CN1556861A - 通过分子解构的拉曼监测实施的核酸测序 - Google Patents

通过分子解构的拉曼监测实施的核酸测序 Download PDF

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Abstract

这里公开的方法、装置和组合物是用于核酸序列测定。更具体地说，该方法和装置涉及通过以下方法对单链DNA或RNA的单个分子进行测序，即将该分子暴露于外切核酸酶活性，每一次从核酸的一端移去一个自由核苷酸，然后利用拉曼光谱学或荧光共振能量转移(FRET)确定被释放的核苷酸。

Description

通过分子解构的拉曼监测实施的核酸测序
技术领域
本方法、组合物和装置涉及分子生物学和基因组学领域。更具体地，该方法、组合物和装置涉及核酸测序。
背景技术
人类基因组计划的出现要求开发出用于核酸，例如DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)测序的改善的方法。遗传信息以组织为染色体的非常长的DNA分子的形式储存。人类基因组的23对染色体含有大约30亿个碱基组成的DNA序列。该DNA序列信息决定了每个个体的多种特征，例如身高、眼睛颜色和种族。许多常见的疾病，例如癌症、纤维囊泡症、镰状细胞性贫血和肌肉萎缩症都至少部分地基于DNA序列中的变异。
人类基因组整个序列的测定已经为判定这些疾病的遗传基础提供了一个基础。然而，为了确定与每一种疾病相联系的遗传变异，仍有大量的工作需要去做。为了确定在DNA序列中促发疾病的特定变化，就要求对表现有每一种这样的疾病的个体或家族的染色体相应部分进行DNA测序。RNA是一种加工遗传信息时所需要的中间分子，在一些情况下RNA也能被测序以确定各种疾病的遗传基础。
核酸测序的已有方法基于按大小分离开的荧光标记核酸的检测，它受到了所能测定的核酸长度的限制。一般来说，一次只能测定500到1000个碱基的核酸序列。这比DNA的功能单位，即基因的长度短得多，后者可能有上万个，甚至十万个碱基长。使用目前的方法来测定一个完整基因的序列，就需要制得该基因的若干拷贝，把它们切为相互重叠的片段然后再测序，之后再把相互重叠的DNA序列组合为完整的基因序列。这个过程费力、昂贵、低效而且耗时。
附图简述
下面的附图构成了本说明书的一部分，它们被引入是为了进一步说明公开的实施方案的某些方面。通过参考这些附图中的一个或者多个，并结合在这里提出的特定实施方案的详细描述，可以更好的理解这些实施方案。
图1显示了用于DNA测序的一个典型的设备(未按比例作图)和方法，其中，被释放的核苷酸与将被测序的核酸分子在空间上是分离的。
图2显示了用于DNA测序的一个典型的设备(未按比例作图)和方法，其中，被释放的核苷酸与核酸分子在空间上不是分离的。检测器对溶液中的核苷酸进行定量。
示例性的实施方案的描述
被公开的方法、组合物和装置用于核酸的快速、自动的测序。在特定的实施方案中，本方法、组合物和装置适用于获得非常长的核酸13分子的序列，大于1000、大于2000、大于5000、大于10000、大于20000、大于50000、大于100000或者甚至有更多碱基的也可以。在各种实施方案中，这样的序列信息在一次单独的测序操作过程中使用模板核酸13，102的一个分子便可以获得。在其他实施方案中，该模板核酸分子13，102的多个拷贝可以平行或顺序地被测序，从而确证核酸的序列或获得完整的序列数据。在可选择的实施方案中，核酸分子13，102和它的互补链可以被测序以确证序列信息的精确性。与核酸测序的已有方法相比，优点包括在一次单独的测序操作中读出长核酸的序列，获得序列数据的速度更快，并且，就产生每单位的序列数据所需要的操作时间而言，测序的花费降低，效率提高。
在某些实施方案中，待测序的核酸13，102是DNA，尽管其他核酸13，102，包括RNA或合成的核酸同型物也被认为可以被测序。下面的详细描述包含了大量特定细节以提供对公开的实施方案的更全面的理解。然而，对于本领域技术人员来说，没有这些特定的细节，也能够实施这些实施方案。在其他方面，那些在本领域广为人知的装置、方法、步骤和个别的组分没有在这里详细描述。
一些实施方案如图1和图2所示，这些方法涉及单个单链核酸分子13，102的测序，这些核酸分子连接到一个反应室11，101中的一个固定化表面14，103，并且在解构(deconstruction)反应中分解。在这些实施方案中，反应室11，101含有一种或多种解构试剂15，106，它们能次序地每一次从核酸分子13，102的未连接端17，105移去一个核苷酸16，104。这些解构试剂15，106的非限定性的例子包括本领域已知的任何外切核酸酶。在一些实施方案中，当核苷酸16，104被释放进入溶液时，通过拉曼光谱被确定。
图1显示了某些实施方案。图1显示了一个用于核酸测序的装置10，该装置包含连接着一个流动通路12的一个反应室11。该反应室11包括连接到一个固定化表面14的一个核酸分子13和一种解构试剂15，如外切核酸酶。该外切核酸酶15催化各个核苷酸16从核酸分子13的自由末端17按次序地释放。当各个核苷酸16通过解构反应被释放并进入溶液时，它们沿流动通路12流动并通过一个检测单元18。该检测单元18含有一个激发源19如一个激光器，它发出激发光束20。该激发光束20和释放的核苷酸16反应，致使电子被激发到更高能态。电子返回低能态时产生的拉曼发射光谱由一个拉曼光谱检测器21如一个光度计或一个单色仪检测。
在图1显示的实施方案中，被释放的核苷酸16在接受检测单元18的检测之前与核酸分子13在空间上是分离的。空间上的分离可以通过隔离各个核苷酸16来提高拉曼检测器21的信噪比。
在图1显示的实施方案中，一个反应室11里含有一个核酸分子13。在可选择的实施例中，将每一个核酸分子13分别置于一个独立的反应室11里，可以对多个核酸分子13同时测序。在这种情况里，各个反应室11中的核酸模板13可能是相同的或者不同的。在其他可以选择的实施方案中，两个或者更多的模板核酸分子13可以放在同一个反应室11里。在这样的实施方案中，核酸分子13的序列相同。当多于一个的核酸分子13存在于反应室11中时，拉曼发射信号将代表反应室11中由所有核酸分子13同时释放的核苷酸16的平均值。熟练的技术人员能够使用已知的数据分析技术，校正在解构反应的任何给定时间获得的信号，这些信号或者落后于反应的主体(majority)，或者先于反应的主体。在某些实施方案中，技术人员可以通过一些步骤使单个反应室11中的多个核酸分子13的解构同步化，如在加入一团解构试剂15时作快速混合。
在某些可选择的实施方案中，可以将一个标记分子加入到检测单元18上游的反应室11或流动通路12。当自由核苷酸16从核酸分子13上释放时，标记分子连接到它们上面，并对其加以标记。这种释放后标记避免了在核酸分子13的核苷酸16进入溶液前被标记时会出现的问题。例如，如果掺入核酸分子13的每一个核苷酸16是在解构之前被标记，那么使用大体积荧光探针分子会产生明显的空间位阻，这将会降低测序反应的效率并增加测序用的时间。
在涉及核苷酸16的释放后标记的实施方案中，可以期望使用别的检测方法，例如荧光光谱法或发光(luminescene)光谱法。许多可以选择的溶液中自由核苷酸16的检测方法是已知的并可加以利用。对于这些方法，拉曼光谱检测单元18可以用被设计成用于检测荧光、发光或其他类型信号的检测单元18替代。
标记分子具有独特且明显可见的光学信号，这些信号能够区分每种常用核苷酸16。在某些实施方案中，该标记能够增加拉曼发射信号的强度，或者以其他方式提高拉曼检测器21检测核苷酸16的灵敏度或特异性。对于涉及拉曼光谱的实施例来说，能够使用的标记分子的非限制性例子包括TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-噁-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红和氨基吖啶。用于特定实施方案的其他标记部分可以包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。在某些实施方案中，碳纳米管也可作为拉曼标记被使用。在拉曼光谱中标记的使用在本领域是已知的(例如，美国专利号5,306,403和6,174,677)。熟练的技术人员明白，当拉曼标记结合到不同的核苷酸16时，应该能够产生可区分的拉曼光谱，或者对于每一种核苷酸16，设计不同的标记与之相连。
在某些实施方案中，核酸分子通过与一个固定化表面14相连而被固定在原位，并浸在沿一个流体通路12流动的微流体中，该流体能运送从核酸分子13上释放的核苷酸16，并使其通过一个检测单元18。在一个非限制性的实例中，微流体流动可以由经过核酸分子13并沿着一个流动通路12的溶剂体流动形成，流动通路12如一个硅、玻璃或其他芯片中的一个微毛细管或一个蚀刻通道。在作为选择的实施方案中，体介质移动很慢或者根本不移动，但是溶液中带电荷的物质(如带负电荷的核苷酸16)在外加电场作用下沿着含有一个通道或细管的一个流动通路12运动。
在其他作为选择的实施方案中，通过移动与核酸分子13相连的固定化表面14，可以使核酸分子13离开释放的核苷酸16。通过利用一个随着核酸分子13移动的检测单元18来扫描和确定释放的核苷酸16。
在上面所讨论的实施方案中，检测单元18必须能够区别从核酸分子13释放的普通核苷酸16。至少，为了测定DNA分子13序列，检测单元18必须能够区分含有腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和胸苷(T)的核苷酸16。如果对RNA 13测序，检测单元18必须能够区分含有A、G、C和尿苷(U)的核苷酸。对于每个反应室11只有一个核酸分子13的情况，没有必要要求检测单元18能够对溶液中的每种核苷酸16进行定量，因为每一次只有一个核苷酸16通过检测单元18。
在其他实施方案中，如图2所示，检测单元107有足够的灵敏度，能够确定存在于溶液中的自由核苷酸104的数目。因此，不需要将释放的核苷酸104与核酸分子102分离开。如图2所示，该装置100包含一个反应室101，该反应室101含有一个一端连接到一个固定化表面103的核酸分子102。通过一种解构试剂106如外切核酸酶的作用，从核酸分子102的未连接端105次序地移去自由核苷酸104。
如图2所示，在这些实施方案中自由核苷酸104与核酸分子102在空间上不是分开的。检测单元107含有一个能发出激发光束110的激发源108和一个检测器109。检测单元107对含有核酸分子102和自由核苷酸104的反应室101作出分析。因为检测器109能对溶液中每个核苷酸104进行定量，所以可以通过核苷酸104释放进入溶液的时间顺序确定核酸102序列。因为被扫描的体积更大，所以可能有必要使用覆盖范围更广、强度更大的激发光束110。
在这些实施方案中，由于每个核苷酸104是连续地从核酸分子102的未连接端105释放，所以可以通过溶液中该核苷酸104信号的增强来确定该核苷酸104。拉曼检测器109能独立地确定溶液中每种核苷酸104——腺苷一磷酸(AMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)和尿苷一磷酸(UMP)或胸苷一磷酸(TMP)——的分子数目，并从由核酸分子102产生的基准拉曼信号中分离出那些信号。
技术人员会明白，对DNA 13，102的分析将导致脱氧核糖核苷或脱氧核糖核苷酸16，104(包括胸苷)的释放，而对RNA 13，102的分析将导致核糖核苷或核糖核苷酸16，104(包括尿苷)的释放。尽管由外切核酸酶15，106活性造成的释放形式通常是核苷一磷酸16，104，但实施方案并不局限于检测自由核苷酸或核苷16，104的某一特定形式，而是包含了利用一种解构试剂15，106的活性从一个核酸13，102上释放出的任何单体16，104。
在进一步的实施方案中，图1和图2显示的方法和装置10，100的一些组合可以被使用。图1的方法可以使用一个低灵敏度的检测器21，但要求更复杂的分子运送程序。图2显示的方法简化了分子运送，但要求一个高灵敏度的检测器109。各种中间方法可以被使用。例如，可以使用沿着一个流体通路12的微流体流动将已检测到的核苷酸16从激发光束20照射的区域移走，而拉曼检测器21的定量功能允许在被释放的核苷酸16之间没有时间或空间分离的情况下进行检测。
在某些实施方案中，来自一个检测器21，109如分光计或单色仪阵列的数据可以传入一个信息处理系统，该系统含有一个将特定拉曼信号与特定核苷酸16，104联系起来的数据库。该信息处理系统记录下由检测器21，109检测到的信号，用数据库中已知核苷酸16，104的信号校正那些信号，并保存关于核苷酸16，104显现的一份记录，该记录表示了核酸分子13，102的序列。该信息处理系统也可实施标准的程序，如背景信号的扣除，并且，当检测到的是来自多个核苷酸16，104的有重叠的时间或空间信号时，可以使用“碱基调用(base-calling)”测定。
在一些实施方案中，核酸分子13，102可以连接到一个表面14，103，例如功能化玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、银或其他金属涂盖的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、橡胶、尼龙、硝酸纤维素、玻璃珠、磁珠或者本领域已知的能在其表面整合上氨基、羧基、硫醇、羟基或第尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应剂等功能性基团的其他任何材料。
在一些实施方案中，功能性基团可以共价连接到交联剂上，以便核酸分子13，102与解构试剂15，106之间的结合反应能够在没有位阻的情况下发生。典型的交联基团包括乙二醇寡聚物和二胺。连接可以是共价或非共价的结合。将核酸分子13，102连接到表面14，103的各种方法在本领域是已知的，并且可以加以利用。
定义
在这里所使用的“一个(‘a’或‘an’)”可以表示某个物件(item)的一个或者多于一个。
“核酸”13，102可以是DNA或RNA，可以是单链的、双链的或三链的，也可以是它们经过化学修饰的形式，尽管单链核酸13，102是优选的。事实上，可以考虑对核酸13，102作出任何修饰。在这里所使用的单链核酸13，102可以用前缀“ss”表示，双链核酸13，102可以用前缀“ds”表示，三链核酸13，102可以用前缀“ts”表示。
“核酸”13，102几乎可以是任何长度，它的碱基数可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、500000、1000000、1500000、2000000、5000000或者甚至更多，直到全长染色体DNA分子13，102。
“核苷”16，104是含有一个碱基(A、T、G、C或U)的分子，这些碱基共价连接到戊糖如脱氧核糖、核糖、或者戊糖的衍生物或同型物(analogs)。
“核苷酸”16，104是指进一步包括至少一个磷酸基团共价连接到其戊糖上的核苷。在一些实施方案中，核苷酸16，104是核糖核苷一磷酸16，104或脱氧核糖核苷一磷酸16，104，尽管在一些实施方案中，可以预料得到的是核苷二磷酸或三磷酸16，104。在其他实施方案中，核苷16，104可从核酸分子13，102上释放出来，并按下面讨论的方法检测。可以考虑对核苷酸16，104的结构作各种取代和修饰，只要它们仍然能够通过解构试剂15，106从核酸13，102上释放出来。例如，在某些实施方案中，核糖或脱氧核糖部分可以用其他的戊糖或戊糖同型物(analog)取代。在其他的实施方案中，磷酸基团可以用各种同型物取代。
核酸
将被测序的核酸分子13，102可以用本领域已知的任何技术来制备。在一些实施方案中，核酸分子13，102是自然发生的DNA或RNA分子。事实上，可以使用已公开的方法来制备和序列测定任何自然发生的核酸13，102，包括但不限于染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA，和核糖体RNA、转运RNA、不均一核RNA或信使RNA。
用于制备和分离各种形式的细胞内核酸13，102的方法是已知的。(见，例如， Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger andKimmel，Academic Press，New York，NY，1987； Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch and Maniatis，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。一般地，含有待测序的核酸13，102的细胞、组织或其他源材料首先要被匀浆化，例如在液氮中冷冻，然后在研钵里用磨棒研磨。某些组织可以用韦林氏搅切器(Waring blender)、维尔第斯匀浆器(Virtis homogenizer)、杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer)或其他匀浆器匀浆化。粗制的匀浆可以用去污剂提取，如十二烷基磺酸钠(SDS)、Triton X-100、CHAPS(3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯)、辛基葡糖苷(octylglucoside)或本领域已知的其他去污剂。可选择或者可作为补充的是，可以使用促溶剂如异硫氰酸胍或有机溶剂如苯酚进行提取。在一些实施例中，可以通过蛋白酶处理来降解细胞蛋白，例如使用蛋白酶K。颗粒污染物可以通过离心或超高速离心来去除(例如，大约5000到10000×g离心10到30分钟，或者50000到100000×g离心30到60分钟)。在低离子强度的含水缓冲液中进行透析可以除去盐或其他可溶性污染物。在-20℃加入乙醇，或者加入醋酸钠(pH6.5，约0.3M)和0.8倍体积的2-丙醇，可以将核酸13沉淀。沉淀的核酸13，102可以通过离心被收集，或者，对于沉淀下来的染色体DNA，可以将其缠绕在玻璃吸管或其它探头上。
本领域技术人员会明白，上面所列的步骤仅仅是示例性的。取决于将被测序的核酸13，102的特定类型，可以作出许多变化。例如，线粒体DNA 13，102常常是通过采用不连续梯度的氯化铯密度梯度离心来制备，而mRNA 13，102则常常是用商业来源的制备柱来制备，这些商业来源例如Promega(Madison，WI)或Clontech(Palo Alto，CA)。这些变化在本领域是已知的。
技术人员会明白，取决于所制备的模板核酸13，102的类型，可以使用各种核酸酶抑制物。例如，通过用焦碳酸二乙酯(DEPC)进行处理，可以去除储液中的核糖核酸酶(RNase)污染。商业上可获得的核酸酶抑制物可以有标准的来源，如Promega(Madison，WI)或BRL(Gaithersburg，MD)。纯化的核酸13，102可以溶解在含水缓冲液中，如TE(Tris-EDTA)(乙二胺四乙酸)，然后在使用前贮存在-20℃或液氮中。
如果要被测序的是单链DNA(ssDNA)13，102，可以按标准方法由双链DNA(dsDNA)制备ssDNA 13，102。最简单的是，加热dsDNA至它的退火温度(在该温度，dsDNA自发分离为ssDNA 13，102)以上。典型的条件可能涉及在92到95℃加热5分钟或更长时间。用于确定分离dsDNA的条件的公式，例如基于GC含量和分子长度的公式，在本领域是已知的。作为选择，单链DNA 13，102可以用本领域已知的标准扩增技术由双链DNA制得，即使用仅结合双链DNA的一条链的引物。制备单链DNA 13，102的其他方法在本领域是已知的，例如将待测序的双链核酸插入复制态的噬菌体如M13中，然后让噬菌体产生核酸13，102的单链拷贝。
尽管某些实施方案涉及自然发生的核酸13，102的制备，而事实上，能够用作外切核酸酶或其他解构试剂15，106的底物的任何类型核酸13，102都可以被测序。例如，用各种扩增技术如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增制得的核酸13，102可以被测序。(见美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159。)作为选择，待测序的核酸13，102可以用标准载体克隆，标准载体如质粒、粘粒、BACs(细菌人工染色体)或YACs(酵母人工染色体)。(见，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook et al.，1989。)核酸插入物13，102可以从载体DNA中分离，例如，用合适的限制性内切核酸酶切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色。将具有所需大小的核酸13，102片段从胶中取出，例如，使用低熔点琼脂糖，或从胶块中电洗脱。插入核酸13，102的分离方法在本领域是已知的。
单个核酸分子的分离
在某些实施方案中，待测序的核酸分子13，102是ssDNA或ssRNA的单个分子。为了收集和操作单个ssDNA或ssRNA分子13，102，可以使用各种方法，如流体动力学聚焦(hydrodynamic focusing)、微操纵器偶联(micro-manipulator coupling)、光捕获、或这些方法的组合和类似的方法。(见，例如，Goodwin et al.，1996，Acc.Chem.Res.29：607-619；美国专利号4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068。)
在某些实施方案中，可以应用微流体学或超微流体学来分选和分离模板核酸13，102。可以运用流体动力学来操纵核酸13，102的运动，使其进入一个微通道、微毛细管或微孔。在一个实施方案中，可以使用液体动力来移动核酸分子13，102通过一个梳状结构，从而分离出单个核酸分子13，102。一旦核酸分子13，102被分离开，就可以使用流力聚焦将这些分子13，102定位在反应室11，101内。热学或电学上的势差、一定的压力或真空也都可用来提供操作核酸13，102所需的驱动力。在典型的实施方案中，为了测序而对模板核酸13，102进行的操作可能涉及到使用一种砌块(channel block)设计，它整合了微构造的通道和一体化的胶质材料。这个设计公开在美国专利号5,867,266和6,214,246。
在另一个实施方案中，含有核酸分子13，102的样品可以在偶联到一个固定化表面14，103之前被稀释。在典型的实施方案中，固定化表面14，103可能是磁性或非磁性微珠(beads)的形式，或是其他离散的结构单元。经过适当的稀释，每个微珠14，103具有结合零个或一个核酸分子13，102的统计概率。连接有一个核酸分子13，102的微珠14，103可以用例如荧光染料和流式细胞仪筛选或磁性筛选的方法来判定。取决于微珠14，103和核酸13，102的相对大小和均一性，可能使用一个磁过滤器和质量分离法来分离含有一个结合核酸分子13，102的微珠14，103。在其他实施方案中，连接到单个微珠或其他固定化表面14，103的多个核酸13，102可以被测序。
在可选择的实施方案中，可以使用一个有涂层的光纤末梢(coatedfiber tip)14，103来获得用于测序的单个核酸分子13(例如，美国专利号6,225,068)。在其他可选择的实施方案中，可以制备含有抗生物素蛋白或其他交联剂的单个分子的固定化表面14，103。这样的表面14，103能够连接将被测序的生物素化核酸的单个分子13，102。这个实施方案不限于抗生物素蛋白-生物素结合体系，而适用于本领域已知的任何偶联体系。
在其他可选择的实施方案中，可以使用光捕获来操纵用于测序的核酸的单个分子13，102。(例如，美国专利号5,776,674)。典型的光捕获系统可以在商业上从Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+LGmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)获得。
固定化的方法
在各种实施方案中，待测序的核酸分子13，102可以连接(或固定)到一固体表面14，103。核酸分子13，102的固定化可以用各种方法来实现，这些方法涉及核酸分子13，102和表面14，103之间的非共价或共价连接。在一个典型的实施方案中，固定化可以通过这样的方法完成，即用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆一个表面14，103，接着进行生物素化核酸13，102的连接(Holmstrom et al.，Anal.Biochem.209：278-283，1993)。固定化亦可这样实现，即用聚L-Lys(赖氨酸)或聚L-Lys，Phe(苯丙氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面14，103，接着用双功能交联剂共价连接氨基或巯基修饰的核酸13，102(Running et al.，Bio Techniques 8：276-277，1990；Newton et al.，Nucleic Acids Res.21：1155-62，1993)。可以通过使用氨基硅烷将胺基引入到表面14，103上以供交联使用。
可以将5’-磷酸化核酸13，102直接共价连接到化学修饰的表面14，103，从而实现固定化(Rasmussen et al.，Anal.Biochem.198：138-142，1991)。核酸13，102与表面14，103之间的共价键通过与水溶性碳二亚胺的缩合而形成。这种方法方便了核酸13，102通过其5’-磷酸基团进行有效的5’-连接。
要将DNA 13，102结合到玻璃上，通常要先对玻璃表面14，103进行硅烷化，然后用碳二亚胺或戊二醛活化。在作为选择的步骤中可以使用的试剂例如3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA 13，102通过整合到其3’或5’端的氨基接头(linkers)来联接。通过紫外辐射可以将DNA 13，102直接结合到膜表面14，103。核酸13，102固定化技术的其他非限制性实例公开在美国专利号5,610,287，5,776,674和6,225,068。
可用于核酸13，102的固定化的表面14，103类型是不受限的。在各种实施方案中，固定化表面14，103可以是磁性珠、非磁性珠、一个平表面、一个点状表面，或其他包含几乎任何材料的任何形状的固体表面，只要该材料是足够持久耐用的，并且是惰性的，能够允许核酸13，102的测序反应发生。可以使用的表面14，103的非限制性的例子包括玻璃、硅土、硅酸盐、聚二甲基硅烷(PDMS)、银或其他金属包覆的表面、硝酸纤维素、尼龙、活化的石英、活化的玻璃、聚二氟偏二乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、其他聚合物如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或聚二甲基硅氧烷和光敏聚合物，光敏聚合物含有光反应物质如氮宾、卡宾和能与核酸分子13，102形成共价连接的羰自由基(见美国专利号5,405,766和5,986,076)。
双功能交联剂可以在各种实施方案中被使用，例如连接核酸分子13，102到一个表面14，103。可以根据双功能交联剂的功能基团的特异性将它们划分，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特异性基团。其中，针对自由氨基的试剂更受欢迎，因为它们在商业上可以获得、合成简便，而且能够在温和的反应条件下应用它们。用于交联分子的典型方法公开在美国专利号5,603,872和5,401,511。交联剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
解构试剂
测序反应涉及到将解构试剂15，106结合到核酸分子13，102的自由端17，105，每一次移去一个核苷酸16，104。在某些实施方案中，反应可由酶来催化，如外切核酸酶15，106。实施方案并不限制可以使用的外切核酸酶15，106的类型。可能用到的外切核酸酶15，106的非限制性的例子包括E.coli外切核酸酶I、III、V或VII，Bal 31外切核酸酶、绿豆外切核酸酶、S1核酸酶、E.coli DNA聚合酶I全酶或Klenow片段酶、RecJ、外切核酸酶T、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶、外切核酸酶T7基因6、蛇毒磷酸二酯酶、脾磷酸二酯酶、海滨热球菌(Thermococcus litoralis)DNA聚合酶、热球菌属(Pyrococcus sp.)GB-D DNA聚合酶、λ(lambda)外切核酸酶、S.aureus微球(micrococcal)核酸酶、脱氧核糖核酸酶(DNase)I、核糖核酸酶A、T1微球核酸酶或本领域已知的其他外切核酸酶。外切核酸酶15，106可以由商业来源获得，如New England Biolabs(Beverly，MA)、Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、Sigma Chemicals(St.Louis，MO)或Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。
技术人员会明白，具有外切核酸酶15，106活性的酶有各种各样的性质，例如，它们能从核酸分子13，102的5’端、3’端或任意一端移去核苷酸16，104。它们可能对RNA、DNA或两者具有特异性。它们的活性可能依赖于单链或双链核酸13，102的使用。它们会不同程度的受到反应介质的各种因素(如盐、温度、pH或二价阳离子)的影响。各种外切核酸酶和聚合酶15，106的这些及其他的性质在本领域是已知的。
技术人员会明白，可以操纵外切核酸酶15，106的活力，以与检测单元18，107对核苷酸16，104的最佳分析速率相吻合。用于调整外切核酸酶15，106的活力的各种方法是已知的，包括调整反应室11，101中的温度、压力、pH、盐浓度或二价阳离子浓度。优化外切核酸酶15，106的活性的方法在本领域是已知的。
标记
某些实施方案可以涉及将一标记整合进入核苷酸前体17，以方便检测单元12对它们的测定。可以使用许多的不同标记，如拉曼标记、荧光团、生色团、放射性同位素、酶标记、抗体、化学发光剂、电发光剂、亲和标记，等等。本领域技术人员会承认，这些标记及其他这里未提到的标记成分可以在该公开方法中使用。
在涉及拉曼光谱的实施方案中使用的标记如上所述。在其他实施方案中，可以使用的标记体可以是荧光团，如Alexa 350、Alexa 430、AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)、BODIPY(5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene-3-丙酸)630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL(荧光素)、BODIPY-R6G(6-羧基若丹明)、BODIPY-TMR(四甲基若丹明)、BODIPY-TRX(德克萨斯红-X)、瀑布蓝(CascadeBlue)、Cy2(青色素)、Cy3、Cy5，6-FAM(5-羧基荧光素)、荧光素、6-JOE(2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素)、俄勒冈绿(OregonGreen)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、若丹明绿、若丹明红、ROX(6-羧基-X-若丹明)、TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明)、四甲基若丹明和德克萨斯红。荧光或发光标记可以由标准的商业来源获得，例如Molecular Probes(Eugene，OR)。
反应室
反应室11，101被设计用来盛放水溶液中的固定化表面14，103、核酸分子13，102、解构试剂15，106和核苷酸16，104。在一些实施方案中，反应室11，101被设计成可控温的，例如整合进帕尔帖元件(Pelletierelements)或使用本领域已知的其他方法。用于控制小体积液体温度的方法属于已知技术。(见，例如，美国专利号5,038,853，5,919,622，6,054,263和6,180,372。)
在某些实施方案中，反应室11，101和任何与之联系的液体通道都可以用批制造工艺来制造，如同在计算机芯片制造或微毛细管芯片制造领域中已知的情况。上述液体通道如流动通路12或通道，它们可提供与一个废物口、一个核酸13，102加载口或一个解构试剂15，106来源的连接。在一些实施方案中，反应室11，101和该装置10，100的其他组分如流动通路12可以制造为一个集成芯片。这样的芯片可以用本领域已知的方法制造，如使用光平板印刷和蚀刻。然而，制造方法是不受限的，本领域已知的其他方法可以被使用，如激光切割、注塑、浇铸或印刷技术。对于某些实施方案，可以使用用于超微电机械系统制造的方法。(见，例如，Craighead，Science 290：1532-36，2000.)微细加工芯片可以在商业上获得，来源如Caliper Technologies Inc.(MountainView，CA)和ACLARA BioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在一个非限制性的实施方案中，可将Borofloat玻璃片(PrecisionGlass & Opitics，Santa Ana，CA)在浓HF(氢氟酸)中预蚀刻一小段时间，然后在等离子体增强化学气相淀积(PECVD)系统(PEII-A，TechnicsWest，San Jose，CA)中一无定形硅牺牲层沉积之前清洗。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用感光性树脂(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤软化。可以使用接触掩模对准器(QuintelCorp.San Jose，CA)将感光性树脂层曝光于一种或多种掩模图案，然后将曝光的感光性树脂用Microposit developer concentrate(Shipley)和水除去。开发出来的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反应器中用CF4(四氟甲烷)除去曝光的无定形硅。可以用浓HF对晶片进行化学蚀刻以制造出反应室11，101、流动通路12和任何通道。剩余的感光树脂可被剥去，无定形硅也可除去。
可以用金刚石打孔钻头(Crystalite，Westerville，OH)在蚀刻的晶片上钻打出接入孔洞。在一个可编程的真空炉(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，将蚀刻和钻孔的平板热键到同样尺寸的平晶片上，便可得到一个完成了的芯片。在某些实施方案中，芯片可以通过将两块蚀刻平板结合在一起而制得。整合有一个反应室11，101和流动通路12的芯片的可以选择的典型加工方法公开在美国专利号5,867,266和6,214,246。
为了便于检测单元18，107对核苷酸16，104进行检测，反应室11，101和/或流动通路12的材料对于检测单元18，107使用的激发和发射频率处的电磁辐射而言，可以是可透过的。玻璃、硅以及在被拉曼光谱、荧光光谱、发光光谱或其他形式的光谱使用的频率范围内通常是具有可透性的其他任何材料都可以被使用。在一些实施方案中，与检测单元18，107相背的反应室11，101和/或流动通路12表面可以用银、金、铂、铜、铝或对于检测单元18，107相对不透光的其他材料覆盖。在那种情况下，不透光材料可以用来增强拉曼或其他信号，例如使用表面增强拉曼光谱，而且不会干扰检测单元18，107的功能。可选择的是，包含有银、金、铂、铜或铝的网格可以放置在反应室11，101和/或流动通路12内。技术人员会意识到，在涉及流动通路12的实施方案中，核苷酸16通常是在它们处于流动通路12中时被检测。在没有流动通路12的实施方案中，核苷酸104是在反应室101中被检测。
在各种实施方案中，反应室11，101的内部体积可以是约1皮升、约2皮升、约5皮升、约10皮升、约20皮升、约50皮升、约100皮升、约250皮升、约500皮升、约1纳升、约2纳升、约5纳升、约10纳升、约20纳升、约50纳升、约100纳升、约250纳升、约500纳升、约1微升、约2微升、约5微升、约10微升、约20微升、约50微升、约100微升、约250微升、约500微升或约1毫升。
流动通路
在某些实施方案中，自由核苷酸16沿着一个流动通路12移动并通过检测单元18。用于运送自由核苷酸16的技术的非限制性实例包括微流体技术。流动通路12可包含一个微毛细管(例如，从ACLARABioSciences Inc.，Mountain View，CA获得)或一个液相集成电路(例如，Caliper Technologies Inc.，Mountain View，CA)。这样的微流体平台只需要几纳升的样品。
在某些实施方案中，将被检测的自由核苷酸16通过溶剂的整体流动沿着流动通路12运动。在其他实施方案中，可以使用微毛细管电泳运送自由核苷酸16，使它们沿着流动通路12运动并通过检测单元18。微毛细管电泳通常涉及使用很细的毛细管或通道，其中可以充有或不充有特定的分离介质。带有适当电荷的物质可以在施加的电场作用下发生电泳，例如当装置的反应室11一侧和检测单元18一侧分别加上负电和正电时，带负电的核苷酸16便会发生电泳。尽管电泳常常是用来对同时加到微毛细管中的混合组分进行大小分离，但是它也可以用来运送先后加入到流动通路12的大小类似的核苷酸16。因为嘌呤核苷酸(A、G)16比嘧啶核苷酸(C、T、U)16大，所以前者迁移得更慢，这样的话，流动通路12的长度和对应的通过检测单元18的时间应该尽量小，以防止有差异的迁移将核酸13上核苷酸16的释放次序混淆起来。作为选择，可以对填充在微毛细管中的分离介质进行选择，由此使嘌呤和嘧啶核苷酸16以相近或相同的迁移速率沿着流动通路12运动。微毛细管电泳方法已经被公开，例如Woolley and Mathies(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11348-352，1994)。
包括微毛细管电泳器件在内的微流体器件的微加工已经被讨论，例如，Jacobsen等(Anal.Biochem，209：278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.66：2949-2953，1994)；Harrison等(Science261：895-897，1993)和美国专利号5,904,824。典型地，这些方法包括在石英、硅或其他晶体衬底或基片上用照相平版印刷法蚀刻出微米级通道，这些方法很具有适用性。在一些实施方案中，微毛细管可以用制造反应室11，101时所用的同种聚合材料来加工，其中使用注塑或本领域已知的其他技术。
检测单元
涉及拉曼光谱的实施方案
在一些实施方案中，检测单元18，107被设计成利用拉曼光谱学对核苷酸16，104进行检测和定量。利用拉曼光谱学检测核苷酸16，104的各种方法在本领域是已知的。(见，例如，美国专利号5,306,403；6,002,471；6,174,677)。关于表面增强拉曼光谱(SERS)或表面增强共振拉曼光谱(SERRS)的变化已经公开。在SERS和SERRS中，对于吸附在粗糙金属表面如银、金、铂、铜或铝表面上的分子，拉曼检测的灵敏度可提高106或更多倍数。
拉曼检测单元18，107的一个非限制性的实施方案公开在美国专利号6,002,471。在这个实施方案中，激发光束20，110由钕:钇铝石榴石(Nd:YAG)激光器19，108产生，波长为532nm；或者由钛:蓝宝石(Ti:sapphire)激光器19，108产生，波长为365nm。可以使用脉冲激光束20，110或连续激光束20，110。激发光束20，110经过共聚焦光学元件和显微物镜，然后聚焦在流动通路12或反应室101上。来自核苷酸16，104的拉曼发射光由显微物镜和共聚焦光学元件收集，然后偶联到单色仪上进行光谱分离。共聚焦光学元件用作降低背景信号，包括双色滤片、二次滤片、共聚焦孔、透镜和平面镜。标准的全视场光学元件可以同共聚焦光学元件一起使用。拉曼发射信号由拉曼检测器21，109检测。该检测器21，109包括与一台用于信号计数和数字化的计算机相连接的雪崩光电二极管。在某些实施方案中，在流动通路12或反应室101中放置了包含有银、金、铂、铜或铝的网格，这样便会因表面增强拉曼或表面增强拉曼共振而得到增强的信号。
已公开的可供选择的检测单元18，107的实施方案如美国专利号5,306,403，其中包括了Spex Model 1403双栅分光光度计21，109，并配有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries ModelC3103402)，它以单光子计数模式运作。激发源19，108是来自SpectraPhysics的514.5nm线氩离子激光器19，108，Model 166，和氪离子激光器19，108(Innova 70，Coherent)的647.1nm线。
作为选择的激发源19，108包括337nm的氮激光器19，108(LaserScience Inc.)和325nm的氦-镉激光器19，108(Liconox)(美国专利号6,174,677)。激发光束20，110经过带通滤波器(Corion)处理成为单色光，然后该光束可以用6×接物透镜(Newport，Model L6×)聚焦到流动通路12或反应室101上。可以用接物透镜来激发核苷酸16，104和收集拉曼信号，其中使用到全息光束分离器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)，以对激发光束20，110和发射的拉曼信号进行直角解析。可以使用全息阶式滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)来减少瑞利散射。作为选择的拉曼检测器21，109包括ISA HR-320光谱摄制仪，配有红增强放大电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。可以使用其他类型的检测器21，109，如电荷注入元件、光电二极管阵列或光电晶体管阵列。
本领域已知的任何具有适当形式或结构的拉曼光谱或相关技术都可以用来检测核苷酸16，104，包括但不限于常规拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)、受激拉曼散射、反拉曼光谱、受激获得拉曼光谱、超拉曼散射、分子光学激光检测器(MOLE)或拉曼显微探针或拉曼显微镜或共聚焦拉曼微光谱测定法、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱学、时间分辨共振拉曼、拉曼退耦光谱学或紫外-拉曼显微镜。
涉及FRET的实施方案
在某些作为选择的实施例中，核苷酸16，104可以用荧光共振能量转移(FRET)来确定和定量。FRET是一种可用来检测检测一个供体分子(donor molecule)和一个受体分子(acceptor molecule)之间距离的光谱学现象。所选择的供体和受体对应该满足供体的荧光发射与受体的激发光谱有重叠。在两个分子结合在一起时(距离少于100埃)，供体的激发态能量非辐射地转移给受体，同时供体的发射淬灭。假如受体分子是一个荧光团，那么它的发射会增强。用于关于寡聚核苷酸的FRET的组合物和方法在本领域是已知的(例如，美国专利号5,866,366)。
常被用作FRET的标记的分子包括荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、若丹明、6-羧基若丹明(R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、4-(4’-二甲基氨基苯氮)安息香酸(DABCYL)和5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酰酸(EDANS)。其他可能的FRET供体和受体分子在本领域是已知的(见美国专利号5,866,336，表1)。技术人员能熟悉地选择用于FRET的成对标记分子(美国专利号5,866,336)。
在涉及FRET的实施方案中，供体和受体分子可以共价或非共价地连接到测序装置10，100的各种组分上。在某些实施方案中，供体和受体分子可以连接到核苷酸16，104、外切核酸酶15，106或流动通路12。
在一些实施方案中，供体分子可以连接到外切核酸酶15，106或流动通路12的表面，而受体分子连接到核苷酸16，104上。在这种情况下，每种核苷酸16，104应该连接到具有可区分的发射光谱的一种受体分子上，而选择的供体分子应该具有宽范围的发射光谱，该光谱范围能够覆盖所有四种受体分子的激发光谱。在外切核酸酶15，106或流动通路12上可以存在多个供体分子，尽管在其他实施例中可以只有一个供体分子。
一受到激发，供体分子将把它们的能量转移给连接在核苷酸16，104上的受体标记分子，并由此得到来自受体分子的增强的发射信号。因为信号增强的程度会随距离增大迅速降低，所以对于距离供体分子非常近的核苷酸16，204，会有最大的信号增强出现。如果一个供体分子连接到外切核酸酶15，106的催化位点，或靠近催化位点，那么具有最强发射信号的核苷酸16，104将是那些位于外切核酸酶15，106的催化位点的核苷酸16，104。供体分子的连接位置应该靠近催化位点，但是在这个位置它不能干扰解构试剂15，106的外切核酸酶活性。在某些实施方案中，供体分子连接到流动通路12的表面，并且连接位置是激发光束20的聚焦处，这样，只有那些位于激发光束20的焦点内的核苷酸16能够给出可检测的荧光信号。可以选择激发光束20，110的波长来最大程度的激发供体分子，而较弱地激发受体分子。当每个核苷酸16，104从核酸分子13，102上移去时，就可检测到来自供体标记的信号。
在某些实施方案中，可以使用本领域已知的方法将待测序的核酸分子13，102放置在一个荧光显微镜的视场内，例如通过使用光捕获(例如，美国专利号6,136,543)。可以使用的荧光显微镜的非限制性的例子是反式相衬和入射光荧光显微镜(IMT2-RFC，Olympus Co.，Ltd.)，其中使用了100倍油镜(Plan.Multidot.Apochromat.Times.100，1.40 NA，Olympus Co.，Ltd.)。如上所述，激发光束20，110可由激光器19，108发出。荧光发射可以通过接物透镜并使用合适的滤片来收集，然后由灵敏的荧光检测器21，109检测，例如CCD器件、光电二极管、光电倍增管或等效物。
信息处理和控制系统及数据分析
在某些实施方案中，核酸测序装置10，100可以包含一个信息处理系统。实施方案并不限制所使用的信息处理系统的类型。一个典型的信息处理系统可以整合一台含有用于信息交流的总线的计算机和一个用于信息处理的处理器。在一个实施方案中，处理器可以选自Pentium系列处理器，包括但不局限于Pentium II系列、Pentium III系列和Pentium 4系列处理器，它们可以Intel Corp.(Santa Clara，CA)获得。在作为选择的实施方案中，处理器可以是Celeron、Itanium或Pentium Xeon 处理器(Santa Clara，CA)。在各种其他实施例中，处理器可以基于Intel 结构，如Intel IA-32或Intel IA-64结构。作为选择，可以使用其他处理器。
该计算机可以进一步包含一个随机存储器(RAM)或其他动态存储器件、一个只读存储器(ROM)和/或其他静态存储器，以及一个数据存储器件如磁盘或光盘和它们对应的驱动。该信息处理和控制系统也可包含本领域已知的其他外围设备，如一个显示器(如阴极射线管或液晶显示器)、一个文字输入设备(如键盘)、一个光标控制设备(如鼠标、跟踪球或光标方向键)和一个通讯设备(如调制解调器、网络接口卡或用于连接以太网、令牌网或其他类型网络的接口设备)。
在特定的实施方案中，检测单元18，107在操作上也可与信息处理系统连接。来自检测单元18，107的数据可由处理器处理，然后数据储存在主存储器。关于标准核苷酸16，104的发射剖图的数据也可储存在主存储器或ROM中。处理器可以比较反应室101或流动通路12中核苷酸16，104的发射光谱，以确定从核酸分子13，102上释放的核苷酸16，104的类型。主存储器也可以储存从核酸分子13，102上释放的核苷酸16，104的顺序。处理器可以分析这些来自检测单元18，107的数据，以确定核酸13，102的序列。可以考虑在某些实施过程中使用一个不同配置的信息处理系统。所以，在不同的实施方案中系统的结构可以不同。
应该注意到，在作为选择的实施方案中，当这里所述的处理过程在一个程序控制的处理器的控制下进行时，该处理可以完全或部分的由可编程或硬编码逻辑来实施，例如现场可编程门阵列(FPGAs)、TTL逻辑或专用集成电路(ASICs)。另外，可以通过程序控制的通用计算机组分和/或客户硬件组分的任意组合来实施被公开的方法。
在数据收集操作之后，数据通常会被报告给一个数据分析操作。为了方便分析操作，由检测单元18，109获得的数据通常是使用一台数字计算机来分析，如上所述。典型地，计算机被恰当地编程以接受和存储由检测单元18，109获得的数据，以及分析和报告收集到的数据。
在某些实施方案中，可以使用客户定制软件包来分析由检测单元18，109获得的数据。在作为选择的实施方案中，可以使用信息处理系统及可公开利用的软件包来实施数据分析。可用于DNA序列分析的软件的非限制性的例子包括PRISMTM DNA测序分析软件(AppliedBiosystems，Foster City，CA)、SequencherTM软件包(Gene Codes，AnnArbor，MI)和通过国家生物技术信息机构获得的各种软件包，网址为www.nbif.org/links/1.4.1.php。

Claims (28)

1.一种装置，包括：
a)含有固定化表面的反应室，该固定化表面连接着单个核酸分子；
b)与反应室相连的流动通路；和
c)检测单元，含括激发源和拉曼光谱检测器。
2.权利要求1的装置，其中激发源是激光器。
3.权利要求1的装置，其中拉曼检测器是分光计或单色仪。
4.权利要求1的装置，进一步包括：(i)信息处理系统；和(ii)数据库。
5.权利要求1的装置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圆锥形表面、平表面或曲表面。
6.权利要求1的装置，其中流动通路包括微毛细管或芯片中的一个或多个微通道。
7.权利要求1的装置，其中流动通路的一部分被银、金、铂、铜或铝包覆。
8.权利要求1的装置，其中流动通路含有银、金、铂、铜或铝网格。
9.权利要求1的装置，进一步包括解构试剂。
10.一种装置，包括：
a)含有固定化表面的反应室，该固定化表面连接着单个核酸分子；和
b)检测单元，包括激发源和拉曼光谱检测器。
11.权利要求10的装置，进一步包括：(i)信息处理系统；和(ii)数据库。
12.权利要求10的装置，其中激发源是激光器。
13.权利要求10的装置，其中拉曼检测器是分光计或单色仪。
14.权利要求10的装置，其中固定化表面是磁珠、非磁性珠、圆锥形表面、平表面或曲表面。
15.权利要求10的装置，反应室中进一步含有银、金、铂、铜或铝网格。
16.权利要求10的装置，进一步包括解构试剂。
17.一种测定核酸序列的方法，包括：
a)制备单个模板分子，在反应室中该核酸分子的一端连接到固定化表面；
b)从核酸分子的未连接端按顺序地移去核苷酸；
c)将核苷酸与核酸分子分离开；和
d)利用拉曼光谱学检测核苷酸。
18.权利要求17的方法，其中利用外切核酸酶活性从核酸分子的未连接端移去核苷酸。
19.权利要求17的方法，其中在核苷酸从核酸分子上移走之后，每个核苷酸被连接上一个标记分子。
20.权利要求17的方法，其中利用表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激获得拉曼光谱学、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射来检测核苷酸。
21.一种测定核酸序列的方法，包括：
a)制备单个模板分子，在反应室中该核酸分子的一端连接到固定化表面；
b)从核酸分子的未连接端按顺序地移去核苷酸；
c)利用拉曼光谱学对反应室中的核苷酸进行定量。
22.权利要求21的方法，其中利用外切核酸酶活性从核酸分子的未连接端移去核苷酸。
23.权利要求21的方法，其中在核苷酸从核酸分子上移走之后，每个核苷酸被连接上一个标记分子。
24.权利要求21的方法，其中利用表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、受激拉曼散射、反拉曼、受激获得拉曼光谱学、超拉曼散射或相干反斯托克斯拉曼散射来检测核苷酸。
25.一种测定核酸序列的方法，包括：
a)制备单个模板分子，在反应室中该核酸分子的一端连接到固定化表面；
b)从核酸分子的未连接端按顺序地移去核苷酸；和
c)利用荧光共振能量转移(FRET)光谱学检测核苷酸。
26.权利要求25的方法，其中在核苷酸从核酸分子上移走之后，这些核苷酸被连接到受体分子上。
27.权利要求26的方法，其中利用外切核酸酶移去这些核苷酸。
28.权利要求27的方法，其中一个或多个供体分子连接到外切核酸酶上。
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