JP2008512084A - 核酸の配列決定のための方法およびデバイス - Google Patents
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Abstract
本発明の方法は、核酸の配列決定方法およびそのためのデバイス類を含む。本発明は広くは標的核酸の配列決定用の基材の調製に関する。本発明は、結着した分子の検出用の表面、および本発明の表面化学現象を用いる分子検出方法を提供する。本発明によると、バックグランドが低減し同時に信号が増大するように担体を処理することによって固体担体表面での分子信号の検出強化が達成される。本発明は、表面上での信号検出を改善させる、表面の調製戦略、分子の結着戦略、および洗浄戦略を提供する。
Description
(関連出願の参照)
この非仮特許出願は、2004年5月25日に出願された米国仮特許出願第60/574,389号の利益および優先権を主張する。この出願の全体は本明細書により参考として援用される。
この非仮特許出願は、2004年5月25日に出願された米国仮特許出願第60/574,389号の利益および優先権を主張する。この出願の全体は本明細書により参考として援用される。
(技術分野)
本発明は、核酸の配列決定方法およびそのためのデバイス類に関し、さらに特に標的核酸のハイスループットの単分子配列決定用の表面の調製方法およびそのためのデバイス類に関する。本発明による表面は、分子の非特異的な結合が最小限になるように処理されたものである。
本発明は、核酸の配列決定方法およびそのためのデバイス類に関し、さらに特に標的核酸のハイスループットの単分子配列決定用の表面の調製方法およびそのためのデバイス類に関する。本発明による表面は、分子の非特異的な結合が最小限になるように処理されたものである。
(発明の背景)
ヒトゲノム解析が完成し、生物学的な構造および機能の重要な洞察が容易になってきた。ヒトゲノムの知識は、生物学的機能および機能不全における差異に基づき、個人の違い並びに個人内での違いを探査するもととなってきた。例を挙げれば、個人間の一塩基の違いは一塩基多型(SNP)と呼ばれるが、著しい表現型の差の主因になっている。それらの差は、表現型の外見的な発現となり得るか、あるいは個人が将来特定の疾患になるという可能性または治療に対する各人の反応の仕方に関係し得るものである。さらにごく僅かなゲノムの変化は、癌のような遺伝子疾患の顕在化の原因を担うことが示されている。正常または異常な機能の複雑さを真に理解するには、多数の特異的な配列情報が必要になるであろう。
ヒトゲノム解析が完成し、生物学的な構造および機能の重要な洞察が容易になってきた。ヒトゲノムの知識は、生物学的機能および機能不全における差異に基づき、個人の違い並びに個人内での違いを探査するもととなってきた。例を挙げれば、個人間の一塩基の違いは一塩基多型(SNP)と呼ばれるが、著しい表現型の差の主因になっている。それらの差は、表現型の外見的な発現となり得るか、あるいは個人が将来特定の疾患になるという可能性または治療に対する各人の反応の仕方に関係し得るものである。さらにごく僅かなゲノムの変化は、癌のような遺伝子疾患の顕在化の原因を担うことが示されている。正常または異常な機能の複雑さを真に理解するには、多数の特異的な配列情報が必要になるであろう。
癌を理解するには、ゲノム配列の複雑さを解き明かすことも必要である。癌は、異質なゲノム不安定状態に端を発する疾患である。大抵の癌は、細胞の小集団において生じる、一連のゲノムの変化(ほんの僅かなものもあれば、それなりに深刻なものもある)から発症する。癌を誘発する配列変異に関する知見は、その疾患の病因を理解することにつながり、さらにその治療および予防の方法にもつながる。ゲノムの複雑さを理解する本質的な第一歩は、分解能が高い配列決定の実現する能力である。
核酸の配列決定には種々のアプローチが存在する。大量の配列決定を行なう一般的な方法の一つとして、鎖長反応停止およびゲル分離によるものがあり、実質的には非特許文献1に記載されている。この方法は、一つの配列中の各種塩基において停止を表す核酸フラグメントの混合集団を生成させることに基づくものである。それらのフラグメントについては、つづいてゲル電気泳動を行ない、そのゲル内のフラグメントの順番で配列が明らかになる。大量配列決定を行なうそれ以外の一般的な方法には、核酸フラグメントの化学的な分解に基づくものがある。それについては非特許文献2を参照のこと。最後に、ハイブリダイゼーションによる配列決定に基づく方法もようやく開発されている。それについては例えば、非特許文献3を参照のこと。
一般的なヌクレオチド配列決定は、大量処理技術で行なわれる。しかしながら大量配列決定技法は、個々のヌクレオチドに関する有用情報を得るプロセスを複雑にするクローニング、増幅および電気泳動の工程が多くあるために、僅かまたはまれなヌクレオチド変化の同定には役立たない。そのため研究は、単分子配列決定技術のような迅速な配列決定方法に向かって進化してきた。個々の患者から得られた単分子の配列決定およびその情報を得る能力は、ケノムの配列決定の次の起点となる。しかしながら、単分子配列決定による重要疾患の有効な診断および治療技術は、低コストのツールおよび個別の分子をスクリーニングする方法がないために妨げられている。
単分子測定に基づく新規の配列決定テクノロジーの開発提案がこれまでに多数出されており、一般的には、特定の蛋白質とDNAとの相互作用を観察することによるか、または超高解像度で走査されるプローブ顕微検査を使用することによるかのいずれかである。それらについては例えば、非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7;および非特許文献8を参照のこと。それらの読取りスピードおよび読取り長は、通常の配列決定テクノロジーとは異なり、電気泳動による分離の分解能によっては、そもそも限定を受けるものではない。単分子配列決定のために提案されたその他の方法としては、合成による配列決定を組込んだヌクレオチド個別検出が含まれる。
複数の基材表面での単分子技法については、大量処理技法よりも理論上、確かにいくつかの利点を有するが、単分子の関連で信号検出の識別を困難にする不適当な表面から生じる高いバックグランド信号のため、その実施には問題があった。核酸の検出に適した表面は、一般的な配列決定および特に単分子配列決定において、重要な課題である。通常の表面のほとんどに見られる主要な障害とは、深刻なバックグランド放射の影響を受けやすい点である。例えば、配列決定に蛍光検出を用いる場合、そのバックグランド放射の問題はなおいっそう明敏になる。
SangerらのProc.Natl.Acad.Sci.,(1977)74(12):5463−5467 MaxamらのProc.Natl.Acad.Sci.,(1977)74:560−564 DrmanacらのNature Biotech.,(1998)16:54−58 Riglerらの"DNA−Sequencing at the Single Molecule Level",Journal of Biotechnology,(2001)86(3):161 Goodwin,P.M.らの"Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing",Nucleosides & Nucleotides,(1997)16(5−6):543−550 Howorka,S.らの"Sequence−Specific Detection of Indivisual DNA Strand using Engineered Nanopores",Nature Biotechnology,(2001)19(7):636−639 Meller,A.らの"Rapid Nanopore Discrimination Between Single Polynucleotide Molecules",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,(2000)97(3):1079−1084 Driscoll,R.J.らの"Atomic−Scale Imaging of DNA Using Scanning Tunneling Microscopy",Nature,(1990)346(6281):294−296
SangerらのProc.Natl.Acad.Sci.,(1977)74(12):5463−5467 MaxamらのProc.Natl.Acad.Sci.,(1977)74:560−564 DrmanacらのNature Biotech.,(1998)16:54−58 Riglerらの"DNA−Sequencing at the Single Molecule Level",Journal of Biotechnology,(2001)86(3):161 Goodwin,P.M.らの"Application of Single Molecule Detection to DNA Sequencing",Nucleosides & Nucleotides,(1997)16(5−6):543−550 Howorka,S.らの"Sequence−Specific Detection of Indivisual DNA Strand using Engineered Nanopores",Nature Biotechnology,(2001)19(7):636−639 Meller,A.らの"Rapid Nanopore Discrimination Between Single Polynucleotide Molecules",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,(2000)97(3):1079−1084 Driscoll,R.J.らの"Atomic−Scale Imaging of DNA Using Scanning Tunneling Microscopy",Nature,(1990)346(6281):294−296
したがって、核酸検出に適した基材表面を含めた一般的な配列決定および特に単分子配列決定のための方法およびデバイス類が当業者から要求されている。
(発明の要約)
本発明は、結着した分子の検出用の表面、および本発明の表面化学現象を用いる分子検出方法を提供する。本発明によると、バックグランドが低減し同時に信号が増大するように担体を処理することによって固体担体表面での分子信号の検出強化が達成される。本発明は、表面上での信号検出を改善させる、表面の調製戦略、分子の結着戦略、および洗浄戦略を提供する。
本発明は、結着した分子の検出用の表面、および本発明の表面化学現象を用いる分子検出方法を提供する。本発明によると、バックグランドが低減し同時に信号が増大するように担体を処理することによって固体担体表面での分子信号の検出強化が達成される。本発明は、表面上での信号検出を改善させる、表面の調製戦略、分子の結着戦略、および洗浄戦略を提供する。
本発明は、分子の結着の改善、非特異性結着の防止のための表面ブロッキングの改善、ならびに非特異結合分子の除去のためのリンス戦略の改善を特徴とする表面を提供する。その結果、所望の基質分子が結着し、非特異的表面残渣によるノイズを最小にする特徴を有する表面が提供される。
結着、ブロッキングおよびリンスのための方法戦術は、結着される分子およびその表面で行なわれる化学反応に合わせて調整される。しかしながら本発明は、一般に非特異的な表面相互作用を最小限にし、特異化反応分子に好都合な戦略を提供する。例えば非特異的結合が疎水的相互作用で進行する場合、その表面は、非反応性の疎水性試薬で処理して結着分子種間の非特異的表面相互作用を解消させる。他に能動的ないくつかのリンス方法戦術も以下に提示する。一般的な表面ブロッキング技法においても、検出妨害の可能性がある非特異的結合を競合させないための非反応性の分子種が用いられる。最後に、固着戦術としては、反応性分子種と表面層との間の分子特異的な化学反応が挙げられる。様々な代替策を以下に示す。
本発明の好ましい方法には、安定な結着および耐洗浄性を促進する条件下での対象分子の表面への結着、バックグランドを弱めるかまたは防止するための表面ブロッキング、対象分子含有の化学反応の実施、ならびに未変化の対象分子残留物のような未反応または望まれない分子を除去するために表面をリンス工程が含まれる。いくつかの実施形態では、リンス工程には能動的リンス工程および受動的リンス工程が含まれる。能動的リンス工程とは、望まれない表面汚染物を能動的に除去する薬剤を用いて行なうものである。
本発明の好ましい表面には、エポキシド表面およびエポキシド誘導化表面が含まれる。一つの好ましい実施形態では、以下に述べるようにストレプトアビジン化したエポキシド表面が用いられる。それ以外の好ましい表面には、アルデヒド表面および活性化アミノ表面が含まれる。表面の選択については、行なわれる化学反応に依存し、本明細書中に提供される手引きを踏まえて、当該分野の通常の技量内である。本発明で用いられる表面はいずれも、最適な表面化学反応を促進するための官能化され得る。そのような官能化されたいくつかの表面については、本明細書で示される。
反応性分子種(例えば、蛋白質、核酸など)の結着については、直接的または間接的な手段のいずれかで行なわれる。エポキシド表面では、反応性アミノ付加による直接的な結着、あるいは二官能性架橋を介しての間接的な結着のいずれかによって行われる。間接的な結着の好ましい手段には、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介するものがあり、特に反応性分子が核酸である場合で好ましい。
好ましいブロッキング方法戦略には、表面に結着するかあるいは非特異的結合を減少させるような、表面の化学的特性を変化させる非検出性分子にその表面を曝露させる工程が含まれる。光学検出可能な標識を用いる方法では、表面をブロッキングまたは非反応化するの一つの方法は、標識化される分子と同タイプの非標識分子に、その表面を曝露させることである。その状態で非標識分子は、表面上での非特異的結合に関して標識分子と競合しなくなり(outcompete)、従って、非特異的標識に起因するバックグランドが減少する。他の方法戦略には、表面と相互作用して非特異的結合を妨げる、リン酸塩、トリス、硫酸塩またはアミンでその表面を処理する工程が含まれる。また非反応性の蛋白質も適する。好ましい実施形態では、ブロッキング試薬のマトリックスを表面に供給することで高度洗浄性で非特異的なバックグランドが低い表面が提供される。いくつかの実施形態では、ブロッキング試薬は高アニオン性のヌクレオシド三リン酸の静電反発力が提供されるように選択される。
好ましいリンス方法戦略は、非反応性または非特異的結着性の物質を置換するが表面の反応性分子種を不安定化させない洗浄成分に関係する。一つの実施形態では、エポキシド表面をアセトニトリルでリンスして未反応成分を置換する。好ましい実施形態では、約10〜約50%の間、好ましくは30%のアセトニトリル溶液が用いられる。能動的リンス試薬の使用の有無にかかわらず、例えば水または緩衝液を用いる受動的リンス工程も行なうことができる。
本発明の好ましい実施形態では、表面で行なわれるテンプレート依存性の合成反応において、取り込みまれたヌクレオチドの光学的検出に対するバックグランドを最小にするように調製された表面に、核酸が結着される。一つの方法では、1本鎖の核酸が調製され、テンプレートの5’末端における直接のアミン結着によってガラススライド上のエポキシド表面に結着される。テンプレート上のプライマー結着サイトには、特異的にハイブリダイズするプライマーが加えられる。結着した光学検出可能な標識を有するデオキシヌクレオチド三リン酸に、連続して曝露させる工程が行なわれる。エポキシド表面への直接のアミン結着については以下に詳細に記載するが、洗浄時またはヌクレオチド付加サイクルにおける破壊に抵抗性の様式で、表面へオリゴヌクレオチドテンプレートを固定する。その表面はさらにブロッキング試薬で処理してその表面上でのヌクレオチド、標識および反応残渣の非特異的な結合を阻止する。核酸に対する好ましいブロッキング方法戦略には、表面で中性環境または親水的環境を構築する表面への分子の共有結着が含まれる。特に、その表面上で正味の負電荷を形成するものが好ましい。例えば、トリス、リン酸塩、アミン、ならびに光学信号を発しないか、表面での適した荷電環境を作り出すか、そして/または表面結着に関して非特異的な結合物質と「競合しなくなる」その他の物質で処理することが好ましい。最後に、能動的なリンス試薬には非特異的に結合した物質を置換する成分が含まれることである。この場合では、以下に述べるようにアセトニトリルのような疎水性分子が好ましい。またクエン酸塩含有の緩衝液も、非特異的結合の低減および反応性分子種(すなわちテンプレート/プライマー二重鎖)の結着促進に有用である。
代替の実施形態では、本発明の方法は特異的な蛋白質−蛋白質相互作用に有利な表面を作るのにも有用である。例えば、表面は特異的な抗体(均一分子集団または不均一分子集団のいずれか)でコーティングされ、種々の抗原との相互作用がその表面への抗原物質の導入によって探査される。この場合、表面は特異的蛋白質の保持に一致するような荷電であって、非特異的に結合した物質の表面相互作用を壊すような荷電が生じるように処理される。したがって疎水的蛋白質に対しては、上述と同様な条件が適用される。親水性蛋白質に対しては反対の条件(例えば、非中性または正に荷電したブロッキング試薬)が有用である。
バックグランドを低減し同時に検出分解能を上げるための基材を調製する、本発明による方法が多数存在する。例えば、結着させる分子種に応じて有用な代替基材が多数存在する。比較的簡素な基材では、検出可能な放射を生成し得るような異質物質を僅かに含むかまたは全く含まないものである。以下に記載するように調製されるガラスおよび溶融シリカが、有用である。
表面のコーティングも重要である。一つの実施形態では、ポリ(テトラフルオロエチレン)(テフロン(登録商標))のようなフルオロポリマーを含有する表面が基材に適用される。そのような表面は粒子が極めてごく僅かしか付着していないので、バックグランドの放射は起こらない。またバックグランド生成の根本原因となる欠陥を取り除くための表面処理方法も多く存在する。そのような方法は本明細書で企図され、以下に詳しく述べられる。それらの方法には例えば、基材表面をその欠陥を取り除くようにコーティングまたはフィルムで処理する工程が含まれる。
一つの好ましい実施形態では、本発明は一般には基材のエポキシドでのコーティングを企図する。さらにその基材は、基材への分子の非特異的結合を抑制するブロッキング剤に曝露される。基材表面での分子の非特異的な結合を抑制すると、核酸配列決定の際の混在事象の検出を干渉するバックグランド信号が減少する。ブロッキング剤の例としては、水、トリス、硫酸塩、アミン類、リン酸塩類(PO4)および界面活性剤が挙げられる。
本発明は、表面への核酸の結着に特に有用である。好ましい実施形態では、核酸は表面のエポキシドに結着している。核酸は、近接エポキシドループと反応するアミン連結を介して直接結着するか、あるいはエポキシド表面と予め反応したストレプトアビジンのようなリンカーを介して結着し得る。エポキシドを用いる場合、表面に主として未反応のエポキシドが存在していることが重要である。反応後のエポキシドは、リンカー分子の反応を困難にすることになるアルコールを表面に形成する。リンカーの他の例としては、抗原/抗体、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン抗体、ジニトロフェノール、フルオレセイン、および当業者に知られたその他のハプテン類が挙げられる。別のケースとして、核酸テンプレートは、エポキシド環の立体配座を変化させたり、開放エポキシド環にテンプレートを直接結着させる他の結合性部位を含有させることも可能である。例えば、いくつかの実施形態では、テンプレートはエポキシドに共有結合するアミノ基を含む。
いくつかの実施形態では、エポキシドはシリカコーティングを介して基材に結着している。エポキシドは、当業者に既知のシラン化技法を用いて結着させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、エポキシドは芳香族溶媒が本質的に存在しない条件で基材に共有結着される。基材にエポキシドを連結させることが可能な他のいかなる分子も、本発明では企図される。最後に挙げられることは、静電的荷電の違いによって、基材への共有結合またはイオン相互作用のいずれかでの直接連結も可能なことである。
好ましい実施形態では、基材には例えば単層形成のように均質配列されたエポキシド分子層が存在する。いくつかの実施形態では、前述または後述に記載のエレメントのいずれかが含まれ得るが、核酸配列決定反応の際に混在事象の検出の干渉となり得る非特異的結合サイトをブロックすることが有益である。水、硫酸塩、アミノ基、リン酸塩または界面活性剤のような薬剤は、非特異的結合をブロックに用いることができる。トリスのような界面活性剤は、単独または他のブロッキング剤と共に、エポキシド分子のブロックまたは非反応化に役立つ可能性がある。したがって界面活性剤は、非反応化した表面の保持および検出の邪魔になり得る過剰なバックグランドを防止するために、表面洗浄工程で併用することができる。ブロッキング工程は、非特異的な結合剤、すなわちエポキシドまたは他の反応性表面において表面分子の反応性部分を低減させるかまたは排除するものと競合する分子に表面を曝露させて行なうことができる。例えば、水はエポキシド環を開いてその反応性をなくする。したがってオリゴヌクレオチドの結着後にエポキシド表面をリンスすると、エポキシドの反応性官能基を減少させるかまたは排除し、その結果非特異的結合を低減させることができる。
本発明の方法には、所望により表面の乾燥工程も含まれる。いくつかの実施形態では、基材はヌクレオチド取り込み工程のような化学反応の前、最中および/または後に乾燥剤に曝露される。好ましい乾燥剤の例としては、リン酸塩緩衝液、アルコール(例えばエタノール)、空気および/またはN2が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の方法は単分子配列決定用の表面の調製およびそれらの処理に用いられる。前述のように単分子配列決定工程は、従来からの大量配列決定工程とは異なり、特に単分子配列決定工程では、核酸二重鎖をそれぞれ分析することで個人間のゲノムの違いをそれぞれ解明でき、個々の腫瘍の分析ができ、個人の治療効果、健康および病気に関するライフサイクルなどの評価ができるようになる。単分子配列決定工程には、信号分割への特別な配慮が求められる。典型的な単分子反応では、個々のヌクレオチド三リン酸は光学検出可能な標識(例えば、蛍光分子)が結着しており、それらは前述のように二重鎖のプライマー部分に、テンプレートに応じて加えられる。個々の標識は取り込みまれると画像化し、配列はプライマー塩基の連続的な付加に基づいて編集される。
表面に結合したテンプレートおよび蛍光標識を用いる核酸配列決定反応において、光退色減少を最小限にするかまたは完全になくすると塩基対合効率が増大することも今回発見された。したがって本発明の好ましい方法は、蛍光標識の退色を下げるか、最小限にするかまたは除く条件下で行なわれる。
単分子レベルで配列決定を行なう際は、テンプレートは基材上で可能な限り定着して安定性が保たれているべきである。エポキシド表面を用いる場合は、安定化のためにいくつかの連結方法戦略が可能である。直接的なアミン連結は有用である。そのほかに間接的な連結も用いることができる。例えば、ビオチン/ストレプトアビジン(またはアビジン)連結、あるいは抗体/抗原連結は結着メカニズムとして有益である。また核酸は2個の反応性分子種間の「サンドイッチ」(例えば、ビオチン−アビジン−ビオチンなど)を介して表面に結着させることもできる。結着メカニズムにかかわらず、次に表面をブロッキング剤でブロックすると、バックグランドが減少する。溶液のpHまたは塩濃度を変えると、核酸テンプレートの基材への結合が好適になるかまたは抑制されるなどの分子の結合特性が変わり得る。一般的に溶液のpHを上げるとビオチン/ストレプトアビジン複合体への核酸テンプレートの結合が促進される。反対に溶液のpHを下げるとビオチン/ストレプトアビジン複合体への核酸テンプレートの結合が抑制される。
前述で示したように、定着し安定なテンプレートは配列決定にとって好ましい。本発明自体によって、種々のプライマー/テンプレート固着方法が提供される。本明細書で提供される固着方法の一つの利点は、配列決定対象の核酸を、再現性をもって表面に結着できることである。本発明の方法には、ハイブリダイズされた二重鎖を安定化するために、固着サイトまたはその近傍のポリヌクレオチド領域の使用が一般に含まれる。さらにそれらの方法には、その二重鎖をさらに安定化するためにロック化核酸(LNA)の添加が含まれる。
本発明は、多数の異なる化学反応の実施に有用である。例えば、受容体の結合性研究、酵素活性などのような蛋白質間の相互作用は、本明細書に記載の表面調製法およびその処理法で高まる。好ましい実施形態では、本発明は核酸の配列決定、特に単分子レベルでの核酸の配列決定に適用される。本発明は、2本鎖DNA、1本鎖DNA、1本鎖DNAヘアピン類、DNA/RNAハイブリッド類およびRNAのようないかなるタイプの核酸の配列決定においても有用である。本発明において有用なヌクレオチド類には、天然で生じるか合成のいずれかの、いかなるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体も含まれる。好ましいヌクレオチド類には、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミン塩基がある。またメチル化核酸類、ペプチド核酸類、ロック化核酸類、ならびに作用がヌクレオチドまたは塩基とほぼ類似し得るそれ以外の構造体のようなヌクレオチド類似体も含まれ、例えば、DNAまたはRNA内で生じる一個または複数の塩基と相補性を示すものおよび/または塩基相補性が組込まれ得るものも挙げられ、連鎖反応停止用の類似体も含まれる。
本発明において特に有用なヌクレオチド類は、検出可能な標識を含むものである。標識化ヌクレオチドには、直接的または間接的に検出可能な標識を含むように予め修飾されたヌクレオチドのいずれもが含まれる。好ましい標識には光学的に検出可能な標識が含まれ、それらにはフルオレセイン、ローダミン、サイアニン、サイアニン−5色素、サイアニン−3色素またはそれらのいずれの誘導体または修飾体のような蛍光標識またはフルオロフォアが含まれ、さらにハプテン標識化のような標識系も含まれる。したがって本発明の方法は、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼに、プライマー/標的核酸複合体を曝露する工程もさらに提供する。
各核酸がそれぞれ光学的に分離可能であるような空間配置で複数の標的核酸が固体担体に結着している、単分子核酸のハイスループットの配列決定工程において、本発明は特に有用である。本明細書で記載されるように、好ましい実施形態では、基材結合化プライマー/標的核酸複合体は、エポキシド表面に結合している。配列の決定は、ヌクレオチド取り込みの検出工程、曝露工程およびおよび検出工程の反復工程、、ならびに取り込みまれたヌクレオチドの順番に基づくテンプレート配列の編集工程によって行なわれる。
好ましい基材には、ガラス、研磨ガラス、シリカ、溶融シリカ、プラスチックおよびゲル類が挙げられる。本発明に適した基材の例としては、ポリテトラフルオロエチレン、あるいはシラン化ポリテトラフルオロエチレンのようなテトラフルオロエチレン誘導体も挙げられる。特に好ましい実施形態では、基材はシリカコーティングを含む。
オリゴヌクレオチド結着用の官能化表面も、本発明により企図される。例えば、官能化シリコーン表面は、紫外線によるアルケンの基材への結着によって調製される。紫外光は、末端が水素であるシリコーンと、t−ブチルオキシカルボニル(t−BOC)で保護されたω−不飽和アミノアルカン(10−アミノデセ−1−エン)との反応を仲介する。t−BOC保護基を取り除くと、アミノデカンで修飾されたシリコーン表面を生じる。ヌクレオチドアレイは、ヘテロ両官能性の架橋化リンカーを用いてアミノ基をチオール修飾化オリゴデオキシリボヌクレオチドに結合させて調製する。オリゴヌクレオチドの表面密度は、使用されたアミノアルカンの量を調節することによって制御することができる。アミノデカンのモル分率とハイブリダイゼーション部位密度との間には、一次の関係が見出された。別な場合では、t−BOC保護基は核酸曝露工程前にすべてが除去されることはない。
一つの実施形態では、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が検出スキームとなる。配列決定工程に関連した蛍光共鳴エネルギー転移については、Braslavaskyらの“Sequence Information can be Obtained from Single DNA Molecules”,Proc.Nat’l Acad.Sci.,100:3960−3964(2003)に全般的に記載されており、本明細書においても参考文献として収載されている。一つの実施形態では、ドナーフルオロフォアは本質的にプライマー、ポリメラーゼまたはテンプレートに結着している。プライマー内に取り込みむために加えられるヌクレオチド類は、アクセプターフルオロフォアを含み、ドナーによってその2個が近接して活性化される。アクセプターが活性化すると特徴的な波長の光を放射する。このようにして、プライマー配列中へのヌクレオチイドの取り込みの検出は、アクセプターの発光を検出して行なわれる。もちろんドナーフルオロフォアで標識化されたヌクレオチドも本発明の方法では有用であり、本発明のFRETに基づく方法では、ドナーとアクセプターフルオロフォアとの対が単に必要とされ、標識化ヌクレオチドは1個のフルオロフォアを含むことができ、テンプレートまたはポリメラーゼの一方は他方を含むことができる。そのような標識技法によって、ヌクレオチドの標識ならびに標識化テンプレートまたはポリメラーゼの一致した蛍光を放射するか、あるいはその代わりにどちらか一方のみの標識の蛍光の放射を生じる。
好ましい実施形態では、検出後にヌクレオチドまたは伸長化プライマーから標識を除去するか、標識を中和するか、あるいは標識をマスキングすることによって標識を検出不能にする。ある実施形態では、本発明による方法は、光退色化による標識中和工程を提供する。これは、例えば、レーザー強度を増加しながらで短時間の間の短いレーザーパルスでのレーザー収束によって実施される。その他の実施形態では、標識は光開裂によってヌクレオチドから除かれる。例えば、ヌクレオチドに結合した感光性標識では、その標識に対して特定の波長の光を収束させて光開裂を起こさせる。一般には励起波長と開裂波長とが異なるレーザーを用いるのが好ましいといえる。標識は化学的に開裂させることも可能である。NaOH、ジチオスレイトールのような試薬、またはその他の適合する緩衝性試薬を用いることで、基材から標識を除去することができる。ヌクレオチドに標識を結着させるためにジスルフィドリンカー類を用いることは特に有用であり、当業者に知られている。
本明細書において記載するように、本発明は、標的分子の調製表面への安定な結着を促進する。本発明は一般に、非特異的結合が低減化または除かれた反応性分子の確実な結着を促進し、有効なリンス工程が可能な表面を含んでいる。本発明の方法は、反応性分子、および基材への分子の非特異的結合を抑制する薬剤に、表面を曝露させる工程、結着分子を含む化学反応の実施工程、ならびに表面から非結合反応物質を効果的にリンスする工程を含む。
好ましい実施形態では、結着は、表面への対象分子の共有結合を介して生じる。結着はビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの間の連結のような化学的な連結、あるいはシランのような包埋化された結合性分子または表面への分子結着を促進するその他の分子への結着を介し得る。例えば、NH2基で修飾されたオリゴヌクレオチド類が、エポキシシラン誘導化ガラススライドまたはイソチオシアネートでコーティングされたガラススライド上に固定化される。スクシニル化核酸類についても、アミノフェニル誘導化ガラススライドまたはアミノプロピル誘導化ガラススライドに、ペプチド結合によってカップリングさせることができ、ジスルフィドで修飾された核酸類については、メルカプトシラン化ガラス担体上に、チオール/ジスルフィド交換反応によって固定化することができる。その代替として、不活性化した顕微鏡用スライドが活性化したシラン化核酸類と共に用いることができる。結着方法の戦略の多くは、ヘテロ両官能性の架橋性分子に基づくものであり、架橋性分子および核酸自体の両方に対して代替物が多く提供されている。
特別な実施形態では、本発明による方法は基材上で単分子を検出するための、基材上での化学反応の実施工程を提供する。そのような方法には、表面の欠陥を除くための基材処理工程、および複数の構成分子のそれぞれが光学的に分割可能なように複数の分子を基材に共有結合させる工程が含まれる。それら分子は、DNAまたはRNAのような核酸が好ましい。またいくつかの実施形態では、本発明による方法には、基材に化学層を塗布して基材上の表面の欠陥を除く工程を含み得る処理工程が含まれる。いくつかの実施形態では、化学層にさらにヌクレオチドを含むことも可能である。単分子検出用の表面は、一般に、化学結合には抵抗性があっても核酸のような検出対象の分子の固着には適しているコーティングまたはフィルムを備える。それらの方法には、結着分子に干渉せずに残渣を実質的に取り除くために基材を洗浄する工程も含まれる。
別の態様によれば、基材上で単一核酸分子を光学的に検出する方法には、基材から放出されるバックグランド光放射が検出対象の信号量以下に低下させるように基材を調製する工程、ならびに複数の核酸分子を基材に結着させる工程が含まれる。本発明のこの態様に従う方法にはさらに、核酸分子内に塩基が取り込みまれる条件下で、核酸分子をポリメラーゼおよび検出可能な標識を含む少なくとも1種の核酸塩基に曝露する工程をさらに含む。さらに本発明による方法は、基材上での明確な信号としての検出標識を観測し、これによって基材上に結合した単一の核酸分子を検出する工程を含む。
本発明の別の態様によれば、基材は高分子電解質の多重層でコーティングされる。このような場合、相補鎖合成による標的核酸の配列決定方法は、高分子電解質の多重層で基材表面をコーティングする工程;その基材上に標的核酸の位置決めを可能にする工程;標識部分を含む核酸を供給する工程;およびポリメラーゼの存在下で相補鎖内にヌクレオチドを取り込みませる工程、を含み得る。本発明の方法にはさらに、相補鎖へのヌクレオチドの取り込みを検出して標的核酸の配列を決定する工程を含む。またそれらの方法は、本明細書で提供される方法を実施および容易にするために設計されたキットにおいて使用され得る。
単分子検出用の表面を調製するためのさらなる実施形態は、荷電層表面(例えば、ガラス)上での共有結合の付与し、その上にさらに電解質層を形成する工程を含む。最初の荷電層の共有結合は、荷電層全体(例えば、PEM)が表面に膠着するの能力を促進にする(すなわちリンス工程の作業性が改善される)。例えば、ガラスに共有結着したアミン層は、表面結着層がガラスに結着する能力を改善する。したがって、非共有的に連結したPEMと比較して耐水性であるアミン層上にPEMを形成することができる。一つの実施形態では、本発明はポリジメチルシロキサンの使用を含み、その上部にジアクリル化ポリエチレングリコール(例えば、Sartomer社(米国、ペンシルバニア州、エクストン市)製のDAPEG SR610)とヘキサクロロ白金酸(Aldrich)との容量比約200:1の溶液を流される。次いでその表面を約80℃で約30分間焼き固め、水で表面をリンスしてジアクリル化ポリエチレングリコールを除去する。次にポリエチレンイミンとポリアクリル酸エステルとの交互の層を含むPEMが表面上にを重層される。最後に、表面をビオチンでコーティングし、続いてストレプトアビジンでコーティングしてビオチン化核酸用の結合部位を作製する。
代替の表面化学は、高分子電解質多重層の塗布の代わりに負に荷電したカップリング蛋白質のコーティングを適用することによる、本明細書に記載の表面を調製する工程を含む。例えば、負電荷を含む硫酸ビオチンまたはそれ以外のビオチン誘導体が表面に付加される。カップリング蛋白質表面の負電荷は、PEMと同じ効果が与えられる。次に例えば、硫酸ビオチンのようなカップラー(連結器)を、ビオチン化核酸にカップリングするため、ストレプトアビジンに結合される。
当業者にとっては自明のことと考えられるが、本発明の個々の特徴については別々にまたは組合わせて用いることができる。本発明の実施形態の詳細な記載は、以下に示される。本発明の他の実施形態は、以下の詳細な記載を精査すると明らかになる。
(発明の詳細な説明)
本発明の方法およびデバイスによって提供される種々の表面化学は、表面に結合される化学反応を含めた種々の適用に多くの利点を提供する。本発明は、単分子検出のような、高いシグナル−ノイズ比が有利である適用に特に有用である。いくつかの適用では、単分子を分離しつつ核酸を容易に結着させる表面化学を作製するため表面が前処理され、この表面で、核酸分子は続く合成反応に利用可能である。さらにコーティングまたはフィルム(例えば、エポキシド、PEMおよび本明細書に記載の他の技法)により基材を処理することは、それに結着した単分子核酸を配列決定するのに有意義であり得る。
本発明の方法およびデバイスによって提供される種々の表面化学は、表面に結合される化学反応を含めた種々の適用に多くの利点を提供する。本発明は、単分子検出のような、高いシグナル−ノイズ比が有利である適用に特に有用である。いくつかの適用では、単分子を分離しつつ核酸を容易に結着させる表面化学を作製するため表面が前処理され、この表面で、核酸分子は続く合成反応に利用可能である。さらにコーティングまたはフィルム(例えば、エポキシド、PEMおよび本明細書に記載の他の技法)により基材を処理することは、それに結着した単分子核酸を配列決定するのに有意義であり得る。
また本発明の表面化学反応は、反応性分子の表面結着も容易にする。例えば、負に荷電した表面層は、核酸分子の結着を容易にする。結着とは、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、カルボン酸類は、共有結合を形成させる良好な標的である。いくつかの実施形態では、結合する対を用いることができ、その場合、末端層が対の一方を含み、対の他方を核酸分子が含む。例えば、ビオチンを基材の末端層に結合させると、ビオチン−ストレプトアビジン結合対を用いる固着を容易にすることができる。そのような処理によって、以下にさらに詳細に記載するように、単分子分離で高密度の核酸被覆を可能にする。
本発明は核酸の配列決定に関連する例であり、当業者にとって明らかであるが、本発明は表面に結合した反応物質を含めた化学反応のいずれにも適用可能である。
本発明は、表面での非特異的な結合が極めて低減された、適切な表面およびテンプレート−基材の強力な固着システムを提供する。特に単分子配列決定反応は、表面安定性が高く、洗浄工程が効率的であり、非特異的結合を防止できることから有益性がある。同様にして本発明の実施形態では、核酸テンプレートと洗浄抵抗性の化学的相互反応を形成し、基材に核酸テンプレートが一度だけ結合するようにブロッキングできるような基材が提供され、その表面は非特異的な結合が減少するように処理される。当該分野で公知である多くの表面は、核酸テンプレートの結合に適しているが、それらの多くについては、配列決定の間の取り込み事象を後で検出するのを妨げる、非標的分子の非特異的結合性が高いため、単分子の配列決定には適さない。
(I.表面)
本発明によると、反応性分子種の結着を容易にし、バックグランドが低い表面が調製される。好ましい表面は、表面での化学事象(例えば、ヌクレオチドの取り込み)の検出を干渉し得るバックグランドの生成を担う欠陥を取り除くように処理されている。従って、本発明による基材は、結合した反応物質の結合親和性を上げるかあるいはその局在化を改善する一種以上のコーティングまたはフィルムで処理、会合化または化学修飾することができる。また表面結合の親和性を上げると、表面保持性が向上し、表面での反応物質の利用率も最大になる。フィルムまたはコーティングの例としては、誘導体も含めたエポキシド類(例えば、ストレプトアビジンのような結合性分子が付いたもの)が挙げられる。
本発明によると、反応性分子種の結着を容易にし、バックグランドが低い表面が調製される。好ましい表面は、表面での化学事象(例えば、ヌクレオチドの取り込み)の検出を干渉し得るバックグランドの生成を担う欠陥を取り除くように処理されている。従って、本発明による基材は、結合した反応物質の結合親和性を上げるかあるいはその局在化を改善する一種以上のコーティングまたはフィルムで処理、会合化または化学修飾することができる。また表面結合の親和性を上げると、表面保持性が向上し、表面での反応物質の利用率も最大になる。フィルムまたはコーティングの例としては、誘導体も含めたエポキシド類(例えば、ストレプトアビジンのような結合性分子が付いたもの)が挙げられる。
本明細書において記載するように、表面はバックグランドの生成を担う欠陥を取り除くように処理することができるばかりでなく、分析のための標的分子(例えば、核酸)の配置を改善するように処理することもできる。従って、本発明による基材は、一種または複数の荷電層(例えば、負電荷層)で処理して荷電分子(例えば、負に荷電した標識化ヌクレオチド)を斥力ではじくことも可能である。本発明による基材は、例えば、ポリアリルアミンで処理し、その後にポリアクリル酸で処理して高分子電解質の多重層を形成することができる。そのポリ(アクリル酸)層のカルボキシル基は負に荷電しているため、負に荷電した標識化ヌクレオチド類を斥力ではじいて検出用標識の配置を改善する。
いくつかの実施形態では、基材(例えば、ガラススライド類)は、分子と基材との結合(例えば、標的核酸とガラスとの結合)親和性を改善する一種または複数のコーティングおよび/またはフィルムで会合化または誘導体化されている。分子−基材の結合親和性を上げると、基材調製および分析(例えば、ハイブリダイゼーション、染色工程、洗浄工程、走査工程など)の様々の工程において分子の保持性が向上する。さらに基材に適用されたコーティングまたはフィルムのいずれについても、ほとんど分解または基材から解離することなく、後続の処理工程(例えば、光曝露、煮沸、焼き固め、洗剤含有加温液体への浸漬など)に耐え得なければ成らない。
基材のコーティングおよびフィルムの例としては、ガラススライド製品、例えば、Molecular Dynamics社製の製品に適用した3−アミノプロピルトリメトキシシランの気相コーティングが挙げられる。そのほかに一般的な疎水性基材コーティングおよびフィルムも、基材表面での親水性分子の均質な分布に役立つ。基材コーティングまたはフィルムを用いる本発明のそれらの実施工程で重要なことは、プライマー伸張工程および検出工程にほとんど邪魔にならないコーティングまたはフィルムが好ましいことである。さらに基材に適用されたコーティングまたはフィルムのいずれでも、基材への標的分子の結合性を上げるか、あるいは標的結合性をほとんどまたは全く損なわないものが好ましい。
基材にコーティングまたはフィルムを施すその他のアプローチとしては、基材に化学薬剤を会合させる方法が含まれ、その場合のコーティングまたはフィルムは、分子または核酸標的と反応性があるものから選択される。例えば、有機アミンおよび有機アルデヒドの反応性基を、基材1cm2あたりに例えば、約5×1012個の密度で適用することができる。それらの反応性基によって、核酸、蛋白質、小分子、抽出物、および細胞全体または細胞フラグメントなどの基材への結合親和性が増大する。基材コーティングおよびフィルムは、単一層としてよく用いられるが、複数層を用いて適用することも適していると言える。本発明のいくつかの実施形態では、基材は写真平版技法を用いて作製される。またマスキングを行なわない基材製造技法も当業者に知られている。
一つの態様によれば、本発明の好ましい実施形態には、エポキシド含有表面の使用が含まれる。エポキシドとは、歪んだ立体配座をとる3員環構造の構成元素のいずれか一つが酸素である。エポキシドは、その歪んだ環構造のためにそれ以外のエーテル類よりも反応性が高い。
本明細書に記載するように、核酸は基材表面上のエポキシドに直接または間接的に連結させることができる。直接結着させる実施形態では、エポキシドはアミノ基含有のテンプレート核酸に導入される。高い反応性を有するエポキシド環は開環し、反応性の炭素がテンプレート表面のアミノ基に結合する。残念ながら、核酸テンプレート表面のアミノ基に対してエポキシドを反応させることは、他の分子に対してもエポキシドを反応させることになるために非特異様な結合が増大してしまう。核酸配列決定反応の際にエポキシド含有表面への分子の非特異的な結合を抑制するためには、核酸テンプレートに結合していないエポキシドを、反応させないようにする必要がある。
エポキド環と相互作用するか、またはエポキシド環を壊す可能性がある分子、あるいはすでに壊れたエポキシド環内の反応し得る炭素に結合することができる分子のいずれもが、非反応化薬剤に適する可能性がある。好ましい非反応化薬剤(ブロッキング剤)は、意図する表面化学(例えば、ヌクレオチドの取り込み、あるいは取り込みまれたヌクレオチドの測定/検出)に干渉しないものでなければならず、本発明において用いられる好ましいブロッキング剤の例は、水、硫酸塩基含有物、アミン基含有物、リン酸(PO4)基含有物、または(トリスのような)界面活性剤である。ブロッキング剤は、配列決定手順の間のいずれの時期にも導入または再導入することができる。またいくつかの実施形態では、ブロッキング剤は基材を核酸テンプレートに曝露させる前に、基材表面の前処理に適用することもできる。さらに界面活性剤(例えば、トリス)のようなブロッキング剤を洗浄工程の一部または洗浄各工程で加えることで、インキュベーション期間および/または洗浄中での表面の非反応化を行なうこともできる。
好ましい実施形態では、基材の表面はエポキシドの単層でコートされている。エポキシドの単層は、シラン化反応を含めた当該分野で公知の多くの方法によって表面上に堆積することができる。異なる分子または分子の組合わせが、表面にエポキシドを連結させるのに役立ち得る。理想的には、表面はテンプレートの導入の前に、エポキシドの一様な分散物でコーティングされる。好ましい実施形態では、次に核酸(2本鎖核酸または1本鎖核酸)がエポキシド層に導入される。アミンはエポキシド環と反応し、その結果として核酸とエポキシドとの間に直接の連結を生じる。次に未結合のエポキシドをブロッキングが行われ得る。
これまで検討したように、核酸は基材表面上のエポキシドに間接的に連結させることも可能である。一つの実施形態では、核酸はビオチン化アミンに予め曝露させたエポキシドに連結される。その曝露の際に、アミンはエポキシド環と反応し、それによってエポキシドにビオチンを連結する。そのビオチン化エポキシドは、さらにストレプトアビジンに曝露させて基材をコーティングする。次にビオチン化核酸テンプレートを基材に導入する。基材上の結合していない状態のエポキシドをいずれもブロッキングするには、本明細書に記載の本発明によるいかなる方法を用いても実施できる。
表面電荷は核酸の表面安定性に影響を及ぼす。一般的に基材に基づく配列決定の実施効率は、特に単分子配列決定の場合、基材上での核酸の立体配座に部分的に依存する。配列決定反応の間、例えば、核酸テンプレートの立体配座は、首尾のよいプライマーのアニーリングおよび伸張のために重要な因子である。負に荷電した核酸テンプレート分子は負に荷電した基材から斥力ではじかれる傾向があり、それによって基材表面に核酸テンプレートを結着させることがより困難になる。核酸テンプレートが基材表面にひとたび結合すると、基材上の負電荷によって核酸は配列決定目的に適した立体配座をとるようになる。すなわち負に荷電した表面は、核酸テンプレートが基材から斥力で反発させ、表面から離れて(または水平な表面にほぼ直交して)テンプレートを放出し、そしてプライマー、ポリメラーゼおよび/またはヌクレオチド(標識または非標識)のような試薬へとこの核酸テンプレートを利用可能にするのを助け得る。
結果として、本発明によると表面の電荷を操作して、テンプレートの結着およびプライマーの伸張の間の理想的な諸条件を実現し得る。例えば、テンプレートが基材上に結合するかまたは配置されるローディング相の間、溶液の塩濃度を上げて基材上にさらに強い正の表面荷電をつくり、核酸のアミン部分とエポキシド環との間の反応を容易にすることができる。逆に、核酸が表面に固定化した後では、溶液の塩濃度を下げることで基材表面から核酸テンプレートを斥力ではじかせることができ、それによって核酸鎖はプライマーのアニーリングおよび伸張反応に適した立体配座を形成する。
別の態様によれば、本発明はポリアニオン層およびそのポリアニオン層に固着した核酸分子を含む基材を提供する。したがって、核酸分子は実質的に平行になるのを避けて配置される(例えば、ポリアニオン層上で横になるのを妨げられて配置される)。いくつかの実施形態では、基材の表面は前処理され、核酸分子の結着およびそれに続く配列解析を容易にする表面化学を形成する。それらの実施形態のいくつかでは、基材表面は高分子電解質多重層(PEM)でコーティングされる。いくつかの場合では、PEMにはビオチンが適用でき、その後でストレプトアビジンが適用される。その後で基材はビオチン化核酸の結着に用いることができる。
PEMでコーティングされた基材は、核酸の配列決定および重合反応に対して実質的な利点を提供する。第一に、PEMはカルボン酸含有のポリマーで容易に末端処理が可能であるため、核酸の結着が容易になる。第二に、結着した核酸分子は、負に荷電したカルボキシル基間の電荷斥力のために、ポリメラーゼによる伸長反応を起容易にする。また負に荷電した核酸骨格は、基材表面に実質的に平行である核酸分子の形成を妨げられる。さらにその負電荷は、取り込みまれなかったヌクレオチドを斥力ではじき、それによって非特異的な結合が低減し、したがってバックグランド干渉も低減する。
いくつかの実施形態では、正に荷電した層と負に荷電した層との交互の多重層が用いられる。不完全に荷電した表面の場合では、多重層が積層すると表面の荷電が顕著に増大し、安定なレベルになる傾向がある。例えば、表面をPEMでコーティングして標的核酸および/またはプライマーを、光の方向に間隔を空けて結着させることが可能である。またその代わりに、標的核酸および/またはプライマーをPEMコートした表面に化学的に結着させることもできる。PEMの形成については、Decherらの文献(Thin Solid Films,210:831−835,1992)にすでに記載されている。PEMの形成は、各々が多くの正電荷あるいは負電荷を持つポリマーであるポリカチオン類およびポリアニオン類の連続した付加によって進行する。負に荷電した表面へのポリカチオンの付加の場合では、ポリカチオンが表面に積層して薄いポリマー層が形成され、表面の荷電が逆転する。同様に、正に荷電した表面にポリアミンを沈着させると、薄いポリマー層が形成され、負に荷電した表面が得られる。ポリ(+)とポリ(−)とに交互に曝露させると、高分子電解質の多重層構造(PEM)が生成し、その表面荷電は最後に加えた高分子電解質によって定まる。この操作によって負に強く荷電した表面を生じ得、負に荷電したヌクレオチドを斥力で反発し得る。
核酸固定化のためのPEMによる基材のコーティング手順の詳細については、以下に記載する。基材表面(例えば、ガラスカバースリップ)は、一般にはRCA溶液で洗浄することができる。基材は洗浄後にPEMでコーティングし、末端をカルボン酸基により終結させることが可能である。そのカルボン酸基をビオチン化した後、ストレプトアビジンを適用してビオチン化分子を捕捉可能な表面を生成し得る。次にそのコーティングした基材に、ビオチン化した核酸テンプレートまたはプライマーを加えて固着させ得る。固定化工程または固着化工程の間、高濃度の陽イオン(例えば、Mg2+)は、負に荷電した核酸分子と負に荷電したPEM表面との間の静電的斥力を遮るのに有用である。その後の工程において、陽イオン濃度を下げることで斥力による遮蔽性を復活させることが可能である。ビオチン化核酸分子を滴定することで、少数の分子が光学機器の回折限界以上に分離され、それぞれが可視化できるように、それらの分子を基材に結合させることが可能である。
本明細書に記載の結着スキームについては、容易に一般化できる。修飾せずに製造されたPEM/ビオチン/ストレプトアビジン表面は、ビオチン化された任意の分子を捕捉または固定するために使用され得る。僅かに変更は、別の捕捉対の使用であり得、例えば、ビオチンの代わりにジゴキシゲニン(dig)を置き換え、そしてこの分子を標識して抗ジゴキシゲニン抗体(anti−dig)により固着されるか、またはジニトロフェノールおよびその抗体が使用され得る。アミンのビオチン化またはジゴキシゲニン標識化のための試薬は、共に市販されている。
結着化学は、基礎となる表面化学にはほとんど依存せず、したがってさらに一般化できる。例えば、ガラスの場合、正または負のポリマーのいずれかで末端処理されたPEMを支持し得、いずれの場合でも広範囲の化学反応が利用できる。しかし、一方、シリコーン、ポリスチレン、ポリカーボネートなどの他の基材、あるいは膜および/またはゲルのような他の基材でも、これらはガラスほど強くは荷電していないが、依然としてPEMを支持し得る。弱く荷電した表面上の最後に形成させたPEM層の荷電は、PEM層の数が充分であるならば、強く荷電した表面上の最終PEM層の荷電と同様に高くなる。したがって、ガラス/PEM/ビオチン/ストレプトアビジン/ビオチン−核酸の表面化学の利点は、他の基材にも容易に適用できる。いくつかの実施形態では、結着スキームは、エクスサイチュまたはインサイチュのいずれかであり得る。
本発明の別の態様によれば、例えば、疎水性が増大または減少する化学物質によるコーティング、または核酸分子もしくはそれ以外のポリマー配列と共有連結可能な化学物質によるコーティングによって、基材を調製できる。いくつかの化学的コーティングは、疎水性を改変し得、かつ共有連結を可能し得る。固体基材上の疎水性は、シラン処理または当業者に既知の他の処理によって、容易に向上され得る。リンカー分子は、表面に接着し、生物学的分子と反応する機能性部分を含む。そのようなリンカーの多くは、容易に利用でき、当該分野で公知である。例えば、基材または担体は、感光性保護化ヒドロキシル基、アルコキシもしくは脂肪族で誘導体されたヒドロキシル基、または他の化学物質で修飾される。
疎水性を低下させ、かつリンカーを提供する好ましいコーティングは、ポリ(エチレンイミン)である。さらにポリ(エチレンイミン)(PEI)でコーティングされた固体基材は、保存安定期間が長いという追加の利点も有する。ポリ(エチレンイミン)のようなポリマーによるシリコンウエハーまたはガラススライドのコーティングは、自前で実施でき、またCel Associates社(米国、テキサツ州、ヒューストン市)のような会社を通じても実施できる。ガラススライドはまた、反射性素材でコーティングするか、またはシラン化学処理を用いてPEIでコーティングすることが可能である。PEIコーティングによって、1本鎖または2本鎖の核酸、1本鎖または2本鎖の長いDNA分子またはそのフラグメント、あるいはアミン含有のその他の生物学的分子を、基材または担体に共有結着させることを可能にする。核酸は、そのオリゴヌクレオチドの5’末端に第一級アミンを配置させるヘキシルアミン修飾を用いて、5’末端で共有結着させることができる。次にそのオリゴヌクレオチド上の5’−アミンは、架橋リンカーと反応させることで、そのオリゴヌクレオチドを固体担体上のポリマーコーティングに共有結着させることができる。
一般には、基材は単一の分子が個々に光学分離可能であることを可能にする、任意の適切な基材であり得る。本発明によると、基材は2次元または3次元のものが使用でき、平らな表面を持つもの(例えば、ガラススライド)が含まれ、あるいは成形されたものでも良い。基材にはガラス(例えば、細孔制御ガラス(CGP))、石英、プラスチック(ポリスチレン(低架橋化ポリスチレンおよび高架橋化ポリスチレン)、ポリカーボネート、ポリプロピレンおよびポリ(メタクリル酸メチル)など)、アクルル系共重合体、ポリアミド、シリコーン、金属(例えば、金のアルカンチオレート誘導体)、セルロース、ナイロン、ラテックス、デキストラン、ゲルマトリックス(例えば、シリカゲル)、ポリアクロレイン、またはそれらの複合材を挙げることができる。
本発明には3次元基材類、例えば、球状体、管状体(例えば、キャピラリー管)、マイクロウエル、微量流動デバイスなど、あるいは核酸の固着に適したそれ以外の構造物が挙げられる。例を挙げると、基材には微小粒子、ビーズ、膜、スライド、プレート、微細加工化チップなどが挙げられる。また基材には、標的核酸またはプライマー類の集団を含む領域を有する平面のアレイまたはマトリックスを挙げることができる。それらの例としては、ヌクレオシド誘導体化CPGスライドおよびヌクレオシド誘導体化ポリスチレン;誘導体化磁性スライド;ポリエチレングリコールでグラフト化したポリスチレンなどが挙げられる。
基材は一般には、単一の分子の個々の光学的分離を可能にするのに適した任意の材料であり得る。従って、本発明によるデバイスおよび方法は、ある分子を別の分子から分離し得る。例えば、その検出限界はミクロン単位であり得る。このことは、二つの分子が数ミクロン離れていて分離可能であり、個々の検出され、そして/または検出可能に識別されることを意味する。基材選択の要素には、例えば、材量、多孔度、大きさおよび形状が挙げられる。さらに、ポリメラーゼの立体障害性を低下(または増大)させることが可能な基材も、本発明に好適である。適した基材の選択に考慮されるその他の重要な要素には、大きさの均一性、合成担体としての効率、および基材の光学特性が挙げられ、例えば、透明平滑性基材(きずがないもの)の場合、単一分子(例えば、核酸)へのヌクレオチドの取り込みの検出のにおいて、装置上の利点をもたらす。
本発明により用いられる基材には、好ましくは光透過性で光学的に均一である(すなわち微小の粗度合いが最小な)生体適合性の、あるいは生物学的に不活性素材が含まれる。特別に製造された基材、または化学的に誘導化された基材でバックグランドの蛍光が低い基材(例えば、ガラススライド)についても、本発明に従って企図される。基材は、この平らな基材の上面または底面(すなわち、検出系における基材の向きに対して)のいずれかで調製および分析が可能である。さらに基材は、取り込みまたヌクレオチドの検出に干渉し得るバックグランドの生成を担う欠陥を最小にする必要がある。従って、基材は、本明細書で検討される結着および/または配列決定方法で用いる前に、欠陥のない平らな表面を構築する生体適合性または生物学的に不活性な素材で前処理することもできる。
(II.結着工程、ブロッキング、およびリンス工程)
(A.エポキシシラン表面へのストレプトアビジンの直接的または間接的な結着)
方法。均質に沈着した反応性エポキシシランコーティングを有するガラス表面については、Erie Scientific Company(ニューハンプシャー州、ポーツマス市)から購入し、修飾せずにそのまま使用する。ストレプトアビジンの直接的な結着には、その表面を反応性にし、蛋白質の表面のアミノ基とそのガラス表面上のエポキシド基とのランダムな架橋化を生じる。その表面を、150mMのK2HPO4(pH8.5)中に濃度170μg/mlのストレプトアビジンと共に、室温で30分インキュベートする。そのストレプトアビジンとのインキュベート、大量の150mMのK2HPO4(pH8.5)でリンス処理を行ない、続いて3×SSC、0.1%Triton、続いて3×SSCでリンスして過剰のストレプトアビジンを除去し、150mMのK2HPO4中で保存する。ストレプトアビジンの間接的な結着に関しては、ヘテロ官能性のポリ(エチレングリコール)を介して行なわれる。分子量3400の線状のHCl−NH2−PEG−COOH(Nektar Therapeutics社(アラバマ州、ハンツビル市)製)の10%w/v溶液を、150mMのK2HPO4(pH8.5)中、室温でエポキシシラン表面と種々の時間反応させ、適切な被覆を確実にする。反応後、前述と同じ大量の溶液中で徹底的なリンス処理によって過剰のPEGを除去する。残留するエポキシド官能性を下記Bの項で記載するようにブロッキング処理した後、PEGのペンダントカルボン酸基に、NHS−EDCを介在させたカップリング反応によってストレプトアビジンを共有結着させる。0.1MのMES(pH5.5)、0.5MのNaCl中に、N−ヒドロキシスクシンアミド200mMおよびEDC200mMの溶液を新鮮に(使用直前)調製する。PEGで処理した表面を、0.1MのMES(pH5.5)および0.1MのNaCl中、室温で10分間前処理し、次にその表面を乾燥させずにNHS−EDC溶液中に移して室温で15分間活性化させる。0.1MのMES(pH5.5)でリンス処理後に、0.1MのMES(pH5.5)、0.1MのNaCl中のストレプトアビジン0.14mg/ml中で、攪拌しながら表面を含浸させて室温で60分間反応させる。反応緩衝液(ストレプトアビジン不含)中でリンス処理し、さらに3×SSCおよび0.1%Tritonでリンスして、過剰のストレプトアビジンを除去する。
(A.エポキシシラン表面へのストレプトアビジンの直接的または間接的な結着)
方法。均質に沈着した反応性エポキシシランコーティングを有するガラス表面については、Erie Scientific Company(ニューハンプシャー州、ポーツマス市)から購入し、修飾せずにそのまま使用する。ストレプトアビジンの直接的な結着には、その表面を反応性にし、蛋白質の表面のアミノ基とそのガラス表面上のエポキシド基とのランダムな架橋化を生じる。その表面を、150mMのK2HPO4(pH8.5)中に濃度170μg/mlのストレプトアビジンと共に、室温で30分インキュベートする。そのストレプトアビジンとのインキュベート、大量の150mMのK2HPO4(pH8.5)でリンス処理を行ない、続いて3×SSC、0.1%Triton、続いて3×SSCでリンスして過剰のストレプトアビジンを除去し、150mMのK2HPO4中で保存する。ストレプトアビジンの間接的な結着に関しては、ヘテロ官能性のポリ(エチレングリコール)を介して行なわれる。分子量3400の線状のHCl−NH2−PEG−COOH(Nektar Therapeutics社(アラバマ州、ハンツビル市)製)の10%w/v溶液を、150mMのK2HPO4(pH8.5)中、室温でエポキシシラン表面と種々の時間反応させ、適切な被覆を確実にする。反応後、前述と同じ大量の溶液中で徹底的なリンス処理によって過剰のPEGを除去する。残留するエポキシド官能性を下記Bの項で記載するようにブロッキング処理した後、PEGのペンダントカルボン酸基に、NHS−EDCを介在させたカップリング反応によってストレプトアビジンを共有結着させる。0.1MのMES(pH5.5)、0.5MのNaCl中に、N−ヒドロキシスクシンアミド200mMおよびEDC200mMの溶液を新鮮に(使用直前)調製する。PEGで処理した表面を、0.1MのMES(pH5.5)および0.1MのNaCl中、室温で10分間前処理し、次にその表面を乾燥させずにNHS−EDC溶液中に移して室温で15分間活性化させる。0.1MのMES(pH5.5)でリンス処理後に、0.1MのMES(pH5.5)、0.1MのNaCl中のストレプトアビジン0.14mg/ml中で、攪拌しながら表面を含浸させて室温で60分間反応させる。反応緩衝液(ストレプトアビジン不含)中でリンス処理し、さらに3×SSCおよび0.1%Tritonでリンスして、過剰のストレプトアビジンを除去する。
(B.残留するエポキシド官能性のブロッキングの実効性の計測)
方法。ストレプトアビジンを直接的にカップリングまたはヘテロ官能基を有するPEGをカップリングさせた後、残留する任意のエポキシド官能性をブロッキングする。ストレプトアビジンの直接的結着の場合では、ブロッキング基の選択に関して、蛍光性ヌクレオシド三リン酸の非特異的な結合を防ぐがストレプトアビジン四量体の二次的なビオチン結合能を不安定化させない層になるように行う。その第一段階では、ストレプトアビジンで処理したエポキシシラン表面と反応し得るか、またはそれにはまり込むことが可能なエポキシド反応性のCyanine5標識化オリゴヌクレオチドの量を定量することによって、2種類の異なるストレプトアビジン固定化後に、残留する反応性エポキシの官能性が存在するならば、どの程度残存しているかが求められる。20mMのTris−塩酸、50mMのNaCl、0.001%のTritonX−100(pH8.0)中に溶解した5’−Cy5−,3’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドの100pM溶液を修飾化表面と5分間インキュベートし、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でのリンス、さらに3×SSC+0.1%TritonX−100溶液でのリンス、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でリンスよって、過剰の標識化オリゴヌクレオチドを除去する。さらにいくつかのスライドも同様に繰返して形成する。
方法。ストレプトアビジンを直接的にカップリングまたはヘテロ官能基を有するPEGをカップリングさせた後、残留する任意のエポキシド官能性をブロッキングする。ストレプトアビジンの直接的結着の場合では、ブロッキング基の選択に関して、蛍光性ヌクレオシド三リン酸の非特異的な結合を防ぐがストレプトアビジン四量体の二次的なビオチン結合能を不安定化させない層になるように行う。その第一段階では、ストレプトアビジンで処理したエポキシシラン表面と反応し得るか、またはそれにはまり込むことが可能なエポキシド反応性のCyanine5標識化オリゴヌクレオチドの量を定量することによって、2種類の異なるストレプトアビジン固定化後に、残留する反応性エポキシの官能性が存在するならば、どの程度残存しているかが求められる。20mMのTris−塩酸、50mMのNaCl、0.001%のTritonX−100(pH8.0)中に溶解した5’−Cy5−,3’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドの100pM溶液を修飾化表面と5分間インキュベートし、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でのリンス、さらに3×SSC+0.1%TritonX−100溶液でのリンス、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でリンスよって、過剰の標識化オリゴヌクレオチドを除去する。さらにいくつかのスライドも同様に繰返して形成する。
表面の非特異的吸収特性に種々のブロッキング法が及ぼす影響については、ストレプトアビジン修飾化表面を(直接またはPEG化させて)異なるブロッキング剤と反応させることによって求められる。蛍光標識化ヌクレオシド三リン酸は中性pH域で負に荷電しているため、数種類の中性または負に荷電したブロッキング剤の効果を利用する。以下の試薬を、両タイプの表面でのブロッキング剤とする。
1Mのトリス/150mMのK2HPO4(pH8.5)溶液
1Mのエタノールアミン溶液
1Mのモノ官能性PEG−NH2(分子量5000)溶液
1Mのグリシン溶液
1MのKHPO4(pH8.5)溶液。
1Mのエタノールアミン溶液
1Mのモノ官能性PEG−NH2(分子量5000)溶液
1Mのグリシン溶液
1MのKHPO4(pH8.5)溶液。
反応後のスライドを大量の150mMのK2PO4(pH8.5)で強くリンスし、さらに3×SSCでリンス後にH2Oでリンスする。ここで再びブロッキング後に残留するエポキシドの官能性について、上述で挙げた試薬の各々でブロッキングを試みることによってストレプトアビジン固定化の各方法による複製スライドを試験する。20mMのトリス−HCl、50mMのNaCl、0.001%のTritonX−100(pH8.0)中の5’−Cy5、3’−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドの100pM溶液を、修飾表面と5分間インキュベートし、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でリンスし、さらに3×SSC+0.1%Triton溶液でリンス後に、オリゴヌクレオチド不含の反応緩衝液でリンスして過剰の標識化オリゴヌクレオチドを除去する。次いで、複製スライドを画像化し、ブロッキングの範囲を決定する。
(III.配列決定工程)
標的となる核酸テンプレートについては、種々のソースに由来するものが可能である。例えば、核酸テンプレートは、当該分野で公知の任意の供給源から単離された天然に存在するDNAまたはRNA、組換え分子、cDNA、あるいは合成類似体であり得る。例えば、標的核酸テンプレートには、ゲノムDNA、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、開始領域および終結領域、発現制御因子、発現調節体、ならびにそれ以外の領域)、1個または複数の一塩基多型(SNP)含有のDNA、対立遺伝子変異体、およびその他の突然変異体であり得る。。
標的となる核酸テンプレートについては、種々のソースに由来するものが可能である。例えば、核酸テンプレートは、当該分野で公知の任意の供給源から単離された天然に存在するDNAまたはRNA、組換え分子、cDNA、あるいは合成類似体であり得る。例えば、標的核酸テンプレートには、ゲノムDNA、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、開始領域および終結領域、発現制御因子、発現調節体、ならびにそれ以外の領域)、1個または複数の一塩基多型(SNP)含有のDNA、対立遺伝子変異体、およびその他の突然変異体であり得る。。
核酸テンプレートは、ヒト、動物、植物、細菌またはウイルスうちの任意の細胞から得られ得、病原性微生物または他の細胞生物体を含む。個体の核酸を分析のために単離し得る。分析のための標的核酸テンプレートは、患者から、例えば、血液、尿、脳脊髄液、精液、唾液、乳頭吸引液、喀痰、便および生検組織から直接得ることができる。組織または体液の検体のいずれも、本発明の方法により使用できる。
本発明で用いられる標的核酸の単離および精製には、多くの方法が利用できる。標的分子または標的核酸については、標的特異的なプライマーのアニーリングおよび伸張反応を可能にするために、蛋白質およびその他の干渉性物質が充分に除かれたものが好ましい。好適な精製方法には、(i)有機溶媒による抽出後のエタノール沈殿法、例えば、フェノール/クロロホルム有機試薬を用いる方法、好ましくは例えば、PE Applied Biosystems社(カリフォルニア州、フォスターシティー市)から購入可能なModel 341 DNA Extractor(商品名)のような自動化DNA抽出装置を用いる方法、(ii)固相吸着方法、および(iii)「塩析」法と一般に呼ばれるような、塩によるDNA沈殿方法が挙げられる。示適には、酵素消化工程(例えば、プロテナーゼKまたはその他の類似のプロテアーゼによる消化)を行なって前述の精製法の各々を遂行し、試料からの蛋白質の除去を容易にする。
標的核酸は、基材(例えば、ガラススライド、プラスチックスライド、ナイロン膜、またはゲルマトリックス)の表面に固定化される。標的核酸をプライマーとハイブリダイズさせて標的核酸−プライマー複合体を形成する。その後、ポリメラーゼおよびヌクレオチド(例えば、dATP、dTTP、dUTP,dCTPおよび/またはdGTP)またはヌクレオチド類似体を用いて、標的核酸またはプライマーの配列決定のためのプライマー伸張反応を行なう。ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込みは、その基材上の分離された位置において検出される。核酸−プライマー複合体は、取り込みまれたヌクレオチドと同じく、単分子の実施形態においてそれぞれ分離可能である。換言すれば、混合した核酸の集団または核酸のクローン集団からまとまった信号が得られる。
迅速な試薬の適用および除去は、本発明による別の利点になる。例えば、ヌクレオチドの濃縮および/またはその他の試薬類は、分析の異なる時点で変更可能である。これによって、取り込みの速度および感度が増大すし得る。例えば、4種のすべてのタイプのヌクレオチドが、ヌクレオチド取り込みの動向をモニターする反応において同時に存在する場合は、各ヌクレオチドの濃度を第一および第二のレンジの間で代替することが可能である。これによって、ヌクレオチド濃度が低い時では信号の可視化がいっそう良好となり、かつヌクレオチド濃度がさらに高い時では重合反応速度がさらに増大するようになる。
本発明のある実施形態では、本発明以外の配列決定方法でみられる問題の多くが避けられる。例を挙げると、本明細書において提供される方法は、多数の分子を高密度(例えば、1cm2あたり、100万または200万個の分子)で同時に分析可能であるため、高い並行処理性を有する。したがって本発明の方法およびデバイスによると、単一基材表面で多数の異なる核酸を同時に配列決定または分析することが可能になる。
核酸標的にプライマーをハイブリダイズさせる条件については、よく知られている。アニーリング反応については、配列特異性を保証するのに充分であるが、安定したハイブリッドの形成が許容される速度で充分可能である厳密な条件下で実施される。プライマーのアニーリングに必要な温度および時間の長さについてはいくつかの要因に依存し、これら要因としては、塩基の組成、プライマーの長さおよび濃度、および用いる溶媒の性質、例えば、DMSO(ジメチルスルホキシド)、ホルムアミドまたはグリセリンのような共溶媒の濃度、およびマグネシウムのような対イオンが挙げられれる。合成核酸を用いるハイブリダイゼーション(アニーリング)は、一般にアニーリング溶媒中での標的−プライマーハイブリッドの融解温度よりも約5−10℃低い温度で行なわれる。アニーリングの温度については一般に55−75℃の範囲であり、プライマーの濃度は約0.2μMである。そのような条件下では、アニーリング反応は通常、数秒以内で完了する。
本発明による方法には、少なくとも一種の分子と第一の検出可能な標識化部分とを含む反応の実施、および基材上に存在する任意の他の検出可能な標識のいずれからとも隔離した、第一の検出可能な標識部分の観測が含まれる。
本発明による方法には、少なくとも1個の塩基によって核酸を伸張させるのに充分な条件下で核酸をプライマーに曝露させるような、プライマーの伸張反応の実施も含まれる。本発明による方法には、プライマー中に伸張塩基を連続して取り込みませることに基づく分子(核酸)配列の編集工程も含まれる。
基材に核酸を固着させることで、取り込みまれていないヌクレオチドを洗浄工程によって基材から取り除くことができる。いくつかの実施形態では、基材は溶融シリカスライド(例えば、Esso社製の溶融シリガラススライド、カタログNo.R130110)製である。溶融シリカは、それ以外の基材素材(例えば、通常のガラススライド)と比較して、自己蛍光が極めて低く、ある実施形態では望ましいものと言える。
本発明の方法およびデバイスによると、種々の外形が可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸はプライマーとのハイブリダイゼーションの前に表面に固定化される。その代替として、標的核酸は最初にプライマーとハイブリダイズさせ得、その後で基材表面に固定化する。その他の実施形態では、プライマーを基材表面に固定化し、次にそのプライマーとのハイブリダイゼーションを介して標的核酸を基材に固着させる。プライマーを、重合反応用のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の供給の前に標的核酸にハイブリダイズさせるか、あるいはヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の供給時にプライマーを標的核酸とハイブリダイズさせ得る。本発明は、基材表面に固定化されたポリメラーゼの適用も企図する。
基材表面に標的核酸またはプライマーを固着または固定化させるのには、種々の方法を用いることができる。固定化は、基材表面に直接または間接的に結合させて行なうことができる。結合には共有結合的な連結が可能である。それについてはJoosらのAnalytical Biochemistry,247:96−101,1997;OroskarらのClin.Chem.,42:1547−1555,1996;およびKhandjianのMole.Bio.Rep.,11:107−115,1986を参照のこと。結合は非共有的な連結によるものも可能である。例えば、ビオチン−ストレプトアビジン結合(Taylorら、J.Phys.D.Appl.Phys.,24:1443,1991)およびジゴキシゲニンの抗ジゴキシゲニン抗体との結合(Smithら、Science,253:1122,1992)は、両方とも基材表面に核酸を固着させるのに一般的なツールであり、並列する。あるいは、脂質単層または脂質二重層内に疎水性鎖を固着させることによる結着も可能である。担体への核酸結着方法については、当該分野で公知の他の方法も用いることができる。
核酸の結着にビオチン−ストレプトアビジンの連結を用いる場合は、核酸をビオチン化し、基材の一方の面をストレプトアブジンでコーティングすることが可能である。ストレプトアビジンは四量体であるため、1分子あたり、4個のビオチン結合サイトを持つ。したがって基材表面と核酸との連結が可能となる。基材表面をストレプトアビジンでコーティングするためには、最初に表面をビオチン化し、次にストレプトアビジンの4個の結合サイトのうちの1個を、その表面への蛋白質の固着に用い、それ以外の結合サイトはビオチン化核酸の結合用にフリーの状態にしておくことができる(Taylorら、J.Phys.D.Appl.Phys.,24:1443,1991参照)。そのような処理によって、高密度テンプレート適用域に相当するように基材表面に高密度のストレプトアビジンを存在させることができる。核酸分子の表面密度については、表面に適用された核酸の濃度を調節して制御することができる。基材表面のビオチン化用試薬については、例えば、Vector Laboratories社から購入することができる。その代わりとして、ビオチン化はBLCPA、すなわちEZ−Link Biochin LC−PEO−Amine(商品名)(Pierce社製、カタログ番号21347)を用いるか、あるいはその他の既知または一般的な方法でも実施可能である。
いくつかの実施形態では、固着工程の前に低濃度(例えば、μM、nMまたはpM域)の標識化ストレプトアビジンが基材表面のコーティングに用いられる。これによって、単分子分離を可能にする核酸固定化が容易になる。またこれによって、基材上のスポットを検出して核酸分子の結着位置を求め、それに続くヌクレオチド取り込み事象をモニターすることも可能になる。
本発明の他の実施形態では、単分子配列決定方法論によって配列決定を行なうのに適した生物活性を有する核酸を含む表面に、再現性を持って結着させる、プライマー/テンプレート固着方法が提供される。単分子レベルで配列決定を行う場合、テンプレートは定着した状態にあり、基材上で可能な限り安定であることが重要である。例えば、本発明によるプライマーおよび/またはテンプレートには、ポリA、ポリT、ポリC、ポリUおよび/またはポリGのテール部分が含まれ得る。いくつかの実施形態では、プライマーおよび/またはテンプレートには、平均テール長が約50塩基またはそれ以上(平均長域は約10〜約100塩基以上)のテール部分が含まれ得る。他の実施形態では、プライマーおよび/またはテンプレートには、が約50塩基未満の平均テール長、例えば、平均5〜10塩基を含み得る。プライマーおよびテンプレートは、異なるが相補的である塩基を有するテール部分を含むのが好ましい。プライマー/テンプレートのホモポリマーは、プライマー/テンプレートの整列を定位置に「ロック」する最初の塩基が加えてまでのまで前後にスライドする。さらに塩基を追加してプライマー/テンプレートの配置をさらに「ロック」することもできる。
異なる核酸分子を別々の基材に各々、固定して配列決定を可能にする一方で、多重核酸を単一基材上で分析することも可能である。後者の場合、テンプレートは基材上の異なる位置に結合させることができる。このことは種々の異なる方法で行なうことができ、それには基材上の異なる位置に固定化された核酸へのプライマー捕捉配列のハイブリダイゼーションが含まれる。
ある実施形態では、分子個々の読取りが他の分子から独立して解析できるように、異なる核酸を基材表面にランダムに結着させることも可能である。核酸および/または蛋白質を結着させるその他の既知のいずれの方法も用いることができる。
(C.検出)
使用される標識のタイプに適している任意の検出方法が使用され得る。したがって検出法の例としては、放射活性の検出、吸光度の検出(例えば、紫外−可視光吸収の検出)、ならびに光学放射(例えば、蛍光または化学発光)の検出が挙げられる。例えば、伸張反応後のプライマーは、用いる走査法に依存して、同時または連続的に基材の全体または一部を走査することによって、基材上で検出することができる。蛍光標識については、Fodor(1995)およびMathiesら(1992)によって記載されたように、蛍光顕微鏡装置を用いて、1個ずつまたは列ごとに、基材上の選択された領域が連続的に走査され得る。ハイブリダイゼーションパターンもまた、Yershovら(1996)によって記載されたような、適した光学系(Ploem、1993)を備えるCCDカメラ(例えば、Princeton Instruments社(米国、ニュージャージー州、トレントン市)製のModel TE/CCD512SF(商品名))を用いて走査されてもよいし、TVモニタリング(Khrapko、1991)によって画像化されてもよい。放射活性シグナルについては、リン光画像化デバイス(Johnstonら、1990;ならびにDrmanacら、1992;および1993)を用いることができる。その他の画像化機器の供給業者としては、General Scanning Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウオータータウン市;www.genscan.com)、Genix Technologies(カナダ、オンタリオ州、ウオータールー市;www.confocal.com)、およびApplied Precision Inc.が挙げられる。このような検出方法は、多重のタグ相補領域の同時走査を達成するのに特に有用である。
使用される標識のタイプに適している任意の検出方法が使用され得る。したがって検出法の例としては、放射活性の検出、吸光度の検出(例えば、紫外−可視光吸収の検出)、ならびに光学放射(例えば、蛍光または化学発光)の検出が挙げられる。例えば、伸張反応後のプライマーは、用いる走査法に依存して、同時または連続的に基材の全体または一部を走査することによって、基材上で検出することができる。蛍光標識については、Fodor(1995)およびMathiesら(1992)によって記載されたように、蛍光顕微鏡装置を用いて、1個ずつまたは列ごとに、基材上の選択された領域が連続的に走査され得る。ハイブリダイゼーションパターンもまた、Yershovら(1996)によって記載されたような、適した光学系(Ploem、1993)を備えるCCDカメラ(例えば、Princeton Instruments社(米国、ニュージャージー州、トレントン市)製のModel TE/CCD512SF(商品名))を用いて走査されてもよいし、TVモニタリング(Khrapko、1991)によって画像化されてもよい。放射活性シグナルについては、リン光画像化デバイス(Johnstonら、1990;ならびにDrmanacら、1992;および1993)を用いることができる。その他の画像化機器の供給業者としては、General Scanning Inc.(米国、マサチューセッツ州、ウオータータウン市;www.genscan.com)、Genix Technologies(カナダ、オンタリオ州、ウオータールー市;www.confocal.com)、およびApplied Precision Inc.が挙げられる。このような検出方法は、多重のタグ相補領域の同時走査を達成するのに特に有用である。
本発明は、単一の標的核酸分子中の単一ヌクレオチドの検出を提供する。この目的には多数の方法が利用できる。介在色素で標識化された核酸中の単一分子を可視化する方法には、例えば、蛍光顕微鏡が挙げられる。例えば、励起状態の単一分子の蛍光スペクトルおよび半減期が測定され得る。光電子倍増管またはアバランシェフォトダイオードのような標準的な検出器を用いることができる。また二段画像増強化CCDカメラを用いる全領域の画像化も用いることができる。さらに低ノイズ冷却CCDも、単一蛍光分子の検出に用いることができる。
シグナル検出系は、使用される標識部分に依存する可能性がある。これは、利用可能な化学によって規定され得る。光学シグナルに関しては、光ファイバーまたは電荷結合素子(CCD)の組合わせを、検出工程に用いることができる。基材自体が使用する放射線を透過する状況では、基材の反対側に配置された検出器を用いて、入射光ビームを標的核酸から基材に通過させることができる。電磁気標識部分については、種々の形態の分光学的システムを用いることができる。検出系のための種々の物理的な配向性が利用でき、重要な設計パラメータ類の検討は当該分野に提供されている。
蛍光標識されたヌクレオチドの単一核酸分子への取り込みを検出するために、多数のアプローチが使用され得る。光学的構成には、近視野走査顕微鏡、遠視野共焦点顕微鏡、広視野エピイルミネーション、光散乱、暗視野顕微鏡、光変換、単一および/または多重光子励起、スペクトル波長識別、フルオロフォア同定、消散波長イルミネーション、および内部全反射蛍光(TIRF)顕微鏡が含まれる。一般に、カメラが装着された顕微鏡を用い、レーザーで活性化した蛍光を検出する。それは高効率光子検出系を指す場合もある。適する光子検出系には、光電変換半導体素子および増強CCDカメラが含まれるが、それらに限定されない。例えば、増強電荷結合素子(ICCD)カメラを用いることができる。基材表面付近の流体中のそれぞれの蛍光色素分子を画像化するのにICCDカメラを用いると、多くの利点が得られる。例えば、ICCD光学構成を用いると、フルオロフォアの一連の画像(動画)を得ることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、2次元画像化に内部全反射蛍光(TIRF)顕微鏡が用いられる。TIRF顕微鏡は、内部反射された全励起光を用いるもので、当業者には周知である。それについては、例えば、www.nikon−instruments.jp/eng/page/products/tirf.aspx.を参照のこと。ある実施形態では、エバネッセント波長イルミネーションおよび内部全反射蛍光顕微鏡を用いて検出が行なわれる。蛍光標識化核酸分子の画像化のために、例えば、基材表面にエバネッセント光の場を構築することができる。液体と固体基材(例えば、ガラス)との間の接触面でレーザービームがすべて反射する場合は、励起光ビームは短い距離だけ液体中に浸透する。換言すれば、光学場は反射性接触面で突然終わるのではなく、その強度が距離に応じて指数関数的に減衰する。この表面の電磁場は、「エバネッセント波」と呼ばれており、接触面付近の液体中で蛍光分子を選択的に励起させることができる。接触面での弱いエバレッセント光学場によって、バックグランドが低下し、可視波長域での信号対ノイズ比が高い状態で単分子検出が容易になる。
エバレッセント場は、ポリメラーゼ存在下での固定化標的核酸−プライマー複合体中への蛍光標識化ヌクレオチドの取り込みの際に、その蛍光標識化ヌクレオチドを画像化することもできる。次いで内部全反射(TIR)蛍光顕微鏡が、固定化標的核酸−プライマー複合体および/または取り込みまれたヌクレオチドを単分子解像度で可視化するのに使用される。
測定された信号は、手動で、またはコンピュータを用いる方法によって解析され、結果を表にまとめることができる。基材および反応条件としては、ハイブリダイゼーションの完全性および伸張の条件の検証ため、および所望される場合は定量用の標準曲線を提供するためのコントロールを含み得る。例えば、試料中に存在することが既知である標的核酸(または試料中に加えられた標的核酸配列)を伸長するために、核酸試料にコントロールプライマーを加えることができる。装う去れた伸張産物の非存在は、試料またはアッセイ構成成分に、補正が必要な欠陥があることを示す。
以下の実施例1〜12は、標的核酸の固定化のための基材表面を調製する方法およびデバイスを例示するものである。一般的に、実施例1〜12は、単一分子がそれぞれ光学的に分解され得るように基材表面を処理するために、実施された。
(実施例1)
市販のアルデヒド修飾化「SuperAldehyde」スライド(TeleChem International社(米国、カリホルニア州、サニーベイル市)製、ロット番号000529および000831)に、その製造業者が提供するプロトコールに従って、アミン修飾化したオリゴヌクレオチドを結着させた。オリゴヌクレオチドの濃度は、0.5×ArrayIt Microスポッティング溶液(TeleChem International社(米国、カリホルニア州、サニーベイル市)製)中、25μMであった。スポッティング後に非結合状態のオリゴヌクレオチドを除去し、過剰なアルデヒド基を不活化するために、スライドを以下のプロトコールで処理した。すなわち、0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で2回、各々5分間洗浄し、蒸留水で2回、各々5分間洗浄し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)75mlおよび25mlのEtOHに溶解した0.25gのNa2BH4含有溶液中で1回洗浄した。さらに、スライドを0.2%のSDSで3回、各々1分間洗浄し、蒸留水で2回、各々1分間洗浄した。これらのスライドの名称を「SuperAldehyde1」とした。このプロトコールで使用した一つの変更としては、スライドを0.05MのNaCNBH3および0.01MのNaOHを含む0.1Mトリス−HCl(pH8.0)溶液中で15分間温置したことが挙げられる。このスライドを、次に0.2%のSDSで3回、各々1分間洗浄し、蒸留水で1回洗浄した。これらのスライドの名称を「SuperAldehyde2」とした。「SuperAldehyde」スライドは、いずれも乾燥させて20℃で保存した。
市販のアルデヒド修飾化「SuperAldehyde」スライド(TeleChem International社(米国、カリホルニア州、サニーベイル市)製、ロット番号000529および000831)に、その製造業者が提供するプロトコールに従って、アミン修飾化したオリゴヌクレオチドを結着させた。オリゴヌクレオチドの濃度は、0.5×ArrayIt Microスポッティング溶液(TeleChem International社(米国、カリホルニア州、サニーベイル市)製)中、25μMであった。スポッティング後に非結合状態のオリゴヌクレオチドを除去し、過剰なアルデヒド基を不活化するために、スライドを以下のプロトコールで処理した。すなわち、0.2%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で2回、各々5分間洗浄し、蒸留水で2回、各々5分間洗浄し、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)75mlおよび25mlのEtOHに溶解した0.25gのNa2BH4含有溶液中で1回洗浄した。さらに、スライドを0.2%のSDSで3回、各々1分間洗浄し、蒸留水で2回、各々1分間洗浄した。これらのスライドの名称を「SuperAldehyde1」とした。このプロトコールで使用した一つの変更としては、スライドを0.05MのNaCNBH3および0.01MのNaOHを含む0.1Mトリス−HCl(pH8.0)溶液中で15分間温置したことが挙げられる。このスライドを、次に0.2%のSDSで3回、各々1分間洗浄し、蒸留水で1回洗浄した。これらのスライドの名称を「SuperAldehyde2」とした。「SuperAldehyde」スライドは、いずれも乾燥させて20℃で保存した。
(実施例2)
3D−LinkTMスライド(SurModics社(米国、ミネソナ州、エデンプレーリ市)製)に、その製造業者が提供するプロトコールに従って、アミン修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた。オリゴヌクレオチドは、150mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)中に、25μMの濃度で溶解した。プリント後に、アレイを相対湿度75%のチャンバー(SurModics社(米国、ミネソタ州、エーデンプレーリ市)製)内で4〜72時間保存した。50mMのエタノールアミン、0.1Mのトリス−HCl(pH9.0)および0.1%のSDSを含有する溶液中で、50℃で15分間、過剰なアミン反応基を不活化させた。それらのスライドを蒸留水で洗浄し、さらに4×SSCおよび0.1%のSDSを含有する50℃の溶液中で15〜60分間洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。それらのスライドは、使用時まで20℃で乾燥させて保存した。
3D−LinkTMスライド(SurModics社(米国、ミネソナ州、エデンプレーリ市)製)に、その製造業者が提供するプロトコールに従って、アミン修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた。オリゴヌクレオチドは、150mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)中に、25μMの濃度で溶解した。プリント後に、アレイを相対湿度75%のチャンバー(SurModics社(米国、ミネソタ州、エーデンプレーリ市)製)内で4〜72時間保存した。50mMのエタノールアミン、0.1Mのトリス−HCl(pH9.0)および0.1%のSDSを含有する溶液中で、50℃で15分間、過剰なアミン反応基を不活化させた。それらのスライドを蒸留水で洗浄し、さらに4×SSCおよび0.1%のSDSを含有する50℃の溶液中で15〜60分間洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。それらのスライドは、使用時まで20℃で乾燥させて保存した。
(実施例3)
市販のメルカプトシラン誘導化スライド(Orchid Bioscience社(ニュージャージー州、プリンストン市)製)に結着させたヌクレオチドを、5’−ジスルフィド基(Operon Technologies社(カリホルニア州、アラメダ市)製)で修飾し、0.5Mの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)および0.02%SDS溶液中に、25μMの濃度まで希釈した。スポッティング後に、スライドを相対湿度75%のチャンバー内で5分間から一晩保存した。次に、10mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaClおよび0.05%のTween−20含有溶液で、スライドを3回洗浄した。蒸留水で洗浄後、スライドを乾燥させ、使用時まで20℃で保存した。メルカプトシラン表面のスライドにアクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチド(Sigma−Genosys社(英国、ケンブリッジ市)製)を結着させるために、そのオリゴヌクレオチドを、後述のEZ−RAYSTMスライド(Mosaic Technologies(米国、マサチューセッツ州、ウオルザム市)製)への結着のように、溶解した。スポッティング後の手順は、ジスルフィド修飾化オリゴヌクレオチドの場合で述べたのと同様であった。
市販のメルカプトシラン誘導化スライド(Orchid Bioscience社(ニュージャージー州、プリンストン市)製)に結着させたヌクレオチドを、5’−ジスルフィド基(Operon Technologies社(カリホルニア州、アラメダ市)製)で修飾し、0.5Mの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)および0.02%SDS溶液中に、25μMの濃度まで希釈した。スポッティング後に、スライドを相対湿度75%のチャンバー内で5分間から一晩保存した。次に、10mMのトリス−HCl(pH7.5)、150mMのNaClおよび0.05%のTween−20含有溶液で、スライドを3回洗浄した。蒸留水で洗浄後、スライドを乾燥させ、使用時まで20℃で保存した。メルカプトシラン表面のスライドにアクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチド(Sigma−Genosys社(英国、ケンブリッジ市)製)を結着させるために、そのオリゴヌクレオチドを、後述のEZ−RAYSTMスライド(Mosaic Technologies(米国、マサチューセッツ州、ウオルザム市)製)への結着のように、溶解した。スポッティング後の手順は、ジスルフィド修飾化オリゴヌクレオチドの場合で述べたのと同様であった。
(実施例4)
EZ−RAYSTMスライドに、製造業者が提供する2000年12月1日版のプロトコールに従って、アクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた。このオリゴヌクレオチドは、0.0008%のN−ラウロイルサルコシン含有の100mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)中に、最終濃度25μMで溶解した。スライド上に潜在するチオール基は、オリゴヌクレオチドのスポッティング前に、45mlの蒸留水中0.64gのトリス(カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩含有溶液中で、15−30分間活性化させた。スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、20℃で乾燥させ、オリゴヌクレオチドをスポットし、配列形成後にアレイを20℃で60分間以上放置した。配列形成の後の処理は、アクリル酸ナトリウム含有のクエンチ緩衝液(Mosaic Technologies(米国、マサチューセッツ州、ウオルザム市)製)40ml中でアレイを30分間浸漬する工程、および1mMのNa2EDTAを加えた10mMのトリス−HCl(pH8.0)で2回、各々5分間洗浄する工程を包含する。最後に、アレイを蒸留水で簡単にリンスした。スライドは使用時まで20℃で保存した。ジスルフィド修飾化オリゴヌクレオチドも、EZ−RAYSTMスライドに結着させた。これらのオリゴヌクレオチドは、0.5Mの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)および0.02%SDS中に、25μMの濃度で希釈した。スポッティング後の手順は、EZ−RAYSTMスライドにアクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた場合で述べたのと同様に行った。
EZ−RAYSTMスライドに、製造業者が提供する2000年12月1日版のプロトコールに従って、アクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた。このオリゴヌクレオチドは、0.0008%のN−ラウロイルサルコシン含有の100mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.0)中に、最終濃度25μMで溶解した。スライド上に潜在するチオール基は、オリゴヌクレオチドのスポッティング前に、45mlの蒸留水中0.64gのトリス(カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩含有溶液中で、15−30分間活性化させた。スライドを蒸留水で簡単に洗浄し、20℃で乾燥させ、オリゴヌクレオチドをスポットし、配列形成後にアレイを20℃で60分間以上放置した。配列形成の後の処理は、アクリル酸ナトリウム含有のクエンチ緩衝液(Mosaic Technologies(米国、マサチューセッツ州、ウオルザム市)製)40ml中でアレイを30分間浸漬する工程、および1mMのNa2EDTAを加えた10mMのトリス−HCl(pH8.0)で2回、各々5分間洗浄する工程を包含する。最後に、アレイを蒸留水で簡単にリンスした。スライドは使用時まで20℃で保存した。ジスルフィド修飾化オリゴヌクレオチドも、EZ−RAYSTMスライドに結着させた。これらのオリゴヌクレオチドは、0.5Mの炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.0)および0.02%SDS中に、25μMの濃度で希釈した。スポッティング後の手順は、EZ−RAYSTMスライドにアクリルアミド修飾化オリゴヌクレオチドを結着させた場合で述べたのと同様に行った。
(実施例5)
Kumarらの記載した方法を僅かに変更して、非修飾化ガラス表面(Menzel−Gluser社(独国、ブラウンシュバイヒ市)製)に、シラン化オリゴヌクレオチド(Interactiva Biotechnologie GmbH(ドイツ、ウルム市)製)を固定化させた。スライドは、スポットの拡散および相互の混合が起きるために、スポッティング前には洗浄しなかった。最後に、スライドを風乾させ、使用時まで20℃で保存した。オリゴヌクレオチドの濃度は15μMであり、DMSO/H2O2:1(eNOS co)およびDMSO/H2O1:1(eNOS nc)中に溶解した。
Kumarらの記載した方法を僅かに変更して、非修飾化ガラス表面(Menzel−Gluser社(独国、ブラウンシュバイヒ市)製)に、シラン化オリゴヌクレオチド(Interactiva Biotechnologie GmbH(ドイツ、ウルム市)製)を固定化させた。スライドは、スポットの拡散および相互の混合が起きるために、スポッティング前には洗浄しなかった。最後に、スライドを風乾させ、使用時まで20℃で保存した。オリゴヌクレオチドの濃度は15μMであり、DMSO/H2O2:1(eNOS co)およびDMSO/H2O1:1(eNOS nc)中に溶解した。
(実施例6)
以下の実施例は、標的核酸固定化用のPEM表面を用いる、単分子配列決定法およびそのデバイスの例を示すものである。
以下の実施例は、標的核酸固定化用のPEM表面を用いる、単分子配列決定法およびそのデバイスの例を示すものである。
DNAテンプレートの結着には、溶融シリカ製の顕微鏡スライド(厚さ1mm、大きさ25×75mm、Escoカタログ番号R130110)を用いた。スライドは、最初にRCAで浄化した。ガラススライドを2%のMicro−90(商品名)溶液(Cole−Palmer社製)中で30分間超音波処理した。超音波処理後に、スライドをMilliQ(商品名)(Millipore社製)の流水の中で8分間リンスし、リンス後にMilliQ水中で保存した。そのリンスしたスライドを次に、MilliQ水/28%NH4OH/30%H2O2(6:4:1)含有50ml容ビーカー内で、60℃で90分間加熱処理した。次いで、スライドをMilliQ水中でリンスし、保存した。RCA浄化法については、国際公開第01/32930号(本明細書中に参考として援用される)にも記載されている。
そのスライドに、ポリアリルアミン/ポリアクリル酸の多層を吸収させた。次に、以下のように、スライドにEZ結合のコネクターを結着させた。すなわち、スライドを乾燥させ、ダイヤモンドペンシルで傷を付け、ハイブリダイゼーションチャンバーで覆った。各スライドに、50mMのEDC/50mMのBLCPA/10mMのMES(1:1:8)混液120μlを塗布した。20分間のインキュベーション後、スライドにStreptavidin Plusの0.1mg/ml希釈溶液120μlを加えた。20分間インキュベーション後、スライドを10μMのトリス200μlで洗浄した。
10pMのOligoの調製:7G核酸テンプレートを、トリス−MgCl2緩衝液中でCyS標識化プライマーと予めハイブリダイズさせた。この処理したスライドを、TIR顕微鏡でコンタミネーションについて試験した。標的核酸/プライマー混液200μlを各スライド上に塗布した。10分間インキュベーション後、スライドを10mMのトリス200μlで洗浄した。
ヌクレオチドおよびポリメラーゼの添加:dTTP,dATP,dGTPおよびCy3−dCTPの各ヌクレオチドを、ECOPOL緩衝液に濃度20−100nMで混合した。そのヌクレオチド混合物200μlに、Klenow210Sを、保存溶液(−20℃で保存)から1μl取り出して加えた。次にその混合液120μlを、各スライド上に加えた。0〜30分間(異なる実験について)インキュベーション後、スライドをTIR顕微鏡で検査した。他に記載がない場合は、全ての反応は室温で行なったが、反応用試薬は4℃または−20℃で保存した。プライマー/核酸ハイブリダイゼーション反応は、サーマルサイクラー機器を用いて行った。
単分子分離は、1個のテンプレート分子のみがスライド上の別個のスポットに結着するのを確実にする低濃度の核酸テンプレートを用いて行った。別個のスポットへの単分子の結着については、結着したフルオロフォアの単一退色パターンを観測することによっても確認される。上記の反応で、約10pM濃度の80マーオリゴヌクレオチドテンプレートを、スライドに固定化するのに用いた。スライド表面に結着した異なるDNA分子間のスペースを測定した結果、数μmであった。
単分子分離での画像化:図1に示すように、標的分子の相補鎖内へのヌクレオチド分子の取り込みを、本発明によって検出および画像化した。図1は、基材表面で並行分析された2種類の異なる標的核酸を示す。例えば、標識化アデニンヌクレオチド(A*)の標的核酸の一つの相補鎖内への取り込みが、上の図に示したスポットで示されるように、基材上に可視化させる。その後で、例えば、標識化チミンヌクレオチド(T*)の異なる標的核酸の相補鎖内への取り込みが、基材表面の異なる配置に対応して、異なる視野位置上のスポットとして見ることができる。両鎖中にヌクレオチドが取り込みまれる場合、例えば、2個のA*の場合は、対応する位置で2個のスポットを検出することができ、それによって標的核酸2個の各々の相補鎖内への取り込みが存在することが示される。
図2に図解するように、Cy5標識化プライマーでプライムされた一本鎖オリゴヌクレオチドテンプレートを、溶融シリカスライド表面にビオチン−ストレプトアブジン系を用いて固定化した。核酸の固定化のためにPEMで基材をコーティングする例として概略図に挙げたものを以下に示す。
カルボン酸基はpH7では負に荷電しており、また一般に共有結合を形成させるための標的となる。基材表面の末端をカルボン酸基にすると、負に強く荷電しかつ化学反応性を有する表面が生成する。特にアミン類は、カルボン酸基と連結してアミド結合を形成して反応を触媒することができ、それには例えば、カルボジイミド類による方法が挙げられる。したがって、末端の一方にビオチン、親水性スペーサー、および末端の他方にアミンを有する分子を用いて、基材表面の末端をビオチンにすることができる。
ストレプトアビジンは、ビオチンで末端化した表面をビオチン捕捉性の表面に変換することができる。つづいて、僅かに負電荷を帯びているストレプトアビジンを用いて核酸テンプレートを結着させ、ビオチン化プライマーを用いて表面を分析することができる。多価性塩の濃度が高い緩衝液を用いることで、負に荷電したDNAが負に荷電した表面から斥力ではじかれるのを防ぐことができる。
PEMでをコーティングするには、まずガラスカバースリップを、高度精製水(18.3MΩ−cmまで脱イオン化した水を孔径0.2μmのフィルターでろ過したもの)、およびRCA溶液(高度精製水/30%NH4OH/30%H2O2(6:4:1)混液)で浄化することで可能となる。次にそのカバースリップを、2%Micro90(商品名)洗剤中で20分間超音波処理することができる。カバースリップを高度精製水で完全にリンスした後、RCA溶液中で攪拌しながら少なくとも1時間穏やかに加熱処理し、高度精製水で再度リンスすることができる。
ガラスカバースリップは浄化後に、PAII溶液(ポリ(アリルアミン)(PAII,+)2mg/ml高度精製水(pH7.0))に浸漬させ、少なくとも10分間激しく攪拌することができる。次にカバースリップをPAII溶液から取出し、高度精製水中に浸漬させて激しく攪拌する工程を少なくとも3回繰返して洗浄することができる。処理については、PAcr溶液(ポリ(アクリル酸)(PAcr,+)2mg/ml高度精製水(pH7.0))中で少なくとも10分間激しく撹拌し、高度精製水で洗浄することでも継続できる。それらの処理工程はさらに1回繰返すこともできる。
PEMコート後に、PEMコート化ガラスを、EDC/BLCPA溶液中で30分間温置することができる。EDC/BLCPA溶液については、50mMのEDC(MES緩衝液)溶液と50mMのBLCPA(MES緩衝液)溶液とを同量で混合し、さらにMES緩衝液で5mM濃度にまで希釈して調製することができる。次にガラスを10mMのトリス−NaClでリンスし、0.1mg/mlのストレプトアビジン溶液とともに1時間温置することができる。ガラスは10mMのトリス−NaClで洗浄後、核酸テンプレート含有溶液(例えば、100mMのMgCl2添加トリス中に濃度10−7Mで溶解させたもの)とともに30分間温置することができる。そのガラスを10mMのトリス−NaClで再度完全にリンスすることもできる。
インサイチュで固着させるには、HClに援助される結合を利用してミクロ流体性基材をガラスカバースリップに結合させることができる。本質的には、最初にチップを界面活性剤(例えば、最まず高度精製水、次に0.1%Tween20溶液で洗浄し、最後に高度精製水で再度リンスする)で洗浄することができる。洗浄後のミクロ流体性チップは、次に数μlの希塩酸(例えば、高度精製水で希釈した1%塩酸)とともにガラスカバースリップ上に配置させ、その後で37℃で1−2時間焼付け処理することができる。そのような処理によって、ガラスへの結合強度が増大(20psi超)し、非特異的な吸着が増えることもない。
溶液は基材表面に僅かな量で存在させるのではなく、チャンネルを通じて注入することができることを除いて、塩酸処理、PEM形成、ビオチン化、およびストレプトアビジン化につづいて、エクスサイチュでの結着についての前記記載のものと本質的に同じ試薬および方法を用いて、テンプレートの結着を行うことができる。
基材表面のビオチンコーティングについては、以下のように行った。50mMの1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)の溶液は、2−[N−モルホリニオ]エタンスルホン酸(MES)緩衝液に溶解(MES緩衝液2.5mlに対してEDC48mg)させて調製した。次にそのEDC溶液の5ml分を、ビオチン−LC−PEOアミン溶液(50mgのBiochin−Lc−PEOを2.5mlのMES緩衝液に溶解した溶液)と配合してEDC−ビオチン溶液を調製した。その溶液をMES緩衝液で希釈して総量96mlとした。次に高分子電解質の多層がコーティングされたスライドを、100ml容のビーカー中で、EDC−ビオチン溶液に室温で60分間浸漬させた。次にスライドをMES緩衝液中で穏やかに攪拌しながら10秒間リンスした。さらに100mlのきれいなMES緩衝液を用いて繰返し浄化した。つづいてスライドを、きれいな5倍容の3×SSC−0.1%Triton緩衝液中でリンスした。3×SSC−0.1%Triton緩衝液を用いた最後のリンス処理において、その緩衝液中で10分間温置した。最後にスライドを10mMのトリス−NaCl緩衝液(10mMトリス−HCl/10mMNaCl)中で10分間激しく攪拌した。得られたスライドは、均一なビオチン層を有していた。
次に、スライドにストレプトアビジンの層を加えた。Streptavidin−Plus(SA20,Prozyme)の14mg/ml溶液については、10mMのトリス/10mMのNaCl緩衝液中に、室温で10分間攪拌して溶解し調製した。その溶液を孔径0.2μmのフィルターでろ過した。ビオチン化スライドを、100ml容のビーカー内で、ストレプトアビジン溶液中に浸漬させ、攪拌棒を用いて室温で15分間攪拌した。スライドを、10mMのトリス/10mMのNaCl緩衝液100ml中で穏やかに攪拌しながら10秒間リンスした。さらにきれいな100mlの3×SSC−0.1%Triton溶液で5回繰返してリンスし、最終のリンス液中でスライドを10分間温置した。次にスライドを新しい10mMのトリス/NaCl浴に移し、10秒間激しく攪拌した。得られたストレプトアビジン化スライドは、使用前まで4℃で10mMのトリス/NaCl中に浸漬させて保存した。
末端の片方にビオチン分子が結着したオリゴヌクレオチドテンプレートは、ストレプトアビジンが連結したスライド表面に結着させることができる。スライド表面は負に荷電しているため、非結合のヌクレオチドが斥力ではじかれやすくなる。DNAがその5’側によってスライド表面に特異的に結着されることは、ポリメラーゼの伸張反応を開始させるプライマーがスライド表面から離れていることを意味する。
テンプレート、および標識化ヌクレオチドの取り込みについては、蛍光画像化によって可視化した。オリゴヌクレオチドの位置は、Cy5標識化プライマーからの蛍光によってモニターした。ヌクレオチドの取り込みについては、そのヌクレオチドがCy3で標識化されてことを利用して検出した。取り込みが起こるとその標識が蛍光を発する。Cy3の蛍光放出は、波長532nmで起こった。一般に数秒間の連続した蛍光放出に続いて信号は減衰し、それらは一般には1回の工程で行われる。図3に示すように、単分子分離の蛍光信号の画像化は、内部全反射(TIR)による表面蛍光放出によって可能になる。
以下は、エポキシド含有基材に核酸テンプレートを直接連結させる例示的方法である。
(直接的連結)
図4Aに示すように、エポキシド分子6を基材表面2に連結させた。基材表面2にエポキシド分子6を結合させることが可能な分子、またはケイ素基4のような基のどちらも、リンカーとして使用できる。アミン誘導化核酸テンプレート(IDT)26は、アミノ基32を介してエポキシド残基30に直接連結させた。次に基材2をトリスで30〜40℃で1時間保護した。次に本明細書に記載の方法によって、核酸テンプレート26の配列決定を行った。配列決定方法の例としては、実施例12に記載の方法が挙げられる。
図4Aに示すように、エポキシド分子6を基材表面2に連結させた。基材表面2にエポキシド分子6を結合させることが可能な分子、またはケイ素基4のような基のどちらも、リンカーとして使用できる。アミン誘導化核酸テンプレート(IDT)26は、アミノ基32を介してエポキシド残基30に直接連結させた。次に基材2をトリスで30〜40℃で1時間保護した。次に本明細書に記載の方法によって、核酸テンプレート26の配列決定を行った。配列決定方法の例としては、実施例12に記載の方法が挙げられる。
(間接的連結)
図4Bに示すように、エポキシド分子6を基材表面2に連結させた。基材表面2にエポキシド分子6を結合させることが可能な分子、またはケイ素基4のような基のどちらも、リンカーとして使用できる。ビオチン化アミン20を加えて、エポキシド分子6と反応させるか、またはエポキシド分子6を破壊し、そしてエポキシド残基30に結合させた。次にストレプトアビジン34を基材表面2に加えて、結合に利用可能なビオチン化アミン20にストレプトアビジン34を結着させた。次にビオチン化核酸テンプレート24を基材表面2に加えてストレプトアビジン32に結合させた。核酸テンプレート26の配列決定は、本明細書に記載の方法によって行った。配列決定方法の例としては、実施例12に記載のものが挙げられる。
図4Bに示すように、エポキシド分子6を基材表面2に連結させた。基材表面2にエポキシド分子6を結合させることが可能な分子、またはケイ素基4のような基のどちらも、リンカーとして使用できる。ビオチン化アミン20を加えて、エポキシド分子6と反応させるか、またはエポキシド分子6を破壊し、そしてエポキシド残基30に結合させた。次にストレプトアビジン34を基材表面2に加えて、結合に利用可能なビオチン化アミン20にストレプトアビジン34を結着させた。次にビオチン化核酸テンプレート24を基材表面2に加えてストレプトアビジン32に結合させた。核酸テンプレート26の配列決定は、本明細書に記載の方法によって行った。配列決定方法の例としては、実施例12に記載のものが挙げられる。
(実施例8)
以下は、本発明によるブロッキング方法の例を説明する。図5に示すように、基材2にはエポキシド分子6を基材表面2に固定することが可能なリンカー38によってその表面に連結したエポキシド分子6が存在する。この実施形態では、アミン誘導化核酸テンプレート26は、核酸テンプレート26のアミノ基32を介してエポキシド残基30に直接結着させた。しかしながら、結合していないエポキシド分子10は、基材2上でなおも反応可能な状態であり得る。本明細書で検討したように、非結合エポキシド分子10は反応性が高く、核酸配列決定反応で干渉するバックグランドを生成させる試薬類(例えば、プライマー、取り込みまれていない状態のヌクレオチド、標識、ポリメラーゼ)のいずれとも相互作用し得るものである。
以下は、本発明によるブロッキング方法の例を説明する。図5に示すように、基材2にはエポキシド分子6を基材表面2に固定することが可能なリンカー38によってその表面に連結したエポキシド分子6が存在する。この実施形態では、アミン誘導化核酸テンプレート26は、核酸テンプレート26のアミノ基32を介してエポキシド残基30に直接結着させた。しかしながら、結合していないエポキシド分子10は、基材2上でなおも反応可能な状態であり得る。本明細書で検討したように、非結合エポキシド分子10は反応性が高く、核酸配列決定反応で干渉するバックグランドを生成させる試薬類(例えば、プライマー、取り込みまれていない状態のヌクレオチド、標識、ポリメラーゼ)のいずれとも相互作用し得るものである。
テンプレート核酸に結合していない状態のエポキシド分子をブロックするために、水12、硫酸塩14、またはアミン誘導化ブロッキング基16を、単独または組合わせて加えることができる。それ以外のブロッキング剤(例えば、トリスのような界面活性剤)も単独、あるいは水12、硫酸塩14、またはアミン誘導化基16と配合して用いることができる。水12、硫酸塩14、アミン誘導化ブロッキング基16、リン酸塩(PO4)または界面活性剤を用いる、エポキシドコーティング表面のブロッキング方法については、実施例7に記載の直接または間接的連結スキームを用いてテンプレート核酸をエポキシド基に連結させた基材表面上で実施した。
(実施例9)
以下の実施例は、エポキシド含有の基材表面を用いる核酸取り込みの検出を容易にする画像乾燥(image drying)方法に関する。エポキシド表面での標識の分解能を上げるために、以下のプロトコールを実施した。リン酸塩(PO4)でブロッキンングしたエポキシド含有の表面では、配列決定反応は、Cy5・一本鎖PCRテンプレートにハイブリダイズさせ、PCRによって増幅されるCy3標識化ポリTプライマーを用いて行った。その後でリン酸塩リンス緩衝液(PRB)のような乾燥剤に曝露させた。それらの反応はリアルタイムで行った。表面は、空気を通じるかまたは空気にさらして残存するPRBを乾燥させた。追加の工程には、表面をさらに乾燥剤(50μlのエタノール)にさらして乾燥させる工程も含まれる。追加工程として、N2ボンベにつないだフローセルを経由してN2を表面にあてる工程もさらに含まれる。PRBを用いることで表面は1秒以内に乾燥し、ほぼ退色する。画像化は、この「乾燥工程」中およびその後に行った。図6に示したように、連続する各乾燥事象によって取り込み事象の解像度が上がった。
以下の実施例は、エポキシド含有の基材表面を用いる核酸取り込みの検出を容易にする画像乾燥(image drying)方法に関する。エポキシド表面での標識の分解能を上げるために、以下のプロトコールを実施した。リン酸塩(PO4)でブロッキンングしたエポキシド含有の表面では、配列決定反応は、Cy5・一本鎖PCRテンプレートにハイブリダイズさせ、PCRによって増幅されるCy3標識化ポリTプライマーを用いて行った。その後でリン酸塩リンス緩衝液(PRB)のような乾燥剤に曝露させた。それらの反応はリアルタイムで行った。表面は、空気を通じるかまたは空気にさらして残存するPRBを乾燥させた。追加の工程には、表面をさらに乾燥剤(50μlのエタノール)にさらして乾燥させる工程も含まれる。追加工程として、N2ボンベにつないだフローセルを経由してN2を表面にあてる工程もさらに含まれる。PRBを用いることで表面は1秒以内に乾燥し、ほぼ退色する。画像化は、この「乾燥工程」中およびその後に行った。図6に示したように、連続する各乾燥事象によって取り込み事象の解像度が上がった。
(実施例10)
以下の実験は、配列決定の際に一連のヌクレオチド取り込みの忠実度に対する光退色の影響を定めるために行った。この実験から、光退色によって配列決定する際の核酸の忠実性が保たれることが明らかになった。図7に提供されるように、最大退色条件下で、最初の塩基(C)および2番目の塩基(G)はいずれも、緑色レーザーによる300秒間の光退色に供した。次に3番目の塩基(A)を赤色レーザーで画像化した。一方、最小の光退色条件下では、最初の2個の塩基(C)および(G)において光退色は起こらなかった。3番目の塩基(A)は、赤色レーザーで画像化した。
以下の実験は、配列決定の際に一連のヌクレオチド取り込みの忠実度に対する光退色の影響を定めるために行った。この実験から、光退色によって配列決定する際の核酸の忠実性が保たれることが明らかになった。図7に提供されるように、最大退色条件下で、最初の塩基(C)および2番目の塩基(G)はいずれも、緑色レーザーによる300秒間の光退色に供した。次に3番目の塩基(A)を赤色レーザーで画像化した。一方、最小の光退色条件下では、最初の2個の塩基(C)および(G)において光退色は起こらなかった。3番目の塩基(A)は、赤色レーザーで画像化した。
この図に示したように、次の塩基の効率については、3番目の取り込みによるテンプレート効率以上に、3番目の塩基(A)の干渉を受ける可能性がある。分子のおおむね1/3(0.9−0.6)が光退色によって失速(stall)した。
(実施例11)
以下の実験は、本発明による単分子配列決定方法で配列決定されるのに適した生物活性を有する核酸が配置された表面に対して、いくつかのプライマー/テンプレートの固着方法で再現性を持って結着可能かどうかを決定するために行った。単分子レベルでの配列決定の際には、テンプレートは固定され、可能な限り基材上で安定であり続けるのが望ましい。
以下の実験は、本発明による単分子配列決定方法で配列決定されるのに適した生物活性を有する核酸が配置された表面に対して、いくつかのプライマー/テンプレートの固着方法で再現性を持って結着可能かどうかを決定するために行った。単分子レベルでの配列決定の際には、テンプレートは固定され、可能な限り基材上で安定であり続けるのが望ましい。
核酸を単離し、所望の大きさにフラグメント化した。生成したフラグメントを修復(例えば、3’のリン酸を除去し5’のリン酸を加えるPNKのような酵素を使用し、必要に応じて限定的にDNAseIでの処理も組合わせる)した後で、フラグメント末端にTdTおよびdATPを付加し、テール部の平均長を50塩基(平均の範囲は10〜100超)にした。必要に応じて、残存するdATPを除去した。第二に、物質の末端にTdTおよびdCTPを付加し、テール部の平均長が第一の工程で得られたテール部よりもかなり短い(例えば、平均5〜10塩基)のホモポリマーを形成させた。末端のテール部形成は最初にdATPで行って次にdCTPで行ったが、異なる2種類の塩基のいずれを用いても連続して末端テール部形成ができ、4種の塩基うちのどの2種の塩基を操作中に用いるかについては、本発明にとって重要ではない。
基材表面には、前述の最初に形成したテール部と少なくとも部分的に相補的な配列を有する捕捉オリゴヌクレオチド(直接共有結合によるか、またはビオチン:アビジンのような結合対を介して5’末端に結着し、3’末端がOHであるもの)を含有させた。この工程の目的は、基材表面に結着させる標的核酸に対して、ランダムの長さで生成させたホモポリマーのテール部の間にアライメントポイントを設置させることである。このアライメントの例は、2種類の配列に交差/隣接する2本の水平な線を用いて図8に挙げている。ホモポリマープライマー/テンプレートスライドは、第一の塩基まで前後させて加え、プライマー/テンプレートのアライメントを定位置に「ロック」させた。追加の塩基を加えて、プライマー/テンプレートのアライメントをさらに「ロック」させることもできる。
ハイブリダイゼーション後に、長さがまちまちのハイブリッドのいずれについても、最少量のdTTPおよび校正作用を有するポリメラーゼ(好ましくは Klenow exo+)を用いて末端補充した。必要に応じて、そのハイブリッドに1〜3個のdNTPを用いて補充してTm(融解温度)を最大にすることができる。例えば、dTTP、dGTPおよびdCTPが使用した塩基である場合は、加えられる次の塩基はdATPにするべきである。それに関連して、実際の配列決定の反応では、既知の塩基である“A”が用いられるべきである。ポリメラーゼのexo+活性によって、反応中の補充において塩基が3’末端に付加せず、それによって塩基がテンプレートと正確に対を形成して次の塩基が付加できることが保証される。しかしながら、exo−の変異型ポリメラーゼを用いることも可能であり、図8には本発明によるプライマー:テンプレート固着系およびその方法の例が概略図で示される。
(実施例12)
核酸の配列決定反応は、前述の実施例に記載したようなエポキシドでコートされた表面に結着させたテンプレート核酸上で実施することができる。配列決定の前に、プライマーを選択してテンプレートにアニーリングさせることができる。プライマーのテンプレートへのアニーリング工程は、テンプレートをエポキシド表面に結着させる前または後で行うことができる。アニーリング反応は、配列特異性を促進するのに充分に厳密であって、しかも許容できる速度で安定したハイブリッドを形成することを充分に可能にする条件下で行われる。
核酸の配列決定反応は、前述の実施例に記載したようなエポキシドでコートされた表面に結着させたテンプレート核酸上で実施することができる。配列決定の前に、プライマーを選択してテンプレートにアニーリングさせることができる。プライマーのテンプレートへのアニーリング工程は、テンプレートをエポキシド表面に結着させる前または後で行うことができる。アニーリング反応は、配列特異性を促進するのに充分に厳密であって、しかも許容できる速度で安定したハイブリッドを形成することを充分に可能にする条件下で行われる。
分析対象の配列の下流域部分が既知である場合には、特異的なプライマーを構築し、標的核酸のその領域にハイブリダイズさせることができる。それとは反対に、標的核酸に対する下流域の配列が未知である場合には、ユニバーサル(例えば、均質性の)プライマーまたはランダムプライマーを、ランダムに組合わせて用いることができる。さらに別のアプローチでは、制限エンドヌクレアーゼで核酸を切断し、その生成したフラグメントの末端を規定する既知の制限サイトとハイブリダイズするようにプライマーを設計することもできる。
基材に標的核酸を固定化し、それにプライマーがハイブリダイズして標的核酸−プライマー複合体が形成されると、ポリメラーゼおよびヌクレオチド(例えば、dATP、dTTP、dUTP、dCTPおよび/またはdGTP)またはヌクレオチド類似体を用いてプライマー伸張反応が行われ、その標的核酸またはプライマーの配列決定ができる。ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込み、ならびに基材表面におけるそれらの位置については、本発明による単分子感度で検出できる。それに関連して、核酸−プライマー複合体はそれぞれ分けることができる。本発明のいくつかの態様によると、単分子分割は、標的核酸を基材に低濃度で固着させ、次に例えば、内部全反射蛍光顕微鏡を用いて、ヌクレオチドの取り込み具合を画像化させて実施することができる。
プライマー伸張反応中、プライマー/テンプレート複合体はポリメラーゼにさらされ、少なくとも1個のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がプライマーを伸張させることができる。またヌクレオチド類似体は、修飾してその3’−ヒドロキシル基を除去、キャップ形成または修飾することもできる。それに関連して、ある実施形態では、本発明の方法は、例えば、取り込みまれたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体から3’−ヒドロキシル基を除去する工程を包含する。プライマーに取り込みまれたヌクレオチドからその3’−ヒドロキシル基を除去することによって、さらなる伸張反応が停止するかまたは妨げられる。ある実施形態では、修飾化ヌクレオチドは、化学的な方法によるその3’−ヒドロキシル基の除去および/または付加が可能なように設計することができる。さらにヌクレオチド類似体については、ポリメラーゼに干渉してさらなる鎖延長を充分に防止するか、または立体的に障害する部分を分子内に含むように修飾することもでき、それによってさらなるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の取り込みが停止する。つづいてその部分、または少なくともその立体障害性部分を除去すると、鎖停止から逆に鎖延長を進行させることもできる。いくつかの実施形態では、修飾追加部分が標識であり得る。それに関連していくつかの実施形態では、ブロッキング部分を化学的に開裂させるか、または光開裂させることで、それぞれ標識を、化学的に退色させるか、または光退色させることもできる。
本発明による方法では、一本鎖標的核酸のような単分子の配列決定を提供する。標的核酸は、一般には、約5塩基長、約10塩基長、約20塩基長、約30塩基長、約40塩基長、約50塩基長、約60塩基長、約70塩基長、約80塩基長、約90塩基長、約100塩基長、約200塩基長、約500塩基長、約1kb塩基長、約3kb塩基長、約10kb塩基長または約20kb塩基長などの塩基長を有し得る。本発明の好ましい方法は、非増幅および/または非精製標的核酸配列に対する配列決定および検出系を提供する。
また本発明の方法には、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のプライマーへの取り込みを検出する工程、ならびに標的核酸の配列決定のための曝露、伝送および/または検出工程を繰り返す工程を包含する。研究者は、プライマーへのヌクレオチドの連続的な取り込みに基づき、標的核酸の相補的配列を編集することができる。同様に研究者は、その相補的配列に基づいて標的核酸の配列を編集することができる。テンプレートに結着させるために選択されたプライマーについても、検出可能な標識を含むことが可能である。本明細書に記載したように、使用される標識のタイプに適した任意の検出方法が、どのような方法も用いることができる。
本発明による方法は、デノボ配列決定、配列解析、DNAフィンガープリント法、例えば一塩基多型(SNP)検出のような多型の同定、ならびに遺伝子による癌研究への適用が提供され得る。また本発明による方法をRNA配列決定に適用すると、選択的スプライシング部位の同定、コピー数のカウント、遺伝子発現の計測、細胞内に存在する低コピー数の未知のRNA分子の同定、実際に転写される配列の決定によるゲノム解釈、系統発生的関係の探究、細胞分化の解明、および組織工学の促進が可能となる。本発明による方法は、RNA翻訳および蛋白質アセンブリのような、他の生体高分子の活性解析にも用いることができる。本発明のある態様によれば、取り込みまれた信号はより高感度で検出され、より速く配列決定される。
本発明は、その意図または本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形態においても具現化され得る。従って、前述の具現例については、本明細書に記載の本発明に対する限定ではなく、全ての点において例示であるとみなされる。従って、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と等価な意味および範囲内に入る全ての変化が、本明細書中で想定される。
Claims (30)
- 表面上で化学反応を実行する方法であって、該方法は、以下:
第一反応体分子を表面に結着させる工程;
該第一反応体分子以外の分子の該表面への結着を低減するために、該表面をブロッキングする工程;
該第一反応体分子と光学検出可能な標識含有第二反応体分子との間で化学反応を実行する工程;
該表面をリンスして未反応の第二反応体分子を除去する工程;および
該リンス工程の後に、該表面で該第二反応体分子と会合した標識を観察する工程、
を包含する、方法。 - 前記第一反応体分子が核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記実行する工程は、前記核酸を少なくとも1塩基伸張させるのに十分な条件下で、該核酸をプライマーに曝露する工程を包含する、請求項2に記載の方法。
- 前記核酸が、DNAおよびRNAから選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記光学検出可能な標識が蛍光分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記蛍光分子が、Cyanine−3およびCyanine−5から成る群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記表面が、エポキシド、PEM、アミン、アルデヒド、3−アミノプロピルトリメトキシシランおよびアビジンから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記第一反応体分子が、前記表面に共有結合で連結している、請求項1に記載の方法。
- 前記核酸分子の少なくとも複数がそれぞれ光学的に分離可能であるように、該核酸分子が前記表面に配置されている、請求項2に記載の方法。
- 前記化学反応が、テンプレート/プライマー2重鎖のプライマーメンバーに対する、ヌクレオチドのテンプレート依存性の付加である、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーへの一連のヌクレオチド付加を編集する工程をさらに包含する、請求項10に記載の方法。
- 前記結着する工程が、抗原−抗体結合対、ビオチン−ストレプトアビジン結合対、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体結合対、ジニトロフェノール−抗ジニトロフェノール抗体結合対、光活性化カップリング分子、および相補的核酸から成る群から選択される結合対を用いて、前記表面に前記第一反応基質分子を固着させる工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記表面を乾燥剤に曝露する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記乾燥剤が、PRB、EtOH、空気およびN2から成る群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 核酸配列決定のための表面を調製するための方法であって、該方法は、以下:
エポキシド含有基材を核酸テンプレートに曝露する工程;および
該エポキシドへの分子の非特異的結合を抑制し得るブロッキング剤に、該エポキシドをさらに曝露する工程、
を包含する、方法。 - プライマー、ポリメラーゼおよび少なくとも1種のヌクレオチドを含む反応混合物に、前記基材を曝露する工程をさらに包含する、請求項15に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドの前記プライマーへの取り込みを検出する工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記基材が、前記エポキシドの前記基材への連結を可能にするシリカコーティングをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 前記基材が、ガラス、溶融シリカ、プラスチックおよびゲルから成る群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤が水である、請求項15に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤が亜硫酸塩である、請求項15に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤がアミンである、請求項15に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤が界面活性剤である、請求項15に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤がリン酸塩である、請求項15に記載の方法。
- 前記界面活性剤がトリスである、請求項23に記載の方法。
- 前記核酸が、前記基材上でそれぞれ光学的に分離可能である、請求項15に記載の方法。
- 前記核酸が検出可能な標識を含む、請求項26に記載の方法。
- 核酸配列を決定する方法であって、該方法は、以下:
(a)エポキシド表面を、アミン標識核酸テンプレートに曝露する工程;
(b)該エポキシドをブロッキング剤にさらに曝露して、該エポキシドへの分子の非特異的結合を抑制する工程;
(c)該テンプレートに結着したプライマーに標識ヌクレオチドが取り込みまれるのを可能にする条件下で、該標識ヌクレオチドおよびポリメラーゼを導入する工程;
(d)該ヌクレオチドが該プライマーに取り込みまれているか否かを決定する工程;および
(e)該テンプレートの配列を決定するために、該工程(c)および(d)を少なくとも1回繰返す工程
を包含する、方法。 - 前記テンプレートが、前記表面でそれぞれ光学的に分離可能である、請求項28に記載の方法。
- 前記ブロッキング剤が、試薬水、亜硫酸塩、界面活性剤、リン酸塩およびアミンから成る群から選択される、請求項28に記載の方法。
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