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird ein farbstoff-markiertes doppelsträngiges DNA-Molekül aus einer wäßrigen Lösung extrahiert, wobei der wäßrigen Lösung Interkalationsfarbstoff-Moleküle zugesetzt werden, deren Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge der Farbstoff-Moleküle liegt. Licht der Anregungswellenlänge der Interkalationsfarbstoff- Moleküle wird in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze derart geleitet, daß es eine geringe Eindringtiefe in die wäßrige Lösung hat. Die Interkalationsfarbstoff-Moleküle werden durch das eingekoppelte Licht zur Fluoreszenz ange regt. Das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze wird detektiert. Die Faserspitze wird aus dem Fluid ent fernt, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgege bene Intensität überschreitet.

Es werden somit nicht mehr die an das doppelsträngige DNA-Molekül gekoppelten Farbstoff-Moleküle angeregt, sondern die Interkalationsfarbstoff-Moleküle. Die an die DNA gekop pelten Farbstoff-Moleküle werden somit geschont. Sie sind entscheidend für ein späteres Detektieren und Identifizieren der einzelnen Nukleotide des DNA-Moleküls.

Ein weiterer entscheidender Aspekt für ein Gelingen ei ner Einzelstrang-DNA-Sequenzierung besteht darin, daß mög lichst kein markiertes und abgespaltenes Nukleotid undetek tiert bleibt.

Erfindungsgemäß wird dazu ein Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Moleküls in einem Fluid angegeben, bei dem
ein Fluid durch eine Mikrokapillare geleitet wird, die an einem Ende eine Austrittsöffnung mit einem Innendurch messer zwischen ca. 300 und 700 nm und einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der Anregungswellenlänge des fluo reszenzfähigen Moleküls hat, wobei das fluoreszenzfähige Molekül an der Austrittsöffnung austritt;
ein Lichtstrahl der Anregungswellenlänge des fluores zenzfähigen Moleküls auf einen Bereich unmittelbar an der Austrittsöffnung der Mikrokapillare fokussiert wird;
das Fluoreszenzlicht mit hoher Sammeleffizienz detek tiert wird; und
der Durchtritt des Moleküls durch den Fokus angenommen wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgege ben Intensität überschreitet.

Das abgespaltene, die Kapillare durch die Austrittsöff nung verlassende Nukleotid erzeugt ein Fluoreszenzlicht, wenn es in den Lichtstrahl kurz vor, an oder kurz hinter der Austrittsöffnung gelangt.

Das angegebene Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluoreszenzfähigen Moleküls ist keineswegs auf DNA-Moleküle beschränkt. Dadurch, daß die relativ kleine Austrittsöffnung der ausgezogenen Mikrokapillare vollständig mit Licht be strahlt wird, kann kein Molekül am Fokus der Lichtquelle vorbeifließen oder -diffundieren.

Ganz entscheidend für eine Verbesserung des Signal- Rausch-Verhältnisses ist es, daß die Wandstärke der ausgezo genen Mikrokapillare im beobachteten Bereich kleiner als ein Viertel der Wellenlänge, vorzugsweise kleiner als ein Achtel der Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lichts ist.

Dadurch kommt es zu einer stark abgeschwächten Reflexion des Anregungslichts. Dies wiederum führt zu einer deutlichen Verringerung des störenden Hintergrundsignals bei der Ein zelmolekül-Detektion.

Eine weitere Abschwächung der Reflexion läßt sich da durch erzielen, daß der Brechungsindex des die Kapillarspit ze ausfüllenden und des umgebenden Lösungsmittels mit dem des Glasmaterials abgeglichen wird.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner durch ein Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA- Moleküls gelöst, bei dem

(a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff-Moleküle gekoppelt sind (markierte Nukleotide);
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze mit einem Durchmesser von höchstens wenigen Mikrometern aus der Lösung extrahiert wird;
(c1) die Faserspitze in eine Mikrokapillare eingeführt wird, die an einem Ende einen Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm hat;
(c2) die Mikrokapillare mit einer Lösung befüllt wird, die ein sukzessives Abspalten einzelner Nukleotide des DNA- Moleküls bewirkt; und
(d) danach die einzelnen abgespaltenen und markierten Nukleotide am Ende der Mikrokapillare detektiert und identi fiziert werden.

Die Bindung des DNA-Moleküls an eine Faserspitze ermög licht dessen einfaches Extrahieren aus der Lösung. So kann das gebundene DNA-Molekül an der Faserspitze in eine Mikro kapillare eingeführt werden. Diese ist so ausgebildet, daß sie ein Detektieren und Identifizieren der markierten Mono nukleotide ermöglicht.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in Un teransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungs beispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Fi guren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zeigt:

Fig. 1A eine perspektivische Ansicht einer Faserspitze;

Fig. 1B eine Schnittansicht einer Faserspitze;

Fig. 2A eine schematische Darstellung einer mit Avidin beschichteten Faserspitze;

Fig. 2B eine schematische Darstellung der Bindung von biotinylierter und farbstoff-markierter DNA an die beschichtete Faserspitze gemäß Fig. 2A;

Fig. 3 eine Schnittansicht einer Anordnung einer Faser spitze mit einem daran gebundenen DNA-Molekül in einer ausgezogenen Mikrokapillare; und

Fig. 4 eine schematische Darstellung der erfindungsge mäßen Anordnung.

Herstellung gefärbter DNA-Molekülkopien

Will man die Basenfolge oder Nukleotid-Folge eines DNA- Moleküls an einem DNA-Einzelstrang entschlüsseln (Sequenzieren), so muß zunächst von dem zu sequenzierenden DNA-Strang eine mit Farbstoff-Molekülen gefärbte komplemen täre Kopie (Gegenstrang) synthetisiert werden.

Dies wird dadurch erreicht, daß an das 3'-Ende des zu sequenzierenden DNA-Moleküls (Template) eine kurze komple mentäre DNA-Sequenz, der sog. Primer, anhybridisiert wird. An das 5'-Ende des Primers ist D-Biotin gekoppelt. Der Lö sung, in der die Reaktion zum Aufbauen eines komplementären Strangs ausgeführt wird, werden Nukleosid-Triphosphate zuge setzt. An diese Mononukleotide sind Farbstoff-Moleküle ge koppelt.

Bis heute ist es nicht möglich, einen Gegenstrang zu synthetisieren, bei dem sämtliche Nukleotide gefärbt sind. Eine Synthese läßt sich bisher nur mit jeweils zwei gefärb ten der vier Basen realisieren. Es werden somit nur für zwei der vier Basen der DNA gefärbte Nukleosid-Triphosphate der Lösung zugegeben. Für die beiden übrigen Basen werden nicht gefärbte Nukleosid-Triphosphate der Lösung zugesetzt. Die eigentliche Kopie des Templates wird dann mit Hilfe einer Polymerase erstellt.

Extrahieren eines einzelnen DNA-Moleküls

In der Regel wird das Template in relativ großer Zahl vorliegen, beispielsweise in mikromolarer Konzentration in Lösung. Entsprechend werden viele gefärbte Kopien des Tem plates erstellt. Für eine Einzelstrang-Sequenzierung muß im nächsten Schritt ein einzelnes gefärbtes DNA-Molekül aus der Lösung extrahiert werden.

Dazu wird eine Faser aus Glas oder PMMA verwendet, deren Spitze einen Durchmesser von weniger als 1 um hat. Eine solche Faserspitze ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Ziel ist es, möglichst nur einen einzigen gefärbten DNA- Strang an die Faserspitze zu binden, wobei am 5'-Ende der gefärbten DNA-Stränge Biotin gebunden ist. Daher wäre es wünschenswert, auf einer möglichst kleinen Fläche der sehr kleinen Faserspitze Avidin oder Streptavidin zu binden, die Biotin an sich binden können und damit ein Anbinden des DNA- Strangs an die Faser ermöglichen.

Um die Faser derart vorzubereiten, wird zunächst die Glas- oder PMMA-Faser in bekannter Weise für die Bindung von Photobiotin vorbereitet. Anschließend wird die Faser in eine Photobiotin enthaltende Lösung getaucht. Nach dem Herauszie hen wird die Faser mit Licht von 300 bis 360 nm Wellenlänge aus einem auf einen möglichst kleinen Bereich der Faser spitze fokussierten Laserstrahl bestrahlt.

Alternativ zur Fokussierung eines Lichtstrahls auf die Spitze kann als Faserspitze eine SNOM-Spitze verwendet wer den (SNOM = Scanning Nearfield Optical Microscopy). In diese wird von dem der Spitze abgewandten Ende Licht mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 360 nm eingekoppelt. Es tritt ausschließlich an der Faserspitze aus. Nur dort wird dann das Photobiotin belichtet.

Durch Belichtung des Photobiotins mit Licht der angege benen Wellenlängen wird eine Bindung zwischen dem Photobio tin und der in bekannter Weise vorbereiteten Oberfläche der Glas- oder PMMA-Faser hergestellt. Nach der Belichtung wird das nicht-gebundene Photobiotin von der Faser in einem Waschschritt entfernt.

Die Faserspitze wird dann in eine Avidin oder Streptavi din enthaltende Lösung getaucht. Avidin bzw. Streptavidin hat vier Bindungsstellen für Biotin. Es bindet somit an das auf der Faser immobilisierte Biotin. Seine anderen drei Bindungsstellen bleiben frei und können an das an den DNA- Strängen gekoppelte Biotin binden. Fig. 2A zeigt schematisch die mit Avidin-Molekülen 2 besetzte Faserspitze 1.

Im Ergebnis erhält man somit eine Faserspitze, an der in einem sehr kleinen Bereich von wenigen 100 nm Durchmesser Avidin bzw. Streptavidin gebunden ist.

Im nächsten Schritt wird die so vorbereitete Faser 1 in die Lösung 3 getaucht, in der die biotinylierten und gefärb ten DNA-Stränge 4 enthalten sind, wie es in Fig. 2B gezeigt ist. Ziel ist es, die Anbindung eines einzelnen bzw. des ersten DNA-Strangs (4A) an die Faserspitze 1 mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie möglichst sofort zu detektieren. Dazu bieten sich zwei optische Detektionsverfahren an, die mit drei DNA-Markierungsmöglichkeiten kombiniert sein kön nen.

Bei dem ersten optischen Detektionsverfahren zur Erfas sung des Ankoppelns eines einzelnen DNA-Moleküls an die Fa serspitze befindet sich die Lösung 3 mit den gefärbten und biotinylierten DNA-Strängen 4 in einem Beobachtungsvolumen eines konfokalen Aufbaus oder eines Fluoreszenz-Mikroskops. In die Faser 1 wird Licht derart eingekoppelt, daß es durch die Faser zu deren Spitze geleitet wird. Das Licht tritt im Bereich der Spitze evaneszent aus, d. h. seine Eindringtiefe in die Lösung ist auf wenige 100 nm beschränkt. Bindet nun ein biotinyliertes und gefärbtes DNA-Molekül an die Oberflä che der Faser, so gerät es in den vom Licht bestrahlten Bereich in der Nähe der Oberfläche der Faser. Es wird dort zur Fluoreszenz angeregt. Diese kann im Fluoreszenz-Mikro skop nachgewiesen werden. Somit wird festgestellt, daß ein DNA-Strang an die Faser gebunden hat. Daraufhin wird die Faser unverzüglich aus der Lösung entfernt.

Das zweite optische Detektionsverfahren macht sich den Umstand zunutze, daß ein Teil des von den Farbstoff-Mole külen des angebundenen DNA-Moleküls emittierten Fluoreszenz lichts wieder in die Faser eingekoppelt wird. Dieses kann an dem der Faserspitze entgegengesetzten Ende der Faser detek tiert werden.

Die Konzentration der biotinylierten und gefärbten DNA- Stränge in der Lösung sollte beim Extrahieren so gering ge wählt werden, daß eine Bindung eines DNA-Strangs an die Fa ser nur in großen zeitlichen Abständen geschieht. Dadurch wächst die Sicherheit, daß bei einem beobachteten Anstieg des des vom Fluoreszenzlicht hervorgerufenen Signals nur ein einziger DNA-Strang an die Faser gebunden hat.

Da die an die Faserspitze gebundenen DNA-Stränge nicht mehr in der Lösung diffundieren, steht für ihre Detektion d. h. die Detektion der von ihnen ausgehenden Fluoreszenz strahlung eine relativ längere Zeit zur Verfügung. Entspre chend geringer kann die in die Faser eingekoppelte Intensi tät des Anregungslichts gewählt werden. Hier kann mit einer Intensität gearbeitet werden, die um einen Faktor 100 unter der für Einzelmolekül-Detektion üblichen Intensität von ca. 1 MW/cm² liegt.

Als Anregungslichtquelle wird typischerweise ein gepul ster Diodenlaser mit einer Wellenlänge im roten Spektralbe reich bei etwa 640 nm gewählt. Diodenlaser arbeiten sehr verläßlich und sind außerordentlich kostengünstig und platz sparend. Beim Arbeiten im roten Spektralbereich sind viele störende Hintergrundsignale stark unterdrückt. Die Verwen dung eines gepulsten Diodenlasers ist dann zweckmäßig, wenn die Nukleotide anhand der Fluoreszenzlebensdauer der an sie gekoppelten Farbstoff-Moleküle identifiziert werden sollen.

Es können auch andere Laser oder andere Lichtquellen verwendet werden. Viele Aspekte der Erfindung sind auch ohne gepulste Laser, d. h. mit Dauerstrichlasern bzw. -licht quellen zu realisieren.

Die erste Möglichkeit zur Markierung eines DNA-Moleküls ist die oben beschriebene Markierung eines DNA-Doppelstrangs durch den Einbau gefärbter Nukleotide.

Eine zweite DNA-Markierungsmöglichkeit besteht darin, daß der Lösung, aus der das DNA-Molekül extrahiert werden soll, vorab ein Interkalationsfarbstoff zugesetzt wird. Dessen Anregungswellenlänge sollte deutlich von der der Farbstoffe abweichen, die zur Markierung der Nukleotide verwendet wurden. Dann kann zum Nachweis der Anbindung des DNA-Moleküls an die Faserspitze Licht einer Wellenlänge eingesetzt werden, bei dem eine Schädigung der Farbstoffe vermieden werden kann. Geeignet ist beispielsweise der Interkalationsfarbstoff Picogreen der Firma Molecular pro bes. Er absorbiert bei 490 nm und emittiert bei 520 nm. Die zur Markierung der Nukleotide verwendeten Farbstoffe absor bieren dagegen bei der Wellenlänge des Diodenlasers, d. h. bei ca. 640 nm.

Zur Anregung der an die DNA-Moleküle angekoppelten In terkalationsfarbstoffe wird in der bereits beschriebenen Weise ein Laserstrahl von dem der ausgezogenen Spitze abge wandten Ende in die Faser eingekoppelt. Die Detektion des Fluoreszenzlichts der Interkalationsfarbstoffe kann wiederum mit den beiden oben beschriebenen Detektionsverfahren durchgeführt werden.

Anschließend wird die doppelsträngige DNA in Ethanol denaturiert. Dadurch lösen sich die Interkalationsfarbstoffe wieder von der DNA. Ferner löst sich die DNA in Einzel stränge auf, wobei sich das nicht-markierte Template von der Faserspitze löst. Für den folgenden exonukleolytischen Abbau der einzelnen Nukleotide des markierten DNA-Strangs wird dann eine Exonuklease eingesetzt, die in der Lage ist, DNA- Einzelstränge abzubauen.

Eine dritte DNA-Markierungsmöglichkeit zum Beobachten des Anbindens eines DNA-Moleküls an die Faserspitze besteht darin, daß 3'-Ende der markierten DNA mit einem zusätzlichen Marker zu versehen. Als Marker kommen dabei B-Phycoerythrin oder gefärbte Mikrokügelchen in Frage. Diese können enzymatisch oder chemisch an das 3'-Ende der DNA-Moleküle angekoppelt werden.

Auch hier sollte die Anregungswellenlänge des zusätzli chen Markers vorzugsweise in einem anderen Wellenlängenbe reich als die Anregungswellenlänge der zur Markierung der Nukleotide verwendeten Farbstoffe liegen.

Bei einem Ausführungsbeispiel wird nach dem Extrahieren eines DNA-Moleküls, d. h. nach dem Herausziehen der Faser spitz aus der Lösung die Anbindung eines DNA-Moleküls an die Faserspitze überprüft. Dazu kann beispielsweise die Faser spitze in den Fokusbereich eines konfokalen Fluoreszenz- Scanning-Mikroskops gebracht werden. Dort lassen sich gebun dene DNA-Moleküle leicht nachweisen.

Detektion der Sequenz der Nukleotide einer DNA

Die Faserspitze 1, an der genau ein DNA-Molekül 4A ge bunden ist, wird in eine ausgezogene Mikrokapillare 5 einge führt, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Derartige Kapillaren sind als Mikroinjektionskapillaren für biologische Anwen dungen erhältlich. Sie besitzen am ausgezogenen Ende einen Innendurchmesser von ca. 500 ± 200 nm und eine Wandstärke von ca. 100 nm. Die Faserspitze wird derart in der Mikroka pillare positioniert, daß das DNA-Molekül nur wenige um von der Austrittsöffnung der Mikrokapillare entfernt ist.

Die Mikroinjektionskapillaren weisen ferner an ihrem breiten Ende ein Gewinde auf, so daß sie leicht an hochge naue Positionierer montiert werden können.

Die Mikrokapillare wird anschließend mit einer Pufferlö sung beladen, die alle für den Abbau des DNA-Strangs nötigen Substanzen enthält, u. a. auch die Exonukleasen. Diese lösen sukzessive die Nukleotide aus dem DNA-Strang.

Im folgenden wird auf Fig. 4 Bezug genommen.

Damit die abgespaltenen Nukleotide detektiert und iden tifiziert werden können, müssen sie zur Austrittsöffnung 6 der Mikrokapillare 5 transportiert werden. Dazu wird die Kapillare 5 in eine Pufferlösung eingetaucht, in der sich eine Elektrode befindet. Eine entsprechende Gegenelektrode ist im von der ausgezogenen Spitze abgewandten Ende der Mikrokapillare angeordnet. Zwischen der Elektrode und der Gegenelektrode wird eine Spannung angelegt, die ein elektri sches Feld in der Lösung bewirkt, das je nach chemischer Behandlung der Kapillar-Innenwände und gewähltem Puffer system derart eingestellt ist, daß die abgespaltenen Mononu kleotide durch die Austrittsöffnung der Mikrokapillare in den Puffer gezogen werden.

Ein konfokales Fluoreszenz-Detektionssystem 7 beobachtet den Bereich der Austrittsöffnung 6 der Mikrokapillare 5, beispielsweise unmittelbar vor der Austrittsöffnung inner halb oder außerhalb der Mikrokapillare. Das Licht des gepul sten Diodenlasers 8 ist auf diesen Bereich fokussiert. Der Fokusdurchmesser beträgt etwas weniger als 1 µm. Der innere Durchmesser der Mikrokapillare am ausgezogenen Ende beträgt ca. 500 nm. Somit wird der gesamte Bereich der Austrittsöff nung der Mikrokapillare vom Laser bestrahlt. Die Licht sammeloptik des konfokalen Aufbaus ist so ausgerichtet, daß sie ebenfalls den gesamten Bereich, der im folgenden Pro benraum genannt wird, erfaßt.

Bewegt sich ein abgespaltenes Mononukleotid von der Fa serspitze 1 zur Austrittsöffnung 6, so durchquert es den Fokusbereich der Detektionseinrichtung. In bekannter Weise wird dann das farbstoff-markierte Mononukleotid zur Fluores zenz angeregt. An einem Einzelphotonen-Detektor 9 werden die einzelnen Fluoreszenzphotonen detektiert, die von dem an das Mononukleotid gekoppelten Farbstoff emittiert werden. Der Detektor ist in bekannter Weise mit einer Signalverar beitungseinrichtung gekoppelt, um ein zeitkorreliertes Ein zelphotonenzählen zu ermöglichen.

Entscheidend für ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis bei der hier erforderlichen Einzelmolekül-Detektion ist, daß die Wände der Mikrokapillare im Probenraum, d. h. im Bereich kurz vor der Austrittsöffnung, eine Wandstärke aufweisen, die kleiner ist als die Wellenlänge des zur Anregung benutzten Lichts, vorzugsweise deutlich kleiner als ein Viertel der Anregungswellenlänge, d. h. höchstens ca. 100 nm. Dadurch kommt es an den Wänden zu einer stark abgeschwächten Refle xion des Anregungslichts. Dies vermindert das Hintergrund signal deutlich. Infolgedessen erhöht sich das Signal- Rausch-Verhältnis für die Einzelmolekül-Detektion.

Ein entscheidender Vorteil, der sich aus dem sehr nahen Plazieren der Faserspitze mit dem gebundenen DNA-Molekül an der Austrittsöffnung ergibt, besteht darin, daß die Wahr scheinlichkeit, daß ein Mononukleotid auf dem Weg von der Faserspitze zur Austrittsöffnung der Mikrokapillare durch Absorption an der Innenwand der Mikrokapillare verlorengeht, drastisch reduziert ist. Somit ist es möglich, die einzelnen markierten und abgespaltenen Mononukleotide zu detektieren.

Um nach einer Detektion die einzelnen Mononukleotide auch identifizieren zu können, gibt es verschiedene Wege. Beispielsweise kann pro Nukleotidart ein Farbstoff-Molekül mit einer speziellen Emissionswellenlänge gewählt werden. Im hier betrachteten Ausführungsbeispiel werden die unter schiedlichen Nukleotidarten mit Farbstoffen mit ähnlichen Absorptions- und Emissionswellenlängen markiert, die jedoch jeweils unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauern aufweisen. Durch die Anregung der Farbstoffe im Probenraum mit gepul stem Laserlicht und die Detektion der aus dem Probenraum emittierten Photonen mittels zeitkorreliertem Einzelphoto nenzählen kann die Fluoreszenzlebensdauer der einzelnen de tektierten Mononukleotide mit hinreichender Verläßlichkeit identifiziert werden. Mit entsprechender Zuverlässigkeit kann somit eine Identifizierung der einzelnen Mononukleotide durchgeführt werden.

Das Ziel der Sequenzierung eines DNA-Strangs wäre somit erreicht, wenn sämtliche Nukleotide selektiv mit Farbstoffen unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauern markiert wären. Da dies bisher nicht möglich ist, werden jeweils nur zwei un terschiedliche Nukleotide mit jeweils zwei Farbstoffen un terschiedlicher Fluoreszenzlebensdauer markiert. Die Sequen zierung des DNA-Strangs wird dann wiederholt, jedoch werden andere Basen mit Farbstoffen markiert, bis eine hinreichende Rekonstruktion der Sequenz des Templates möglich ist.

Claims

1. Verfahren zum Extrahieren eines einzelnen fluores zenzfähigen Makromoleküls aus einem Fluid, dadurch gekennzeichnet,
daß ein einen Durchmesser von höchstens wenigen Mikrome tern aufweisender Bereich einer Spitze einer Faser mit Mole külen beschichtet wird, wobei die Moleküle so ausgewählt werden, daß sie mit dem Material der Faserspitze und dem fluoreszenzfähigen Makromolekül eine Bindung eingehen kön nen;
daß die beschichtete Faserspitze in das das fluoreszenz fähige Makromolekül enthaltende Fluid eingetaucht wird, wo bei der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird;
daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faser spitze detektiert wird; und
daß die Faserspitze aus dem Fluid entfernt wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgegeben Intensität überschreitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird, indem das Licht in die Faser eingekoppelt und zur Fa serspitze derart geleitet wird; daß es eine geringe Ein dringtiefe in das Fluid hat.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht derart zur Faserspitze geleitet wird, daß an dem Bereich ein evaneszentes Feld erzeugt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Faserspitze mit Licht der Anregungswel lenlänge des fluoreszenzfähigen Makromoleküls bestrahlt wird, indem die Faserspitze in den Fokusbereich eines Fluo reszenzmikroskops gebracht und mittels Fluoreszenzmikrosko pie überprüft wird, ob ein fluoreszenzfähiges Makromolekül an die Faserspitze gebunden ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Faser aus PMMA oder Glas verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Faser mit einem Durchmesser der Spitze von weniger als 1 µm verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Faserspitze eine für die Nahfeldmi kroskopie geeignete Faserspitze verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung der Faserspitze mit Mo lekülen auf einer Fläche von maximal einigen µm durchge führt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß vor dem Eintauchen der Faserspitze Biotin an das fluoreszenzfähige Makromolekül gekoppelt wird; und
daß als Moleküle für die Beschichtung der Faserspitze Avidin oder Streptavidin verwendet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich mit Avidin oder Streptavidin beschichtet wird, indem
die Oberfläche der Faserspitze mit Photobiotin-Molekülen beschichtet wird;
der Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit Licht im Wellenlängenbereich von ca. 300 bis 360 nm derart belichtet wird, daß die Photobiotin-Moleküle im belichteten Bereich an die Faserspitze gebunden werden;
die nicht gebundenen Photobiotin-Moleküle danach von der Faserspitze abgewaschen werden; und
die Faserspitze in eine Avidin oder Streptavidin enthal tende Lösung getaucht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht zur Belichtung des Bereichs der Oberfläche in die Faser eingekoppelt und durch die Faser zur Faserspitze geleitet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Bereich der Oberfläche der Faserspitze mit einem von außen auf die Faserspitze fokussierten Lichtstrahl belichtet wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als fluoreszenzfähiges Makromolekül ein DNA- oder RNA-Molekül verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Biotin an das 5'-Ende des DNA- oder RNA-Moleküls gekop pelt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekenn zeichnet,
daß vor dem Eintauchen der Faserspitze am 3'-Ende des DNA- oder RNA-Moleküls ein zusätzliches Marker-Molekül an gekoppelt wird, dessen Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge eines die Nukleotide der DNA- oder RNA-Moleküle markierenden Farb stoffs liegt;
daß Licht der Anregungswellenlänge des Marker-Moleküls in die Faser eingekoppelt und zur Faserspitze derart gelei tet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als Marker-Molekül B-Phycoerythrin oder ein mit Farb stoff-Molekülen angefärbtes Mikrokügelchen verwendet werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze dadurch detektiert wird, daß von dem fluo reszenzfähigen Molekül emittiertes Fluoreszenzlicht von der Faserspitze aus durch die Faser geleitet und an einem der Faserspitze entgegengesetzten Faserende detektiert wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzlicht aus der Umgebung der Faserspitze dadurch detektiert wird, daß ein Fluores zenzmikroskop auf die in das Fluid eingetauchte Faserspitze fokussiert wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei ein farbstoff-markiertes doppelsträngiges DNA-Molekül aus einer wäßrigen Lösung extrahiert wird;
dadurch gekennzeichnet,
daß vor dem Eintauchen der Faserspitze der wäßrigen Lösung Interkalationsfarbstoff-Moleküle zugesetzt werden, deren Anregungswellenlänge in einem anderem Wellenlängenbereich als die Anregungswellenlänge des das DNA-Molekül markierenden Farbstoffs liegt;
daß Licht der Anregungswellenlänge der Interkalations farbstoff-Moleküle in die Faser eingekoppelt und zur Faser spitze geleitet wird; und
daß nach dem Eintauchen das Licht in der Faser derart geleitet wird, daß es eine geringe Eindringtiefe in die wäß rige Lösung hat.

20. Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Mole küls, wobei

(a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff-Moleküle ge koppelt sind (markierte Nukleotide);
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze gemäß dem Verfahren nach einem der An sprüche 1 bis 19 extrahiert wird;
(c) die Nukleotide des extrahierten DNA-Moleküls in ei ner Detektionsapparatur sukzessive einzeln abgespalten wer den; und
(d) die einzeln abgespaltenen Nukleotide in der Detek tionsapparatur detektiert und identifiziert werden.

21. Verfahren zum Detektieren eines einzelnen fluores zenzfähigen Moleküls in einem Fluid, wobei
das Fluid durch eine Mikrokapillare geleitet wird, die an einem Ende eine Austrittsöffnung mit einem Innendurchmes ser zwischen ca. 300 und 700 nm und einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der Anregungswellenlänge des fluoreszenzfä higen Moleküls hat, wobei das fluoreszenzfähige Molekül an der Austrittsöffnung austritt;
ein Lichtstrahl der Anregungswellenlänge des fluores zenzfähigen Moleküls auf einen Bereich unmittelbar an der Austrittsöffnung der Mikrokapillare derart fokussiert wird;
das Fluoreszenzlicht mit hoher Sammeleffizienz detek tiert wird; und
der Durchtritt des Moleküls durch den Fokus angenommen wird, sobald das detektierte Fluoreszenzlicht eine vorgege ben Intensität überschreitet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl derart an der Austrittsöffnung fokus siert wird, daß der gesamte Querschnitt der Mikrokapillare bestrahlt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei ein Mole kül mit einer Anregungswellenlänge im roten Spektralbereich detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtstrahl von einem Diodenlaser im roten Spektralbereich erzeugt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, da durch gekennzeichnet,
daß der Lichtstrahl von einem gepulsten Laser erzeugt wird, und
daß das Fluoreszenzlicht zeitaufgelöst detektiert wird.

25. Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Mole küls, wobei

(a) eine Vielzahl von im wesentlichen identischen DNA- Molekülen in einer Lösung synthetisiert werden, bei denen an wenigstens einen Teil der Nukleotide Farbstoff-Moleküle ge koppelt sind (markierte Nukleotide);
(b) eines der synthetisierten DNA-Moleküle durch Binden an eine Faserspitze mit einem Durchmesser von höchstens we nigen Mikrometern aus der Lösung extrahiert wird;
(c1) die Faserspitze in eine Mikrokapillare eingeführt wird, die an einem Ende einen Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm hat;
(c2) die Mikrokapillare mit einer Lösung befüllt wird, die ein sukzessives Abspalten einzelner Nukleotide des DNA- Moleküls bewirkt; und
(d) danach die einzelnen abgespaltenen und markierten Nukleotide am Ende der Mikrokapillare detektiert und identi fiziert werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (b) das DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 20 extrahiert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekenn zeichnet, daß die Faserspitze in Schritt (c1) wenige Mikro meter vor dem Austrittsende in der Mikrokapillare positio niert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen markierten Nukleotide nach einem der An sprüche 21 bis 24 detektiert werden.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, da durch gekennzeichnet,
daß unterschiedliche Arten von Nukleotiden jeweils mit Farbstoffen mit unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern markiert werden;
daß in Schritt (d) die markierten Nukleotide mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie detektiert und an hand der Fluoreszenzlebensdauer der an sie gekoppelten Farb stoffe identifiziert werden.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 29, da durch gekennzeichnet,
daß vor Schritt (d) die Mikrokapillare in eine Lösung getaucht wird, die elektrisch mit einer Elektrode gekoppelt ist;
daß innerhalb der Mikrokapillare durch die Lösung ein elektrischer Strompfad zu einer Gegenelektrode gebildet wird; und
daß zwischen der Elektrode und der Gegenelektrode eine elektrische Spannungsdifferenz derart eingestellt wird, daß sich die abgespaltenen Nukleotide durch das Ende aus der Mi krokapillare heraus bewegen.

31. Anordnung zum Durchführen des Verfahrens nach An spruch 21, mit
einer Lichtquelle einer vorgegebenen Wellenlänge;
einer Mikrokapillare mit einer Austrittsöffnung mit ei nem Innendurchmesser zwischen ca. 300 und 700 nm und mit einer Wandstärke kleiner als ein Viertel der vorgegebenen Wellenlänge, wobei die Lichtquelle so auf das Ende der Mi krokapillare ausgerichtet ist, daß ihr Licht auf einen im Bereich der Austrittsöffnung gebildeten Probenraum fokus siert ist, der den gesamten Querschnitt der Austrittsöffnung umfaßt; und
einer auf den Probenraum gerichteten Einrichtung zum De tektieren von einzelnen Photonen aus dem Probenraum.

32. Anordnung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lichtquelle ein gepulster Diodenlaser ist; und
daß die Einrichtung zum Detektieren einen Detektor zum zeitaufgelösten Erfassen von einzelnen Photonen enthält.

33. Anordnung nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekenn zeichnet, daß die Lichtquelle Licht im roten Spektralbereich emittiert.