KR100669589B1 - 분자 해체의 라만 모니터링에 의한 핵산 서열결정 장치 및방법 - Google Patents

분자 해체의 라만 모니터링에 의한 핵산 서열결정 장치 및방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 방법, 장치 및 조성물은 핵산 서열결정에 유익하다. 더 구체적으로, 본 방법 및 장치는 단일 분자의 단쇄 DNA 또는 RNA를 엑소뉴클레아제 활성에 노출시키고, 핵산의 한쪽 말단으로부터 한번에 하나의 자유 뉴클레오타이드를 제거하고, 방출된 뉴클레오타이드를 라만 분광법 또는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 분광법에 의해 동정함으로써 단일 분자의 단쇄 DNA 또는 RNA를 서열결정하는 것에 관한 것이다.

Description

분자 해체의 라만 모니터링에 의한 핵산 서열결정 장치 및 방법{NUCLEIC ACID SEQUENCING BY RAMAN MONITORING OF MOLECULAR DECONSTRUCTION}
본 발명의 방법, 조성물 및 장치는 분자 생물학 및 게놈학 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 방법, 조성물 및 장치는 핵산 서열결정에 관한 것이다.
인간 게놈 계획이 출현함으로 인해 DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)와 같은 핵산의 개선된 서열결정 방법의 개발이 필요하다. 유전 정보는 염색체로 조직화된 매우 긴 DNA 분자의 형태로 저장되어 있다. 인간 게놈내 23쌍의 염색체는 염기 약 30억개의 DNA 서열을 함유한다. 이 DNA 서열 정보는 키, 눈의 색 및 민족성과 같은 각 개인의 다수의 특징을 결정한다. 암, 낭포성 섬유증, 겸상 적혈구 빈혈증 및 근위축증과 같은 다수의 일반적인 질환은 일부분 이상 DNA 서열의 변이에 근거한다.
인간 게놈의 전체 서열의 결정은 이러한 질환의 유전학적 기초를 밝히기 위한 기초를 제공하였다. 그러나, 각각의 질환과 관련된 유전학적 변이를 밝히기 위 하여 해야 할 연구가 많이 남아 있다. 상기 질환을 촉진하는 DNA 서열의 구체적인 변화를 밝히기 위하여, 각각의 상기 질환을 나타내는 개인 또는 가족의 염색체 부분의 DNA 서열결정이 필요할 것이다. 유전 정보의 가공에 필요한 중간 분자인 RNA도 또한 일부 경우에서 다양한 질환의 유전학적 기초를 밝히기 위하여 서열결정될 수 있다.
크기에 의해 분리된 형광표지된 핵산의 검출을 근거로 한 기존의 핵산 서열결정 방법은 서열결정될 수 있는 핵산의 길이에 의해 제한된다. 전형적으로, 한번에 염기 500 내지 1,000개의 핵산 서열만이 결정될 수 있다. 이는 유전자라고 불리는, 길이가 염기 수만개 또는 심지어 수십만개일 수 있는 DNA의 기능 단위의 길이보다 훨씬 짧은 것이다. 현재의 방법을 사용하여, 완전한 유전자 서열을 결정하기 위해서는 다수 카피의 유전자를 만들고, 중복 단편으로 절단하고, 서열을 결정하여야 하며, 그 후 중복 DNA 서열을 완전한 유전자로 조립할 수 있다. 이 과정은 힘들고, 비용이 들며, 비능률적이고, 시간이 걸린다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 이루며, 개시된 실시양태의 특정 양상을 추가로 증명하기 위하여 포함된다. 실시양태는 본원에 제시된 구체적인 실시양태의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이들 도면을 참조로 하면 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 방출된 뉴클레오타이드가 서열결정할 핵산 분자로부터 공간적으로 분 리되어 있는, DNA 서열결정을 위한 전형적인 장치(일정한 비례로 그린 것 아님) 및 방법을 도시한다.
도 2는 방출된 뉴클레오타이드가 핵산 분자로부터 공간적으로 분리되어 있지 않은, DNA 서열결정을 위한 전형적인 장치(일정한 비례로 그린 것 아님) 및 방법을 도시한다. 검출기는 용액내에 존재하는 뉴클레오타이드를 정량한다.
개시된 방법, 조성물 및 장치는 핵산의 신속한 자동 서열결정에 유익하다. 임의의 실시양태에서, 본 방법, 조성물 및 장치는 길이가 염기 1,000개보다 길거나, 2000개보다 길거나, 5,000개보다 길거나, 10,000개보다 길거나, 20,000개보다 길거나, 50,000개보다 길거나, 100,000개보다 길거나, 훨씬 더 많은 염기수의 매우 긴 핵산 분자의 서열을 얻기에 적합하다. 다양한 실시양태에서, 이러한 서열 정보는 하나의 핵산 분자(13,102)를 사용하여, 1회 서열결정 작업시 얻어질 수 있다. 다른 실시양태에서, 다수 카피의 핵산 분자(13,102)는 핵산 서열을 확인하거나 또는 완전한 서열 데이터를 얻음과 동시에 또는 그 다음에 서열결정될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자(13,102) 및 그의 상보쇄를 서열결정하여 서열 정보의 정확성을 확인할 수 있다. 종래의 핵산 서열결정 방법보다 유리한 점으로는 1회의 서열결정 작업으로 긴 핵산 서열을 판독하는 능력, 보다 빠른 속도의 서열 데이터 획득, 서열결정에 드는 비용의 감소 및 생성된 서열 데이터 단위당 걸리는 조작 시간량의 면에서 더 큰 효율이 있다.
임의의 실시양태에서, 서열결정할 핵산(13,102)은 DNA이지만, RNA 또는 합성 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 다른 핵산(13,102)도 역시 서열결정할 수 있다고 생각된다. 하기의 상세한 설명은 개시된 실시양태의 더 철저한 이해를 제공하기 위하여 다수의 구체적인 상세 설명을 함유한다. 그러나, 당업자라면 이러한 구체적인 상세 설명 없이도 이들 실시양태를 실시할 수 있음을 알 것이다. 그밖의 경우에서, 당업계에 널리 공지된 장치, 방법, 과정 및 개별 성분들은 본원에 상세하게 기술하지 않았다.
도 1 및 도 2에 개시된 일부 실시양태에서, 본 방법은 반응 챔버(11,101)내 고정화 표면(14,103)에 결합되고 해체 반응에서 분해된 개별 단쇄 핵산 분자(13,102)의 서열결정을 포함한다. 이러한 실시양태에서, 반응 챔버(11,101)는 핵산 분자(13,102)의 비결합 말단(17,105)으로부터 한번에 하나의 뉴클레오타이드(16,104)를 순서대로 제거하는 하나 이상의 해체 시약(15,106)을 함유한다. 이러한 해체 시약(15,106)의 비제한적인 예로는 당업계에 공지된 임의의 엑소뉴클레아제가 있다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16,104)는 용액내로 방출되기 때문에 라만 분광법에 의해 동정된다.
도 1에 특정 실시양태가 도시되어 있다. 도 1은 유동 경로(12)에 결합된 반응 챔버(11)를 포함하는, 핵산 서열결정을 위한 장치(10)를 도시한다. 반응 챔버(11)는 엑소뉴클레아제와 같은 해체 시약(15)과 함께 고정화 표면(14)에 결합된 핵산 분자(13)를 함유한다. 엑소뉴클레아제(15)는 핵산 분자(13)의 자유 말단(17)으로부터의 개별 뉴클레오타이드(16)의 순차적인 방출을 촉진한다. 개별 뉴클레오타이드(16)가 해체 반응에 의해 방출되어 용액으로 들어감에 따라, 이들은 검출 장치(18)를 지나서 유동 경로(12) 아래로 이동한다. 검출 장치(18)는 여기 광선(20)을 방사하는, 레이저와 같은 여기원(19)을 포함한다. 여기 광선(20)은 방출된 뉴클레오타이드(16)와 상호 반응하여 전자가 더 높은 에너지 상태로 여기된다. 전자가 낮은 에너지 상태로 되돌아감으로써 일어나는 라만 방출 스펙트럼은 분광계 또는 단색화 장치와 같은 라만 분광 검출기(21)에 의해 검출된다.
도 1에 도시된 실시양태에서, 방출된 뉴클레오타이드(16)는 검출 장치(18)에 의해 검출되기 전에 핵산 분자(13)로부터 공간적으로 분리되어 있다. 공간적 분리는 개별 뉴클레오타이드(16)를 격리시킴으로써 라만 검출기(21)의 신호 대 잡음 비를 증가시키는 작용을 한다.
도 1은 하나의 반응 챔버(11)내에 하나의 핵산 분자(13)가 함유되어 있는 실시양태를 도시한다. 또 다른 실시양태에서, 별개의 각 반응 챔버(11)내에서 다수의 핵산 분자(13)가 동시에 서열결정될 수 있다. 이러한 경우에서, 각각의 반응 챔버(11)내의 핵산 분자(13)는 동일하거나 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나의 반응 챔버(11)내에 둘 이상의 핵산 분자(13)가 존재할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 핵산 분자(13)는 서열이 동일할 것이다. 반응 챔버(11)내에 하나보다 많은 핵산 분자(13)가 존재하는 경우, 라만 방출 신호는 반응 챔버(11)내의 모든 핵산 분자(13)로부터 동시에 방출된 뉴클레오타이드(16)의 평균을 나타낼 것이다. 당업자라면, 공지의 데이터 분석 기법을 사용하여, 반응 챔버(11)에서 일어나는 대부분의 반응보다 속도가 뒤떨어지거나 앞서는 해체 반응의 임의의 주어진 시간에서 얻어진 신호를 보정할 수 있을 것이다. 임의의 실시양태에서, 당업자라면 해체 시약(15)의 덩어리를 첨가하여 빨리 혼합하는 것과 같은, 하나의 반응 챔버(11)에 존재하는 다수의 핵산 분자(13)의 해체를 동조화하는 과정을 사용할 수 있다.
임의의 또 다른 실시양태에서, 표지 분자를 반응 챔버(11)에 또는 검출 장치(18)의 상류에 있는 유동 경로(12)에 첨가할 수 있다. 표지 분자는 자유 뉴클레오타이드(16)가 핵산 분자(13)로부터 방출되면 자유 클레오타이드(16)에 결합하여 그를 표지한다. 이러한 방출후 표지는 핵산 분자(13)의 뉴클레오타이드(16)가 용액내로 방출되기 전에 표지될 때 겪게 되는 문제를 피하게 한다. 예를 들어, 부피가 큰 형광 탐침 분자를 사용하면, 핵산 분자(13)내로 도입된 각각의 뉴클레오타이드(16)를 해체 전에 표지할 때 상당한 입체 장애를 제공하여, 서열결정 반응의 효율 및 그에 걸리는 시간을 증가시킬 수 있다.
뉴클레오타이드(16)의 방출후 표지를 포함하는 실시양태에서, 또 다른 검출 방법, 예를 들어 형광 분광법 또는 발광 분광법이 사용될 수 있다고 생각된다. 용액내의 자유 뉴클레오타이드(16)를 검출하는 다수의 또 다른 방법은 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 라만 분광 검출 장치(18)를 형광, 발광 또는 다른 유형의 신호를 검출하도록 고안된 검출 장치(18)로 대체할 수 있다.
표지 분자는 각각의 일반 뉴클레오타이드(16)에 대하여 구별될 수 있는 독특하고 매우 명백한 광학 기호를 갖는다. 임의의 실시양태에서, 표지는 라만 방출 신호의 강도를 증가시키거나 또는 달리 뉴클레오타이드(16)에 대한 라만 검출기(21)의 감도 또는 특이도를 증진시키는 작용을 할 수 있다. 라만 분광법을 포함하는 실시양태에 사용될 수 있는 표지 분자의 비제한적인 예로는 TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛(cresyl fast violet), 크레실 블루 바이올렛(cresyl blue violet), 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue), 파라-아미노벤조산, 에리트로신 및 아미노아크리딘이 있다. 특정 실시양태에 유익할 수 있는 다른 표지 잔기로는 시아나이드, 티올, 염소, 브롬, 메틸, 인 및 황이 있다. 임의의 실시양태에서, 탄소 나노튜브(nanotube)는 라만 표지로서 유익할 수 있다. 라만 분광법에서의 표지의 사용은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,306,403 호 및 제 6,174,677 호). 당업자라면, 상이한 뉴클레오타이드(16)에 결합되는 경우 라만 표지는 구별가능한 라만 스펙트럼을 생성하여야 하거나, 또는 상이한 표지는 오직 한 유형의 뉴클레오타이드(16)에만 결합하도록 고안되어야 함을 이해할 것이다.
임의의 실시양태에서, 핵산 분자(13)를 고정화 표면(14)에 결합시킴으로써 제자리에 고정시키고, 방출된 뉴클레오타이드(16)를 핵산 분자(13)로부터 떨어져 검출 장치(18)를 지나 운반하는 유동 경로(12) 아래의 마이크로유체 흐름에 담근다. 비제한적인 예로, 마이크로유체 흐름은 핵산 분자(13)를 지나 유동 경로(12), 예를 들어 미소모세관 또는 규소, 유리 또는 기타 조각의 에칭(etching)된 채널의 아래를 향하는 용매의 대량 흐름으로 인해 일어날 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대량의 매질은 매우 천전히 움직이거나 또는 전혀 움직이지 않지만, 용액내의 하전된 종(예: 음으로 하전된 뉴클레오타이드(16))은 외부에서 인가된 전기장에 반응하여 채널 또는 관을 포함하는 유동 경로(12) 아래로 움직인다.
또 다른 실시양태에서, 핵산 분자(13)는 방출된 뉴클레오타이드(16)로부터 떨어져 결합되어 있는 고정화 표면(14)을 이동시킴으로써 움직일 수 있다. 방출된 뉴클레오타이드(16)는 핵산 분자(13)를 뒤따르는 이동 검출 장치(18)에 의해 주사되고 동정될 수 있다.
상기 논의된 실시양태에서, 검출 장치(18)는 핵산 분자(13)로부터 방출된 일반 뉴클레오타이드들(16)을 구별할 수 있어야 한다. 최소한, 검출 장치(18)는 DNA 분자(13)를 서열결정하기 위하여 아데노신(A), 구아노신(G), 시토신(C) 및 티미딘(T)을 함유하는 뉴클레오타이드들(16)을 구별할 수 있어야 한다. RNA(13)를 서열결정할 경우, 검출 장치(18)는 A, G, C 및 우리딘(U)을 함유하는 뉴클레오타이드(16)를 구별할 수 있어야 한다. 반응 챔버(11)당 하나의 핵산 분자(13)가 있다면, 검출 장치(18)가 용액내의 각 뉴클레오타이드(16)의 양을 정량할 수 있을 필요가 없는데, 이는 뉴클레오타이드들(16)이 한번에 하나씩 검출 장치(18)를 지나 이동하기 때문이다.
도 2에 도시된 다른 실시양태에서, 검출 장치(107)는 용액내에 존재하는 자유 뉴클레오타이드(104)의 수를 정량할 정도로 민감하다. 따라서, 핵산 분자(102)와 방출된 뉴클레오타이드(104)의 분리는 필요하지 않다. 도 2에 도시된 바와 같이, 장치(100)는 한쪽 말단이 고정화 표면(103)에 결합된 핵산 분자(102)를 함유하는 반응 챔버(101)를 포함한다. 자유 뉴클레오타이드(104)는 엑소뉴클레아제와 같 은 해체 시약(106)의 작용에 의해 핵산 분자(102)의 비결합 말단(105)으로부터 순서대로 제거된다.
도 2에 도시된 바와 같이, 이러한 실시양태에서 자유 뉴클레오타이드(104)는 핵산 분자(102)로부터 공간적으로 분리되어 있지 않다. 여기 광선(110)을 방사하는 여기원(108) 및 검출기(109)를 포함하는 검출 장치(107)는 핵산 분자(102) 및 자유 뉴클레오타이드(104)를 둘다 함유하는 반응 챔버(101)를 분석한다. 검출기(109)는 용액 내의 각 뉴클레오타이드(104)의 양을 정량할 수 있기 때문에, 핵산(102) 서열은 용액으로 뉴클레오타이드(104)가 방출되는 시간적 순서에 의해 결정될 수 있다. 대량으로 주사되기 때문에, 보다 넓은 영역에 미치는 더 강력한 여기 광선(110)을 사용하는 것이 필요할 수 있다.
이러한 실시양태에서, 핵산 분자(102)의 비결합 말단(105)으로부터 각각의 뉴클레오타이드(104)가 연속적으로 방출됨에 따라, 뉴클레오타이드(104)는 용액 내에서 해당하는 뉴클레오타이드(104)의 신호가 증가함에 따라 동정된다. 라만 검출기(109)는 용액내의 각각의 뉴클레오타이드(104) 분자, 즉 아데노신 모노포스페이트(AMP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 시토신 모노포스페이트(CMP) 및 우리딘 모노포스페이트(UMP) 또는 티미딘 모노포스페이트(TMP)의 수를 따로 따로 정량하고, 이들 신호를 핵산 분자(102)에 의해 생성되는 기준 라만 신호로부터 구별해낼 수 있다.
당업자라면, DNA(13,102)의 분석 결과, 데옥시리보뉴클레오사이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드(16,104)(티미딘 포함)의 방출이 일어나는 반면에, RNA(13,102)의 분석 결과, 리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오타이드(16,104)(우리딘 포함)의 방출이 일어날 것임을 이해할 것이다. 뉴클레오사이드 모노포스페이트(16,104)는 일반적으로 엑소뉴클레아제(15,106) 활성에 의해 방출된 형태일 것이지만, 이 실시양태는 임의의 특정 형태의 자유 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드(16,104)의 검출에 제한되지 않고, 해체 시약(15,106)의 활성에 의해 핵산(13,102)으로부터 방출될 수 있는 임의의 단량체(16,104)를 포함한다.
또 하나의 실시양태에서, 도 1 및 도 2에 도시된 방법 및 장치(10,100)의 몇몇 조합이 사용될 수 있다. 도 1의 방법은 덜 민감한 검출기(21)를 사용할 수 있지만, 더 복잡한 분자 운반 과정을 필요로 한다. 도 2의 방법은 단순화된 분자 운반 과정을 갖지만, 더 민감한 검출기(109)를 필요로 한다. 다양한 중간 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유동 경로(12) 아래로의 마이크로유체 흐름을 사용하여 여기 광선(20)에 의해 조사된 영역으로부터 이미 검출된 뉴클레오타이드(16)를 제거할 수 있지만, 라만 검출기(21)의 정량 성능은 방출된 뉴클레오타이드(16) 사이의 특정한 시간적 또는 공간적 분리가 없이 검출이 가능하게 한다.
임의의 실시양태에서, 분광계 또는 단색화 장치 어레이(array)와 같은 검출기(21,109)로부터의 데이터는 특정 라만 신호와 특정 뉴클레오타이드(16,104)를 관련시키는 데이터베이스를 보유하는 정보 처리 시스템으로 흐를 수 있다. 정보 처리 시스템은 검출기(21,109)에 의해 검출된 신호를 기록하고, 이들 신호를 데이터베이스내의 공지의 뉴클레오타이드(16,104)의 신호와 상호 관련시키고, 핵산 분자(13,102)의 서열을 나타내는 뉴클레오타이드(16,104) 양상의 기록을 보유한다. 정보 처리 시스템은 또한 중복되는 시간적 또는 공간적 신호가 하나보다 많은 뉴클레오타이드(16,104)로부터 검출될 때, 바탕 신호의 제거 및 "염기 판단(base-calling)" 결정과 같은 표준의 과정을 수행할 수 있다.
임의의 실시양태에서, 핵산 분자(13,102)는 표면(14,103), 예를 들어 작용화된 유리, 규소, PDMS(폴리디메틸 실록산), 은 또는 기타 금속이 코팅된 표면, 석영, 플라스틱, PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), PVP(폴리비닐 피롤리돈), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스, 나일론, 니트로셀룰로즈, 유리 비드, 자성 비드, 또는 표면(14,103)에 작용기(예: 아미노, 카르복실, 티올, 히드록실 또는 딜스-알더(Diels-Alder) 시약)를 도입할 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 다른 물질에 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용기는 가교결합제에 공유 결합될 수 있어서, 입체 장애없이 핵산 분자(13,102)와 해체 시약(15,106) 사이의 결합 상호반응이 일어날 수 있다. 전형적인 가교결합 기로는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민이 있다. 결합은 공유 또는 비공유 결합에 의한 것일 수 있다. 핵산 분자(13,102)를 표면(14,103)에 결합시키는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 이들을 사용할 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "임의의"란 하나 또는 그보다 많은 항목을 뜻할 수 있다.
"핵산"(13,102)은 DNA, RNA, 단쇄, 이중쇄 또는 삼중쇄 및 이들의 임의의 화학 변형물을 포함하지만, 단쇄 핵산(13,102)이 바람직하다. 사실상, 핵산(13,102)의 임의의 변형이 예상된다. 본원에 사용된 바와 같이, 단쇄 핵산(13,102)은 접두어 "ss"로, 이중쇄 핵산(13,102)은 접두어 "ds"로, 삼중쇄 핵산(13,102)은 접두어 "ts"로 나타낼 수 있다.
"핵산"(13,102)은 거의 염기 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 5,000,000개 또는 그 이상의 염기수의 길이 내지 전장의 염색체 DNA 분자(13,102)일 수 있다.
"뉴클레오사이드"(16,104)는 오탄당(예: 데옥시리보스, 리보스 또는 오탄당의 유도체 또는 유사체)에 공유 결합된 염기(A, C, G, T 또는 U)를 포함하는 분자이다.
"뉴클레오타이드"(16,104)는 오탄당에 공유 결합된 하나 이상의 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드를 가리킨다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16,104)는 리보뉴클레오사이드 모노포스페이트(16,104) 또는 데옥시리보뉴클레오사이드 모노포스페이트(16,104)이지만, 임의의 실시양태에서는 뉴클레오사이드 디포스페이트 또는 트리포스페이트(16,104)가 생성될 수 있다고 예상된다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오사이드(16,104)는 핵산 분자(13,102)로부터 방출되어 이 하에 논의된 바와 같이 검출될 수 있다. 뉴클레오타이드(16,104)가 해체 시약(15,106)에 의해 핵산(13,102)으로부터 방출될 수 있기만 하다면, 뉴클레오타이드(16,104)의 구조에 다양한 치환 또는 변형이 이루어질 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 임의의 실시양태에서 리보스 또는 데옥시리보스 잔기는 다른 오탄당 또는 오탄당 유사체로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, 포스페이트 기는 다양한 유사체에 의해 치환될 수 있다.
핵산
서열결정할 핵산 분자(13,102)는 당업계에 공지된 임의의 기법에 의해 제조될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 핵산(13,102)은 천연 DNA 또는 RNA 분자이다. 사실상 임의의 천연 핵산(13,102)(비제한적인 예: 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA 및 엽록체 DNA, 및 리보솜 RNA, 전이 RNA, 이질성 핵 RNA 및 전령 RNA)은 개시된 방법에 의해 제조되고 서열결정될 수 있다.
다양한 형태의 세포 핵산(13,102)을 제조하고 단리하는 방법이 공지되어 있다(예컨대, 버거(Berger) 및 킴멜(Kimmel)의 문헌[Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, New York, NY, 1987]; 샘브룩(Sambrook), 프리취(Fritsch) 및 마니아티스(Maniatis)의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 참조). 일반적으로, 서열결정할 핵산(13,102)을 함유하는 세포, 조직 또는 기타 원료 물질을 먼저, 예를 들어 액체 질소에서 동결시킨 후 막자 사발에서 분쇄 함으로써 균질화한다. 웨어링 블렌더(Waring blender), 버티스 균질화기(Virtis homogenizer), 다운스(Dounce) 균질화기 또는 기타 균질화기를 사용하여 임의의 조직을 균질화할 수 있다. 조질의 균질화물을 세제, 예를 들어 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 트리톤 X-100, CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판 설포네이트), 옥틸글루코사이드 또는 당업계에 공지된 기타 세제로 추출할 수 있다. 선택적으로 또는 이외에, 추출은 카오트로픽제(chaotropic agnet)(예: 구아니디늄 이소티오시아네이트) 또는 유기 용매(예: 페놀)를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 프로테이나제 K로의 단백질분해효소 처리를 사용하여 세포 단백질을 분해할 수 있다. 원심분리 또는 초원심분리(예를 들어, 약 5,000 내지 10,000×g에서 10 내지 30분, 또는 약 50,000 내지 100,000×g에서 30 내지 60분)에 의해 입상의 오염원을 제거할 수 있다. 낮은 이온 강도의 수성 완충제에 대한 투석은 염 또는 기타 가용성 오염원을 제거하기에 유익할 수 있다. 핵산(13,102)은 -20℃에서 에탄올의 첨가에 의해 또는 나트륨 아세테이트(pH 6.5, 약 0.3M) 및 0.8배 체적의 2-프로판올의 첨가에 의해 침전될 수 있다. 침전된 핵산(13,102)은 원심분리에 의해, 또는 염색체 DNA(13,102)의 경우에는 침전된 DNA(13,102)를 유리 피펫 또는 다른 탐침에 감음으로써 수획할 수 있다.
당업자라면, 상기 기재된 과정은 전형적인 예일 뿐이며, 서열결정할 핵산(13,102)의 특정 유형에 따라 다양한 변형법이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 미토콘드리아 DNA(13,102)는 종종 단계 구배를 사용하여 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 제조되지만, mRNA(13,102)는 종종 프로메가(Promega)사(미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 클론테크(Clontech)사(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)와 같은 상업적 공급자의 제조용 칼럼을 사용하여 제조된다. 이러한 변형법은 당업계에 공지되어 있다.
당업자라면, 제조되는 핵산(13,102)의 유형에 따라 다양한 뉴클레아제 저해제가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 벌크상 용액내의 RNase 오염은 디에틸 피로카르보네이트(DEPC)로의 처리에 의해 제거될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 뉴클레아제 저해제는 프로메가사(미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 BRL사(미국 메릴랜드주 가이더스버그 소재)과 같은 표준의 공급자로부터 얻을 수 있다. 정제된 핵산(13,102)은 TE(Tris-EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산))와 같은 수성 완충제내에 용해시키고, 사용하기 전까지 -20℃에서 또는 액체 질소내에 보관할 수 있다.
단쇄 DNA(ssDNA)(13,102)를 서열결정하는 경우에서, ssDNA(13,102)는 표준의 방법에 의해 이중쇄 DNA(dsDNA)로부터 제조될 수 있다. 가장 간단하게는, dsDNA를 그의 서냉복원(annealing) 온도 이상으로 가열할 수 있는데, 이 온도에서 dsDNA는 자발적으로 ssDNA(13,102)로 분리된다. 대표적인 조건은 92 내지 95℃에서 5분 이상 가열함을 포함할 수 있다. 예를 들어 GC 함량 및 분자의 길이를 기준으로, dsDNA를 분리하는 조건을 결정하기 위한 방식은 당업계에 공지되어 있다. 또 다르게는, 단쇄 DNA(13,102)는 이중쇄 DNA중 하나의 쇄에만 결합하는 프라이머를 사용하여, 당업계에 공지된 표준의 증폭 기법에 의해 이중쇄 DNA로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 서열결정할 이중쇄 핵산을 M13과 같은 복제 형태의 파지내로 삽입 하고, 파지가 핵산(13,102)의 단쇄 복제물을 생성하게 함으로써, 단쇄 DNA(13,102)를 제조하는 다른 방법이 당업계에 공지되어 있다.
임의의 실시양태는 천연 핵산(13,102)의 제조에 관한 것이지만, 엑소뉴클레아제 또는 다른 해체 시약(15,106)의 기질로서 작용할 수 있는 사실상 임의의 유형의 핵산(13,102)은 잠재적으로 서열결정될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™) 증폭과 같은 다양한 증폭 기법에 의해 제조된 핵산(13,102)이 서열결정될 수 있었다(미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호 참조). 서열결정할 핵산(13,102)은 또 다르게는 플라스미드, 코스미드, BAC(세균 인조 염색체) 또는 YAC(효모 인조 염색체)와 같은 표준의 벡터내에 클론화할 수 있다.(예컨대, 버거 및 킴멜의 상기 문헌(1987); 샘브룩 등의 상기 문헌(1989) 참조). 핵산 삽입물(13,102)은, 예를 들어 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절개한 후 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색에 의해 벡터 DNA로부터 단리될 수 있다. 선택된 크기-분별화된 핵산(13,102)은, 예를 들어 저융점 아가로스의 사용 또는 겔 조각으로부터의 전기용출에 의해 겔로부터 제거될 수 있다. 삽입 핵산(13,102)의 단리 방법은 당업계에 공지되어 있다.
단일 핵산 분자의 단리
임의의 실시양태에서, 서열결정할 핵산 분자(13,102)는 ssDNA 또는 ssRNA의 단일 분자이다. 단일 ssDNA 또는 ssRNA 분자(13,102)의 선택 및 조작을 위한 다양한 방법, 예를 들어 유체역학 집속, 극미조작자 커플링(micro-manipulator coupling), 광트랩(optical trapping) 또는 이들 방법과 유사 방법의 혼합을 사용할 수 있다(예컨대, 구드윈(Goodwin) 등의 문헌[Acc. Chem. Res. 29:607-619(1996)]; 미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 5,776,674 호, 제 6,136,543 호, 제 6,225,068 호 참조).
임의의 실시양태에서, 마이크로유체 또는 나노유체를 사용하여 핵산 분자(13,102)를 분류하고 단리할 수 있다. 유체역학을 사용하여 핵산(13,102)의 미소채널, 미소모세관 또는 미공으로의 움직임을 조작할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 유체역학력을 사용하여 핵산 분자(13,102)를 빗형 구조를 가로질러 이동시켜 단일 핵산 분자(13,102)를 분리할 수 있다. 핵산 분자(13,102)가 분리되면, 유체역학 집속을 사용하여 분자(13,102)를 반응 챔버(11,102)내에 위치시킬 수 있다. 열적 전위 또는 전기적 전위, 압력 또는 진공을 사용하여 핵산(13,102)을 조작하기 위한 원동력을 제공할 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 서열결정하기 위한 핵산(13,102)의 조작은 미국 특허 제 5,867,266 호 및 제 6,214,246 호에 개시된 바와 같이, 미소제작된 채널 및 통합된 겔 물질을 도입하는 채널 블록 디자인의 사용을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 핵산 분자(13,102)를 함유하는 샘플을 고정화 표면(14,103)에 커플링하기 전에 희석할 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 고정화 표면(14,103)은 자성 또는 비자성 비드 또는 기타 분리된 구조 단위의 형태일 수 있다. 적당히 희석되면, 각각의 비드(14,103)는 0 또는 1개의 핵산 분자(13,102)를 결합시키는 통계적 가능성을 가질 것이다. 핵산 분자(13,102)가 결합된 비드(14,103)는, 예를 들어 형광 염료 및 유세포 측정기 분류 또는 자성 분류를 사용하여 동정될 수 있다. 비드(14,103) 및 핵산(13,102)의 상대적 크기 및 균일성에 따라, 자기 필터 및 질량 분리를 사용하여 하나의 결합된 핵산 분자(13,102)를 함유하는 비드(14,103)를 분리하는 것이 가능할 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일 비드 또는 다른 고정화 표면(14,103)에 결합된 다수의 핵산(13,102)을 서열결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 코팅된 섬유 팁(14,103)을 사용하여 서열결정하기 위한 단일 분자 핵산(13,102)을 생성할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제 6,225,068 호). 또 다른 실시양태에서, 단일 분자의 아비딘 또는 다른 가교결합제를 함유하도록 고정화 표면(14,103)을 제조할 수 있다. 이러한 표면(14,103)은 서열결정할 하나의 비오티닐화 핵산 분자(13,102)에 결합할 수 있었다. 이 실시양태는 아비딘-비오틴 결합 시스템에 제한되지 않지만, 당업계에 공지된 임의의 커플링 시스템에 적합화될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 서열결정하기 위한 단일 분자 핵산 분자(13,102)의 조작에 광트랩을 사용할 수 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,776,674 호). 전형적인 광트랩 시스템은 셀 로보틱스 인코포레이티드(Cell Robotics, Inc.)사(미국 뉴멕시코주 앨부커키 소재), 에스 플러스 엘 게엠베하(S+L GmbH)사(독일 하이델베르크 소재) 및 파 아 엘 엠 게엠베하(P. A. L. M. GmbH)사(독일 볼프라차우젠 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다.
고정화 방법
다양한 실시양태에서, 서열결정할 핵산 분자(13,102)를 고체 표면(14,103)에 결합(또는 고정화)시킬 수 있다. 핵산 분자(13,102)의 고정화는 핵산 분자(13,102)와 표면(14,103) 사이의 비공유 또는 공유 결합을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성할 수 있다. 전형적인 실시양태에서, 고정화는 표면(14,103)을 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 코팅한 후 비오티닐화 핵산(13,102)을 결합시킴으로써 달성할 수 있다(홈스트롬(Holmstrom) 등의 문헌[Anal. Biochem. 209:278-283, 1993]). 고정화는 또한 규소, 유리 또는 기타 표면(14,103)을 폴리-L-Lys(리신) 또는 폴리 L-Lys,Phe(페닐알라닌)으로 코팅한 후, 이작용기성 가교결합제를 사용하여 아미노- 또는 설프히드릴-변형된 핵산(13,102)을 공유 결합시킴으로써 일어날 수 있다(러닝(Running) 등의 문헌[BioTechniques 8:276-277, 1990]; 뉴튼(Newton) 등의 문헌[Nucleic Acids Res. 21:1155-62, 1993]). 가교결합을 위하여 아미노실란을 사용함으로써 아민 잔기를 표면(14,103)에 도입할 수 있다.
고정화는 5'-포스포릴화 핵산(13,102)을 화학적으로 변형된 표면(14,103)에 직접 공유 결합시킴으로써 일어날 수 있다(라스무센(Rasmussen) 등의 문헌[Anal. Biochem. 198:138-142, 1991]). 핵산(13,102)과 표면(14,103)의 공유 결합은 수용성 카르보이미드와의 축합에 의해 형성된다. 이 방법은 핵산(13,102)의 5'-포스페이트에 의한 핵산(13,102)의 주된 5'-결합을 용이하게 한다.
DNA(13,102)는 일반적으로 먼저 유리 표면(14,103)을 실란화한 다음, 카르보디이미드 또는 글루타르알데히드로 활성화함으로써 유리에 결합된다. 또 다른 과 정은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GOP) 또는 아미노프로필트리메톡시실란(APTS)과 같은 시약을 사용하여, DNA(13,102)를 분자의 3' 또는 5' 말단에 도입된 아미노 링커에 의해 연결시킬 수 있다. DNA(13,102)는 자외선을 사용하여 막 표면(14,103)에 직접 결합시킬 수 있다. 핵산(13,102)을 위한 기타 비제한적인 고정화 기법의 예는 미국 특허 제 5,610,287 호, 제 5,776,674 호 및 제 6,225,068 호에 개시되어 있다.
핵산(13,102)의 고정화에 사용되는 표면(14,103)의 유형은 제한되지 않는다. 다양한 실시양태에서, 고정화 표면(14,103)은 자성 비드, 비자성 비드, 평면, 뾰족한 표면, 또는 핵산(13,102)을 서열결정 반응이 일어나도록 하기에 충분히 내구성이고 불활성인 임의의 물질을 거의 포함하는 고체 표면(14,103)의 임의의 다른 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 표면(14,103)의 비제한적인 예로는 유리, 실리카, 실리케이트, PDMS, 은 또는 기타 금속이 코팅된 표면, 니트로셀룰로즈, 나일론, 활성화된 석영, 활성화된 유리, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 기타 중합체(예: 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 폴리(디메틸 실록산)), 및 핵산 분자(13,102)와 공유 결합을 형성할 수 있는 니트렌, 카르벤 및 케틸 라디칼과 같은 광반응성 종을 함유하는 광중합체가 있다(미국 특허 제 5,404,766 호 및 제 5,986,076 호 참조).
이작용기성 가교결합제는 핵산 분자(13,102)를 표면(14,103)에 결합시키는 것과 같은 다양한 실시양태에서 유익할 수 있다. 이작용기성 가교결합제는 그의 작용기, 예컨대 아미노, 구아니디노, 인돌 또는 카르복실 특이성 기의 특이성에 따 라 나뉘어질 수 있다. 이들중에서, 자유 아미노 기를 표적으로 하는 시약은 그의 상업적 입수가능성, 합성의 용이함 및 적용될 수 있는 온화한 반응 조건 때문에 대중적이다. 분자의 가교결합을 위한 전형적인 방법은 미국 특허 제 5,603,872 호 및 제 5,401,511 호에 개시되어 있다. 가교결합제로는 글루타르알데히드(GAD), 이작용기성 옥시란(OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDE), 및 카르보디이미드(예: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC))가 있다.
해체 시약
서열결정 반응은 핵산 분자(13,102)의 자유 말단(17,105)에 해체 시약(15,106)을 결합시키고 뉴클레오타이드(16,104)를 한번에 하나씩 제거함을 포함한다. 임의의 실시양태에서 반응은 엑소뉴클레아제(15,106)와 같은 효소에 의해 촉진될 수 있다. 실시양태는 사용될 수 있는 엑소뉴클레아제(15,106)의 유형에 의해 제한되지 않는다. 가능한 용도의 엑소뉴클레아제(15,106)의 비제한적인 예로는 이 콜라이(E. coli) 엑소뉴클레아제 I, III, V 또는 VII, Bal 31 엑소뉴클레아제, 녹두 엑소뉴클레아제, S1 뉴클레아제, 이 콜라이 DNA 폴리머라제 I 홀로효소 또는 클레노우(Klenow) 단편, RecJ, 엑소뉴클레아제 T, T4 또는 T7 DNA 폴리머라제, Taq 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 T7 유전자 6, 뱀독 포스포디에스테라제, 비장 포스포디에스테라제, 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 폴리머라제, 피로코쿠스 속(Pyrococcus sp.) GB-D DNA 폴리머라제, 람다 엑소뉴클레아제, 에스 아루레우스(S. aureus) 단구균 뉴클레아제, DNase I, 리보뉴클레아제 A, T1 단구균 뉴클레아제, 또는 당업계에 공지된 기타 엑소뉴클레아제가 있다. 엑소뉴클레아제(15,106)는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)사(미국 매사츄세츠주 비벌리 소재), 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)사(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가사(미국 위스콘신주 메디슨 소재), 시그마 케미칼스(Sigmna Chemicals)사(미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)사(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)과 같은 상업적 공급자로부터 입수가능하다.
당업자라면, 엑소뉴클레아제(15,106) 활성을 갖는 효소가 다양한 특성을 가짐을 알 것이다. 예를 들어, 이들은 5' 말단, 3' 말단, 또는 핵산 분자(13,102)의 양 말단으로부터 뉴클레오타이드(16,104)를 제거할 수 있다. 이들은 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA(13,102) 둘다에 대하여 특이성을 나타낼 수 있다. 이들의 활성은 단쇄 또는 이중쇄 핵산(13,102)의 사용에 의존할 수 있다. 이들은 반응 매질의 다양한 특징, 예를 들어 염, 온도, pH 또는 2가 양이온에 의해 달리 영향받을 수 있다. 다양한 엑소뉴클레아제 및 폴리머라제(15,106)의 이러한 특징 및 다른 특징은 당업계에 공지되어 있다.
당업자라면, 엑소뉴클레아제(15,106) 활성의 속도를 검출 장치(18,107)에 의한 뉴클레오타이드(16,104)의 최적 분석 속도와 일치하도록 조작할 수 있음을 알 것이다. 반응 챔버(11,101)내의 온도, 압력, pH, 염 농도 또는 2가 양이온 농도의 조절을 포함하여, 엑소뉴클레아제(15,106) 활성의 속도를 조절하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 엑소뉴클레아제(15,106) 활성의 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있다.
표지
임의의 실시양태는 뉴클레오타이드(16,104)에 표지를 도입하여 검출 장치(18,107)에 의한 이들의 측정을 용이하게 함을 포함할 수 있다. 라만 표지, 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 효소 표지, 항체, 화학발광제, 전계발광제, 친화성 표지 등과 같은 다수의 상이한 표지가 사용될 수 있다. 당업자라면, 이들 표지 잔기 및 본원에서 언급되지 않은 그밖의 표지 잔기를 다양한 실시양태에 사용할 수 있음을 알 것이다.
라만 분광법을 포함한 실시양태에 사용하기 위한 표지는 상기에서 논의하였다. 다른 실시양태에서, 사용되는 표지 잔기는 형광단, 예를 들어 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA(7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산), BODIPY(5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산) 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL(플루오레세인), BODIPY-R6G(6-카르복시로다민), BODIBY-TMR(테트라메틸로다민), BODIPY-TRX(텍사스 레드-X), 캐스캐이드 블루(Cascade Blue), Cy2(시아닌), Cy3, Cy5,6-FAM(5-카르복시플루오레세인), 플루오레세인, 6-JOE(2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 로다민 그린, 로다민 레드, ROX(6-카르복시-X-로다민), TAMRA(N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민), 테트라메틸로다민, 및 텍사스 레드일 수 있다. 형광 또는 발광 표지는 몰레큘라 프로 브스(Molecular Probes)사(미국 오레곤주 유진 소재)와 같은 표준의 상업적 공급자로부터 얻을 수 있다.
반응 챔버
반응 챔버(11,101)는 고정화 표면(14,103), 핵산 분자(13,102), 해체 시약(15,106) 및 뉴클레오타이드(16,104)를 수성 환경에 수용하도록 고안된다. 일부 실시양태에서, 반응 챔버(11,101)는, 예를 들어 펠레티어(Pelletier) 요소의 도입 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 온도가 제어되도록 고안된다. 저체적 액체의 온도 제어 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,038,853 호, 제 5,919,622 호, 제 6,054,263 호 및 제 6,180,372 호 참조).
임의의 실시양태에서, 반응 챔버(11,101) 및 임의의 관련 유체 채널, 예를 들어 폐기구, 핵산(13,102) 첨가구, 또는 해체 시약(15,106)원에 대한 연결을 제공하는 유동 경로(12) 또는 채널은 컴퓨터 칩 제조 또는 미소모세관 칩 제조 분야에 공지된 일괄제작 공정으로 제조된다. 일부 실시태에서, 반응 챔버(11,101) 및 장치(10,100)의 기타 부품(예: 유동 경로(12))은 하나의 집적 칩으로서 제조될 수 있다. 이러한 칩은 포토리소그래피(photolithography) 및 에칭과 같은, 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 제조 방법은 비제한적이며, 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 레이저 제거, 사출성형, 주조성형 또는 각인 기법이 사용될 수 있다. 나노전기기계 시스템의 제조 방법을 임의의 실시양태에 사용할 수 있다(예컨대, 크레이그헤드(Craighead)의 문헌[Science 290:1532-36, 2000] 참 조). 미소제작된 칩은 캘리퍼 테크날러지스 인코포레이티드(Caliper Technologies Inc.)사(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 및 어클라라 바이오사이언시스 인코포레이티드(ACLARA BioSciences Inc.)사(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)와 같은 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다.
비제한적인 예로, 보로플로트(Brofloat) 유리 웨이퍼(프리시젼 글래스 앤 옵틱스(Precision Glass & Optics)사, 미국 캘리포니아주 산타 애나 소재)를 진한 HF(히드로플루오르산)내에서 단시간동안 예비 에칭하고, 세정한 후, 플라즈마 화학 증착(PECVD) 시스템(PEII-A, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 테크닉스 웨스트(Technics West)사)에서 비정질 규소 희생층을 증착할 수 있다. 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔(HMDS)으로 전처리하고, 포토레지스트(쉬플리(Shipley) 1818, 미국 매사츄세츠주 말보로우 소재)로 스핀코팅(spin-coating)하고, 소프트 베이킹(soft-bake)할 수 있다. 접촉 마스크 정렬기(미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 퀸텔 코포레이션(Quintel Corp.)사)를 사용하여 하나 이상의 마스크 디자인을 갖는 포토레지스트 층을 노광시키고, 마이크로포지트(Microposit) 현상제 농축액(쉬플리사) 및 물의 혼합물을 사용하여 노광된 포토레지스트를 제거할 수 있다. 현상된 웨이퍼를 하드-베이킹(hard-bake)하고, PECVD 반응기내에서 CF4(사플루오르화 탄소)를 사용하여 노광된 비정질 규소를 제거할 수 있다. 웨이퍼를 진한 HF로 화학 에칭하여 반응 챔버(11,101), 유동 경로(12) 및 임의의 채널을 생성할 수 있다. 남아 있는 포토레지스트를 소거하고, 비정질 규소를 제거할 수 있다.
에칭된 웨이퍼에 다이아몬드 드릴 비트(drill bit)(미국 오하이오주 웨스터빌 소재의 크리스탈라이트(Crystalite)사)로 액세스 홀(access hole)을 뚫을 수 있다. 완성 칩은 에칭되고 구멍뚫린 판을 프로그램형 진공 노(센츄리온 VPM(Centurion VPM), 미국 캘리포니아주 유카이파 소재의 제이 엠 네이(J. M. Ney)사)에서 동일한 크기의 편평한 웨이퍼에 열접합하여 제조할 수 있다. 임의의 실시양태에서, 칩은 에칭된 두 판을 서로 접합하여 제조할 수 있다. 반응 챔버(11,101) 및 유동 경로(12)를 도입하는 칩의 또 다른 전형적인 제작 방법은 미국 특허 제 5,867,266 호 및 제 6,214,246 호에 개시되어 있다.
검출 장치(18,107)에 의한 뉴클레오타이드(16,104)의 검출을 용이하게 하기 위하여, 반응 챔버(11,101) 및(또는) 유동 경로(12)를 포함하는 물질은 검출 장치(18,107)에 사용되는 여기 및 방출 진동수의 전자기선을 통과시키도록 선택될 수 있다. 라만 분광법, 형광 분광법, 발광 분광법, 또는 다른 형태의 분광법에 사용되는 진동수 범위에서 일반적으로 투과성인 유리, 규소 및 임의의 다른 물질이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검출 장치(18,107)의 반대편에 있는 반응 챔버(11,101) 및(또는) 유동 경로(12)의 표면은 검출 장치(18,107)에 대하여 비교적 불투명한 은, 금, 백금, 구리, 알루미늄 또는 다른 물질로 코팅될 수 있다. 그 위치에서, 불투명 물질은, 예를 들어 표면 강화 라만 분광법에 의해 라만 또는 다른 신호를 강화시키는데 이용될 수 있지만, 검출 장치(18,107)의 작용을 방해하지는 않는다. 또 다르게는, 반응 챔버(11,101) 및(또는) 유동 경로(12)는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄을 포함하는 메쉬를 함유할 수 있다. 당업자라면, 유동 경 로(12)를 포함하는 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16)가 일반적으로 유동 경로(12)에 있을 때 검출될 것임을 이해할 것이다. 유동 경로(12)가 없는 실시양태에서, 뉴클레오타이드(104)는 반응 챔버(101)내에서 검출될 것이다.
다양한 실시양태에서, 반응 챔버(11,101)는 내부 체적이 약 1피코리터, 약 2피코리터, 약 5피코리터, 약 10피코리터, 약 20피코리터, 약 50피코리터, 약 100피코리터, 약 250피코리터, 약 500피코리터, 약 1나노리터, 약 2나노리터, 5나노리터, 약 10나노리터, 약 20나노리터, 약 50나노리터, 약 100나노리터, 약 250나노리터, 약 500나노리터, 약 1마이크로리터, 약 2마이크로리터, 약 5마이크로리터, 약 10마이크로리터, 약 20마이크로리터, 약 50마이크로리터, 약 100마이크로리터, 약 250마이크로리터, 약 500마이크로리터, 또는 약 1밀리리터일 수 있다.
유동 경로
임의의 실시양태에서, 자유 뉴클레오타이드(16)는 검출 장치(18)를 지나서 유동 경로(12) 아래로 이동한다. 자유 뉴클레오타이드(16)의 운반 기법의 비제한적인 예로는 마이크로유체 기법이 있다. 유동 경로(12)는 미소모세관(예컨대, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 어클라라 바이오사이언시스 인코포레이티드사로부터 입수가능함) 또는 액체 집적회로(예컨대, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 캘리퍼 테크날러지스 인코포레이티드사)를 포함할 수 있다. 이러한 마이크로유체 플랫폼(platform)은 나노리터 체적의 샘플만을 필요로 한다.
임의의 실시양태에서, 검출될 자유 뉴클레오타이드(16)는 용매의 벌크상 유 동에 의해 유동 경로(12) 아래로 이동한다. 다른 실시양태에서, 미소모세관 전기영동을 사용하여 자유 뉴클레오타이드(16)를 유동 경로(12) 아래로 운반하고 검출 장치(18)를 지나서 운반할 수 있다. 미소모세관 전기영동은 일반적으로 특정한 분리 매질로 충전되거나 충전되지 않을 수 있는 얇은 모세관 또는 채널의 사용을 포함한다. 음으로 하전된 뉴클레오타이드(16)와 같은 적당히 하전된 분자 종의 전기영동은 인가된 전기장에 반응하여 일어나는데, 장치의 반응 챔버(11)쪽에서는 음이고, 검출 장치(18)쪽에서는 양이다. 전기영동은 미소모세관에 동시에 첨가되는 성분들의 혼합물의 크기 분리에 종종 사용되지만, 유동 경로(12)에 순차적으로 첨가되는 유사 크기의 뉴클레오타이드(16)를 운반하는데도 사용될 수 있다. 퓨린 뉴클레오타이드(A, G)(16)는 피리미딘 뉴클레오타이드(C, T, U)(16)보다 커서 더 천천히 움직일 것이기 때문에, 유동 경로(12)의 길이 및 검출 장치(18)를 통과하는 상응하는 주행 시간은 핵산(13)으로부터 방출되는 뉴클레오타이드(16)의 순서가 뒤섞이지 않게 시차 이동을 보호하도록 최소한으로 유지되어야 한다. 또 다르게는, 유동 경로(12) 아래로의 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오타이드(16)의 이동 속도가 유사하거나 동일하도록, 미소모세관을 충전하는 분리 매질을 선택할 수 있다. 미소모세관 전기영동 방법은, 예를 들어 울리(Woolley) 및 마티스(Mathies)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11348-352, 1994]에 의해 개시되었다.
미소모세관 전기영동 장치를 포함한 마이크로유체 장치의 미소제작은, 예컨대 쟈콥슨(Jacobsen) 등의 문헌[Anal. Biochem, 209:278-283, 1994]; 에펜하우저(Effenhauser) 등의 문헌[Anal. Chem. 66:2949-2953, 1994]; 해리슨(Harrison) 등의 문헌[Science 261:895-897, 1993] 및 미국 특허 제 5,904,824 호에 논의된 바 있다. 전형적으로, 이들 방법은 실리카, 규소 또는 기타 결정질 기재 또는 칩에 미크론 크기의 채널을 포토리소그래피 에칭함을 포함하고, 사용하도록 쉽게 적합화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 미소모세관은 당업계에 공지된 사출성형 또는 기타 기법을 사용하여, 반응 챔버(11,101)의 제작에 대하여 기술된 것과 동일한 중합체 물질로부터 제작될 수 있다.
검출 장치
라만 분광법을 포함하는 실시양태
일부 실시양태에서, 검출 장치(18,107)는 라만 분광법에 의해 뉴클레오타이드(16,104)를 검출하고 정량하도록 고안된다. 뉴클레오타이드(16,104)를 라만 분광법에 의해 검출하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,306,403 호, 제 6,002,471 호, 제 6,174,677 호 참조). 표면 강화 라만 분광법(SERS) 또는 표면 강화 공명 라만 분광법(SERRS)에 대한 변형이 개시된 바 있다. SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면과 같은 거친 금속 표면에 흡착된 분자의 경우 106배 이상 강화된다.
라만 검출 장치(18,107)의 비제한적인 예는 미국 특허 제 6,002,471 호에 개시되어 있다. 이 실시양태에서, 여기 광선(20,110)은 파장 532㎚의 Nd:YAG 레이저(19,108) 또는 파장 365㎚의 Ti:사파이어 레이저(19,108)에 의해 생성된다. 펄스 레이저 광선(20,110) 또는 연속 레이저 광선(20,110)을 사용할 수 있다. 여기 광선(20,110)은 공초점 렌즈 및 현미경 대물 렌즈를 통과하여, 유동 경로(12) 또는 반응 챔버(101)로 초점이 모여진다. 뉴클레오타이드(16,104)로부터의 라만 발광은 현미경 대물 렌즈 및 공초점 렌즈에 의해 모이고, 분광 분리를 위한 단색화 장치에 연결된다. 공초점 렌즈는 이색성 필터, 차단 필터, 공초점 핀홀(pinhole), 렌즈, 및 바탕 신호를 감소시키기 위한 거울의 혼합물을 포함한다. 공초점 렌즈 뿐만 아니라 표준의 전역 렌즈도 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 라만 검출기(21,109)에 의해 검출된다. 검출기(21,109)는 신호를 계수하고 디지탈화하하기 위하여 컴퓨터에 인터페이스 접속된 애벌란시 포토다이오드(avalanche photodiode)를 포함한다. 임의의 실시양태에서, 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄을 포함하는 메쉬가 유동 경로(12) 또는 반응 챔버(101)에 포함되어, 표면 강화 라만 또는 표면 강화 라만 공명으로 인한 증가된 신호를 제공할 수 있다.
단광자 계수 방식으로 작동되는 갈륨-비소 광전증폭관(RCA 모델 C31034 또는 부를레 인더스트리즈(Burle Industries) 모델 C3103402)이 장착된 스펙스(Spex) 모델 1403 이중격자 분광광도계(21,109)를 포함한 검출 장치(18,107)의 또 다른 실시양태는, 예를 들어 미국 특허 제 5,306,403 호에 개시되어 있다. 여기원(19,108)은 스펙트라피직스(SpectraPhysics), 모델 166으로부터의 아르곤-이온 레이저(19,108)의 514.5㎚ 선, 및 크립톤-이온 레이저(19,108)(이노바(Innova) 70, 코히런트(Coherent)사)의 647.1㎚ 선이다.
또 다른 여기원(19,108)으로는 337㎚의 질소 레이저(19,108)(레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.)사) 및 325㎚의 헬륨-카드뮴 레이저(19,108)(리코녹스(Liconox)사)가 있다(미국 특허 제 6,174,677 호). 여기 광선(20,110)은 대역 필터(코리온(Corion)사)로 분광 정제될 수 있고, 6배 대물 렌즈(뉴포트(Newport)사, 모델 L6X)를 사용하여 유동 경로(12) 또는 반응 챔버(101)에 초점이 맞춰질 수 있다. 홀로그래피(holography) 광선 분할기(카이저 옵티칼 시스템스 인코포레이티드(Kaiser Optical Systems, Inc.)사, 모델 HB 647-26N18)를 사용하여 여기 광선(20,110) 및 방출된 라만 신호에 대하여 직각 배열을 생성함으로써, 뉴클레오타이드(16,104)를 여기시켜 라만 신호를 모으는데 대물 렌즈를 사용할 수 있다. 홀로그래피 노치(notch) 필터(카이저 옵티칼 시스템스 인코포레이티드사)를 사용하여 레일리(Rayleigh) 산란선을 감소시킬 수 있다. 또 다른 라만 검출기(21,109)로는 레드-강화 광증폭 전하 결합 소자(RE-ICCD) 검출 시스템(프린스턴 인스트루먼츠(Princeton Instruments)사)이 장착된 ISA HR-320 분광사진기가 있다. 하전된 사출 장치, 포토다이오드 어레이 또는 광트랜지스터 어레이와 같은 다른 유형의 검출기(21,109)가 사용될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 형태 또는 구성의 라만 분광법 또는 관련 기법(비제한적인 예: 정상 라만 산란, 공명 라만 산란, 표면 강화 라만 산란, 표면 강화 공명 라만 산란, 간섭성 안티-스토크(anti-Stoke) 라만 분광법(CARS), 자극된 라만 산란, 역 라만 분광법, 자극된 게인 라만 분광법(stimulated gain Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 산란(hyper-Raman scattering), 분자 광학 레이저 검 사기(MOLE) 또는 라만 미소탐침 또는 라만 현미경 또는 공초점 라만 마이크로분광계, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시분해 공명 라만, 라만 분리 분광법 또는 자외선-라만 현미경 검사법)을 사용하여 뉴클레오타이드(16,104)를 검출할 수 있다.
FRET를 포함하는 실시양태
임의의 또 다른 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16,104)는 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 사용하여 동정되고 정량된다. FRET는 공여체 분자와 수용체 분자 사이의 근접성을 검출하는데 사용되는 분광계 현상이다. 공여체 및 수용체 쌍은 공여체로부터의 형광 방출이 수용체의 여기 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 두 분자가 회합되면(100옹스트롬 미만의 거리로), 공여체의 여기-상태 에너지는 수용체로 비방사적으로 전이되고, 공여체 방출이 정지된다. 수용체 분자가 형광단이면 그의 방출이 증진된다. 올리고뉴클로타이드에 의한 FRET의 사용을 위한 조성물 및 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,866,366 호 참조).
FRET의 표지로서 빈번하게 사용되는 분자로는 플루오레신, 5-카르복시플루오레신(FAM), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시플루오레신(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조) 벤조산(DABCYL), 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)이 있다. 그밖의 가능한 FRET 공여체 또는 수용체 분자가 당업계에 공지되어 있다(미국 특허 제 5,866,336 호 표 1 참조). 당업자라면, FRET를 위한 표지 분자쌍의 선택에 익숙할 것이다(미국 특허 제 5,866,336 호).
FRET를 포함하는 실시양태에서, 공여체 및 수용체 분자는 서열결정 장치(10,100)의 다양한 성분에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 임의의 실시양태에서, 공여체 또는 수용체 분자는 뉴클레오타이드(16,104), 엑소뉴클레아제(15,106) 또는 유동 경로(12)에 결합될 수 있다.
임의의 실시양태에서, 공여체 분자는 엑소뉴클레아제(15,106) 또는 유동 경로(12)의 표면에 결합되고, 수용체 분자는 뉴클레오타이드(16,104)에 결합될 수 있다. 이 경우에, 각 유형의 뉴클레오타이드(16,104)는 구별가능한 방출 스펙트럼을 갖는 수용체 분자에 결합되어야 하는 반면에, 공여체 분자는 4가지의 모든 수용체 분자의 여기 스펙트럼과 겹치는 넓은 방출 스펙트럼을 가지도록 선택되어야 한다. 엑소뉴클레아제(15,106) 또는 유동 경로(12)에 다수의 공여체 분자가 존재할 수 있지만, 다른 실시양태에서는 오직 하나의 공여체 분자가 존재할 수 있다.
여기되면, 공여체 분자는 그의 에너지를 뉴클레오타이드(16,104)에 결합된 수용체 표지 분자에 전이하여, 수용체 분자로부터 방출 신호가 강화될 것이다. 신호 강화의 강도는 거리에 따라 빠르게 감소하기 때문에, 최대의 신호 강화는 공여체 분자(들)에 매우 가까운 뉴클레오타이드(16,104)의 경우에 일어날 것이다. 엑소뉴클레아제(15,106)에 결합된 공여체 분자의 경우에, 접촉 부위 또는 그 근처에서, 가장 강한 방출 신호를 갖는 뉴클레오타이드(16,104)는 엑소뉴클레아제(15,106)의 접촉 부위에 위치할 것이다. 공여체 분자는 접촉 부위 에 밀접하게 결합되어야 하지만, 해체 시약(15,106)의 엑소뉴클레아제 활성을 방해하지 않을 위치에 결합되어야 한다. 공여체 분자가 여기 광선(20)의 초점이 모이는 위치에서 유동 경로(12)의 표면에 결합되는 실시양태에서, 여기 광선(20)의 초점내의 뉴클레오타이드(16)만이 검출가능한 형광 신호를 제공하여야 한다. 여기 광선(20,110)의 파장은 공여체 분자를 최대로 여기시키면서, 수용체 분자를 매우 약하게 여기시키도록 선택될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드(16,104)가 핵산 분자(13,102)로부터 제거되면, 그의 공여체 표지로부터의 신호가 검출될 것이다.
임의의 실시양태에서, 서열결정할 주형 핵산(13,102)은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 광트랩의 사용에 의해(예컨대, 미국 특허 제 6,136,543 호) 형광 현미경의 시계 범위내에 위치할 수 있다. 사용될 수 있는 형광 현미경의 비제한적인 예는 오일-침지된 100배 렌즈(플랜 멀티도트 아포크로마트 타임즈 100(Plan.multidot.Apochromat.times.100), 1.40NA, 올림푸스 캄파니 리미티드(Olympus Co., Ltd.)사)를 사용하는, 역위 위상차 및 입사광선 형광 현미경(IMT2-RFC, 올림푸스 캄파니 리미티드사)이다. 여기 광선(20,110)은 상기 논의된 바와 같이 레이저(19,108)에 의해 방사될 수 있다. 형광 방출은 적당한 필터를 사용하여 대물 렌즈를 통해 모아질 수 있고, CCD 장치, 포토다이오드, 광전증폭관 또는 등가물과 같은 임의의 민감성 형광 검출기(21)를 사용하여 검출될 수 있다.
정보 처리 및 제어 시스템 및 데이터 분석
임의의 실시양태에서, 핵산 서열결정 장치(10,100)는 정보 처리 시스템을 포 함할 수 있다. 이 실시양태는 사용되는 정보 처리 시스템의 유형에 대하여 제한이 없다. 전형적인 정보 처리 시스템은 정보를 전달하기 위한 버스(bus) 및 정보를 처리하기 위한 프로세서(processor)를 포함하는 컴퓨터를 도입할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 프로세서는 펜티엄(Pentium, 등록상표)류의 프로세서(비제한적인 예: 인텔 코포레이션(Intel Corporation)사(미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)로부터 입수가능한 펜티엄 II류, 펜티엄 III류 및 펜티엄 4류)중에서 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 프로세서는 셀러론(Celeron, 등록상표), 이타늄(Itanium, 등록상표), 또는 펜티엄 제온(Pentium Xeon, 등록상표) 프로세서(인텔 코포레이션사, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)일 수 있다. 다양한 다른 실시양태에서, 프로세서는 인텔(Intel, 등록상표) IA-32 또는 인텔 IA-64 아키텍처(architecture)와 같은 인텔 아키텍처를 기본으로 할 수 있다. 또 다르게는, 다른 프로세서가 사용될 수 있다.
컴퓨터는 임의 접근 기억장치(RAM) 또는 다른 동적 기억장치인 판독 전용 기억장치(ROM) 또는 다른 정적 기억장치 및 데이터 기억장치(예: 자기 디스크 또는 광디스크 및 그의 상응하는 구동장치)를 추가로 포함할 수 있다. 정보 처리 시스템은 또한 표시 장치(예컨대, 음극선관 또는 액정 표시장치), 영숫자 입력 장치(예컨대, 키보드), 커서 제어 장치(마우스, 트랙볼(trackball) 또는 커서 방향키) 및 통신 장치(예컨대, 모뎀, 네트웍 인터페이스 카드, 또는 에터넷(Ethernet)에 연결하는데 사용되는 인터페이스 장치, 토큰 링(token ring), 또는 기타 유형의 네트웍)와 같은, 당업계에 공지된 기타 주변 장치를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 검출 장치(18,107)는 정보 처리 시스템에 작동가능하게 연결될 수 있다. 검출 장치(18,107)로부터의 데이터는 프로세서에 의해 처리되어 주 기억장치에 데이타 저장될 수 있다. 표준의 뉴클레오타이드(16,104)의 방출 프로파일에 대한 데이터는 또한 주 기억장치 또는 ROM에 저장될 수 있다. 프로세서는 반응 챔버(101) 또는 유동 경로(12)내의 뉴클레오타이드(16,104)로부터의 방출 스펙트럼을 비교하여 핵산 분자(13,102)로부터 방출된 뉴클레오타이드(16,104)의 유형을 동정할 수 있다. 주 기억장치는 또한 핵산 분자(13,102)로부터 방출된 뉴클레오타이드(16,104)의 서열을 저장할 수 있다. 프로세서는 검출 장치(18,107)로부터의 데이터를 분석하여 핵산(13,102)의 서열을 결정할 수 있다. 임의의 실행을 위하여 별도로 장착된 정보 처리 시스템이 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 시스템의 구성은 상이한 실시양태에 따라 변할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 프로그램화된 프로세서의 제어하에 수행될 수 있지만, 또 다른 실시양태에서 프로세서는 현장 프로그램화가능한 게이트 어레이(FPGA), TTL 논리 또는 주문형 집적 회로(ASIC)와 같은 임의의 프로그램화 또는 하드코딩화 논리에 의해 완전히 또는 부분적으로 실행될 수 있다. 또한, 개시된 방법은 프로그램화된 범용 컴퓨터 부품 및(또는) 주문형 하드웨어 부품의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.
데이터 수집 공정에 이어서, 데이터는 전형적으로 데이터 분석 공정으로 보고될 것이다. 분석 공정을 용이하게 하기 위하여, 검출 장치(18,109)에 의해 얻어진 데이터는 전형적으로 전술된 것과 같은 디지탈 컴퓨터를 사용하여 분석될 것이 다. 전형적으로, 컴퓨터는 수집된 데이터의 분석 및 보고 뿐만 아니라, 검출 장치(18,109)로부터 얻은 데이터의 수령 및 저장을 위해 적당히 프로그램화될 것이다.
임의의 실시양태에서, 맞춤형 소프트웨어 패키지를 사용하여 검출 장치(18,109)로부터 얻어진 데이터를 분석할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정보 처리 시스템 및 공개적으로 입수가능한 소프트웨어 패키지를 사용하여 데이터 분석을 수행할 수 있다. DNA 서열 분석용으로 입수가능한 소프트웨어의 비제한적인 예로는 프리즘(PRISM™) DNA 서열결정 분석 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)사, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 시퀀서(Sequencher™) 패키지(진 코드스(Gene Codes)사, 미국 미시간주 앤 아버 소재), 및 내셔널 바이오테크날러지 인포메이션 퍼실리티(National Biotechnology Information Facility)를 통해 웹사이트 www.nbif.org/links/1.4.1.php에서 입수가능한 다양한 소프트웨어 패키지가 있다.

Claims (29)

  1. a) 하나 이상의 표시되지 않은 핵산 분자가 부착되는 고정화 표면을 함유하는 반응 챔버;
    b) 상기 반응 챔버에 결합되는 유동 경로;
    c) 상기 유동 경로 내의 액체;
    d) 상기 액체 용액 내에 자유로이 존재하는, 뉴클레오타이드 검출 지점의 하나 이상의 표시되지 않은 뉴클레오타이드; 및
    e) 액체 용액 내에서 자유로운 상기 표시되지 않은 뉴클레오타이드가 검출 장치를 지나 움직일 때 이를 검출하도록 프로그램된 검출 장치로서, 여기원 및 라만 분광 검출기를 포함하는 검출 장치
    를 포함하는 핵산서열 결정장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 여기원은 레이저인
    핵산서열 결정장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 라만 검출기는 분광계 또는 단색화 장치인
    핵산서열 결정장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    (i) 정보 처리 시스템; 및 (ii) 데이터베이스를 추가로 포함하는
    핵산서열 결정장치.
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유동 경로는 칩내에 미소모세관 또는 하나 이상의 미소채널을 포함하는
    핵산서열 결정장치.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 유동 경로의 일부는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄으로 코팅되는
    핵산서열 결정장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 유동 경로는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 메쉬를 함유하는
    핵산서열 결정장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    엑소뉴클레아제를 추가로 포함하는
    핵산서열 결정장치.
  10. a) 하나 이상의 표시되지 않은 핵산 분자가 부착되는 고정화 표면을 함유하는 반응 챔버;
    b) 상기 반응 챔버 내의 엑소뉴클레아제;
    c) 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 메쉬를 갖는 상기 반응 챔버의 일부;
    d) 액체 용액 내에 자유로이 존재하는, 뉴클레오타이드 검출 지점의 하나 이상의 표시되지 않은 뉴클레오타이드; 및
    e) 액체 용액 내에서 자유로운 상기 표시되지 않은 뉴클레오타이드가 검출 장치를 지나 움직일 때 이를 검출하는 검출 장치로서, 여기원 및 라만 분광 검출기를 포함하는 검출 장치
    를 포함하는 핵산서열 결정장치.
  11. 제 1 항에 있어서,
    용액 내의 뉴클레오타이드는 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트, 시토신 모노포스페이트, 우리딘 모노포스페이트 및 티미딘 모노포스페이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는
    핵산서열 결정장치.
  12. 제 10 항에 있어서,
    고정화 표면에 부착된 하나 이상의 핵산 분자를 추가로 포함하는
    핵산서열 결정장치.
  13. 제 1 항에 있어서,
    용액 내의 뉴클레오타이드들이 한번에 하나씩 상기 검출 장치를 지나는
    핵산서열 결정장치.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출 장치는, 강화되지 않은 라만 분광법, 공명 라만 산란법, 간섭성 안티-스토크(anti-Stoke) 라만 분광법(CARS), 자극된 라만 산란법, 역 라만 분광법, 자극된 게인 라만 분광법(stimulated gain Raman spectroscopy), 하이퍼-라만 산란법(hyper-Raman scattering), 분자 광학 레이저 검사기(MOLE), 라만 미소탐침, 라만 현미경, 공초점 라만 마이크로분광계, 3차원 또는 스캐닝 라만 분광법, 라만 포화 분광법, 시분해 공명 라만 분광법, 라만 분리 분광법 또는 자외선-라만 현미경 검사법에 의하여 표시되지 않은 뉴클레오타이드를 검출하는
    핵산서열 결정장치.
  15. 삭제
  16. 제 10 항에 있어서,
    엑소뉴클레아제를 추가로 포함하는
    핵산서열 결정장치.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출 장치는 뉴클레오타이드가 이동할 때 그 뒤를 따라 검출 장치를 이동시킬 수 있는 메커니즘을 포함하는
    핵산서열 결정장치.
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