CZ20011183A3 - Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny - Google Patents

Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny Download PDF

Info

Publication number
CZ20011183A3
CZ20011183A3 CZ20011183A CZ20011183A CZ20011183A3 CZ 20011183 A3 CZ20011183 A3 CZ 20011183A3 CZ 20011183 A CZ20011183 A CZ 20011183A CZ 20011183 A CZ20011183 A CZ 20011183A CZ 20011183 A3 CZ20011183 A3 CZ 20011183A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
colony
primers
templates
Prior art date
Application number
CZ20011183A
Other languages
English (en)
Inventor
Céline Adessi
Eric Kawashima
Pascal Mayer
Jean-Jacques Mermod
Gerardo Turcatti
Original Assignee
Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applied Research Systems Ars Holding N. V. filed Critical Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Publication of CZ20011183A3 publication Critical patent/CZ20011183A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Description

Způsoby amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny
Oblast techniky
Vynález popisuje amplifikaci nukleové kyseliny a její sekvenování. Specificky se vynález vztahuje k metodám amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny a k přístrojům a sadám, které jsou použitelné při amplifikaci a sekvenování ve velkém měřítku s velkým množstvím zpracovávaného materiálu.
Dosavadní stav techniky
Analýza sekvence nukleové kyseliny je základem při mnoha aktivitách v biologii, biotechnologii a v medicíně. Schopnost stanovit sekvenci nukleové kyseliny se stává důležitějším se vzrůstajícími potřebami stanovit sekvence velkých genomů u lidí a jiných vyšších organizmů a také při detekci polymorfizmu jediného nukleotidu a testování a monitorování exprese genu. Genetické informace získané sekvenováním se mohou použít v mnoha oblastech, jako je například objev cílených léků a diagnóza onemocnění a posouzení nebezpečí a identifikace organizmu a jeho charakterizace.
Prvním krokem takového použití je stanovení aktuálního chemického prostředku nukleových kyselin, přesněji stanovení výskytu čtyř bází, které obsahuje nukleová kyselina. Jsou to adenin (A) , cytosin (C) , guanin (G) a thymin (T) nebo uráčil (U). Takové použiti však vyžaduje sekvenování nukleových kyselin ve velkém měřítku, což činí metody sekvenování vhodné pro zpracování velkého množství materiálu velmi žádané.
Metody sekvenování nukleové kyseliny se popisují v dosavadním stavu techniky. Dvě metody nejčastěji používané jsou metody chemického štěpení podle Maxama a Gilberta, které vznikají na základě specifické chemie baží a v současné době je velmi populární metoda sekvenování podle Sangera, která je založena na principu zakončení enzymatického řetězce a používá se jako rutinní metoda při sekvenaci nukleové kyseliny.
Při sekvenování podle Sangera se každá sekvenovaná nukleové kyselina replikuje v reakci, která obsahuje polymerázu DNA, deoxynukleotidové trifosfáty (dNTP) a dideoxynukleotidové trifosfáty (ddNTP). DNA polymeráza může začlenit dNTP a ddNTP do rostoucího řetězce DNA. V případě, že se ddNTP začlení, 3'konec rostoucího řetězce DNA nevykazuje hydroxylovou skupinu a neexistuje substrát pro prodloužení řetězce, tak se zakončí řetězec nukleové kyseliny. Protože jedna určitá reakce zahrnuje jeden typ ddNTP, vzniká směs nukleových kyselin s různou délkou, přičemž všechny nukleové kyseliny jsou zakončeny ddNTP. Obvykle se vytvoří oddělené reakce v případě každého ze čtyř typů ddNTP a vzniklá distribuce délek fragmentů nukleových kyselin se analyzuje elektroforézou na denaturačním gelu (kde se fragmenty nukleové kyseliny rozdělí podle své velikosti) nebo hmotnostní spektroskopií. Je obvyklé, aby se jeden nebo více deoxynukleotidtrifosfátů obsažený v reakční směsi značil, což umožňuje detekci fragmentů různých délek.
S hora popsané metody jsou nevýhodné, protože každá sekvenovaná nukleová kyselina se musí zpracovat jednotlivě během biochemické reakce. Gelová elektroforéza je nepohodlná, pracná a pomalá, dokonce, když se použije kapilární elektroforéza, není úplně vhodná pro sekvenování ve velkém měřítku, kdy se zpracovává velké množství materiálu. Navíc následné stanovení sekvence je obtížné. Hmotnostní spektroskopie je stále na úrovni prototypu a vyžaduje velmi drahé zařízení a každý vzorek se musí analyzovat jednotlivě.
Jeden způsob zvýšení množství zpracovávaného materiálu je paralelní způsob zpracování vzorků. Metody použití hybridizace
DNA sond nukleové kyseliny umožňují sdružování procesu během • · • 44 · · · »··· Λ ···· ····· ·· · · · · · · ......
· ········ ······ · · · · · · ··· biochemických a elektroforetických procesů, přičemž ale rostou náklady a délka trvajících manipulací.
Dále jsou dostupné metody založené na čipech DNA a DNA hybridizaci (popisuje se v publikaci Thomas and Burke Exp. Opin. Ther. Patents 8: 503-508 (1998)). Tyto metody nejsou výhodné, protože v případě každé aplikace se musí navrhnout a vyro čip DNA. Je to dlouho trvající operace a cena jednoho čipu klesne pouze tehdy, jestliže je nutné vyrobit velké množství čipů. Čipy nelze použít více jak jednou a pro jeden vzorek nukleové kyseliny je určen jeden čip. To je nevýhodné, protože, má-li se diagnostikovat pacient, měly by se jeho vzorky dát zpracovat v každém okamžiku. Nakonec rozsah sekvence, která se má analyzovat za použití takového čipu, je omezen na méně než 100 000 baží a je také omezen druhem použití, jako je například genotypování DNA a profily exprese genů.
Během nejznámějších metod analýzy sekvence nukleové kyseliny, amplifikace nukleových kyselin je nutný krok za účelem získání nukleové kyseliny v množství, které je dostatečné pro analýzu.
Několik metod amplifikace nukleových kyselin je dobře známých v oboru a jsou dokumentovány v dosavadním stavu techniky. Nukleové kyseliny se například amplifikují začleněním nukleové kyseliny do konstrukce expresívního vektoru. Takové vektory se pak mohou začlenit do vhodné biologické hostitelské buňky a vektor DNA zahrnující nukleovou kyselinu se pomnoží kultivací biologického hostitele za použití dobře zavedeného protokolu.
Nukleové kyseliny amplifikované za použití uvedených metod se mohou izolovat z hostitelských buněk za použití metod, které jsou dobře známy v oboru. Takové metody jsou však • · časově náročné, pracné a těžko nevýhodné, protože jsou automatizovatelné.
Metoda amplifikace DNA pomocí PCR se popisuje od roku 1985 (v popisuje se v publikaci Saiki et al., Science 230, 13501354) a je nyní metodou velmi známou a dobře zdokumentovanou. Cílový fragment nukleové kyseliny se může amplifikovat za použití dvou krátkých oligonukleotidových sekvencí (obvykle se nazývají primery), které jsou specifické pro známé sekvence, které lemují sekvenci DNA, jenž se amplifikuje. Primery hybridizují s opačnými řetězci dvouřetězcového fragmentu DNA po té, co se denaturovaly a jsou orientovány tak, že dochází k syntéze DNA v oblasti mezi dvěma primery pomocí DNA polymerázy, přičemž sekvence primerů se prodlužují začleněním nukleotidů do sekvence pomocí polymerázy. Extenzní reakce vytvářejí dvě dvouřetězcové cílové oblasti, kdy každá se opět denaturuje a je tak připravena pro další cyklus hybridizace a extenze. Třetí cyklus produkuje dvě dvouřetězcové molekuly, které obsahují cílovou oblast ve dvouřetězcové formě. Pomocí opakovaných cyklů teplotní denaturace, hybridizace primerů a extenze dochází k rychlé exponenciální akumulaci specifického cílového fragmentu DNA. Tato metoda probíhá v roztoku a amplifikovaný fragment cílové nukleové kyseliny se izoluje z roztoku metodami, které jsou dobře známy v oboru. Je to například gelová elektroforéza.
Popisují se metody, které používají jeden primer zachycený na povrchu podkladu ve spojení s volnými primery obsaženými v roztoku. Tyto metody umožňují současnou amplifikaci a zachycení produktu PCR na povrchu podkladu (popisuje se v publikaci Oroskar, A.A. et al., Clinical Chemistry 42: 1547 (1996)) .
Dokumenty WO 96/04404 a WO 98/36094 (Mosaic Technologies, lne. et al.) popisuji způsob detekce cílové nukleové kyseliny ve vzorku, který obsahuje cílovou nukleovou kyselinu. Metoda zahrnuje vyvolání amplifikace cílové nukleové kyseliny založené na PCR, pouze když cílová nukleová kyselina je přítomna v testovaném vzorku. V případě amplifikace cílové sekvence jsou oba primery připojeny na pevný povrch, což zaručuje, že amplifikované sekvence cílové nukleové kyseliny jsou také zachyceny na pevném podkladu. Amplifikační postup popsaný v tomto dokumentu se také někdy nazývá metoda „bridge amplification. V případě uvedené metody se specificky navrhnou dva primery, jako pro běžné PCR, přičemž primery lemují určitou cílovou sekvenci DNA, která se amplifikuje. Tak v případě, že určitá cílová nukleová kyselina je přítomna ve vzorku, pak se cílová nukleová kyselina může hybridizovat s primery postupu a amplifikovat se pomocí PCR. První krok při tomto amplifikace PCR je hybridizace cílové nukleové kyseliny s prvním specifickým primerem zachyceným na podpoře
První amplifikační produkt, který je komplementární s cílovou nukleovou kyselinou se Při vystavení cílová nukleová extenzí sekvence primeru 1.
denaturačním podmínkám se uvolní může se pak účastnit dalších hybridizačních pak tvoří podkladu kyselina a reakcí se sekvencemi primeru 1, které jsou zachyceny na podkladu. První amplifikační produkt, který je zachycen na podkladu se pak může hybridizovat s druhým specifickým primerem („primer 2) zachyceným na podkladu a druhý amplifikační produkt obsahující sekvenci nukleové kyseliny komplementární s prvním amplifikačním produktem se může tvořit extenzí sekvence primeru 2 a je také zachycený na podkladu. Tak cílová nukleová kyselina prvního a druhého amplifikovaného produktu je schopna se podílet na pluralitě hybridizačního procesu a procesu prodloužení, která je limitována pouze přítomností cílové nukleové kyseliny a počtem sekvencí primeru 1 a primeru 2 a výsledek je počet kopii cílové sekvence připojené na povrchu.
• ·
Protože při tomto procesu se tvoři amplifikační produkty pouze, když je přítomna cílová nukleové kyselina, podklad se monitoruje za účelem zjištění, zda je přítomen jeden nebo více amplifikačních produktů, což indikuje přítomnost nebo nepřítomnost specifické cílové sekvence.
Mozaiková metoda se může použít k dosažení množství multiplexování tak, že několik různých cílových sekvencí nukleové kyseliny se může amplifikovat současně sestavením různých sad pro první a druhý primer, které jsou specifické pro každou odlišnou sekvenci cílové nukleové kyseliny v různých oblastech pevného povrchu.
Nevýhodou mozaikového postupu je to, že jak sekvence prvního tak druhého primeru jsou specifické pro každou amplifikovanou cílovou nukleovou kyselinu. To je možné použití pouze při amplifikaci známé sekvence. Navíc množství materiálu je omezeno počtem různých sad specifických primerů a následně amplifikované molekuly cílové nukleové kyseliny, které se mohou sestavit do odlišných oblastí daného pevného podkladu a uspořádání nukleových kyselin do vzdálených oblastí je časové náročné. Mozaikový proces vyžaduje, aby se dva různé primery homologicky zachytily svými 5'konci k podkladu ve vzdálených oblastech, kde se tvoří amplifikovaný produkt. Toho se nedá dosáhnout současně dostupnou technologií výroby čipů DNA a je nutné použít některé způsoby dispenzace vzorků. Tak hustota, které lze dosáhnout tímto přístupem vykazuje některá omezení jako jiné klasické technologie uspořádání. Další omezení je rychlost monitorování jednotlivých vzdálených oblastí na podkladu za účelem zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaných cílových nukleových kyselin.
Uspořádání vzorků DNA se v klasickém případě provede na membránách (například nylonové nebo nitrocelulózové membrány). Použití vhodné robotiky (například Q-bot™, Genetix Ltd, Dorset • ···· · · ·· ·· • · · · · · · ···· · ···· ·
BH23 3TG UK) umožňuje získat hustotu až 10 vzorků/mm2. Při takových metodách se DNA kovalentně váže na membránu fyzikálněchemickým způsobem (například UV radiací) a je tak možné uspořádat velké molekuly DNA (například molekuly, které jsou tvořeny více jak 100 nukleotidy), stejně jako menší molekuly DNA, jako jsou oligonukleotidové primery.
Jsou známy také jiné postupy, které umožňují získat uspořádání s vyšší přístupy založené na s klíčkách, kde se hustotou oligonukleotidů. Například předem uspořádaných skleněných podložních uspořádání reaktivních použitím technologie „ink-jet (popisuje ploch získalo v publikaci se
Blanchard,
A.
P. and L. Hood,
Microbial and
Comparative
Genomics,
1:
225 (1996) nebo uspořádání reaktivních polyakrylových gelů (popisuje se v publikaci Yershov, G et al., Proceedengs of the National Academy of Science, USA, 93:
4913-4918 (1996)) umožňuje teoreticky uspořádat až 100 vzorků na jednom mm2.
Vyšší hustota vzorků je stále dosažitelná použitím čipů DNA (popisuje se v publikaci Fodor, S. P. A. et al., Science 251: 767 (1991)) . V současné době se v oboru molekulární biologie používají čipy s 625 oligonukleotidovými sondami na 1 mm2 (popisuje se v publikaci Lockhart, D. J. et al., Nátuře Biotechnology 14: 1675 (1996)). Udává se, že je možné dosáhnout hustoty sond až 250 000 vzorků na 1 cm2 (2 500/mm2) (popisuje se v publikaci Chee, M. et al., Science 274: 610 (1996) ) . Avšak na jediný čip je možné uspořádat až 132 000 různých nukleotidu, jehož plocha je přibližně 2,5 cm . Je důležité poznamenat, že tyto čipy se vyrábějí takovým způsobem, že 3 ΌΗ konec oligonukleotidů je zachycen na pevném povrchu. To znamená, že oligonukleotidy zachycené na čipech takovým způsobem se nemohou použít jako primery při amplifikaci PCR.
φ φ
Je důležité poznamenat, že v případě, kdy produkty PCR se mohou zachytit na zařízení, kde probíhá amplifikace, hustota výsledného uspořádání produktů PCR je omezena dostupným zařízením. Současně dostupné zařízení jsou pouze mikrotitrační destičky, které obsahují 96 prohlubní. Tyto destičky umožňují získat pouze přibližně 0,02 vzorků produktů PCR na 1 mm2 povrchu.
Například za použití komerčně dostupného systému Nucleolink™ (Nunc A/S, Roskilde, Dánsko) je možné dosáhnout současné amplifikace a uspořádání vzorků při hustotě 0,02 vzorků na 1 mm2 povrchu prohlubní, kde byly zachyceny oligonukleotidové primery. Technické problémy však způsobují, že není pravděpodobné, že tento přístup umožní podstatné zvýšení hustoty vzorků.
Z toho plyne, že- jestliže chceme zvýšit množství zpracovávaného materiálu, je nutné vytvořit několik metod amplifikace nukleové kyseliny, které umožňují současnou amplifikaci a uspořádání vzorků nukleové kyseliny při vyšší hustotě a dále umožňuje monitorování vzorků vyšší rychlostí, přičemž se upřednostňuje paralelní způsob.
Navíc je zřejmé, že existuje potřeba vytvořit novou metodu sekvenování, která umožní zpracovat a paralelně sekvenovat velké množství vzorků. To znamená, že je nutné vytvořit metody sekvenování, které umožňují podstatné multiplexování postupu. Podstatné multiplexování sekvenačního postupu povede na druhou stranu k vyššímu množství zpracovaných vzorků, než je možné dosáhnout metodami sekvenování, které jsou dobře známy v oboru. Takové nové metody budou dokonce více požadovány, jestliže umožní sekvenovat větší množství vzorků při rozumných nákladech a s menší vynaloženou prací než běžné způsoby sekvenování.
• ·
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nové metody amplifikace nukleové kyseliny na pevné fázi, které umožní uspořádat a současně amplifikovat velké množství rozdílných sekvencí nukleových kyselin při velké hustotě. Vynález také popisuje metody, které umožní velkou rychlostí paralelně monitorovat velké množství odlišných amplifikovaných sekvencí nukleových kyselin. Vynález dále popisuje metody, kterými se mohou současně a v krátkém časovém úseku stanovit sekvence 'velkého počtu rozdílných nukleových kyselin. Metody jsou zvláště použitelné při sekvenování celého genomu nebo při situacích, kde se musí současně sekvenovat velké množství genů (například 500) z mnoha jednotlivců (například 500) nebo se musí současně vyhodnotit velké množství (například milión) polymorfizmů nebo se současně monitoruje exprese velkého množství genů (například 100 000).
Vynález popisuje způsob amplifikace alespoň jedné nukleové kyseliny, který zahrnuje následující kroky:
vytvoření alespoň jednoho templátu nukleové kyseliny
obsahující amplif ikovanou nukleovou kyselinu, kde
uvedená nukleové kyselina obsahuje na 5'konci
oligonukleotidovou sekvenci Y a na 3'konci
oligonukleotidovou sekvenci Z a navíc nukleové
kyselina nese n a svém 5' konci prostředek pro
zachycení nukleové kyseliny na pevném povrchu, (2) smíchání uvedeného templátu nukleové kyseliny s jedním nebo více primery X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svém 5'konci prostředek pro zachycení na pevném povrchu tak, že 5'konec templátu nukleové kyseliny a primerů se váže na pevný podklad, (3) provedení jedné nebo více amplifikačních reakcí nukleové kyseliny vázané na templátu tak, že se tvoří kolonie nukleové kyseliny.
• ·
V dalším provedení vynálezu se ve druhém kroku metody dva různé primery kolonií X smíchají s templátem nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sekvence primeru kolonií X byly takové, že oligonukleotidová sekvence Z může hybridizovat s jedním koloniovým primerem X a oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako sekvence koloniových primerů X.
V jiném provedení vynálezu oligonukleotidová sekvence Z je komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y, přičemž se označuje jako Y'a koloniový primer X je stejná sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.
V dalším provedení vynálezu koloniový primer X může obsahovat degenerovanou průměrovou sekvenci a templát nukleové kyseliny, který obsahuje nukleovou kyselinu, jenž se amplifikuje a neobsahuje oligonukleotidovou sekvenci 5' a 3' konce.
V jiném provedení vynálezu metoda zahrnuje další který umožňuje alespoň jeden krok stanovení sekvence krok, j edné nebo více kolonií nukleotidové kyseliny vytvořené v kroku
3.
Vynález dále popisuj e způsob sekvenování alespoň j edné nukleové kyseliny obsahuj icl následující kroky:
(1) vytvoření alespoň jednoho templátu nukleové kyseliny obsahuj icí uvedená nukleová sekvenovanou nukleovou kyselinu, kde obsahuje na kyselina
5'konci oligonukleotidovou sekvenci a na
3'konci oligonukleotidovou sekvenci navíc nukleová kyselina nese na svém 5konci prostředek pro zachycení smíchání nukleové kyseliny na pevném povrchu, uvedeného templátu nukleové kyseliny s jedním nebo více koloniovými primery X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svém 5konci prostředek pro zachycení na pevném *
templářů nukleové kyseliny a povrchu tak, že 5'konec primerů se váže na (3) provedení jedné nukleové kyseliny pevný nebo na tvoří kolonie nukleové podklad, více amplifikačnich reakcí vázaném templátu tak, že se kyseliny, (4) provedení alespoň jednoho kroku alespoň jedné z vytvořených stanovení sekvence kolonií nukleové kyseliny.
V dalším provedení vynálezu 5' konce templátu nukleové kyseliny a koloniové primery nesou prostředek pro zachycení sekvencí nukleové kyseliny kovalentní vazbou na pevném povrchu.
zachycení skupina,
Upřednostňuje se, aby tento prostředek vhodný pro kovalentní vazbou byla chemicky upravitelná funkční karboxylová skupina jako je například fosfátová skupina, nebo aldehydová skupina, thiol, hydroxyl dimethoxyltrityl (DMT) nebo aminoskupina, přičemž se upřednostňuje aminoskupina.
Nukleové skupiny, které se mohou amplifikovat podle vynálezu zahrnují způsobů podle cDNA, rekombinantní DNA modifikované DNA,
RNA,
DNA, například genomovou DNA, nebo libovolnou formu syntetické nebo libovolnou formu syntetické mRNA nebo nebo modifikované
RNA.
Uvedené lišit v délce a mohou to být nukleové kyseliny se fragmenty nebo menší mohou části větších molekul nukleové kyselina, párů baží a více
Nukleové kyselina, nebo neznámé kyseliny. Upřednostňuje se, bude amplifikovat, měla alespoň 50 se upřednostňuje 150 až 4 000 párů amplifikovat může mít být v jednořetězcové nukleové která se která se bude sekvence a může aby baží.
známé nebo dvouřetězcové formě. Nukleová bude amplifikovat se může získat z libovolného zdroje.
Termín „templář nukleové kyseliny zahrnuje entitu, která obsahuje nukleovou kyselinu, jenž se amplifikuje nebo ♦ · · ···· ·· sekvenuje v jednořetězcové formě. Jak se uvádí dále v textu nukleová kyselina, která se amplifikuje a sekvenuje, se může také vyskytovat ve dvouřetězcové formě. Termín „templát nukleové kyseliny podle vynálezu může zahrnovat jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou nukleovou kyselinu.
Templáty nukleové kyseliny se mohou použít při metodě podle vynálezu a mohou se vyskytovat v různých délkách. Upřednostňuje se, aby templáty obsahovaly alespoň 50 párů baží a více se upřednostňuje 150 až 4 000 párů baží. Nukleotidy, kyseliny mohou být se které tvoří templát nukleové vyskytující nebo nepřirozeně Templáty nukleové kyseliny podle nukleovou kyselinu, ale mohou 3'konci krátké oligonukleotidové sekvence obsažená na 5'konci Oligonukleotidová sekvence Y je vyskytovat ve variabilní délce.
přirozeně se vyskytující nukleotidy.
vynálezu obsahují ne pouze také dále obsahovat na 5'a sekvence. Oligonukleotidová se nazývá sekvencí Y.
známou sekvencí a může se Oligonukleotidová sekvence Y vhodná pro použití podle vynálezu obsahuje přednostně alespoň pět nukleotidů, přičemž se upřednostňuje 5 až 100 nukleotidů a více se upřednostňuje přibližně 20 nukleotidů. Přirozeně a nepřirozeně se vyskytující nukleotidy mohou být přítomny v nukleotidové sekvenci Y. Jak se uvádí shora v textu, upřednostňuje se, aby sekvence oligonukleotidu Y byla stejná jako sekvence koloniového primeru X. Oligonukletidová sekvence obsažená na 3'konci templátu nukleové kyseliny podle vynálezu se zde označuje jako Z. Oligonukleotidová sekvence Z je známou sekvencí a může mít variabilní délku. Oligonukleotidová sekvence Z vhodná pro použití v metodách podle vynálezu obsahuje přednostně alespoň pět nukleotidů, přičemž se upřednostňuje 5 a 100 nukleotidů a více se upřednostňuje přibližně 20 nukleotidů. Přirozeně nebo nepřirozeně se vyskytující nukleotidy se mohou vyskytovat v oligonukleotidové sekvenci Z. Oligonukleotidová sekvence Z se navrhla tak, že hybridizuje s jedním koloniovým primerem X a upřednostňuje se, ···· ·· · · < · * · • · · · ···· • · · · · • · · · · · · • · · aby se navrhla tak, že je komplementární s oligonukleotidovou sekvenci
Y, která se nazývá sekvenci Y' .
Oligonukleotidové sekvence a Z obsažené na
5'a 3'konci templátu nukleové kyseliny se nemusí nacházet na extrémních koncích templátu.
Ačkoli nukleotidové sekvence
Y a Z se přednostně nacházej i blízko 5' a 3' konců templátu respektive templátu nukleových kyselin (například s 0 až
100 nukleotidy
5' a 3'
Oligonukleotidové sekvence
Y a Z se mohou proto nacházet v libovolné poloze templátu nukleové kyseliny, která zahrnuj e sekvence Y a Z, a vyskytuj i se na obou stranách. To znamená, že lemují sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuj e.
Termín „templát nukleové kyseliny také zahrnuje entitu, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se amplifikuje nebo sekvenuje ve dvouřetězcové formě. V případě, že templát nukleové kyseliny se vyskytuje ve dvouřetězcové formě, oligonukleotidové sekvence Y a Z jsou obsaženy na 5' a
3'koncích j ednoho z řetězců. Druhý řetězec, což je způsobeno pravidly párování
DNA, je komplementární se řetězcem, který obsahuj e oligonukleotidové sekvence Y a Z a tak obsahuje oligonukleotidovou sekvenci
Z'na 5'konci a oligonukleotidovou sekvenci Y'na 3'konci.
Termín „koloniový primer znamená entitu, která obsahuje oligonukleotidovou sekvenci, která je schopná hybridizovat s komplementární sekvencí iniciovat specifickou polymerázouvou reakci. Sekvence obsahující koloniový primer se vybrala tak, že vykazuje maximální hybridizační aktivitu se svou komplementární sekvenci a velmi nízkou nespecifickou hybridizační aktivitu s kterou je možné použít libovolnou jinou sekvencí. Sekvence, jako koloniový primer může zahrnovat libovolnou sekvenci, ale přednostně zahrnuj e
AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG nebo 5'-CACCAACCCAAACCAACCCAAACC.
Koloniový primer může obsahovat 5 až 100 baží, ale upřednostňuje se 15 až baží. Primer může zahrnovat • · · · ·· ·· « · « · přirozeně i nepřirozeně se vyskytující nukleotidy. Jeden nebo dva různé koloniové primery se mohou použít při vytvoření kolonií nukleových kyselin za použití metod podle vynálezu. Koloniové primery vhodné pro použití v přítomnosti vynálezu mohou také zahrnovat degenerované primerové sekvence.
Termín „degenerované primerové sekvence zahrnuje krátkou oligonukleotidovou sekvenci, která je schopna hybridizovat s libovolným fragmentem nukleové kyseliny nezávislé na sekvenci uvedeného fragmentu nukleové kyseliny. Takové degenerované primery nevyžadují přítomnost oligonukleotidové sekvence Y nebo Z v templátu nukleotidové sekvence, aby došlo k hybridizaci, ačkoli použití degenerovaných primerů při hybridizaci s templářem obsahujícím oligonukleotidové sekvence X nebo Y není vyloučeno. Při použití při amplifikaci podle vynálezu, degenerativní primery musí hybridizovat se sekvencemi nukleové kyseliny v templátu v místech, které jsou vedle nebo lemují sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuj e.
Termín „pevný podklad znamená libovolný pevný podklad, na který se může kovalentně zachytit nukleová kyselina, jako jsou například latexové částice, dextranové částice, polystyren, polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, povrch tvořený zlatém, skleněný povrch a silikonové plátky. Upřednostňuje se, aby pevným povrchem byl skleněný povrch.
Termín „prostředky vhodné pro zachycení nukleových kyselin na pevný podklad zahrnuje chemické a nechemické zachycení zahrnující chemicky modifikovatelné funkční skupiny. Termín „zachycení znamená imobilizaci nukleové kyseliny na pevných površích buď kovalentním zachycením nebo prostřednictvím nevratné pasivní adsorpce nebo prostřednictvím afinity mezi molekulami, imobilizaci na povrchu potaženém avidinem. Zachycení musí být dostatečně silné, aby se molekuly nedaly • · · · · · ·· ·· · * ··♦ ···· ··· · ···· · · « ··· · · · · · · · • · · · · · · · ··· ·· · · ·· ··· odstranit vymytím vodou nebo vodným pufrem za podmínek denaturujících DNA.
Termín „chemicky upravitelné funkční skupiny zahrnuje skupinu, jako je třeba fosfátová skupina, karboxylové nebo aldehydová část, thiol nebo aminoskupina.
Termín „kolonie nukleové kyseliny znamená diskrétní oblast obsahující více kopií řetězce nukleové kyseliny. Ve stejné kolonii může být přítomno více kopií řetězce komplementárního s řetězcem nukleové kyseliny. Velké množství kopií řetězců nukleové kyseliny, které tvoří kolonie jsou v obecném případě imobilizovány na pevném povrchu a mohou být v jednořetězcové nebo ve dvouřetězcové formě. Kolonie nukleových kyselin podle vynálezu se mohou vytvořit v různých velikostech a hustotách v závislosti na použitých podmínkách. Upřednostňovaná velikost kolonií je od 0,2 μπι do β μπι, více se upřednostňuje od 0,3 pm do 4 pm. Hustota kolonií nukleové kyseliny vhodné pro použití při metodě podle vynálezu je v typickém případě 10 000/mm2 až 100 000/mm2. Věří se, že je možné dosáhnout vyšší hustoty a to 100 000/mm2 až 1 000 000/mm2 a 1 000 000/mm2 až 10 000 000/mm2.
Metody podle vynálezu se mohou použít k vytvoření kolonií nukleové kyseliny. Vynález tak poskytuje jednu nebo více kolonií nukleotidové kyseliny. Kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou vytvořit z jediného imobilizovaného templátu nukleové kyseliny podle vynálezu. Metoda podle vynálezu umožňuje současnou produkci řady takových kolonií nukleových kyselin, kdy každá může obsahovat odlišné imobilizované řetězce nukleové kyseliny.
Vynález dále popisuje velké množství templátů nukleové kyseliny, které obsahují nukleové kyseliny, které se budou amplifikovat, kde uvedené nukleové kyseliny obsahují na svém •··· ·· ·· * · · · • · · · ····
5'konci oligonukleotidovou oligonukleotidovou sekvenci nesou na svém 5'konci pr
16 • ··· · · ··· · · • ·······»
• · · · ·
sekvenci Y a na 3' konci
Z a navíc nukleotidové kyseliny
středek pro zachycení nukleové
kyseliny na pevný povrch. Upřednostňuje se, když se velké množství templátů nukleových kyselin smíchá s velkým množstvím koloniových primerů X, které se mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na 5'konci prostředek pro zachycení koloniových primerů na pevném povrchu. Upřednostňuje se, aby se velké množství templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů kovalentně vázalo na pevný povrch.
V dalším provedení podle vynálezu se velké množství dvou různých koloniových primerů X smíchalo s velkým množstvím templátů nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby sekvence koloniových primerů X byla taková, že oligonukleotidová sekvence Z se může hybridizovat s jedním koloniovým primerem X a oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako sekvence jednoho koloniového primeru X.
V jiném provedení podle vynálezu je oligonukleotidová sekvence Z komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y, (Y') a velké množství koloniových primerů X je stejnou sekvencí jako oligonukleotidová sekvence Y.
Další provedení vynálezu se popisuje velké množství koloniových primerů X obsahujících degenerované primerové sekvence a velké množství templátů nukleové kyseliny obsahujících nukleové kyseliny, které se amplifikují, a tyto templáty neobsahují oligonukleotidovou sekvenci Y nebo Z na 5 ' a 3'konci.
Templáty nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou připravit za použití metod, které jsou standardní nebo běžné v oboru. V obecném případě se tyto metody zakládají na metodách genetického inženýrství.
• · · ·
• · • · • · · ·
Nukleové kyseliny, které se budou amplifikovat, se mohou zdokumentovány v oboru. Například získáním vzorku získat za použití metod, které jsou dobře známy a jsou dobře nukleové kyseliny, jako je celková
DNA, genomová DNA, cDNA, celková
RNA, mRNA atd., metodou, která je dobře známa a dobře zdokumentována v oboru a vytvořením nukleových kyselin například omezeným fragmentů z uvedených štěpením restrikčními enzymy nebo mechanickými způsoby.
V typickém případě se nukleová kyselina, která se má amplifikovat, získala jako dvouřetězcová forma. V případě, že se nukleová kyselina vyskytuje v jednořetězcové formě, se například mRNA nejdříve připraví jako dvouřetězcová forma způsobem, který je dobře znám v oboru, například za použiti oligo-dT primerů a reverzní transkriptázy a DNA polymerázy. Po té, co se získá amplifikovaná nukleová kyselina v dvouřetězcová formě s vhodnou délkou, spojí se svými konci oligonukleotidové sekvence Y a Z. To znamená, že se spojí s oběma konci sekvence nukleové kyseliny a vytvoří se tak templát. To je možné provést za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, jako je například ligace nebo začlenění nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat, do biologického vektoru do místa, které je lemováno vhodnou oligonukleotidovou sekvencí. V jiném případě, když je alespoň část sekvence nukleové kyseliny, která se ampíifikuje, je známa, může se pomocí PCR vytvořit templát nukleové kyseliny obsahující oligonukleotidové sekvence Y a Z na 5' a 3' konci. Při PCR se používají vhodné primery PCR, které zahrnují sekvence specifické pro amplifikovanou nukleovou kyselinu. Před zachycením templátu nukleové kyseliny na pevný povrch, se může připravit jednořetězcová forma za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, například zahřáním na teplotu 94 °C a rychlým ochlazením na teplotu 0°C na ledu.
• « • · · ·
Oligonukleotidová sekvence obsažená na 5konci nukleové kyseliny může být libovolnou sekvencí libovolné délky a je zde označena jako sekvence Y. Vhodné délky a sekvence oligonukleotidů se vybraly za použití dobře známých metod. Například oligonukleotidové sekvence zachycené každým koncem nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat, jsou v normálním případě relativně krátké nukleotidové sekvence obsahující 5 až 100 nukleotidů. Oligonukleotidová sekvence obsažená na 3'konci nukleové kyseliny může být libovolnou sekvencí libovolné délky a je zde označena jako sekvence Z.
Vhodné délky a sekvence použití metod dobře oligonukleotidu se známých v mohou vybrat za oboru.
Oligonukleotidové sekvence obsahovaly na každém konci nukleové kyseliny, která případě jde o relativně krátké nukleotidové sekvence obsahující 5 až 100 nukleotidů.
se mají amplifikovat, v normálním
Tyto sekvence mohou hybridizovat s jedním z koloniových primerů X. Upřednostňuje se, aby sekvence oligonukleotidové sekvence Y byla stejná jako jeden z koloniových primerů X. Více se upřednostňuje, aby oligonukleotidová sekvence Z byla komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y(Y) a koloniové primery X vykazují stejnou sekvenci jako oligonukleotidová sekvence Y.
Oligonukleotidové sekvence Y a Z podle vynálezu se mohou připravit za použití metod, které jsou standardní nebo běžné v oboru nebo se mohou získat z běžných zdrojů.
V případě produkce templátů nukleové kyseliny podle vynálezu se může zavést další požadovaná nukleová kyselina pomocí metody, která je dobře známa v oboru. Takové další sekvence zahrnují například místa, která rozeznávají restrikční enzymy nebo jisté značky nukleových kyselin, které umožňují amplifikaci produktů dané sekvence templátů nukleové kyseliny. Jiné požadované sekvence zahrnují sekvence zpětně balené DNA, která tvoří smyčku nebo jinou sekundární strukturu, když se vyskytuje v jednořetězcové formě, „řídící sekvence DNA, které řídí interakce protein/DNA, jako je například sekvence promotorové DNA, kterou rozeznává polymeráza nukleové kyseliny nebo sekvenci operátoru, kterou rozeznává protein vázající DNA.
Jestliže existuje velké množství sekvencí nukleové kyseliny, která se amplifikuje, a pak zachycení oligonukleotidů Y a Z může proběhnout ve stejné nebo odlišné reakci.
Když se připraví templát nukleové kyseliny, může se amplifikovat, před tím než se použije v metodách podle vynálezu. Taková amplifikace může proběhnout za použití metod, které jsou dobře známy v oboru, například začleněním templářové nukleové kyseliny do expresívního vektoru a amplifikaci ve vhodném biologickém hostiteli nebo amplifikaci pomocí PCR. Tento amplifikační krok není však podstatný, protože metoda podle vynálezu umožňuje, aby se v kolonii nukleové kyseliny produkovalo velké množství kopií templátu nukleové kyseliny vytvořené z jedné kopie templátu nukleové kyseliny.
Upřednostňuje se, aby 5'konec templátu nukleové kyseliny, jak se popisuje shora v textu, se upravil tak, aby nesl prostředek pro kovalentní zachycení templářů nukleové kyseliny na pevný povrch. Takové prostředky mohou chemicky fosfátová upravitelná funkční skupina, jako karboxylová nebo aldehydová skupina, být například je například thiol skupina, nebo aminoskupina.
Nejvíce se upřednostňuje, když se k úpravě
5'konce nukleové kyseliny použij e fosfát nebo aminoskupina.
Koloniové primery podle vynálezu se mohou použití metod, které jsou v oboru standardní připravit za nebo běžné.
V obecném případě koloniové primery podle vynálezu budou • · syntetické oligonukleotidy vytvořené způsoby, které jsou dobře známy v oboru nebo se mohou získat z běžných zdrojů.
Při amplifikaci libovolné sekvence nukleové kyseliny se mohou použít jeden nebo více odlišných koloniových primerů. Tím se tato metoda liší a je výhodnější ve srovnání s řadou jiných amplifikačních metod známých v oboru, které se například popisují v dokumentu WO 96/04404, kde se různé specifické primery musí navrhnout pro každou určitou sekvenci nukleové kyseliny, která se bude amplifikovat.
Upřednostňuje se, aby se 5'konce koloniových primerů podle vynálezu upravily tak, aby nesly prostředek pro jejich kovalentní zachycení na pevném povrchu. Upřednostňuje se, aby tento prostředek pro kovalentní zachycení byla chemicky upravitelná funkční skupina, jak se popisuje shora v textu. Je-li to nutné koloniové primery se mohou navrhnout tak, aby zahrnovaly další požadované sekvence taková, jako jsou místa rozeznávaná restrikční endonukleázou nebo jiné typy míst štěpení, jako je například štěpitelná místa na rybozómu. Jiné požadované sekvence zahrnují sekvence zpětně balené DNA (která tvoři smyčky nebo jiné sekundární struktury, když se vyskytuje v jednořetězcové formě), „řídící sekvence DNA, které řídí interakce protein/DNA, jako je například sekvence promotorové DNA, kterou rozeznává polymeráza nukleové kyseliny nebo sekvenci operátoru, kterou rozeznává protein vázající DNA.
Imobilizace koloniového primerů X na podklad pomocí 5'konce vede k odstranění 3'konce z podkladu tak, že koloniový primer je dostupný pro extenzi polymerázou, pak probíhá hybridizace komplementární oligonukleotidové sekvence obsažené na 3'konci templátu nukleové kyseliny.
Po té, co se syntetizují templáty nukleové kyseliny a koloniové primery podle vynálezu, smíchají se ve vhodném poměru tak, že když jsou zachyceny na pevném povrchu získá se • · • · • · • · · · * · • · · · • · · vhodná hustota zachycených templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů. Upřednostňuje se, aby část koloniových primerů ve směsi byla vyšší než část templátů nukleové aby poměr množství koloniových kyseliny byl takový, že nukleové kyseliny se se vrstva koloniových které kyseliny. Upřednostňuje se, primerů k množství templátů když koloniové primery a imobilizují na primerů obsahující velké se nacházejí v přibližně nukleové templáty pevném povrchu tvoři množství koloniových primerů, celé v jednotné hustotě po nebo podpory, přičemž jeden definované ploše pevné templátů nukleové kyseliny se imobilizuje v intervalech ve vrstvě koloniových primerů.
nebo více j ednotlivě
Templáty nukleové kyseliny se mohou v jednořetězcové formě.· Mohou se také vyskytovat vyskytovat úplně nebo částečně ve dvouřetězcové formě, buď upravenými 5'konci tak, jak to umožňuje V tomto případě po ukončení procesu separovat řetězce způsoby zahřáním na teplotu 94 °C a s jedním nebo s oběma zachycení na povrchu.
zachyceni dobře známými v oboru, je možné například pak se řetězce odstraní
Je vhodné, aby v případě, že oba promytím.
řetězce dvouřetězcových molekul reagovaly s výsledek bude stejný se zachytil a provedl zachyceny na povrchu, kdy pouze jeden řetězec se jeden amplifikační krok. Jinými slovy zachytily oba řetězce dvouřetězcového povrchem a j sou jako v případě, v případě, že se templátů nukleové kyseliny a oba řetězce se zachytily vzájemně blízko sebe a je tuto situaci možné rozlišit od výsledku, kdy dojde k zachycení pouze jednoho řetězce a uskutečnění amplifikace. Tak je možné použít jednořetězcové i dvouřetězcové templáty nukleových kyselin za účelem získat templát nukleových kyselin zachycený na povrchu a vhodný pro vytvoření kolonii.
Vzdálenost mezi jednotlivými koloniovými primery a jednotlivými templáty nukleové kyseliny (a vzhledem k hustotě
koloniových primerů a templářů nukleových kyselin) je možné řídit změnou koncentrace koloniových primerů a templářů nukleové kyseliny, které se imobilizují na povrchu. Preferovaná hustota koloniových primerů je alespoň 1 fmol/mm2, upřednostňuje se alespoň 10 fmol/mm2, více se upřednostňuje 30 až 60 fmol/mm2. Hustota templářů nukleové kyseliny pro použití v metodě podle vynálezu je v typickém případě 10 000/mm2 až 100 000/mm2. Věří se, že je možné dosáhnout vyšší hustoty například 100 000/mm2 až 1 000 000/mm2 a 1 000 000/mm2 až 10 000 000/mm2 .
Naopak řízení hustoty zachycených templářů nukleové kyseliny a koloniových primerů umožňuje řídit konečný vznik kolonií nukleové kyseliny na povrchu podpory. To je způsobeno skutečnosti, že jedna kolonie nukleové kyseliny může vzniknout následkem zachycení jednoho templářů nukleové kyseliny, což zaručuje, že koloniové primery podle vynálezu jsou přítomny ve vhodné poloze na pevném povrchu (popisuje se dále v textu). Hustota molekul nukleové kyseliny v jedné kolonii se může také řídit řízením hustoty zachycených koloniových primerů.
Po té, co se koloniové primery a templáty nukleové kyseliny podle vynálezu imobilizují na pevném povrchu ve vhodné hustotě, mohou se pak vytvořit kolonie nukleové kyseliny tím, že se provede vhodný počet cyklů amplifikace na kovalentně vázaném templářů nukleové kyseliny tak, že každá kolonie obsahuje více kopií původního imobilizovaného templářů nukleové kyseliny a její komplementární sekvenci. Jeden cyklus amplifikace zahrnuje kroky hybridizace, extenze a denaturace a ' -i tyto kroky se v obecném případě uskutečňují za použití činidel nebo podmínek dobře známých v oboru vhodných pro PCR.
Typická amplifikační reakce zahrnuje vystavení pevného povrchu a zachyceného templářů nukleové kyseliny a koloniových primerů podmínkám, které vyvolávají hybridizaci primerů. Například působeni teploty okolo 65 °C. Za uvedených podmínek ···· ·· ·· ·· · • ··· · · · · •·· · ···· · · · ··· · · ··· · · • · · · · · · · ··· ·· ·· ·· · · * oligonukleotidová sekvence Z na 3'konci templátu nukleové kyseliny hybridizuje s imobilizovaným koloniovým primerem X a v přítomnosti podmínek a činidel, které podporují extenzi primeru, což je například teplota okolo 72 °C, přítomnost polymerázy nukleové kyseliny, například DNA polymerázy závislé na DNA nebo molekuly reverzní transkriptázy (to je DNA polymeráza závislá na RNA) nebo RNA polymerázy plus přítomnosti molekul nukleozidtrifosf átů nebo libovolných jiných nukleotidových prekurzorů, například upravených molekul nukleozidtrifosfátu, se prodlouží koloniový primer adicí nukleotidů komplementárních se sekvencí templátové nukleové kyseliny.
Příklady polymeráz nukleové kyseliny, které se mohou použít podle vynálezu, jsou DNA polymeráza (Klenow fragment, T4 DNA polymeráza), tepelně stabilní DNA polymeráza pocházející z různých termostabilních bakterií (jako jsou DNA polymerázy Taq, VENT, Pfu, Tfll), stejně jako jejich geneticky upravené deriváty (TaqGold, VENTexo, Pfu exo) . Může se také použít kombinace RNA polymerázy a reverzní transkriptázy, přičemž vzniká amplifikace kolonie DNA. Upřednostňuje se, aby polymeráza nukleové kyseliny užívaná pro extenzi koloniových primerů byla stabilní za podmínek vhodných pro reakci PCR, to znamená při opakovaných cyklech zahřívaní a chlazení při používané denaturační teplotě, jejíž hodnota je přibližně 94 °C. Upřednostňuje se, aby používaná
DNA polymeráza byla Taq
DNA polymeráza.
Upřednostňuj e se, aby používané molekuly nukleozidtrifosfátu byly deoxyribonukleotidt rif osf áty, jako jsou například dATP, dTTP, dCTP, dGTP, nebo ribonuklezidtrifosfáty, jako jsou například dATP, dUTP, dCTP, dGTP. Molekuly nukleozidtrifosfátu se mohou vyskytovat přirozeně nebo se mohou syntetizovat.
• · • · • · · • * · · ·
Po krocích hybridizace a extenze se podpora a zachycená nukleová kyselina vystaví působení denaturačních podmínek v přítomnosti dvou imobilizovaných nukleových kyselin. První kyselinou je počáteční imobilizovaný templář nukleovou nukleové kyseliny a druhou je nukleová kyselina, která je k němu komplementární.
Extenze j ednoho imobilizovaného koloniového primeru probíhá od
X. Původní imobilizovaný imobilizovaný vytvořený templář nukleové kyseliny a prodloužený koloniový primer jsou pak schopny iniciovat další kola amplifikace, přičemž se podklad vystaví dalším cyklům hybridizace, extenze a denaturace. Výsledkem takových dalších kol amplifikace povede ke vzniku kolonie nukleové kyseliny obsahující velké množství imobilizovaných kopií templářové nukleové kyseliny a její komplementární sekvence.
Počáteční znamená, že imobilizace templátové nukleové kyseliny templátová nukleová kyselina může pouze hybridizovat s koloniovými primery lokalizovanými ve vzdálenosti rovnající se celkové délce templářové nukleové kyseliny. Pak hranice kolonie vytvořené omezena na relativně malou oblast, ve nukleové kyseliny je které se imobilizuje počáteční templátová kola amplifikace,
Když probíhají další to znamená hybridizace, extenze a nukleová kyselina.
denaturace, vzniká jednou tolik kopií templátové molekuly a komplement. Pak vytvořená hranice kolonie kyseliny se bude schopna dále prodlužovat, ačkoli tato hranice je stále omezena na relativně lokální oblast, ve které se imobilizoval počáteční templář nukleové kyseliny.
Schéma metody vytvoření kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu je zobrazeno na obrázku č. 1. Obrázek č. 1(a) zobrazue koloniový primer X podle vynálezu (ukazuje se, že má sekvenci ATT) a templát nukleové kyseliny podle vynálezu, který obsahuje na 5'konci oligonukleotidovou sekvenci Y, zde je zobrazena jako ATT a 3'konci oligonukleotidovou sekvenci Z, ··«· ·« ·« * · · · zde zobrazenou jako
AAt, koloniového primeru
X.
která hybridizuje jako sekvence
Při schematické reprezentaci se koloniový primer X oligonukleotidové sekvence Y
Z zobrazují tak, že obsahují pouze tři nukleotidy. V praxi je však vhodné, aby se použila delší sekvence. 5'konce obou koloniových primerů a pro zachycení templátu nukleové prostředek kyseliny nesou pevném povrchu.
To je na obrázku č. 1 prostředek zachycení nukleové kyseliny na plné kovalentnímu zobrazeno může vést nekovalentnímu zachycení.
Pro jednoduchost je na obrázku j ako ke čtverce.
Tento nebo zobrazen pouze j eden koloniový primer X a
V praxi velké množství jedna templátová nukleová kyselina.
koloniových primerů X bude s velkým množstvím templátů nukleové kyseliny. Velké primerů X může obsahovat dva odlišné koloniových primery X.
přítomno množství koloniové
Pro jednoduchost však schématická reprezentace obrázku č. 1 pouze jeden typ koloniového primeru sekvencí ATT. Velké množství templátů nukleové kyseliny zobrazuje na
X se může obsahovat různé sekvence nukleové kyseliny v centrální části mezi oligonukleotidy Y a
Z, oligonukleotidové sekvence Y a Z na znázorněn
č. 1 je pro jednoduchost nukleové kyseliny, kde 'a ale obsahuje stejné
3'koncích. Na obrázku pouze jeden druh část sekvence v centrální templátu části je zobrazena jako CGG.
V přítomnosti pevné nukleové kyseliny podpory 5' koloniového primeru konce obou se vážou na templátů
To je znázorněno na obrázku č. 1 (b) .
Podklad podklad.
zachycený templát nukleové kyseliny a koloniové primery se pak vystaví působení obrázku podmínek, které vyvolávají č. l(c) je zobrazen templát hybridizaci nukleové hybridizuje s koloniovým primerem.
Taková primeru. Na kyseliny, který hybridizace je umožněna skutečností, že oligonukleotidová sekvence Z na
3'konci templátu nukleové kyseliny může hybridizovat
s koloniovým primerem.
Při schématické reprezentaci oligonukleotidové sekvence Z se ukázalo, že je komplementární s koloniovým primerem, ačkoli v praxi skutečná komplementární sekvence není podstatná. Hybridizace se může objevit za podmínek, kterým jsou vystaveny templáty nukleové kyseliny a koloniové primery.
Na obrázku č. 1 (d) je zobrazeno stádium extenze primerů. Za vhodných teplotních podmínek a v přítomnosti DNA polymerázy a doplnění nukleotidových prekurzorů, jako je například dATP, dTTP, dCTP a dGTP, DNA polymeráza prodloužila koloniový primer na jeho 3'konci za použití templátu nukleové kyseliny. V případě, že prodloužení primerů je úplné, zobrazeno na obrázku č. l(e), je pak možné vidět, že se vytvořil druhý mobilizovaný řetězec nukleové kyseliny, který je komplementární s počátečním templátem nukleové kyseliny. Při oddělení dvou řetězců nukleové kyseliny, například zahřáním, budou přítomny dvě imobilizované nukleové kyseliny. První je počáteční imobilizovaný templát nukleové kyseliny a druhou je jeho komplementární nukleová kyselina, která se prodloužila z jednoho imobilizovaného koloniového primerů X, jak je možné vidět na obrázku č. l(f).
Původní imobilizovaný templát nukleové kyseliny a imobilizovaný prodloužený vytvořený koloniový primer je pak schopen hybridizovat s jinými přítomnými koloniovými primery (které jsou označeny jako koloniové primery 2 a 3 na obrázku č. l(g)) a po dalším kole prodloužení primerů (obrázek č. 1 (h) ) a po separaci řetězce (obrázek 1 (i)) vznikají čtyři jednoduché imobilizované řetězce. Dva z nich obsahují sekvence, které odpovídají templátu počáteční nukleové kyseliny, a dva obsahuji řetězce s nimi komplementární.
Další cykly amplifikace jsou zobrazeny na obrázku č. 1 a po provedení vzniká kolonie nukleové kyseliny obsahující velké • · množství zmobilizovaných kopií templátové nukleové kyseliny a její komplementární sekvence.
Je tak možné vidět, že metoda podle vynálezu umožňuje vytvoření kolonie nukleové kyseliny z jednoho templátu imobilizované nukleové kyseliny a že velikost těchto kolonií se může řídit změnou počtu cyklů amplifikace, které je templát nukleové kyseliny vystaven. Tak počet nukleových kyselin vytvořených na povrchu pevného podkladu závisí na počtu templátů nukleové kyseliny, která se na začátku imobilizuje na podkladu, přičemž vzniká dostatečný počet imobilizovaných koloniových primerů v lokalitě každého zmobilizovaného templátu nukleové kyseliny. Z tohoto důvodu se upřednostňuje, aby pevný povrch, na který se koloniové primery a templáty nukleové kyseliny zmobilizují, obsahoval vrstvu imobilizovaných koloniových primerů při vhodné hustotě s templáty nukleové kyseliny imobilizované v intervalech s vrstvou primerů.
Tak zvané autopaternování kolonií nukleové kyseliny je výhodné ve srovnání s řadou metod, které jsou známy v oboru. Je možné získat vyšší hustotu kolonií nukleových kyselin, což je způsobeno skutečností, že hustotu je možné řídit regulací hustoty, při které se templáty nukleové kyseliny původně zmobilizují. Taková metoda není pak omezena například tím, že vykazuje specifické uspořádání primerů na určité lokální ploše podkladu a pak iniciuje tvorbu kolonií nanesením určitého vzorku, který obsahuje templát nukleové kyseliny na stejné ploše primeru. Počet kolonií, které se mohou uspořádat za použití metod dobře známých v oboru, (popisuje se například v publikaci WO 96/04404, Mosaic Technologies, lne.) je pak omezen hustotou/mezerami, při kterých se plochy specifických primerů mohou uspořádat v počátečním kroku.
• · ♦ · * ·· · · · · ··* · * ··· « · • ·♦·· ·· » ··· ·· ·· · · ··«
Tím, že je možné řídit počáteční hustotu templátu nukleové kyseliny a proto také je možné řídit hustotu kolonií nukleové kyseliny vytvořené z templátu nukleové kyseliny, je možné také řídit velikost vytvořených kolonií nukleové kyseliny a navíc hustotu templátu nukleové kyseliny v jednotlivých koloniích, přičemž optimální situace je možné dosáhnout na pevném podkladu dostatečně velké velikosti, který obsahuje velký počet amplifikovaných sekvencí, což umožňuje následnou analýzu nebo monitorování kolonií nukleové kyseliny.
Když se vytvoří provést další krok, kolonie nukleových kyselin, může být nutné jako je například vizualizace kolonií nebo stanovení sekvence kolonií může být (popisuje se dále v textu) . například nutná, jestliže
Vizualizace je nezbytné testovat kolonie vytvořené v přítomnosti nebo v nepřítomnosti například celé nebo části určitého fragmentu nukleové kyseliny. V tomto případě kolonie, které obsahují určitý fragment nukleové kyseliny by se mohl detekovat navržením sondy nukleové kyseliny, která se specificky hybridizuje s fragmentem nukleové kyseliny.
Taková sonda nukleové kyseliny se přednostně značí detekovatelnou entitou, jako je fluorescenční skupina, entita obsahující biotin (která se může například detekovat inkubací streptavidinem značeným fluorescenční skupinou), radioaktivní značku (která se může začlenit do sondy nukleové kyseliny způsoby, které jsou dobře známy v oboru a mohou se detekovat na základě jejich radioaktivity například inkubací se scintilační kapalinou) nebo barvivém nebo jiným barvícím činidlem.
V jiném případě taková sonda nukleové kyseliny se nemusí značit a navrhne se tak, aby působila jako primer vhodný pro začlenění množství značených nukleotidů s polymerázou nukleové ··♦· ·· ·· ·· · * · · · ···· ··· · · · ·· · · · ··· » t ♦ · · · · • ···· ·· · ·♦· ·· ·· ·· ··· kyseliny. Může se tak provést detekce začleněné značky a tak se detekují kolonie nukleové kyseliny.
Kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu se pak připravují hybridizací. Taková příprava zahrnuje ošetření kolonii tak, že celý nebo část templátu nukleové kyseliny tvořící kolonie je přítomen v jednořetězcové formě. Toho je možné dosáhnout například teplotní denaturací libovolné dvouřetězcové DNA v koloniích. V jiném případě se kolonie mohou ošetřit restrikčnimi endonukleázami, které jsou specifické pro dvouřetězcovou formu sekvence v templátové nukleové kyselině. Tak endonukleáza může být specifická vůči sekvenci obsažené v oligonukleotidové sekvenci Y nebo Z nebo vůči jiné sekvenci, která je přítomna v templátové nukleové kyselině. Po štěpení se kolonie zahřejí tak, že dvouřetězcové molekuly DNA se oddělí a kolonie se promyjí, aby se odstranily nemobilizované řetězce tak, že v koloniích zůstává zachycena jednořetězcová DNA.
Po přípravě kolonii vhodných pro hybridizací se pak přidá ke koloniím značená nebo neznačená sonda za podmínek vhodných pro hybridizací sondy s jejich specifickou sekvencí DNA. Takové podmínky může stanovit odborník za použití metod známých v oboru a budou záležet na příkladu sekvence sondy.
Sonda se pak může odstranit teplotní denaturací, jestliže je to nutné, a pak se může hybridizovat a detekovat sonda specifická pro druhou nukleovou kyselinu. Tyto kroky se mohou opakovat tolikrát, kolikrát je to nutné.
Značené sondy, které hybridizuj! s koloniemi nukleové kyseliny se pak mohou detekovat za použití zařízení, které zahrnuje vhodné detekční zařízení. Preferovaný detekční systém pro fluorescenční značky je kamera s nábojovou vazbou (CCD), která se v optimálním případě spojí se zvětšovacím zařízením, jako je například mikroskop. Za použití takové technologie je • · · · • · možné současně paralelně monitorovat velké množství kolonii. Například za použití mikroskopu s CCD kamerou a s objektivem se 10-ti násobným nebo s 20-ti násobným zvětšením, je možné pozorovat kolonie na povrchu mezi 1 mm2 a 4 mm2, které odpovídají monitorování 10 000 až 200 000 kolonii. Je jasné, že tento počet poroste s vylepšením optiky a s velikostí čipů.
Alternativní metodou monitorování vzniklých kolonií je skenování povrchu pokrytého koloniemi. Je možné například použít systémy, kde je možné současně uspořádat až 100 000 000 kolonii a zachytí se monitorovací obrázek celého povrchu kamerou CCD. Tímto způsobem je možné vidět až 100 000 000 kolonií během krátkého času.
Dále se může použit za účelem monitorování kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu libovolné jiné zařízení umožňující detekci a přednostně kvantifikaci fluorescence na povrchu. Také je možné použít fluorescenční zobrazovače nebo konfokální mikroskopy.
V případě, že značky jsou radioaktivní, pak je možné použít systém detekující radioaktivitu.
Při metodách podle vynálezu se provede další krok umožňující alespoň jeden krok stanovení sekvence alespoň jedné z vytvořených kolonií nukleové kyseliny, což je možné provést za použití sekvenační techniky za použití libovolné vhodné pevné fáze. Například jednou metodou stanovení sekvence, která se může použít při stanovení sekvence podle vynálezu, zahrnuje hybridizaci vhodného primeru, který se zde nazývá „sekvenační primer, s templátem sekvenované nukleové kyseliny, extenzi primeru a detekci nukleotidů používaných při prodloužení primeru. Upřednostňuje se, aby nukleová kyselina užívaná pro prodloužení primeru se detekovala před přidáním dalšího nukleotidu, což umožňuje postupné sekvenování in šitu jednotlivých po sobě jdoucích baží nukleové kyseliny.
• ♦
Detekce začleněných nukleotidů se provádí tak, že se do primeru extenzní reakce začlení jeden nebo více značených nukleotidů. Mohou se použít libovolné vhodné detekovatelná značky, jako je například fluorofor, radioaktivní značení atd. . Upřednostňuje se použití fluorescenční značky. Stejné nebo odlišné značky se mohou použít v každém odlišném typu nukleotidu. V případě, že značka je fluorofor pro každý odlišný typ nukleotidu se použije stejné značky, pak každé začlenění nukleotidu může dojit ke kumulativnímu zvýšení signálu detekovatelného při určité vlnové délce. Jestliže se používají odlišné značky, pak tyto signály se mohou detekovat při různých vlnových délkách.
sekvenčního primeru
Aby se umožnila hybridizace vhodného se sekvenovaným templátem nukleové kyseliny, pak templát se v jednořetězcové formě. V případě, že kyseliny umožňující vytvořit kolonie vyskytuj e nukleové templáty nukleové kyseliny jsou přítomny ve dvouřetězcové formě, mohou se zpracovat kyseliny tak, aby za použití vznikly metod, templáty jednořetězcové které jsou dobře známy nukleové v oboru, například denaturací nebo štěpením atd..
Sekvenační primery, které hybridizují s templátem nukleové kyseliny a používají se při extenzi primeru, jsou přednostně krátké oligonukleotidy, které přibližně obsahují 15 až 25 nukleotidů. Sekvence primerů se navrhla tak, že hybridizují s částí templátu sekvenované nukleové kyseliny, přičemž se upřednostňuje, aby k tomu došlo za přísných hybridizačních podmínek. Sekvence primerů užívaných při sekvenování může mít stejné nebo podobné sekvence těm, které jsou obsaženy v koloniových primerech a které se používají při vzniku kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Sekvenační primery se mohou vyskytovat v roztoku nebo v imobilizované formě.
• 9 • ♦· · 9 99 9 * · · · · ·· « • · · · » - · · · · ··· * »- ··· «ρ • · · · · 99 ··* ·· ·· · · ···
Po té, co se sekvenačni primer navázal na templát nukleové kyseliny, který se sekvenuje tak, že se vystaví vhodným podmínkám stanoveným metodami dobře známými v oboru, provede se prodloužení primerů, například za použití polymerázy nukleové kyseliny a dodaných nukleotidů, přičemž, alespoň některé se vyskytují ve značené formě a nastolí se podmínky, které jsou vhodné pro extenzi primerů. Mohou se použit příklady polymeráz nukleové kyseliny a nukleotidů, jak se popisuje shora v textu.
Aby se odstranily nezačleněné nukleotidy, které mohou interferovat s následnými kroky, je třeba po každém kroku prodloužení primerů zahrnout promytí. Po té, co se provedlo prodloužení primerů, monitoruje se kolonie nukleové kyseliny za účelem stanovení, zda značený nukleotid se začlenil do prodlouženého primerů. Krok extenze primerů se pak opakuje za účelem stanovení dalších a následných nukleotidů začleněných do prodlouženého primerů.
Libovolné zařízení, které umožňuje detekci a přednostně kvantifikaci vhodného značení, jako je například fluorescence nebo radioaktivita, je možné využít při stanovení
V případě, že značka je fluorescenční molekula, sekvence.
je možné použít kameru CCD, která je spojena se zvětšovacím přístroj em (jak se popisuje shora
Ve skutečnosti zařízení používané při stanovení sekvence podle vynálezu může být stejné jako ta zařízení, která se popisují shora v textu a jsou vhodná pro monitorování kolonií amplifikované nukleové kyseliny.
Detekční systém se přednostně používá v kombinaci s analytickým systémem za účelem stanovit počet nebo podstatu nukleotidů začleněných v každé kolonii po každém kroku extenze primerů. Tato analýza, která se může provést bezprostředně po každém kroku prodloužení primerů nebo později za použití • · •·· · »«·· · · · •·· * · · · · · · • ···· «· ··· ·· ·· ·· · · · zaznamenaných dat umožňuje, aby se stanovila sekvence templátů nukleové kyseliny v dané kolonii.
Jestliže stanovovaná sekvence není známa, pak nukleotidy aplikované v případě dané kolonie se aplikují obvykle v určeném pořadí, který se pak opakuje po celou analýzu. Je to například dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Jestliže stanovovaná sekvence je známa a znovu se sekvenuje, například pro účely analýzy, zda existují malé rozdíly, kterými se sekvence liší od známé sekvence, pak sekvenační proces je rychlejší, když se v každém kroku sekvenace přidají nukleotidy ve vhodném pořadí, které se zvolí podle známé sekvence. Rozdíly od dané sekvence se pak detekují tak, že nedojde k začlenění jistých nukleotidů při určitém stádiu extenze primerů.
Tak je možné vidět, že celá nebo část sekvence amplifikovaného templátů nukleové kyseliny tvořící určité kolonie nukleové kyseliny se může stanovit za použití metod podle vynálezu.
V jiném provedení vynálezu se celá nebo částečná sekvence více jak jedné nukleové kyseliny stanoví určením celé nebo části sekvence amplifikovaného templátů nukleové kyseliny, která je přítomna ve více jak jedné kolonii nukleové kyseliny. Upřednostňuje se, aby se současně mohlo stanovit velké množství sekvencí.
Provedení stanovení sekvence nukleových kyselin za použití metody podle vynálezu je výhodné, protože je pravděpodobné, že je způsobeno skutečností, že velké množství každé sekvenované nukleové kyseliny se vyskytuje v každé kolonii nukleové kyseliny podle vynálezu. Jestliže je to nutné, je možné zvýšit spolehlivost tím, že se použije velké množství kolonií nukleové kyseliny obsahující stejný templát sekvenované nukleové kyseliny a pak stanovení sekvence pro každé množství kolonií a porovnání takto stanovených sekvencí.
Upřednostňuje se, aby zachyceni koloniového primerů a templátu nukleové kyseliny na pevný povrch bylo termostabilní při teplotě, které se podklad vystaví během amplifikační reakce nukleové kyseliny. Je to například teplota až přibližně 100 °C, například přibližně 94 °C. Upřednostňuje se, aby zachycení bylo kovalentní.
V jiném provedení vynálezu kovalentní navázání koloniových primerů a templátu nukleové kyseliny na pevný podklad se vyvolává síťovacím činidlem, jako je například l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid (EDC), sukcinanhydrid, fenyldiizothiokyanát nebo maleinanhydrid nebo heterobifunkční síťovací činidlo, jako je například mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), Nsukcinimidyl-[4-j odoacetyl]aminobenzoát (SIAB), sukcinimidyl-4[N-maleimidometyl]cyklohexan-l-karboxylát (SMCC), N-ymaleimidobutyryloxy-sukcinimidester (GMBS) , sukcinimidyl-4-[pmaleimidofenyljbutyrát (SMPB) a odpovídající sulfosloučeniny (ve vodě rozpustné). Preferovaná síťovací činidla vhodná pro použití podle vynálezu jsou s-SIAB, s-MBS a EDC.
V dalším provedení vynálezu pevný podklad má derivatizovaný povrch.
V jiném provedení vynálezu derivatizovaný bifunkčními povrch síťovacími se následně upravuje přednostně reaktivními pevného podkladu skupinami, aby vznikl funkční povrch, síťovacími skupinami.
Termín „derivatizovaný povrch znamená povrch, který se upravil chemickými reaktivními skupinami, jako je například aminoskupina, thíolová nebo akrylátová skupina.
Termín „funkční povrch znamená derivatizovaný povrch, který se upravil specifickými funkčními skupinami, jako jsou například maleinové nebo sukcinové funkční části.
• ♦ · · * • · · · ·«··
V metodě podle vynálezu, kterou je možné použit při jistých aplikacích, zachycení koloniových primerů a templářů nukleové kyseliny na pevný podklad splnilo řadu požadavků. Ideální zachycení by nemělo být ovlivněno vystavení vysoké teplotě a opakovanému procházení cykly zahřátí/ochlazení, což se používá při během amplifikace nukleové kyseliny. Podklad by měl umožnit získání hustoty zachycených koloniových primerů alespoň 1 fmol/mm2, upřednostňuje se hustota 10 fmol/mm2, více se upřednostňuje 30 až 60 fmol/mm2. Ideální podklad by měl vykazovat jednotný rovný povrch s nízkou hodnotou fluorescence pozadí a měl by být také teplotně stabilní (neměl by se deformovat). Pevné podklady, které umožňují pasivní adsorpci DNA na jistých typech plastických a syntetických nitrocelulózových membrán, nejsou vhodné. Pevný podklad by se měl použít pouze jedenkrát a neměl by být nákladný.
Z těchto důvodů pevný podklad může být libovolný pevný podklad, na který se může zachytit nukleová kyselina. Může to být například latexové částice, částice dextranu, polystyrénový a polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, povrchy tvořené zlatém, skleněné povrchy a plátky silikonu. Upřednostňuje se, aby pevný podklad byl skleněný povrch a zachycení nukleových kyselin na tento povrch je proveden kovalentní vazbou.
Kovalentní navázání koloniových primerů a templátů nukleové kyseliny na pevný podklad se může provést za použití metod, které jsou známy v oboru. Například epoxysilan-amino kovalentní navázání oligonukleotidů na pevné podklady, jako jsou porézní skleněné částice, které se používají při in šitu syntéze oligonukleotidů (prostřednictvím připojení 3'konce) a také se upravily pro zachycení oligonukleotidů 5'konce. Oligonukleotidy upravené na 5'konci pomocí karboxylové a • ···· ·» ,. ,, , *· ... · » · · · ·· • · · · · « · · · · · « * ··*....:
• · · ·. » , t „ ·*· ··« ·» .. .. ...
aldehydové skupiny se kovalentně zachytily na latexových částicích upravených hydrazinem (Kremsky et al. , 1987).
Jiné přístupy vhodné pro zachycení oligonukleotidů na pevných površích je použití síťovaciho činidla, jako je sukcinanhydrid, fenylizothiokyanát (Guo et al. , 1994) nebo maleinanhydrid (Yang et al., 1998). Jiným velmi používaným síťovacím činidlem je l-etyl-3-(3-dimetylamonipropyl)karbodiimidhydrochlorid (EDC). Chemie EDC se poprvé popisuje v publikaci Gilham et al., (1986). Uvádí se, že templáty DNA se zachytí na papír (celulózu) prostřednictvím terminální fosfátové skupiny na 5'konci. Za použití chemie EDC se použily jiné podklady. Jsou to například latexové částice v publikaci Wolf et al., 1987 a Lund (popisují se al., 1988), et polystyrénové mikroprohlubně (popisuje se
Rasmussen et al., 1991), sklo s určenou v publikaci velikostí pórů
Ghosh et al., 1987) a molekuly 1987). Kondenzace oligonukleotidů s upraveným 5'-koncem s činidlem zprostředkovaná karbodiimidem (popisuj e dextranu se v publikaci (Gangeras et al., se popisuje v publikaci Chu et al., (1983) a Egan et al., (1982) v případě fosfátové skupiny, kterou se upravil 5'konec.
Výsledkem zachycení oligonukleotidů prostřednictvím
5'konce za použití karbodiimidů se může dosáhnout
o, 0 r ale nespecifického zachycení prostřednictvím vnitřních nukleotidů oligonukleotidů.
V publikaci Rasmussen et (1991) se popisuje zvýšení až 85 % specifické zachycení prostřednictvím 5'konce derivatizací povrchu za použití sekundárních aminoskupin.
V publikacích se popisují výhody hetero-bifunkčních síťovacích činidel. Hetero nebo monobifunkční síťovací činidla se široce používají při přípravě konjugátových molekul peptidových nosičů (peptid-protein) za účelem zesílit imunogenitu u zvířat (Peeters et al., 1989). U většiny těchto • · · činidel se popisuje, že tvoří stabilní kovalentni vazby ve vodném roztoku. Tato síťovací činidla se použila při navázání DNA na pevný podklad pouze v jednom bodě molekuly.
V publikaci Chrisey et al., (1996) se popisuje studie účinnosti a stability zachycení DNA na pevné fázi za použití šesti různých heterobifunkčních síťovacích činidel. V tomto příkladu se zachycení projeví pouze na 5'konci oligomerů DNA upraveného thiolovou skupinou. Tento typ zachycení se také popisuje v publikaci 0'Donnell-Maloney et al., (1996). Popisuje se zachycení cílů DNA v sekvenční analýze MALDI-TOF a v dokumentu EP-A-665293 Hamamatsu Photonics F.K. company se popisuje stanovení sekvence baží nukleové kyseliny na pevném povrchu.
Provedlo se několik studií, které hodnotí termální stabilitu zachycení oligonukleotidů na pevném podkladu. Chrisey et al. , (1996) popisuje, že v případě sukcinimidyl-4 [p-maleimidofenyl]butyrátové síťovacího činidla (SMPB) se uvolnilo ze skleněného povrchu skoro 60 % molekul během ošetření teplem. V tomto případě se však nepopisuje termální stabilita jiných činidel.
Za účelem vytvořit kolonie nukleové kyseliny prostřednictvím amplifikační reakce na pevné fázi, jak se popisuje v této přihlášce, templáty
5'konci na primery a nukleových kyselin se specificky zachytí svými pevném povrchu, přičemž se upřednostňuje sklo. Skleněný povrch se může derivatizovat reaktivními aminoskupinami silanizaci za koloniové použití aminoalkoxysilanů.
Vhodná silanová činidla zahrnuj i aminopropyltrimetoxysilan, aminopropyltrietoxysilan a 4aminobutyltrietoxysilan. Skleněné povrchy se mohou také derivatizovat jinými reaktivními skupinami, jako je například • ···· ·· ·· ·· ··« · · · ··· • ··· · ···· · · akrylátová skupina nebo epoxyskupina za použití epoxysilanu, akrylátsilanu a akrylamidsilanu. Následuje derivatizační krok, přičemž molekuly nukleové kyseliny (koloniové primery nebo templáty nukleové kyseliny) vykazují na svém 5konci chemicky upravitelnou funkční skupinu. Je to například fosfátová, thiolová nebo aminoskupina, které- jsou kovalentně zachyceny na derivatizovaném povrchu, síťovacím činidlem, jak se popisuje shora v textu. V jiném případě krok derivatizace je následován zachycením bifunkčního síťovaciho činidla na povrchových aminoskupinách, přičemž vznikají upravené funkční povrchy. Molekuly nukleových kyselin (koloniový primer nebo templáty nukleové kyseliny), které vykazují na 5-konci fosfátovou, thiolovou skupinu nebo aminoskupinu pak reagují s funkčním povrchem za vzniku kovalentní vazby mezi nukleovou kyselinou a sklem.
Potencionální síťovací činidla a činidla vhodná pro zavedení se mohou použít při kovalentním zachycení DNA/oligonukleotidu na pevném povrchu a zahrnují l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydrochlorid (EDC), sukcinanhydrid, fenyldiizothiokyanát nebo maleinanhydrid nebo heterobifunkční síťovací činidlo, jako je například mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidester (MBS), N-sukcinimidyl-[4-jodoacetyljaminobenzoát (SIAB) , sukcinimidyl-4-[Nmaleimidometyl]cyklohexan-l-karboxylát (SMCC) , N-y-maleimidobutyryloxy-sukcinimidester (GMBS), sukcinimidyl-4-[p-maleimidofenyl]butyrát (SMPB) a odpovídající sulfosloučeniny, které jsou rozpustné ve vodě. Preferovaná síťovací činidla podle vynálezu jsou s-SIAB, s-MBS a EDC. s-MBS je maleimidsukcinimidový heterobifunkční síťovací činidlo a s-SIAB je jodoacetylsukcinimidové heterobifunkční síťovací činidlo. Obě tyto činidla jsou schopny tvořit kovalentní vazbu se skupinami SH a primárními aminoskupinami. EDC je karbodiimidové činidlo, • · • · · které zprostředkovává kovalentni zachycení fosfátové skupiny a aminoskupiny.
Koloniové primery a templáty nukleových kyselin se v obecném případě modifikují na svém 5'konci fosfátovou skupinou nebo primární aminoskupinou (například síťovacím činidlem EDC) nebo thiolovou skupinou (v případě linkerů sSIAB nebo s-MBS).
Vynález dále poskytuje pevný podklad, na který se připojí velké množství koloniových primerů X, jak se popisuje shora v textu a alespoň jeden templát nukleové kyseliny, jak se popisuje shora v textu, kde uvedené templáty nukleové kyseliny obsahují na svých 5'koncích oligonukleotidovou sekvenci Y, jak se popisuje shora v textu, a na svých 3'koncích obsahují oligonukleotidovou sekvenci pevný podklad, kterým je množství templátů zachycení templátů nukleové nukleové pevném povrchu byla
Z. Upřednostňuje s výhodou se, aby se na sklo, zachytilo velké kyseliny.
Upřednostňuje se, aby koloniových primerů na kyseliny kovalentni. Uskutečněním jednoho nebo více cyklů amplifikace nukleové kyseliny na imobilizovaném templátů nukleové kyseliny za použití metod, jak se popisuje shora v textu, se mohou vytvořit kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu. Vynález dále popisuje podklad obsahující jednu nebo více kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Vynález dále popisuje použití pevných podkladů podle vynálezu v metodách amplifikace nukleové kyseliny nebo sekvenování. Takové metody amplifikace nebo sekvenace nukleové kyseliny zahrnuje metody podle vynálezu.
Vynález dále popisuje použití derivatizovaného nebo funkčního podkladu, připraveného způsobem, jak se popisuje shora v textu při metodách amplifikace a sekvenování. Takové metody amplifikace a sekvenování nukleových kyselin zahrnují metody podle vynálezu.
Vynález dále popisuje přistroj pro provedení metod podle vynálezu nebo přístroj pro produkci pevného podkladu, který obsahuje kolonie nukleové kyseliny podle vynálezu. Takový přístroj může například obsahovat velké množství templátu nukleové kyseliny a koloniových primerů podle vynálezu vázaných přednostně kovalentní vazbou na pevný podklad, jak se popisuje shora v textu, spolu s polymerázou nukleové kyseliny, s velkým množstvím nukleotidových prekurzorů, jak se popisuje shora v textu, přičemž část z nich se může značit a může obsahovat prostředek pro řízení teploty. V jiném případě může přístroj obsahovat například podklad obsahující jeden nebo více kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu. Upřednostňuje se, aby přístroj také obsahoval detekční prostředky pro detekci a rozlišeni signálů z jednotlivých kolonií nukleových kyselin uspořádaných na pevném povrchu za použití metod podle vynálezu. Takové detekční prostředky mohou zahrnovat zařízení s vázaným nábojem, které je operativně spojeno se zvětšovacím zařízením, jako je mikroskop, jak se popisuje shora v textu.
Upřednostňuje se, aby libovolný přístroj podle vynálezu byl automatický.
Vynález popisuje řešení a potřeby vědců v oboru biotechnologií, které jsou směrovány do odvětví genomu, farmakologie, vývoje drog, charakterizace potravin a typováni genů. Taková metod se může aplikovat například při sekvenování a opětném sekvenování, diagnostikování a testování, monitorování genové exprese, při profilech genové diversity, zkoumání a hodnocení polymorfizmu celého genomu, při vytvoření genomových sklíček (celý genom pacienta se nanese na mikroskopické sklíčko) a sekvenování celého genomu.
Vynález se může použít při sekvenování a opětném sekvenování nukleové kyseliny, kde jsou například geny specificky amplifikovány do kolonií za účelem úplného ···· ·· · · ·· · • · · · ···· •·· · ···· · · · ··· ·· · · · · · • · · · · · · · • ·· ·· · · ·· ··· sekvenování DNA. Opětná sekvenace genu umožňuje identifikaci všech známých a nových genetických polymorfizmů zkoumaných genů. Amplifikace se používá při diagnóze onemocnění a genetické identifikaci živých organizmů.
Při použití vynálezu při diagnostikování a testování se mohou amplifikovat celé genomy nebo frakce do kolonií za účelem sekvenování DNA známých polymorfizmů jediného nukleotidu (SNP). Identifikace SNP nachází použití ve výzkumu v oboru medicíny za účelem identifikovat faktory genetických poruch spojených s onemocněním. Typování genů pomocí SNP také nachází uplatnění při diagnostikování v oboru farmacie, což se využívá při identifikaci a léčbě pacientů pomocí specifických léků.
Použití vynálezu při tvoření profilů genetické diversity se mohou identifikovat amplifikaci vzorku DNA do kolonií a následným sekvenováním DNA specifických značek v případě každé jednotlivé genetické entity populace například organizmů nebo buněk nebo tkáně. Tímto způsobem se může definovat genetická diverzita vzorku stanovením počtu značek pro jednotlivou entitu.
Použití podle vynálezu při monitorování exprese genu, se exprimované molekuly mRNA tkáně nebo zkoumaného organizmu přemění na molekuly cDNA, které se amplifikují do sady kolonií za účelem sekvenování DNA. Frekvence kolonií, které kódují danou mRNA je úměrná frekvenci molekul mRNA přítomných v počáteční tkáni. Aplikace monitorování genové exprese se zahrnuje do bio-medicínského výzkumu.
Mikroskopická sklíčka nesoucí celý genom (genomová sklíčka), kde celý genom živého organizmu je přítomen v počtu kolonií DNA, který je dostatečný, aby obsahoval všechny sekvence uvedeného genomu. Tyto sklíčka se mohou připravit za použití metod podle vynálezu a mohou představovat genetické • ···· ·· ·· ·· • · · · · · ··· karty libovolného živého organizmu. Genetické karty nacházejí uplatnění ve výzkumu oboru medicíny a genetické identifikaci živých organizmů, které se využívají v průmyslu.
Vynález se také může použít k provedení sekvenace celého genomu, kde celý genom živého organizmu se amplifikuje jako sada kolonií pro sekvenování rozsáhlé DNA. Sekvenování celého genomu umožňuje například 1) přesnou identifikaci genetických kmenů libovolného živého organizmu, 2) zkoumání nových genů kódovaných v genomu a 3) zkoumání nových genetických polymorfizmů.
nejsou omezeny
Aplikace vynálezu z jednotlivého kyselin se na analýzu vzorků nukleové kyseliny
Značky nukleových organizmu mohou začlenit nebo pacienta.
do templátů a mohou se tak amplifikovat, přičemž pro je možné použít odlišné značky že se stanoví sekvence nukleových kyselin každý organizmus nebo pacienta nukleových kyselin. Tak v případě, amplifikované nukleové kyseliny, může se také stanovit sekvence značky a původ identifikovaného vzorku.
Vynález dále popisuje použití metod podle vynálezu nebo kolonií nukleové kyseliny podle vynálezu nebo velkého množství templátů nukleových kyselin podle vynálezu nebo pevných podkladů podle vynálezu, které se používají při přípravě molekul nukleové kyseliny za účelem sekvenování, monitorování genové exprese, stanovení profilů genetické diversity, diagnostikování, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání polymorfizmu celého genomu a hodnocení a přípravy sklíček s celým genomem (to znamená celý genom jednotlivce na jednom podkladu) nebo se mohou použít při libovolné jiné aplikace, která zahrnuje amplifikaci nebo sekvenování nukleových kyselin.
Vynález dále poskytuje sadu vhodnou pro použití při sekvenování, opětném sekvenování, monitorování exprese genu, • · · · · ·· ·· ·« • · · ··· «·· stanovení profilu genetické diversity, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání a hodnocení celého genomu nebo libovolnou jinou aplikaci zahrnující amplifikaci nebo sekvenování nukleových kyselin. Tento kit obsahuje velké množství templátů nukleové kyseliny a koloniových primeru podle vynálezu vázaných na pevném podkladu.
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma metody vhodné pro vytvoření kolonie nukleové kyseliny, jak se popisuje v jednom provedení vynálezu.
Na obrázku č. 2 je zobrazeno schéma přípravy templátů a následné zachycení na pevný povrch.
Na obrázku č. 2a je znázorněna příprava templátů A, B a B' obsahující sekvence koloniových primeru. Za použití PCR primeru TP1 a TP2 se z genomové DNA vytvořil templát o velikosti 3,2 Kb. Templáty A . (obsahující 854 bp) a B (obsahující 927 bp) se vytvořily za použití PCR primerů TPA1/TPA2 nebo TPB1/TPB2. Oligonukleotidy TPA1 a TPB1 se mají upravený 5' konec a to buď fosfátovou nebo thiolovou skupinou, které slouží k následnému zachycení (*) . Získané templáty obsahují sekvence odpovídající koloniovým primerům CPI a/nebo CP2. 11 exonů genu se zde nazývá jako El až Ell.
Na obrázku č. 2b je zobrazeno chemické zachycení koloniových primerů a templátů na skleněný povrch. Je zde zobrazena derivatizace pomocí ATS (aminopropyltrietoxysilan) .
Na obrázku č. 3 jsou zobrazeny kolonie DNA vytvořené z koloniového primerů. Obrázek zobrazuje počet kolonií pozorovaných v poli pod 20-ti násobným zvětšením, jako funkci koncentrace templátu vázaného na stěnu. Nejnižší koncentrace detekovatelného templátu je 10’13 M.
Na obrázku č. 4 je zobrazena diskriminace mezi koloniemi, které pochází z dvou různých templátu.
Na obrázku č. 4a se nachází zobrazení kolonií vytvořených z obou templátu a negativních kontrol.
Na obrázku č. 4b jsou zobrazeny kolonie pocházející z obou templátů ve stejné poloze ve stejné prohlubni, které se zviditelnily dvěma různými barvivý, a negativní kontroly.
Na obrázku č. 4c jsou zobrazeny souřadnice obou typů kolonií v pod-sekci pole viditelného v mikroskopu. Jsou zde také zobrazeny kolonie z různých templátů, které se neshodují.
Na obrázku č. 5 jsou zobrazeny schémata templátu nebo zachycení oligonukleotidů na sklo. Krok A je pak derivatizace povrchu, přičemž povrch skleněného sklíčka se ošetří kyselým roztokem, aby se zvýšil počet volných hydroxylových skupina na povrchu skla. Připravená sklíčka se ponoří do roztoku aminosilanu. Zkratka ATS představuje aminopropyltrietoxysilan. Krok B: BI nebo B2 pak znamená funkcionalizaci skleněného povrchu se síťovacími činidly a pak následuje zachycení oligonukleotidů. Aminoskupina reaguje se síťovacím činidlem prostřednictvím amidové vazby, což odpovídá kroku Bl. Zkratka s-MBS znamená sulfo-m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysukcinimidester a zkratka s-SIAB znamená sulfo-Nsukcinimidyl[4-jodoacetyl]aminobenzoát. Krok B2 : oligonukleotidy (oligonukleotidy s modifikovaným 5'koncem, kde se vyskytuje thiolová skupina) se zachytí na povrchu prostřednictvím vytvoření kovalentní vazby mezi thiolem a dvojnou vazbou maleimidu. Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok obsahuje PBS, 0,1 M NaH2PO4, pH6,5, 0,15 M NaCl) . Krok • · · · · · · · · · · ··· ··· «·· • ··· · ···· · · • ··· · β ··· ·
Β3 zahrnuje zachyceni oligonukleotidů za použití EDC a imidazolu. 5'konec fosfátem upravených oligonukleotidů reaguje s imidazolem v přítomnosti EDC za vzniku 5'fosforimidazolidových derivátů (není zobrazeno) . Deriváty tvoří fosforamidát vázaný s aminoskupinami derivatizovaného skleněného povrchu. Zkratka EDC znamená l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimidhydro-chlorid.
Na obrázku č. 6: je zobrazen graf, kde počet kolonií pozorovaný v poli mikroskopu při zvětšení 20 x je funkci koncentrace templátu vázaného na stěnu. Templát DNA se vázal v různých koncentracích buď prostřednictvím spojovacího prostředku (EDC) na povrch skla derivatizovaného aminoskupinou (A) nebo na skleněný povrch funkcionalizovaný s-MBS (B). Kolonie s dvouřetězcovou DNA se podrobily štěpení restrikčními enzymy a získaly se jednotlivé řetězce hybridizované s komplementárním oligonukleotidem značené fluorescentní molekulou cy5.
Na obrázku č. 7 je zobrazen příklad sekvenováni in šitu kolonií DNA vytvořených na skle.
Na obrázku č. 7a je zobrazen výsledek po inkubaci s Cy5™ -dCTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Je možné vidět pět rozmazaných bodů, což ukazuje, že dochází k ne příliš dramatickému rušivému účinku (jako je srážení agregátů Cy5™ -dCTP, adsorpce nebo jednoduše nespecifické začlenění do DNA v koloniích nebo na povrchu).
Na obrázku č. 7b je zobrazen výsledek inkubace Cy5™ -dUTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Neobjevil se žádný bod, což indikuje, že neproběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množstvím, kdy nukleotid určený pro začleněni neodpovídá sekvenci templátu následující hybridizovaný primer.
• · · · ♦ · · ·· ·· ··* · · · · · · • · · · · ···· 9 9
Na obrázku č. 7c je zobrazen výsledek inkubace Cy5™ -dCTP se vzorkem, který se inkuboval s primerem pl81. Objevila se řada fluorescenčních bodů, což indikuje, že proběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množství, přičemž nukleotid určený pro začlenění odpovídá sekvenci templátů následujícím po hybridizovaném primeru.
Obrázek č. 8 zobrazuje hybridizaci sond s oligonukleotidy zachycenými na Nucleolink před a po proběhnutí cyklů PCR. Obrázek ukazuje hybridizaci R58 s CP2 (5'-(fosfát)TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno plnými kruhy), CP8 (5' (aminohexametylen)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno plnými trojúhelníky), CP9 (5' (hydroxyl)TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno kosočtvercem), CP10 (5' (dimetoxytrityl)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno prázdnými kruhy) a CPU (5'(biotin)~ TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) (značeno prázdnými trojúhelníky).
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Příprava templátů DNA vhodných pro vytvoření kolonií DNA
Kolonie DNA se vytvořily z templátů DNA a koloniových primerů. Termín „sekvence koloniového primeru znamená sekvenci odpovídající sekvenci koloniového primeru a nazývá se „oligonukleotidovou sekvencí Y nebo „oligonukleotidovou sekvencí Z'.
Vlastnosti koloniových primerů se vybraly na základě výběru oligonukleotidových primerů, které vykazují slabé nespecifické začlenění nukleotidu v přítomnosti tepelně stabilní DNA polymerázy. Koloniové primery CPa (5' -.p CACCAACCCAAACCAACCCAAACC) a CPp (5'-p AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) se vybraly na základě jejich malé schopnosti začlenit • ···♦ · · ·· ·· • · · · · · · · * • · · · · · · · ♦ · · • ··· * fc ··· · radioaktivně značeného nukleotidu [a32P-dCTP] v přítomnosti stabilní DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 2 minut, 50 cyklů).
modelový
DNA o velikosti 3,2 Kb se vybral jako demonstruje možnost vytvoření kolonií za použití koloniových primerů
Fragment systém, který lidský gen kódující produktů (HUOXRAGE, a templátů DNA. Vybraný templát obsahuje receptor pro další glykozylaci konečných
GenBank číslo uložení D28769). RAGE specifické primery jsou uvedeny v tabulce
1. Templát o velikosti 3,2 kb pomocí PCR se amplifikoval
0,1 μς lidské genomové DNA s 1 μΜ primery TP1 a TP2 s j ednotkou
DNA polymerázy
City, CA) standardním °C po dobu °C po (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 30 vteřin, teplota 65 °C po minut, 40 cyklů).
dobu velikosti 3,2 Kb účelem vytvoření se použil jako templát dvou kratších templátů ve dobu 1 minuty, teplota
Tento fragment DNA o kolonie (templát A a B). kratších templátů obsahují obě
Primery sekvence, pro templát a sekvence účelem amplifikace DNA pro sekundární PCR, za vhodných pro vytvoření používané k vytvoření které koloniových primerů jsou specifické
CP2, za
CPI a obecném na pevném povrchu. V vzniku templátů DNA se upraví případě na jeho
PCR primer používaný ke
5'konci buď fosfátovou nebo thiolovou skupinou. Po amplifikaci
PCR se vytvořily fragmenty DNA, které obsahují sekvence koloniových primerů na jednom nebo na obou koncích, které sousedí s DNA fragmentem RAGE (popisuje se na obrázku č. 2a).
Templát A (dvouřetězcový templát, který obsahuje sekvenci koloniového primerů CPP na obou koncích) se vytvořil s 0,1 ng templátů o velikosti 3,2 Kb s 1 μΜ primery TPA1 a 1 μΜ TPA2 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, «
CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 60 vteřin, teplota 72 °C po dobu 60 vteřin, 30 cyklů) . Produkty se pak čistily na Qia-quick koloně od firmy Qiagen (Qiagen
GmbH, Hilden, Německo).
Templát B (dvouřetězcový templát, který obsahuje sekvence koloniových primerů odpovídající ΟΡβ) se vytvořil s 0,1 ng templátu o velikosti 3,2 kb s 1 μΜ primery TPB1 a 1 μΜ TPB2 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotních cyklů (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 1 minuty, 30 cyklů) . Produkty se pak čistily na koloně Qia-quick od firmy Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Německo).
Templát B' (dvouřetězcový templát obsahující sekvence koloniových primerů odpovídající CPa a ΟΡβ na obou koncích) se vytvořil 0,1 ng templátu o velikosti 3,2 kb s 1 μΜ primery TPB3 a 1 μΜ TPB4 s 1 jednotkou DNA polymerázy (AmpliTaq, Perkin Elmer, Foster City, CA) ve standardním pufru a za podmínek teplotního cyklu (teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 1 minuty, teplota 72 °C po dobu 1 minuty, 30 cyklů). Produkty se pak čistily na kolonách Qia-quick od firmy Qiagen (Qiagen GmbH, Hilden, Německo).
Všechny použité specifické oligonukleotidy při přípravě templářů DNA a pro vytvoření kolonií se uvádějí v tabulce č. 1 spolu s libovolnou chemickou modifikací.
Obecné schéma vykazující chemické začlenění koloniových primerů a templářů na skleněném povrchu je zobrazeno na obrázku č. 2b, kde se provedla derivatizace pomocí ATS (aminopropyltrietoxysilan).
Tabulka č. 1: Seznam oligonukleotidů používaných při přípravě templátů a vytvoření kolonií
název sekvence DNA souřadnice (orientace) úprava oligonukleotidů použití
TP1 9810 (R) templát o velikosti 3,2 kb
TP2 6550 (F) templát o velikosti 3,2 kb
CPI žádné 5'P vytvoření kolonií
CP2 žádné 5'P vytvoření kolonií
CP3 žádné 5'SH vytvoření kolonií
CP4 žádné 5'SH vytvoření kolonií
CP5 žádné 5'P vytvoření kolonií
CP6 žádné 5'P vytvoření kolonií
CP7 žádné 5' (NH2) vytvoření kolonií
CP8 žádné 5' (NH2) vytvoření kolonií
CP9 žádné 5'(OH) kontrolní
···· ·· ·· e- · · · ··· · · ··♦
oligo
CP10 žádné 5'(DMT) kontrolní oligo
CPU žádné 5' (biotin) kontrolní oligo
TPA1 6550 (F) 5'P templát A
TPA2 7403 (R) 5'P templát A
TPB3 9049 (F) žádné templát B'
TPB1 9265 (F) žádné templát B
TPB2 8411 (R) 5'P templát B
TPB4 9265 (R) 5'SH templát B'
Souřadnice pocházejí z „HUMOXRAGE gene, přístupové číslo je
D28769, symbol (R) znamená „reverzní a symbol (F) znamená „dopředný.
Příklad la: Příprava náhodného templátů DNA lemovaného degenerativním primerem
Fragment DNA o velikosti 3,2 kb se vybral jako modelový systém pro demonstraci možnosti vytvořit kolonie za použití amplifikace PCR s náhodnými primery. Tato strategie se může aplikovat sekvenováním fragmentů DNA přibližné velikosti 100 kb a kombinací fragmentů s celými genomy. Fragment DNA o velikosti 3,2 kb se vytvořil pomocí PCR z lidské genomové DNA za použití primerů PCR TP1 5'-pGAGGCCAGAACAGTTCAAGG a TP2 5'pCCTGTGACAAGACGACTGAA, jak se popisuje v příkladu 1. Fragment o velikosti 3,2 kb se pak štěpil na menší fragmenty kombinací restrikčních enzymů (EcoRI a Hhal za vzniku čtyř fragmentů o velikosti 800 bp). Štěpené nebo neštěpené fragmenty DNA se pak smíchaly s degenerovaným primerem p252 (5'-P TTTTTTTTTTISISISISISIS, kde symbol I znamená inosin (který tvoří pár s A, T a C) a symbol S znamená G nebo C a kovalentně se váže na prohlubně „Nucleolink (Nunc, Německo). Ve zkumavkách pak proběhla náhodná PCR amplifikace na pevné fázi a vizualizace se provedla hybridizací se značenými sondami DNA, jak se popisuje v příkladu 2a.
Příklad 2: Kovalentní navázání templátů DNA a koloniových primerů na pevný podklad (plast) a tvorba kolonií s koloniovým primerem
Kovalentní navázání templátů a koloniového primeru na pevný podklad (plast)
Koloniový primer (CP2, ' _ TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAG
GAAAGGGAAAGGG s fosforylovaným
5'koncem (Microsynth GmBH,
Švýcarsko) se zachytil v prohlubních plastových mikrotitračních destiček „Nucleolink (Nunk,
Dánsko) • ···· ·· ·· ·· ··· ··· ··· • ··· « ···· · · • · · · · · · · ·· ·· · · · · · v přítomnosti různých dávek templátu A (připraveno způsobem popsaným v příkladu 1) . 8 prohlubní se provedlo ve dvou provedeních se sedmi ředěními templátu 1/10 s primerem CP2. Nejvyšší počáteční koncentrace je 1 nM.
Prohlubně mikrotitračních destiček, na které se kovalentně navázaly koloniový primer CP2 a templát se připravily následujícím způsobem. Do každé prohlubně mikrotitrační destičky „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primeru s různou koncentrací templátu ředěného z 1 nM v 10 mM 1-metylimidazol (pH7,0) (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se přidalo k roztoku koloniového primeru a templátu 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-{3-dimetylaminopropyl}-karbodimidu (hodnota pH je 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metyl-imidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C přes noc. Inkubační prohlubně se pak dvakrát vypláchly 200 μΐ RS (0,4 Ά NaOH, 0,25 % Tween 20) , inkubovaly se 15 minut s 200 μΐ RS, dvakrát se promyly 200 μΐ RS a dvakrát s 200 μΐ TNT (TNT tvoří 100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se nechaly vyschnout při teplotě 50 °C a uchovávaly se v zataveném plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonií
V každé prohlubni se vyvolal růst kolonií přidáním 20 μΐ směsi PCR, čtyř dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA (bovinní sérový albumin), 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), 1 x koncentrovaného pufru PCR a 0,025 jednotek/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA). Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a růst kolonií se uskutečnil inkubací zatavených prohlubní po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů při následujících podmínkách: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut.
• · * · · · · · · ···· · ···· · ·
Po ukončeni uvedeného programu se prohlubně uchovávaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Dříve než se provede hybridizace se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a zahřály se na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladily se na ledu. Sonda se přidala po opětném zahřátí na teplotu 45 °C.
Zviditelnění kolonií
Sonda:
Sondu tvoří fragment DNA obsahující 1 405 párů baží, který zahrnuje na svém 3'konci sekvenci templátu (polohy nukleotidů 8 405 až 9 259) . Sonda DNA se syntetizovala pomocí PCR za použití primeru p47 (5 ' -GGCTAGGAGCTGAGGAGGAA) amplif ikuj ícího od báze 8 405 a TP2 biotinylovaného na 5' konci amplifikuj ícího od báze 9 876 kódujícího DNA-řetězce.
Hybridizace a detekce:
Sonda se naředila na koncentraci 1 nM v pufru „easyhyb (Boehringer Mannheim, Německo) a do každé prohlubně se přidalo 20 μΐ. Sonda a kolonie se denaturovaly při teplotě 94 °C po dobu 5 minut a pak se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 50 °C. Nadbytek sondy se odstranil promytím při teplotě 50 °C v 2x koncentrovaném SSC 0,1 % roztokem Tween. Sondy DNA se navázaly na zeleně fluorescenční fluorosféry potažené avidinem o průměru 0,04 μ (Molecular Probes) v pufru TNT po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Nadbytek kuliček se odstranil promytím pufrem TNT. Kolonie se zviditelnily mikroskopicky a provedla se analýza zobrazení, jak se popisuje v příkladu 2a. Na obrázku č. 3 je zobrazen počet kolonií pozorovaných v poli mikroskopu při 20-ti násobném zvětšení, jako funkce koncentrace templátu vázaného na prohlubeň. Nejnižší —13 koncentrace detekovatelného templátu odpovídá koncentraci 10
M.
Přiklad 2a: Kovalentní navázáni templářů DNA a koloniových primerů na pevný podklad (plast) a tvorba kolonií s degenerovaným primerem.
Kovalentní navázání templátu a koloniového primeru na pevný podklad (plast)
Mikrotitrační prohlubně s p252 s fragmenty templářové DNA se připravily následujícím způsobem: do každé prohlubně „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primeru p252 s různou koncentrací templátu ředěného z koncentrace 0,5 nM v 10 mM 1-metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se k roztoku koloniového primeru a templátu přidalo 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-(dimetylaminopropyl)karbodiimidu (pH 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se přes noc při teplotě 50 °C. Po inkubaci se prohlubně promyly dvakrát 200 μΐ RS (0,4 A NaOH, 0,25 % Tween 20), vše se pak inkubovalo po dobu 15 minut s 200 μΐ RS, pak následují dvě promytí 200 μΐ RS a dvě promytí 200 μΐ TNT (pufr TNT zahrnuje 100 mM TrisHCl pH7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se sušily při teplotě 50 °C a uchovávaly se v zataveném plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonii
Tvorba kolonií proběhla podle upraveného protokolu, který umožňuje náhodnou iniciaci v každé prohlubni s 20 μΐ směsi PCR, která obsahuje čtyři dNTP (0,2 mM každého dNTP), 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), lx koncentrovaný pufr a 0,025 jednotek/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA) . Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a proběhla amplifikace inkubací zatavených prohlubní po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů za následujících podmínek: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po
dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut. Po dokončeni tohoto programu se prohlubně udržovaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Před hybridizací se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a obsah se zahřál na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladil se na ledu. Sonda se přidala po ohřátí na teplotu 45 °C.
Zviditelnění kolonií
Sondy:
Dva fragmenty DNA o velikosti 546 a 1 405 párů baží obsahující sekvence původního templátu se amplifikovaly pomoci PCR. Kódující DNA-řetězec se značil biotinem za použití PCR primerů značeným biotinem na jeho 5'konci. Souřadnice párů baží sondy jsou 6 550 až 7 113 a 6 734 až 9 805.
Hybridizace a detekce:
Sonda se ředila na koncentraci 1 nM v pufru „easyhyb (Boehringer.Mannheim, Německo) a do každé prohlubně se přidalo 20 μΐ. Sonda a kolonie se denaturovaly při teplotě 94 °C po dobu 5 minut a pak se inkubovaly po dobu 6 hodin při teplotě 50 °C. Nadbytek sondy se odstranil promytím při teplotě 50 °C v 2x koncentrovaném SSC s 0, 1 % roztokem Tween. Sondy DNA se navázaly na zeleně fluorescenční fluorosféry potažené avidinem o průměru 40 nanometrů (Molecular Probes, Portland, OR) v pufru TNT po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Nadbytek částic se odstranil promytím pufrem TNT. Fluorescence se detekovala za použití inverzního mikroskopu (za použití objektivu 20x/0,4 LD Achroplan na Axiovert S100TV s are rtuťovou lampou HBO 100W/2, Caři Zeiss, Oberkochen, Německo) spojeného s kamerou 768 (Η)x512(V)pixel-CCD (Princeton Instruments lne. Trenton, NJ, USA). Expozice trvala 20 vteřin přes sadu filtrů XF22 (Ex. filtr: 485DF22, dichroický filtr: 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex. filtr: 640DF20, dichroický filtr: 670DRLPO2 Em: 682DF22) od firmy Omega Optical ····· ·· ·· ·· · ··« ··· · · · · ···· · ···· · · · • ·«······· · • ········ ······ · · ·· ·· ··· (Brattleboro Vt) v případě značení FITC a Cy5. Data se analyzovala za použiti software WinWiew (Princeton Instruments lne., Trenton NJ, USA). Počet kolonií v poli mikroskopu se spočítal ve dvou provedení prohlubní za použití softwaru pro analýzu zobrazení.
Příklad 3: Sekvenační diskriminace ve různých koloniích, která pochází z různých poměrů dvou různých kovalentně vázaných templátů a koloniového primerů
Kovalentní navázání templátů a koloniového primerů na pevný podklad (plast)
Koloniový primer (CP2, 5'-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGG
GAAAGGG s fosforylovaným 5'koncem (Microsynth GmBH, Švýcarsko) se zachytil v prohlubních plastových mikrotitračních destiček „Nucleolink (Nunk, Dánsko) v přítomnosti různých dávek templátů A (připraveno způsobem popsaným v příkladu 1) . Série 8 prohlubní se provedla ve třech provedeních se sedmi ředěními obou templátů 1/10. Ředění templátů jsou upraveny opačným směrem tak, že nejvyšší koncentrace templátů se shoduje s nejnižší.
Prohlubně mikrotitračních destiček, na které se kovalentně navázaly koloniový primer CP2 a oba templáty se připravily následujícím způsobem. Do každé prohlubně mikrotitrační destičky „Nucleolink se přidalo 30 μΐ 1 μΜ roztoku koloniového primerů CP2 s různou koncentrací obou templátů ředěného z 1 nM v 10 mM 1-metylimidazolu (pH7,0). (Sigma Chemicals). Do každé prohlubně se přidalo k roztoku koloniového primerů a templátů 10 μΐ 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodimidu (hodnota pH je 7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C přes noc. Inkubační prohlubně se pak dvakrát vypláchly 200 μΐ RS (0,4 N NaOH, 0,25 % Tween 20), inkubovaly • ·
se 15 minut s 50 μΐ RS, třikrát se promyly 50 μΐ RS a třikrát s 50 μΐ TNT (TNT tvoři 100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20). Zkumavky se uchovávaly v TNT při teplotě 4 °C.
Tvorba kolonií
V každé prohlubni se vyvolal růst kolonií přidáním 20 μΐ směsi PCR, kterou tvoří čtyři dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA (bovinní sérový albumin), 0,1 % Tween 20, 8% DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka, Švýcarsko), 1 x koncentrovaný pufr
PCR a 0,025 jednotek/μΐ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Foster City, CA).
Destičky s prohlubněmi se pak umístily do teplotního cyklovače a růst kolonií se uskutečnil inkubaci zatavených prohlubni po dobu 5 minut při teplotě 94 °C a proběhlo 50 cyklů při následujících podmínkách: teplota 94 °C po dobu 30 vteřin, teplota 65 °C po dobu 2 minut, teplota 72 °C po dobu 2 minut. Po ukončení uvedeného programu se prohlubně uchovávaly při teplotě 8 °C do dalšího použití. Dříve než se provede hybridizace se prohlubně naplnily 50 μΐ pufru TE (pufr TE obsahuje 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,4) a zahřály se na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a ochladily se na ledu. Sonda se přidala po opětném zahřátí na teplotu 50 °C.
Zviditelnění kolonií
Sondy:
Dva fragmenty DNA o velikosti 546 a 1 405 párů baží odpovídající sekvencím fragmentu DNA o velikosti 3,2 kb na svém 5'a 3'konci se amplifikovaly pomocí PCR. Kódující DNAřetězec se značil bíotínem za použití PCR primerů značeného biotinem (popisuje se v příkladu 2). Dvě sondy se denaturovaly zahřáním na teplotu 94 °C po dobu 5 minut, pak se rychle ochladily v 1 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 a nechaly se navázat na fluorosféry potažené streptavidinem o průměru 0,04 μιη, které
se značily různými barvivý po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C. Sondy vázané na částicích se ředily 20 krát v pufru „easyhyb předehřátém na teplotu 50 °C. Do každé prohlubně, která obsahuje denaturované kolonie se přidalo 20 μΐ sond.
Hybridizace a detekce:
Hybridizace se provedla při teplotě 50
Nadbytek sondy se odstranil promytím při °C po dobu 5 hodin.
°C v 2x teplotě koncentrovaném
SSC s 0,1 roztokem
SDS.
Kolonie se zviditelnily mikroskopem objektivem umožňuj ící zvětšení s expozicí analýza zobrazení způsobem popsaným č. 4a je uvedeno zobrazení kolonií dvacetinásobné vteřin provedla se
2a. Na obrázku v příkladu vytvořených z templátů a negativních kontrol. Na obrázku č.
4b jsou zobrazeny kolonie vytvořené z templátů ve stejné poloze ve stejné prohlubni zviditelněné dvěmi rozdílnými barvami a
Obrázek č. 4c zobrazuje souřadnice obou sekci mikroskopického pole. Obrázek č. kolonie z různých templátů nejsou shodné.
negativní kontroly, typů kolonií v pod4c demonstruje, že
Příklad 4: Kovalentní navázání templátů DNA a oligonukletidů na skleněné pevné podklady
Skleněná sklíčka derivatizovaná aminosilanem se použila jako pevný podklad pro kovalentní zachycení oligonukleotidových sond upravených thiolovou skupinou za použití heterobifunkčních síťovacích činidel. Vybraná činidla vykazují skupiny reaktivní s thiolovou skupinou (maleimid) a aminoskupinou (sukcinimidylester) . Zachycení oligonukleotidu a stabilita imobilizovaných molekul silně závisí na stabilitě síťovacího činidla za daných podmínek. Reakční schéma templátů DNA nebo zachycení oligonukleotidů na skle se popisuje na obrázku č. 5.
• ···· · · · • * *- ··· · · • · · · · · « • · ·· ·· · · ·
Hodnotila se stabilita při uchovávání připravených skleněných sklíček se síťovacími činidly s-MBS a s-SIAB a jejich teplotní stabilita. Důležitým faktorem, který ovlivňuje rozsah hybridizace imobilizovaných oligonukleotidových sond je hustota zachycených sond (popisuje se v publikaci Beattie et al., 1995 a Joss et al., 1997). Tento účinek se studoval při různých koncentracích oligonukleotidů během imobilizace a testování hustoty zachycených oligonukleotidů hybridizací.
Materiály a metody
Ošetření mikroskopických skleněných sklíček kyselinou
Mikroskopická skleněná sklíčka (Knittel, Měrek ABS) se namočily do (HelmanexIIR základního roztoku Helmanex během jedné hodiny
0,25 %,
IN NaOH). Sklíčka se promyla vodou, ponořily se přes noc do 1M HC1, promyly se opět vodou a ošetřily se po dobu jedné hodiny roztokem kyseliny sírové (H2SO4/H2O poměru objemů 1/1 a přidalo se malé množství čerstvého sulfátu amonného). Sklíčka se promyla vodou etanolem a nakonec čistým acetonem. Sklíčka se sušila uchovávala ve vakuu až do doby dalšího použití.
Silanizace povrchu
Předem ošetřená sklíčka se ponořila do 5 % roztoku ATS (aminopropyltriethoxysilan, Aldrich) v acetonu. Silanizace se provedla při teplotě místnosti po dobu dvou hodin. Po třech promytích v acetonu (jedno promytí trvá 5 minut) se sklíčka promyla etanolem, sušily se a uchovávaly se vakuu.
Zachycení síťovacího činidla
Síťovací činidla s-MBS a s-SIAB (sulfo-m-maleimidobenzoylN-hydroxysukcinimidester a zkratka s-SIAB znamená sulfo-Nsukcinimidyl[4-jodoacetyljaminobenzoát, Pierce, Rockford IL) se připravily jako 20 mM roztoky v PBS (fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem, 0,1 M NaH2PO4, pH7,2, 0,15 M NaCl) .
Sklíčka upravená sílaném, na která se naneslo 80 μΐ roztoku
siťovacího činidla se přikryly krycími mikroskopickými sklíčky a nechaly se reagovat po dobu 5 hodin při teplotě 20 °C. Sklíčka se promyla PBS, krátce se ponořila do vody a opláchla se etanolem. Sklíčka se pak sušila a uchovávala se ve vakuu ve tmě do doby dalšího použití.
Zachycení oligonukleotidu
Oligonukleotidy se syntetizovaly tak, že se jejich 5' konec upravil thiolovou skupinou (CP3 a CP4 Eurogentec, Brussels) nebo fosforečnanovou částí (CPI a CP2, Eurogentec, Brussels) za použití standardní chemie fosforamiditu.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci thiolovou skupinu (CP3 a CP4) se připravily jako 100 μΜ roztoky ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (NaPi obsahuje 0,1 M NaH2PO4 pH6,6, 0,15 M NaCl) a na sklíčka se nanesly kapky o objemu 1 μΐ, přičemž sklíčka se funkcionalizovala siťovacím činidlem. Sklíčka se nechala kultivovat po dobu 5 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se uchovávala v saturované vlhké atmosféře, aby se předešlo odpaření. Sklíčka se promyla za stálého míchání pufrem NaPi. V případě studia teplotní stability se sklíčka dvakrát ponořila do pufru Tris (10 mM, pH8) po dobu 5 minut při teplotě 100 °C a přímo se ponořily do roztoku 5x koncentrovaný SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrát sodný, pH 7) při teplotě 4 °C po dobu 5 minut. Sklíčka se až do dalšího použiti uchovávala v 5x koncentrovaném roztoku SSC při teplotě 4 °C.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci fosfátovou skupinu (CPI a C2), se aplikovaly (v kapkách o celkovém objemu 1 μΐ) po dobu 5 hodin při teplotě místnosti na aminoderivatizované skla, jako 1 μΜ roztoku v 10 mM 1metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals), který obsahuje 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC, Pierce, • ·
Rockford, IL) . Sklíčka se promyla dvakrát při teplotě 100 °C v pufru Tris (tento pufr obsahuje 10 mM Tris pH 8) a přímo se ponořily do 5x koncentrovaného roztoku SSC při teplotě 4 °C po dobu 5 minut. Sklíčka se uchovávala v 5x koncentrovaným roztoku SSC při teplotě 4 °C až do doby dalšího použití.
Zachycení oligonukleotidu a templátové DNA
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci thiolovou skupinu, (CP3 a CP4) a templát B's thiolovou skupinou na svém 5'konci se smíchaly ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (roztok NAPi obsahuje 0,1 M Nal^PCU pH6,6, 0,15 M NaCl). Koncentrace templářů DNA kolísá od 0,001 do 1 μΜ a koncentrace primeru se pohybuje v rozmezí od 0,1 do 100 μΜ, přičemž optimální koncentrace templátu je 1 μΜ a v případě primeru to je hodnota 100 μΜ. Dále se postupuje podle způsobu zachycení primerů CP3 a CP4 na funkční povrch sklíčka popsaného shora v textu.
Oligonukleotidové primery, které mají na svém 5'konci fosfátovou skupinu, (CPI a CP2) a templát B s fosfátovou skupinou na svém 5' konci se smíchaly ve 10 mM roztoku 1metylimidazolu (pH 7,0) (Sigma Chemicals), který obsahuje 40 mM l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbcdiimid (EDC, Pierce, RockFord, IL) . Koncentrace templátu DNA kolísá od 0,001 do 10 nM a koncentrace primeru se pohybuje v rozmezí od 0,1 do 1 μΜ, přičemž optimální koncentrace templátu je 10 nM a v případě primeru to je hodnota 1 μΜ. Dále se postupuje podle způsobu zachycení primerů CPI a CP2 na aminoderivatizovaný povrch sklíčka popsaného shora v textu.
Hybridizace s fluorescenčně značenými sondami
Oligonukleotidové sondy, které jsou fluorescenčně značené molekulami Cy5 nebo FITC na jejich 5'konci, se syntetizovaly Eurogentec (Brussels). Aby se zabránilo nespecifické • ·
hybridizaci, sklíčka se inkubovala s blokačním roztokem (tento roztok obsahuje 5 x koncentrovaný roztok SSC, Tween 0,1 %, BSA 0,1 %) po dobu jedné hodiny a promyly se za stálého míchání v 5x koncentrovaném roztoku SSC (promývání proběhlo dvakrát a trvalo 5 minut). Oligonukleotidové sondy se ředily na koncentraci 0,5 μΜ v 5 x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 % a nanesly se na skleněný povrch po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se propláchla za stálého míchání při teplotě 37 °C 5x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 5 minut a dvakrát 2 x koncentrovaným roztokem SSC, který obsahuje 0,1 % SDS, po dobu 5 minut.
Hybridizace s radioaktivně značenými sondami
Jako hybridizační sondy za účelem kvantifikovat výtěžek hybridizace se použily radioaktivně značené oligonukleotidy komplementární s kovalentně vázanými oligonukleotidy.
Za použití polynukleotidové kinázy bakteriofága T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) se enzymaticky značily 5'konce oligonukleotidů pomocí [y-32P]dATP (Amersham, UK) . Nadbytek [y32P]dATP se odstranil kolonou „Chromá Spin TE-10 (Clontech, Palo Alto, CA). Radioaktivně značené oligonukleotidy (0,5 μΜ oligonukleotidů v 5x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 %) se nanesly na derivatizovaná sklíčka po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka se jednou promyla za stálého míchání v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 5 minut a dvakrát v 2x koncentrovaném roztoku SSC, SDS 0,1 % po dobu 5 minut při teplotě 37 °C. Po hybridizaci se stanovila specifická aktivita za použití scintilačniho počítače.
Pozorování mikroskopem
Sklíčka se přelila 5x koncentrovaným roztokem a překryla se mikroskopickým krycím sklíčkem. Fluorescence se detekovala za použití inverzního mikroskopu model Axiovert S100TV, který
má are rtuťovou lampu HBO 100W/2 (Carl Zeiss, Oberkochen, Německo) spojený s kamerou CCD vybavenou CCD Kodak s formátem 768(H) x 512 (V) pixelů, 6,91 x 4,6 mm, velikost pixelu je 9 x 9 μιπ2 (Princeton Instruments lne. Trenton, NJ, USA) . Doba expozice je 1 až 50 vteřin a použil se objektiv LD Achroplan 20x/0,400 (Crl Zeiss, Oberkochen, Německo) a sada filtrů XF22 (ex. 485DF22, dichroický filtr 505DRLPO2 Em: 530DF30) a XF47 (Ex: 640DF20, dichroický filtr 670DRLPO2 Em: 682DF22) od Omega Optical (Brattleboro VT) v případě FITC a Cy5 fluoroforů. Data se analyzovaly za použití software Winwiew (Princeton Instruments lne., Trenton NJ, USA).
Výsledky
Hodnocení stability zachycení při uchovávání a teplotní stability.
Hodnotila se stabilita při uchovávání sklíček připravených s s-MBS a s-SIAB. Protože tato činidla jsou citlivá vůči hydrolýze, výsledky zachycení oligonukleotidů budou záviset na jejich stabilitě. Aminoderivatizovaná sklíčka se funkcionalizovaly čerstvě připravenými síťovacími činidly, jako je s-MBS a s-SIAB. Funkcionalizovaná sklíčka se uchovávala po zachycení pomocí síťovacího činidla po dobu 10 dni v desikátoru ve vakuu ve tmě a při teplotě místnosti. Po této době se testovaly skladovaná sklíčka (t= 10 dní) a sklíčka, která bezprostředně reagovaly se síťovacími činidly (t= 0) . Výsledky získané po reakci oligonukleotidem upraveným thiolovou skupinou a hybridizaci s komplementární fluorescenční sondou se porovnaly pro oba časy t= 0 a t= 10 dní.
Po imobilizaci sklíčka funkcionalizovaná s-SIAB jsou po deseti dnech skladování zcela stabilní, jak je zřejmé ze stejných výsledků hybridizace pro t= 0 a t= 10 dní. Naopak spojení s-MBS se skleněným povrchem je méně stabilní a vede k
% ztrátě výtěžku zachyceni oligonukleotidů a hybridizace při deseti dnech skladování. Preferují se sklíčka funkcionalizovaná pomocí s-SIAB a mohou se připravovat s předstihem a mohou se uchovávat suchá ve vakuu, ve tmě a po dobu alespoň deseti dní, aniž dojde k žádnému snížení výtěžku zachycení sondy.
Za účelem hodnocení teplotní stability oligonukleotidů zachycených na skleněném povrchu se sklíčka vystavila ošetření při teplotě 100 °C po dobu 5 minut v 10 mM Tris-HCl, pH 8. Zbývající oligonukleotid, který zůstává po promytí stále imobilizovaný, se testoval hybridizací s fluorescenčně značeným komplementárním oligonukleotidem. Přibližně 14 % zachycených molekul se uvolnilo ze sklíček upravených pomocí s-SIAB a 17 % zachycených molekul se uvolnilo ze sklíček upravených pomocí s-MBS po prvních 5 minutách promývání, ale
další uvolnění se detekovalo
případy (tabulka č. 1A) . Tyto
srovnání s výsledky získanými
1996, kde se uvolnilo více
připoj ených na fúzované silik
síťovacího činidla
při druhém promytí pro oba výsledky jsou povzbudivé ve v publikaci Chrisey et al·., jak 62 % oligonukleotidů ?nová sklíčka prostřednictvím SMPB (sukcinimidyl-4-[pmaleimidofenyljbutyrát) . Tyto výsledky se naměřily po deseti minutách ošetření v PBS při teplotě 80 °C.
Tabulka č. 1A: Studie teplotní stability
výsledky hybridizace (jednotky normalizované na 100 %)
čerstvě zachyceno po 5 min promytí při teplotě 100 °C po 2 x 5 minutách promytí při teplotě 100 °C
s-MBS 80±6 . 69±4 7 3±4
s-SIAB 100±9 84±8 87±3
• ·
Oligonukleotidy se zachytily na sklíčka funkcionalizovaná buď s-MBS nebo s-SIAB. Zachycené oligonukleotidy se testovaly hybridizaci s fluorescenčně značeným komplementárním oligonukleotidem. Fluorescenční signál je normalizovaný na hodnotu 110 v případě nejsilnějšího získaného signálu. Uvádějí se průměrné hodnoty tří provedení analýzy.
Hybridizace jako funkce zachycení sondy
Studovaly jsme rozsah hybridizace kovalentně vázaných oligonukleotidových sond jako funkci povrchového pokrytí zachycených oligonukleotidů za použití síťovacích činidel sMBS a s-SIAB a reakcí zprostředkovaných EDC. Koncentrace oligonukleotidů aplikovaných za účelem imobilizace byla 1 μΜ EDC a v případě síťovacího činidla kolísá v rozmezí 1 až 800 μΜ. Hustota na povrchu se testovala hybridizaci se sondami značenými 32P. Optimální koncentrace zachycení primerů za použití heterobifunkčních síťovacích činidel je 500 μΜ, které souhlasí s povrchovou hustotou hybridizovaných molekul 60 fmol/mm2 v případě s-MBS a v případě s-SIAB 270 fmol/mm2.
Podobné hustoty se dosáhlo v případě s-MBS za použití zachycení oligonukleotidů s fosfátovou skupinou na svém
5'konci na aminosilanizovaném skle zprostředkovaného
EDC/imidazolem. Pouze 1 μΜ roztoky oligonukleotidů jsou nezbytné pro dosažení stejného výsledku zachycení.
Tabulka č. 1B: Hybridizace jako funkce zachycení sondy
Hybridizované oligo (fmol/mm )
koncentrace oligonukleotidů používaného při zachycení (μΜ) s-MBS s-SIAB EDC
1 NT NT 50
100 10 100 NT
500 60 270 NT
« *f«* V* ·· ·· 0 • « * · · · * · · ·»·· · * · · · * · · · ··»····.
··*··· ·* ·· · · ···
Oligonukleotidy se zachytily na sklíčka funkcionalizované buď s-MBS nebo s-SIAB nebo prostřednictvím aktivačního činidla EDC. Zachycené oligonukleotidy se testovaly hybridizací s radioaktivně značeným komplementárním oligonukleotidem. Specifická aktivita a proto také hustota hybridizovaných molekul se stanovila scintilačni kapalinou. Zkratka NT znamená netestovalo se.
Povrchová hustota 60 fmol/cm2 odpovídá průměrnému molekulovému prostoru mezi vázanými oligonukleotidy, což je 8 nm. Podle našich výsledků hustota pokrytí 30 fmol/mm2 (prostor mezi molekulami 20 nm) je dostatečná pro získání kolonií DNA. Tento výtěžek je možné získat imobilizací primerů v koncentraci 100 μΜ za použití heterobifunkčního síťovaciho činidla s-SIAB nebo 1 μΜ sond za použití přístupu sprostředkovaného EDC. Hustota hybridizace je v rozmezí hodnoty nejvyšší hustoty získané na sklíčkách )jak se popisuje v publikaci Guo et al., 1994, Joss et al., 1997, Beattie et al., 1995).
Tvorba kolonií DNA na skle: tvorba kolonií závisí na délce, koncentraci templátu a koncentraci primerů.
Teoreticky tvorba kolonií DNA vyžaduje vhodnou hustotu primerů zachycených na povrchu odpovídající vhodné délce templátové DNA. Za účelem optimální tvorby kolonií DNA je důležité definovat rozmezí hustot vázaných primerů a templátů, stejně jako stechiometrický poměr mezi templátem a primerem.
Materiál a metody
Příprava sklíček
Sklíčka se derivatizovala a funkcionalizovala, jak se popisuje shora v textu (materiály a metody). Primery kolonií
DNA jsou CPI a CP2. Templáty kolonií se připravily způsobem popsaným v přikladu 1 v případě templátu B', ale za použití
4 4 • 44
4 4
4·
4 4 4 4 templátů se • ··· • 44 • 4
4»
4* primerů TPB3 a TPB2. Upravené kolonie primerů aplikovaly na skleněný povrch v různých koncentracích koloniového primerů a koloniového templátu.
Tvorba kolonií
Sklíčka uchovávaná v 5 x koncentrovaném roztoku SSC se promyla vodou filtrovanou přes mikrofiltr, aby se odstranily sole. Růst kolonií se vyvolal na skleněném povrchu směsí PCR, která obsahuje čtyři druhy dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, Ix pufr PCR a 0,05 U/μΙ DNA polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Poster City, CA). Směs PCR se umístila do zatavené komory (MJ Research, Watertown, MA). Sklíčka se umístila do teplotního cyklovače (The DNA Engine, MJ Research Watertown, MA) a provedly se následující teplotní cykly: krok 1 při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, krok 2 při teplotě 65 °C po dobu 3 minut, krok 3 při teplotě 74 °C po dobu 6 minut a tento program se opakuje 50 krát. Po ukončení tohoto programu se sklíčka držela při teplotě 6 °C až do dalšího použití.
Štěpení kolonií s dvouřetězcovou DNA
Skleněný povrch obsahující DNA se štěpil restrikční nukleázou tak, že se kolonie přelila restrikčním enzymem v lx koncentrovaném štěpícím pufru. Reakce proběhla dvakrát po dobu
1,5 hodiny při teplotě 37 °C. Kolonie s dvouřetězcovou DNA se denaturovaly ponořením sklíček dvakrát do pufru Tris (obsahuje 10 mM, pH 8) při teplotě 100 °C po dobu 5 minut. Pak následuje promytí 5x koncentrovaným roztokem SSC při teplotě 4 °C. Sklíčka se uchovávala v 5x koncentrovaném roztoku až do dalšího použití.
Hybridizace kolonií s jednořetězcovou DNA
Aby se zabránilo nespecifické hybridizaci, sklíčka se inkubovala s blokačním roztokem (5x koncentrovaný roztok SSC, 0,1 % Tween, 0,1 % BSA) po dobu 1 hodiny a sklíčka se promyla « · t ·*W· 99 ·♦ ·· • · · * · * ♦ · · · « * * * · ♦ 9 9 « » · · » · » 6 ♦ • *······* • · · · « · · 9 · · * · · ·
5x koncentrovaným roztokem SSC (promytí se provedlo dvakrát po dobu 5 minut). Oligonukleotid s fluorescenčně značeným 5'koncem pomocí molekuly Cy5 (Eurogentec, Brussels) se ředil na koncentraci 0,5 μΜ v 5x koncentrovaném roztoku SSC, Tween 0,1 % a nanesl se na skleněný povrch na dobu alespoň 2 hodin. Sklíčka se promyla za stálého míchání 5x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 5 minut a dvakrát 5 x koncentrovaným roztokem s 0,1 % SDS po dobu 5 minut při teplotě 37 °C.
Sklíčka se zviditelnila dříve popsaným způsobem.
Pozorovalo se, že rozsah hybridizace je funkce hustoty zachycení oligonukleotidu. Podobná studie s vázanými templáty DNA ukázal, že tvorba kolonii je také funkcí koncentrace templátů zachyceného na sklíčkách. V závislosti na chemických postupech užívaných při zachycení oligonukleotidu a templátů je optimální koncentrace templátů 1 μΜ v případě bifunkčního síťovacího činidla s-MBS (obrázek č. 6B) a 1 nM v případě EDC karbodiimidu (obrázek č. 6A) . Je zajímavé, že vyšší koncentrace templátů nezvyšuje počet kolonií v případě chemie EDC a dosáhlo se hodnoty odpovídající maximálnímu počtu kolonií.
Studovaly jsme tvorbu kolonií (počet) jako funkci koncentrace primerů, koncentrace templátové DNA aplikované na povrch a délku templátů DNA.
Také se hodnotil počet kopií templátů v každé kolonii. Kvantifikace se založila na fluorescenční detekci fluoroforů značených molekulami Cy5, Cy3 nebo fluoresceinem doplněnými činidlem proti bělení (Prolong, Molecular Probes, Portland, OR) . Kalibrace se provedla pomocí hybridizačních experimentů pomocí primerů zachycených na povrchu a odpovídající skutečná hustota se stanovila pomocí radioaktivity.
• · ··· ·· ·* ·· · • · * * · · · • e » · « · «« • · « - · · B ·· * · · · · ** ·· ·· ·· ···
Přiklad 5: In-situ sekvenování DNA kolonií
Sklíčka (o průměru 5 mm, Verrerie de Carouga, Švýcarsko) se nejdříve umístily do 0,2 % roztoku Helmanex (ve vodě), do lázně IN NaOH po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti, pak se propláchla destilovanou vodou, čistým hexanem a opět dvakrát destilovanou vodou a aplikovalo se 1 M HC1 přes noc při teplotě místnosti. Pak se sklíčka promyla dvakrát destilovanou vodou a ošetřila se H2SO4 (50 %) plus K2S20g po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Sklíčka se opět promyla destilovanou vodou a pak dvakrát etanolem. Sklíčka se derivatizovala ATS (jak se popisuje v příkladu 4).
Koloniové primery CPI (5'-p TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGG AAAGGGAAAGGG) a CP2 (5'-p TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) fosforylované na 5'konci (Microsynth GmbH, Švýcarsko) a templátová DNA B (připravený, jak se popisuje v příkladu 1) se kovalentně svým 5'koncem zachytily na sklíčku o průměru 5 mm (Verrerie de Carouge, Švýcarsko) tak, aby konečná koncentrace byla 1 μΜ až 10 nM. Postupuje se následovně. 2 nm každého primerů se přidaly k 0,2 nm templátu v 1 ml roztoku A (41 μΐ metylimidazolu (Sigma, kat. č. M-8878) v 50 ml H2O, pH se upravilo na hodnotu 7 pomocí HC1) a pak se vše smíchalo v poměru 1:1 s roztokem D (roztok D je 0,2 mM EDC v 10 ml roztoku A) . Na obě strany sklíček se naneslo 3,5 μΐ směsi a sklíčka se inkubovala přes noc při teplotě místnosti. Sklíčka se pak krátce opláchla 5x koncentrovaným roztokem SSC a umístila se do pufru 10 mM Tris pH 8,0 při teplotě 100 °C po dobu dvakrát pět minut.
Nespecifická místa na skle se blokovala bovinním sérovým albuminem (BSA, Boehringer Mannheim GmbH, Německo, kat. číslo 238040) o koncentraci 1 mg/ml v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a pak se promyly destilovanou vodou.
Sklíčka se pak jednotlivě umístily do reakční zkumavky Microamp™ (Perkin Elmer), která obsahuje 170 μΐ směsi PCR a pak se vytvořily kolonie DNA za použití Taq polymerázy (AmpliTaq, PE-Applied Biosystems lne., Foster City, CA), přičemž proběhlo 50 cyklů (teplota 94 °C po dobu 60 vteřin, teplota 60 °C po dobu 3 minut, teplota 72 °C po dobu 6 minut) v teplotním cyklovači MTC 200 (MJ Research, Watertown, MA) . DNA na každém sklíčku se štěpila dvakrát za použití 1,3 jednotek restrikční endonukleázy PvuII (Stratagene) v pufru NEB 2 (New England Biolabs) po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Po štěpení se zkumavky umístily do 10 mM pufru Tris pH 8,0 při teplotě 100 °C po dobu 2x 5 minut, pak se reakce blokovala filtrovaným (Millex GV4, Millipore) roztokem BSA o koncentraci 1 mg/ml v 2x koncentrovaném pufru SSC po dobu 30 minut při teplotě místnosti a promyly se nejdříve 2x koncentrovaným roztokem SSC s 0,1 % SDS a pak 5x koncentrovaným roztokem SSC. Každé sklíčko se inkubovalo přes noc při teplotě místnosti s 5x koncentrovaným roztokem SSC/0,1 % Tween 20, který obsahuje 1 μΜ sekvenačni primer pl81 (CGACAGCCGGAAGGAAGAGGGAGC) . Kontroly, které neobsahují primer se uchovávaly v 5x koncentrovaném roztoku SSC s 0,1 % Tween 20. Sklíčka se promyla dvakrát 5x koncentrovaným roztokem SSC s 0,1 % SDS při teplotě 37 °C po dobu 5 minut a dále pak 5x koncentrovaným roztokem SSC. Primer pl81 může hybridizovat s templátem B'a sekvence následující po pl81 je CAGCT.... Za účelem zaostření se zelené fluorescenční částice adsorbovaly na dno prohlubně a každá prohlubeň se inkubovala s 20 μΐ ředění 1/2 000 žlutých/zelených fluorescenčních FluoSpheres® potažených streptavidinem (Molecular Probes, Eugene, OR) v 5x koncentrovaném roztoku SSC po dobu 20 vteřin při teplotě místnosti.
Po hybridizaci s primerem se přidaly, na každé sklíčko 2 μΐ roztoku, který obsahuje 0,1 % BSA, 6 mM dithiotreitolu (Sigma
Chemicals), 5 μΜ Cy5(tm)-dCTP nebo 5 μΜ Cy5(tm)-dUTP (Amersham, UK) a lx koncentrovaný reakční pufr sekvenázy. Přidání Cy5(tm)nukleotidu se inicializuje přidáním 1,3 jednotky DNA polymerázy T7 Sequenase<tml (Amersham, UK) po dobu dvou minut v 5x koncentrovaném roztoku SSC s 0,1 % SDS po dobu 15 minut a sklíčka se promyla 5x koncentrovaným pufrem SSC.
Vzorky se pozorovaly za použití inverzního mikroskopu (Axiovert S100TV, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Německo) vybavený CCD kamerou Mikromax 512x768 a za použití software Winview (Princeton Instruments, Trenton, NJ). Při zaostření se použil objektiv s 20-ti násobným zvětšením a sada filtrů XF 22 (Omega Optical, Brattleboro, VT) a při pozorováni vzorků se začleněným Cy5TM se použil objektiv s 20-ti násobným zvětšením a sada filtrů XF 47 (Omega Optical, Brattleboro, VT) při 50 vteřinové expozici za použití třídění 2x2 pixelů. Žluté/zelené FluoSpheres® (přibližně se jich v poli objektivu nachází 100) nevykazuji detekovatelný signál za použiti sady filtru XF47 a při 50 vteřinové expozici (data nejsou uvedeny). Fotografie se vytvořily pomocí programu Winview (Princeton Instruments).
Na obrázku č. 7A je zobrazen výsledek po inkubaci s Cy5™dCTP se vzorkem, který se před tím neinkuboval s primerem pl81. Je možné vidět pět rozmazaných bodů, což ukazuje, že dochází k ne příliš dramatickému rušivému srážení agregátů Cy5™-dCTP, adsorpce účinku (jako je nebo jednoduše nespecifické začlenění do DNA v koloniích nebo na povrchu).
Na obrázku č. 7b je zobrazen výsledek inkubace Cy5™-dUTP se vzorkem, který se neinkuboval s primerem pl81. Neobjevil se žádný bod, což indikuje, že neproběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množstvím, kdy nukleotid určený pro začlenění neodpovídá sekvenci templátů následující hybridizovaný primer.
Na obrázku č. 7c je zobrazen výsledek inkubace Cy5™-dCTP se vzorkem, který se inkuboval s primerem pl81. Objevila se řada fluorescenčních bodů, což indikuje, že proběhlo začlenění fluorescenční báze v detekovatelném množství, přičemž nukleotid určený pro začlenění odpovídá sekvenci templátů následujícím po hybridizovaném primeru.
Ukázalo se, že je možné začlenit fluorescenční nukleotidy do DNA obsažené v koloniích způsobem, který je specifický pro sekvenci, a je možné monitorovat toto začlenění zde popsaným přístrojem nebo metodou. To je však pouze příklad. Je vhodné, když je potřeba, aby se fluorescenční báze opakovaly několikrát. Když se to provede způsobem specifickým pro sekvenci, je pak možné dedukovat část sekvence DNA obsažené v koloniích.
Příklad 6: Analýza značení 5' konce mRNA
Nejpřesnější způsob monitorování exprese genu v buňkách nebo tkáních je omezení počtu kroků mezi shromážděním vzorku a vyhodnocení mRNA. Běžně dostupné jsou také nové metody pro rychlou izolaci mRNA. Nejúčinnější metody zahrnují rychlou izolaci vzorku a bezprostřední porušení buněk do roztoku hydrochloridu guanidinu, který zcela rozloží proteiny a deaktivuje RNázy. Pak následuje čištění mRNA ze supernatantu porušených buněk pomocí oligo-dT afinitní chromatografie. Nakonec mRNA s čepičkou na svém 5'konci se může specificky cílit a transformovat do cDNA za použití jednoduché strategie (syntéza cDNA SMART, Clontech, Palo Alto).
Tato metoda dovoluje syntézu kopií cDNA pouze translačně aktivní mRNA s čepičkou na 5'konci. Kombinaci shora popsané rychlé metody izolace mRNA a přípravy cDNA tvorby kolonií DNA metodou vnesení templátů vznikl postup pro identifikaci velkého množství materiálu značek na 5'konci sekvence mRNA. Výhodou našeho vynálezu je možnost sekvenovat velké množství • · • ·
cDNA přímým zavedením produktu reakcí syntézy cDNA, amplifikací cDNA do tisíce kopií a současně následuje in sítu sekvenování cDNA.
Materiály a metody
Syntetické oligonukleotidy a plazmidy
Oligonukleotidy se syntetizovaly s 5'-fosfáty pomocí Eurogentec nebo Microsynth. Za použití standardních metod se vytvořily plazmidy obsahující částečné kódující a 3'nepřekládané sekvence myšího genu draslíkového kanálu mSlo, který následuje po promotoru T3 RNA polymerázy.
Syntéza mRNA
Plazmidy mSlo se linearizovaly v jediném místě, které rozeznává restrikční nukleáza Sáli nebo Sací a které následuje v plazmidu po sekvenci póly A+. Po ošetření štěpeného plazmidu proteinázou K, DNA linearizovaného plazmidu se extrahovala jednou směsí fenol/CHsCl/izoamylalkohol a srážela se s etanolem. Sraženina DNA se znovu rozpustila ve vodě v koncentraci 10 mikrogramů v mikrolitru. Syntetická mRNA s čepičkou 5'-metylguanozin se syntetizovala in vitro pomocí bitu pro syntézu mRNA „mMessage mMachine podle instrukcí výrobce (Ambion, Austin TX) . Syntetická mRNA se uchovávala při teplotě 80 °C.
Enzymy
Restrikční enzymy se získaly od firmy New England Biolabs (Beverly, MA).
Syntéza cDNA
Syntetická mRNA se smíchala s mRNA póly A+ myších jater v různých poměrech (1:1, 1:10, 1:100) a podle směsi mRNA myších jater a syntetické mRNA se uskutečnila za použiti sady pro syntézu cDNA „SMART PCR (Clontech, Palo Alto, CA) s nějakými malými úpravami. Při reakci syntézy cDNA se ···· ·· ·· • · · · • · · · · * ·· ·· ·· ··· přibližně 1 μα směsi mRNA smíchal s primerem CP5, který má 5'konec sekvence CPp, (5'p-AGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGTTTTTTTTTTT TTTTTNN). Tento primer se používá při syntéze prvního řetězce cDNA. V případě syntézy druhého řetězce se použije metoda „SMART. Základem syntézy „SMART je vlastnost reverzní transkriptázy myšího viru Moloney přidat na 3'konec prvního řetězce cDNA tři až pět deoxycytozinových zbytků v případě, že mRNA obsahuje 5' -metylguanozinovou čepičku manuál pro použivatele sady SMART, Clontech, Palo Alto, CA) . Primer CP6, který obsahuje sekvenci CPp plus AAAGGGGG na 3'konci (5'pAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGGGG) , se používá při syntéze druhého řetězce cDNA. Pufr a SUPERSCRIPT™ II RNáza II reverzní transkriptáza z viru myší leukémie Moloney (Lufe Technologies, Ltd.) se používá, jak se popisuje v instrukcích a reakce se provedla při teplotě 42 °C po dobu 1 hodiny. cDNA · se pak testovala pomocí PCR za použití primerů p251, který obsahuje fragment sekvence ΟΡβ (5'-GAGAAGGAAAGGGAAAGG) a Taq DNA polymerázou (Platinum Taq, Life Technologies, Ltd.).
Příprava kolonií DNA
5'p-cDNA se smíchala s různými koncentracemi koloniového primerů na chemicky vázaly na stěny zkumavek vhodných pro reakce
PCR „Nucleolink (NUNC) podle návodu výrobce. Kolonie
DNA se pak připravily za použití
Taq polymerázy (AmpliTaq
Gold, cyklech minuty,
PE-Applied Biosystems lne., (teplota 94 °C po dobu 30 teplota 72 °C po dobu 1,5 minuty)
Foster vteřin,
City, °C
CA)
PO v cyklovači v 30 dobu 1 teplot
MTC 200 (MJ Research, Watertown,
MA) .
Sondy DNA a hybridizace
Sondy DNA značené biotinem a radioaktivně 32P specifické pro sekvenci DNA genu mSlo se syntetizovaly pomocí primerů, který je značen na svém 5'konci biotinem a normálním přímým • · «
primerem metodou
PCR za použiti templátu (mSlo DNA plazmid).
Sonda začlenila cc[32P]-dCTP (Amersham,
Amersham UK) v poměru
300:1 (a[32P]-dCTP k dCTP) v reakci
PCR s konečnou koncentrací čtyř deoxynukleozidtrifosfátů μΜ.
Z výsledných biotinylovaných a radioaktivně značených sond DNA se odstranily sole na koloně Chromaspin-1 000 (Clontech, Palo
Alto, CA) .
Sondy
DNA se hybridizovaly se vzorky v pufru „easyhyb (Boehringer-Mannheim,
Německo) za použití následujícího schématu teploty (cyklovači teplot
MTC200):
teplota 94 °C po dobu 5 minut, pak následuje 68 kroků, kdy každých 30 vteřin se sníží teplota o 0,5°C (to znamená, že teplota se sníží během 34 minut o 65 °C) . Při hybridizaci se použily zatavené prohlubně. Vzorky se pak třikrát promyly 200 μΐ TNT při teplotě místnosti. Prohlubně se pak inkubovaly po dobu 30 minut s 50 μΐ TNT, které obsahuje 0,1 mg/ml BSA (New England Biolabs, Beverly, MA) . Prohlubně se pak inkubovaly po dobu 5 minut s 15 μΐ roztoku červených fluorescenčních mikrosfér o velikosti 40 nanometrů potažených streptavidinem (molecular Probes, Portland, OR) . Roztok mikrosfér se připravil tak, že se 2 μΐ zásobního roztoku mikrosfér , které sonikovaly po dobu 5 minut ve vodní lázni s ultrazvukem o výkonu 50 W (Elgasonic, Bienne, Švýcarsko) ředil v 1 ml roztoku TNT, který obsahoval 0,1 mg/ml BSA a filtroval se přes filtr Millex GV4 s velikosti pórů 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA) .
Vizualizace kolonii DNA
Obarvené vzorky se pozorovaly za použití inverzního mikroskopu Axiovert 10 za použití objektivu s 20-ti násobným zvětšením (Carl Zeiss AG, Operkochen, Německo) vybavený kamerou Micromax 512x768 CCD (Princeton instruments, Trenton, NJ) za použití sady filtrů PB546/FT580/LP590 a deseti vteřinové expozice. Dokumenty se převedly do formátu TIFF a
zpracovaly se ve vhodném software (PhotoPaint, Corel Corp. Ltd., Dublin, Ireland). Zpracování spočívá v inverzi a v lineárním zesílení kontrastu za účelem vytvořit obrázek, který je vhodný pro černobílý tisk na laserové tiskárně.
Výsledky
Syntéza syntetické mRNA a cDNA
Syntéza cDNA se kontrolovala pomocí PCR za použití primerů p251 (vytvořeného na každém konci prvního řetězce cDNA), přičemž správná délka produktů se testovala elektroforézou na agarózovém gelu. Syntetická mRNA mSlo se ředila do mRNA jater a dokázala se pruhy specifickými pro mSlo se snižující se intenzitou zesílením nespecifického smíru cDNA jater.
Detekce a kvantifikace kolonií DNA
Kolonie DNA se testovaly za použití fluorescenci zobrazujícího mikroskopu CCD nebo scintilačního počítáni. Počet fluorescenčně detekovatelných kolonií se zvýšil jako funkce množství zavedeného templátu, jak je zobrazeno na obrázku č.
o o
6. Toto zvýšení se odráží jako množství detekovatelného P.
Pomocí radioaktivně značených sond je možné detekovat kopie mRNA v přibližném poměru
1:100. Pomocí fluorescenčního mikroskopu zobrazovací technologií CCD se může detekovat mRNA v ředění 1:10 000.
Příklad 7: Kovalentní navázáni primerů na pevný podklad
Oligonukleotidové primery se zachytily do mikrotitračních prohlubní Nucleolink (Nunc, Dánsko) plastových za účelem stanovit optimální čas párování. Oligonukleotidy (5'-(aminohexametylen) -TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG) ,
CP9
CP10 (5'(dimethoxytrityl) -TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG a
CPU ······ a· • ·· · ··· ····· (5'(biotin)-TTTTTTTTTTAGAAGGAGAAGGAAAGGGAAAGGG), Microsynth
GmbH, Švýcarsko) se zachytily do mikrotitračních prohlubní Nucleolink následujícím způsobem (pro každý nukleotid se použilo 8 prohlubní): do každé prohlubně se dalo 20 μΐ roztoku, který obsahuje 0,1 μΜ oligonukleotid, 10 mM 1-metylimidazol (pH7,0) (Sigma Chemicals) a 10 mM l-etyl-3-(3dimetylaminopropyl)-karbodiimid (pH7,0) (Sigma Chemicals) v 10 mM 1-metylimidazolu. Prohlubně se pak zatavily a inkubovaly se při teplotě 50 °C po dobu různou dobu. Tárovací reakce se ukončila ve specifický čas promytím dvakrát 200 μΐ RS (0,4 NaOH, 0,25 % Tween 20) a dvakrát 200 μΐ TNT (100 mM TrisHCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20) . Zkumavky se sušily při teplotě 50 °C po dobu 30 vteřin a uchovávaly se v plastovém sáčku při teplotě 4 °C.
Stabilita vázaných oligonukleotidů z podmínek tvorby kolonií pomocí PCR
Stabilita se testovala za podmínek růstu kolonií přidáním směsi PCR (20 μΐ čtyř dNTP (0,2 mM) , 0,1 % BSA, 0,1 % Tween 20, 8 % DMSO (dimetylsulfoxid, Fluka Švýcarsko), IX pufr PCR).Prohlubně se pak umístily do cyklovače teplot a proběhlo 33 cyklů za následujících podmínek: teplota 94 °C po dobu 45 vteřin, teplota 60 °C po dobu 4 minut, teplota 72 °C po dobu 4 minut. Po ukončení uvedeného programu se prohlubně promyly 5x koncentrovaným roztokem SSC, 0,1 % Tween 20 a nechaly se při teplotě 8 °C až do dalšího použití. Dříve než se naplnily hybridizační prohlubně 50 μΐ 5x koncentrovaného SSC, 0,1 %
Tween 20 se zahřál na uchovával se při teplotě teplotu místnosti. 94 °C po dobu 5 minut a
Sondy:
Oligonukleotidové sondy R57 (5' (fosfát)-
GTTTGGGTTGGTTTGGGTTGGTG, kontrolní sonda) a R58 (5'(fosfát)-
• · · · · · • · · · * · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··«
CCCTTTCCCTTTCCTTCTCCTTCT, které jsou komplementární s CP2, CP8, CP9, CP10 a CP11 se enzymaticky značily na jejich 5'konci pomocí [y-32P]dATP (Amersham, UK) za použití polynukleotidové kinázy bakteriofága T4 (New England Biolabs, Beverly, MA). Přebytek 32P dATP se odstranil pomocí kolony Chromá Spin TE-10 (Clontech, Palo Alto, CA) . Radioaktivně značené oligonukleotidy (0,5 μΜ v 5x koncentrovaném roztoku SSC, 0,1 % Tween 20) se pak hybridizovaly s oligonukleotidem deprivatizovaných v prohlubních Nucleolink při teplotě 37 °C po dobu dvou hodin. Prohlubně se promyly čtyřikrát 5x koncentrovaným roztokem SSC, 0,1 % Tween 20 po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Počítáním v scintilačním roztoku se pak testovala navázaná sonda.
Výsledky
Existuje znatelný rozdíl mezi rychlostí a specifikou párování oligonukleotidů závisejícího na podstatě funkční skupiny na 5'konci oligonukleotidu. Oligonukleotidy nesoucí na svém 5'konci aminoskupinu, která se páruje přibližně dvakrát rychleji jak se oligonukleotidy funkcionalizuj i fosfátovou skupinou na svém 5'konci (uvedeno v tabulce č. 2 a na obrázku č. 8). Vedle kontrolních oligonukleotidů funkcionalizovaných 5'hydroxylem, 5'-DMT nebo 5'-biotinem se všechny spojují rychlostí podobnou rychlosti 5'fosfátu, což je otázka specifické podstaty chemického zachycení za použití 5'fosfátové skupiny.
Tabulka č. 2:
5'-fosfát 5'-amine 5'-hydroxyl 5'-DMT 5'-biotin
Ka (min *) 0,0068 0,0135 0,0063 0,0070 0,0068
zachycený oligonukleotid (fmol/prchlubeň) 608 1344 542 602 650
stabilita PCR (% zbývej íci) 5 6 69 66 66 62
Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG
CHARAKTERISTIKA
SEKVENCE:
(A)
DÉLKA: 24 párů baží
TYP: nukleová kyselina
DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D)
TOPOLOGIE: lineární
DRUH
MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A)
POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer (xi)
Popis sekvence:
SEQ ID NO: 2:
CACCAACCCA AACCAACCCA AACC (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukíeotidový primer
SEQ ID NO: 3:
:
SEKVENCE:
(xi) Popis sekvence:
GAGGCCAGAA CA.GTTCAAGG (2) Informace o SEQ ID NO:
(i) CHARAKTERISTIKA (A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
CCTGTGACAA GACGACTGAA (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
CACCAACCCA AACCAACCCA AACC (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
TTTTTTTTTT CACCAACCCA aaccaaccca aacc (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 34 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
TTTTTTTTTT AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
li) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGTTTTTT TTTTTTTTTT NN (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGG (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA (2) Informace o SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
• · • · · ·
(A) DÉLKA: 44 párů bázi .
(B) TYP: nukleová kyseiina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer'
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGCCTGTG ACAAGACGAC TGAA (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 62 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTGAGGCCA GTGGAAGTCA
GA (2) Informace o SEQ ID NO: 14:
CHARAKTERISTIKA
SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 60 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
primer
CACCAACCCA AACCAACCCA AACCGAGCTC AGGCTGAGGC AGGAGAATTG
(2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGAGCTG AGGAGGAAGA GAGG
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 52 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
primer
AGAAGGAGAA GGAAAGGGAA AGGGGCGGCC GCTCGCCTGG TTCTGGAAGA CA (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „oligonukleotidový primer (ix) ZNAKY:
• ·
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 11
(D) Jiné informace:
/mod.báze = i
(ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 13 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i
(ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 15
(D) Jiné informace:
/mod.báze = i
(ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 17 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i
ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 19
(D) Jiné informace:
/mod.báze = i
ix) ZNAKY:
(A) Název/klíč: modifikovaná báze
(B) Pozice: 21 (D) Jiné informace:
/mod.báze = i (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
NSNSNSNSNS NS
(2) Informace o SEQ ID NO: 18:
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) POPIS: /popis: „oligonukleotidový
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
CGACAGCCGG AAGGAAGAGG GAGC
2) Informace o SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů baží
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A) primer
POPIS: /popis: „oligonukleotidový primer
Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Claims (3)

  1. NÁROKY
    1. Způsob amplifikace alespoň z n a č u j vytvoření obsahující se t j edné nukleové kyseliny ž e zahrnuje:
    alespoň jednoho templátu nukleové nukleovou kyselinu(y), která se amplifikuje, obsahuje na 5'konci 3'konci i m, kyseliny přičemž uvedená nukleová kyselina(y) oligonukleotidovou sekvenci na oligonukleotidovou kyselinu(y) nesoucí sekvenci na 5'konci navíc nukleovou prostředky pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevný podklad, smíchání uvedeného templátu(ů) nukleové kyseliny s jedním nebo více koloniových primerů s oligonukleotidovou sekvencí
    X, které mohou hybridizovat
    Z a nesou na svém 5' konci prostředky pro zachycení koloniových primerů na pevný podklad, přičemž v přítomnosti pevného podkladu se 5'konce templátu nukleové kyseliny a koloniových primerů vážou na pevný podklad, provedení amplifikačních reakcí jedné nebo více nukleových kyselin za použití navázaného templátu(ů) tak, že se vytvoří kolonie nukleové kyseliny.
    2.
    Způsob podle nároku
    1, vyznač t i ž komplementární oligonukleotidová sekvence s oligonukleotidovou sekvencí Y a jící Z je koloniový primer X je stejná sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.
    3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dva různé koloniové primery X se smíchaly s uvedeným templátem(y) v kroku (2) a kde sekvence koloniových primerů X jsou takové, že oligonukleotidová sekvence Z může hybridizovat s jedním z koloniových primerů X a • · · • · · · • * * • » « » · » • < · Φ « · * · · · V ř * · · • ► · · t i · * · · · · « ····»· · « ·» je stejná jako jeden jedné nukleové ž e zahrnuje:
    templátů nukleové kyseliny, kyseliny oligonukleotidová sekvence Y z koloniových primerů X.
    4. Způsob amplifikace alespoň vyznačující se tím,
    1) vytvoření alespoň jednoho zahrnující nukleovou kyselinu(y), která se bude amplifikovat, přičemž uvedená nukleová kyselina(y) nesou na svém 5'konci prostředky pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevném povrchu,
  2. 2) smíchání uvedených templátů nukleové kyseliny s jedním nebo více degenerativních koloniových primerů X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí v uvedeném templátů(ech) na místě lemujícím sekvenci nukleové kyseliny, která se amplifikuje a nese na 5'konci prostředky pro zachycení koloniových primerů na pevný podklad, přičemž v přítomnosti pevného podkladu se 5'konce templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů vážou na pevný podklad,
  3. 3) provedení amplifikačních reakcí jedné nebo více nukleových kyselin za použití vázaného templátů(ů) tak, že se vytvoří kolonie nukleových kyselin.
    5. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 4, v y z n a č u jící se tím, ž e zahrnuje další krok, který provádí alespoň v jednom kroku stanovení sekvence j edné nebo více vytvořených kolonií nukleové kyseliny. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící
    se tím, že krok stanovení sekvence zahrnuje začlenění a detekci značených oligonukleotidů.
    7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že celé nebo částečné sekvence templátů amplifikované nukleové kyseliny přítomných ve více než jedné kolonii nukleové kyseliny se stanoví současně.
    « · *
    až
    7, další krok
    V···4« • · • · · 9· • « ·, • ·· • · · ♦ ·
    Způsob podle libovolného z nároků vyznačuj ící se tím, ž e zahrnuje vizualizace vytvořených kolonií.
    9.
    Způsob podle nároku vyzná ící se tím, ž e uvedený krok vizualizace zahrnuje použití značené nebo neznačené sondy nukleové kyseliny.
    10.
    Způsob podle libovolného nároku 1 až
    9, vyzná zachycení č u j ící templátu(ů) pro zahrnuj e prostředky se tím, že prostředky koloniových primerů na pevný podklad sekvencí pro kovalentní zachycení nukleových kyselin na uvedený podklad.
    Způsob podle nároku 10, vyznač se tím, že uvedené prostředky pro kovalentní zachycení sekvencí nukleové kyseliny na upravitelná funkční skupina.
    pevný podklad je chemicky
    12 .
    Způsob podle nároku
    11, vyznač jící tím, ž e uvedená je fosfátová skupina, upravitelná funkční karboxylová nebo aldehydová chemicky skupina část, thiolová, hydroxylová, dimetoxytritylová (DMT) skupina nebo aminoskupina.
    13. Způsob podle nároku 12, vyznačuj ící se tím, že uvedená chemicky upravitelná funkční skupina je aminoskupina.
    14. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že uvedený pevný povrch se vybral ze skupiny zahrnující latexové, dextranové částice, polystyrénový, polypropylenový povrch, polyakrylamidový gel, zlaté, skleněné povrchy a křemíkové plátky.
    • · β * * · « · ♦ · · * * · 0 * ...
    * · · Λ · φ β fr· Γ· · · * « · « φ
    • WW WWW ·· ΦΦ φφ ·Φφ 15. Způsob podle nároku 14, vyzná č u j ící s e tím, ž e uvedený pevný podklad je sklo. 16. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 15, v y z n a č u ’ jící se tím, že hustota vytvořených
    kolonii nukleové kyseliny je 10 000 na milimetr čtvereční až
    100 000 na milimetr čtvereční.
    17. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 16, vyznačuj ící se tím, ž e hustota koloniových primerů X zachycených na uvedeném podkladu je alespoň 1 fmol/mm2. 18. Způsoby podle libovolného z nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím, ž e hustotě i templátů
    nukleové kyseliny je 10 000 na milimetr čtvereční až 100 000 na milimetr čtvereční.
    19. Velké množství templátů různých nukleových kyselin obsahující nukleové kyseliny, které se amplifikují, přičemž každá z uvedených nukleových obsahuje na svých 5'koncích známou oligonukleotidovou sekvenci Y a na 3' konci známou oligonukleotidovou sekvenci Z a navíc nukleová kyselina(y) nesou na 5'konci prostředek pro zachycení nukleové kyseliny(kyselin) na pevný podklad.
    20. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19, kde oligonukleotidová sekvence Z je komplementární s oligonukleotidovou sekvencí Y.
    21. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19, když se smíchá s velkým množstvím koloniových primerů X, které mohou hybridizovat s oligonukleotidovou sekvencí Z a nesou na svých 5'koncích prostředky na zachycení koloniových primerů na pevný podklad.
    ···· ·· ·· ·· • · · · · · · •·· · ···· · · • · · ·· ··· · ··· ·· ·· ·· ·
    22. Velké množství templátů nukleové kde kyseliny oligonukleotidová s oligonukleotidovou sekvencí Y sekvence
    Z je a koloniový podle nároku 21, komplementární je stejná primer sekvence jako oligonukleotidová sekvence Y.
    23. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 19 se smíchá se dvěma různými koloniovými primery X a kde sekvence koloniových primerů X jsou takové, že oligonukleotidová sekvence Y je stejná jako koloniové primery X.
    24. Velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároku 21, kde koloniové primery X obsahují degenerovanou příměrovou sekvenci a templáty nukleové kyseliny neobsahují oligonukleotidové sekvence Y nebo Z.
    25. Pevný podklad, vyznačující se tím, že se na něj zachytilo velké množství koloniových primerů X podle libovolného z nároků 1 až 24 a množství templátů nukleové kyseliny podle libovolného z nároků 19 až 24.
    26. Pevný podklad podle nároku 25, vyznačuj ící se tím, žejeto pevný podklad podle nároků 14 a 15.
    27. Pevný podklad podle libovolného z nároků 25 nebo 26, vyznačující se tím, že zachycení templátů nukleové kyseliny a koloniových primerů na pevný podklad je kovalentní.
    28. Pevný podklad, vyznačující se tím, že zahrnuje jednu nebo více kolonií nukleových kyselin vytvořených metodou podle libovolného z nároků 1 až 18.
    29. Použití pevného podkladu podle libovolného z nároků 25 až
    28 při způsobech amplifikace nebo sekvenování nukleové kyseliny.
    30. Použiti podle nároku 29, kde uvedený způsob je způsob podle libovolného z nároků 1 až 18.
    31. Použití způsobu podle libovolného z nároků 1 až 18 při amplifikaci nebo sekvenování nukleové kyseliny. 32. Použití způsobu podle libovolného z nároků 1 až 18 nebo kolonií nukleové kyseliny vytvořených uvedenými způsoby nebo
    velké množství templátů nukleové kyseliny podle nároků 19 až 24 nebo pevných podkladů podle nároků 25 až 28 při získávání molekul nukleových kyselin pro sekvenování a opětné sekvenování, monitorování exprese genu, profilování genetické diverzity, při diagnóze, testování, sekvenování celého genomu, zkoumání a hodnocení polymorfizmu celého genomu a při přípravě sklíček s celými genomy nebo při jiných aplikacích, které zahrnují amplifikaci nukleových kyselin nebo jejich sekvenování.
    33. Sada vyzná vhodná pro použití při amplifikaci nebo sekvenování, zahrnuje velké č u j ící se t i m, že množství templátů nukleových kyselin podle libovolného z nároků až 24 a koloniové primery podle libovolného z nároků
    1 až
    32 vázaných na pevný podklad.
    34.
    Sada podle nároku
    33, č u j ící se tím, že je vhodná pro použití y z n a při sekvenování, opětném sekvenování, monitorování exprese genu, profilování genetické diverzity, diagnóze, testování, sekvenování celého celého genomu nebo nukleových genomu, zkoumání a hodnocení polymorfizmu libovolné jiné aplikaci zahrnující amplifikaci kyselin nebo jejich sekvenování.
CZ20011183A 1998-09-30 1999-09-30 Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny CZ20011183A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98307985 1998-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011183A3 true CZ20011183A3 (cs) 2001-09-12

Family

ID=8235083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011183A CZ20011183A3 (cs) 1998-09-30 1999-09-30 Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny

Country Status (25)

Country Link
US (4) US7115400B1 (cs)
EP (2) EP1117827B8 (cs)
JP (1) JP2002525125A (cs)
KR (1) KR20010085860A (cs)
CN (1) CN1325458A (cs)
AR (1) AR021833A1 (cs)
AT (1) ATE311474T1 (cs)
AU (1) AU771073B2 (cs)
BG (1) BG105363A (cs)
BR (1) BR9914159A (cs)
CA (1) CA2344575A1 (cs)
CZ (1) CZ20011183A3 (cs)
DE (1) DE69928683T2 (cs)
EA (1) EA004271B1 (cs)
EE (1) EE200100195A (cs)
HK (1) HK1042525A1 (cs)
HU (1) HUP0105052A3 (cs)
IL (1) IL142178A0 (cs)
NO (1) NO20011303L (cs)
NZ (1) NZ510599A (cs)
PL (1) PL347125A1 (cs)
SK (1) SK4292001A3 (cs)
TR (1) TR200100911T2 (cs)
WO (1) WO2000018957A1 (cs)
ZA (1) ZA200102420B (cs)

Families Citing this family (761)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1591541B1 (en) 1997-04-01 2012-02-15 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US20100130368A1 (en) * 1998-07-30 2010-05-27 Shankar Balasubramanian Method and system for sequencing polynucleotides
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
DE10027040A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-06 Basf Lynx Bioscience Ag Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
CA2444649C (en) 2001-04-20 2012-10-02 The Penn State Research Foundation Methods for nucleic acid manipulation
US7195908B2 (en) * 2002-10-31 2007-03-27 Corning Incorporated Supports treated with triamine for immobilizing biomolecules
EP1587940A4 (en) * 2002-12-20 2006-06-07 Caliper Life Sciences Inc SINGLE MOLECULAR AMPLIFICATION AND DNA PROOF
WO2004070007A2 (en) 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Method for preparing single-stranded dna libraries
EP2789383B1 (en) 2004-01-07 2023-05-03 Illumina Cambridge Limited Molecular arrays
US20060030036A1 (en) 2004-05-28 2006-02-09 Victor Joseph Chips for multiplex analyses
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
WO2006064199A1 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
EP2233582A1 (en) 2005-02-01 2010-09-29 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
KR20070112785A (ko) 2005-02-01 2007-11-27 에이젠코트 바이오사이언스 코오포레이션 비드-기초 서열화를 위한 시약, 방법, 및 라이브러리
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
US8936926B2 (en) * 2005-12-22 2015-01-20 Pacific Biosciences Of California Active surface coupled polymerases
WO2007091077A1 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Solexa Limited Method for sequencing a polynucleotide template
US20080009420A1 (en) * 2006-03-17 2008-01-10 Schroth Gary P Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
WO2008002502A2 (en) 2006-06-23 2008-01-03 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of dna cluster arrays
EP2049682A2 (en) * 2006-07-31 2009-04-22 Illumina Cambridge Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
ES2376202T3 (es) * 2006-07-31 2012-03-09 Wanli Bi Amplificación de �?cidos nucleicos usando un oligonucleótido modificado reversiblemente.
JPWO2008018355A1 (ja) * 2006-08-08 2009-12-24 シャープ株式会社 バイオセンサ及びその製造方法並びに当該バイオセンサを用いた検出方法
EP2057465A4 (en) 2006-08-09 2010-04-21 Homestead Clinical Corp SPECIFIC ORGAN PROTEINS AND METHODS OF USE
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
EP2076609A1 (en) 2006-10-10 2009-07-08 Illumina Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
WO2008069906A2 (en) * 2006-11-14 2008-06-12 The Regents Of The University Of California Digital expression of gene analysis
CA2676570C (en) 2007-01-26 2016-05-03 Illumina, Inc. Nucleic acid sequencing system and method
US8315817B2 (en) 2007-01-26 2012-11-20 Illumina, Inc. Independently removable nucleic acid sequencing system and method
EP2121983A2 (en) 2007-02-02 2009-11-25 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008096146A1 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Solexa Limited Preparation of templates for methylation analysis
US9598724B2 (en) 2007-06-01 2017-03-21 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
WO2008157515A1 (en) * 2007-06-16 2008-12-24 Sacrab Genomics Nucleic acid packaging system
WO2008157640A2 (en) * 2007-06-18 2008-12-24 Illumina, Inc. Microfabrication methods for the optimal patterning of substrates
JP2009000070A (ja) * 2007-06-22 2009-01-08 Hitachi Ltd 大規模並列核酸分析方法
US8222040B2 (en) * 2007-08-28 2012-07-17 Lightspeed Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing by selective excitation of microparticles
US8759077B2 (en) 2007-08-28 2014-06-24 Lightspeed Genomics, Inc. Apparatus for selective excitation of microparticles
JP2010537643A (ja) 2007-08-29 2010-12-09 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー 代替的な核酸配列決定法
US20090093378A1 (en) * 2007-08-29 2009-04-09 Helen Bignell Method for sequencing a polynucleotide template
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US8716190B2 (en) 2007-09-14 2014-05-06 Affymetrix, Inc. Amplification and analysis of selected targets on solid supports
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
JP2009178159A (ja) * 2007-11-05 2009-08-13 Hitachi Plant Technologies Ltd 核酸配列の検出方法及び核酸配列検出基板
US8202691B2 (en) 2008-01-25 2012-06-19 Illumina, Inc. Uniform fragmentation of DNA using binding proteins
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
EP2294214A2 (en) * 2008-05-07 2011-03-16 Illumina, Inc. Compositions and methods for providing substances to and from an array
US8407012B2 (en) * 2008-07-03 2013-03-26 Cold Spring Harbor Laboratory Methods and systems of DNA sequencing
EP2302028B1 (en) 2008-07-09 2013-09-11 Panasonic Corporation Sequencer
WO2010021936A1 (en) * 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
EP2318552B1 (en) 2008-09-05 2016-11-23 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
US20100087325A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
AU2009319907B2 (en) * 2008-11-03 2015-10-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9394567B2 (en) 2008-11-07 2016-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Detection and quantification of sample contamination in immune repertoire analysis
EP4335932A2 (en) 2008-11-07 2024-03-13 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
EP2373817A4 (en) * 2008-12-10 2013-01-02 Illumina Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR HYBRIDIZING NUCLEIC ACIDS
WO2010075188A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Illumina Inc. Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols
PT2387627E (pt) 2009-01-15 2016-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp Determinação do perfil de imunidade adaptativa e métodos de geração de anticorpos monoclonais
US20100216648A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Febit Holding Gmbh Synthesis of sequence-verified nucleic acids
JP5600880B2 (ja) * 2009-03-03 2014-10-08 東洋紡株式会社 改良された増幅試薬
JP5239978B2 (ja) * 2009-03-23 2013-07-17 パナソニック株式会社 センサおよびシーケンサー
US20100285970A1 (en) * 2009-03-31 2010-11-11 Rose Floyd D Methods of sequencing nucleic acids
CN102625850B (zh) * 2009-04-03 2014-11-26 蒂莫西·Z·刘 多重核酸检测方法和系统
CA2760439A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Good Start Genetics, Inc. Methods and compositions for evaluating genetic markers
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
EP2248914A1 (en) 2009-05-05 2010-11-10 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications
US9309557B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9334531B2 (en) 2010-12-17 2016-05-10 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
US9309566B2 (en) 2010-12-17 2016-04-12 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
EP3409792B1 (en) 2009-06-25 2023-09-20 Fred Hutchinson Cancer Center Method of measuring adaptive immunity
US10036063B2 (en) 2009-07-24 2018-07-31 Illumina, Inc. Method for sequencing a polynucleotide template
WO2011014811A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Ibis Biosciences, Inc. Capture primers and capture sequence linked solid supports for molecular diagnostic tests
CN102625838B (zh) 2009-08-14 2016-01-20 阿霹震中科技公司 用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒
HUE030765T2 (en) 2009-08-25 2017-05-29 Illumina Inc A method for selecting and amplifying polynucleotides
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
WO2011037990A1 (en) * 2009-09-22 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Entangled mate sequencing
EP2488656B1 (en) 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
WO2011053845A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Illumina, Inc. Microvessels, microparticles, and methods of manufacturing and using the same
US20120202704A1 (en) 2009-12-07 2012-08-09 Illumina, Inc. Multi-sample indexing for multiplex genotyping
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
EP3382037B1 (en) 2010-01-19 2021-02-17 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
AU2011207561B2 (en) 2010-01-19 2014-02-20 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP2526207A4 (en) * 2010-01-22 2013-10-09 Univ California COMPOSITIONS AND METHODS FOR CHEMICAL SCREENING AT SIGNATURE BASE
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
WO2011106368A2 (en) 2010-02-23 2011-09-01 Illumina, Inc. Amplification methods to minimise sequence specific bias
WO2011112465A1 (en) 2010-03-06 2011-09-15 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses for detecting optical signals from a sample
US8502867B2 (en) 2010-03-19 2013-08-06 Lightspeed Genomics, Inc. Synthetic aperture optics imaging method using minimum selective excitation patterns
US9465228B2 (en) 2010-03-19 2016-10-11 Optical Biosystems, Inc. Illumination apparatus optimized for synthetic aperture optics imaging using minimum selective excitation patterns
KR101866401B1 (ko) 2010-04-05 2018-06-11 프로그노시스 바이오사이언스, 인코포레이티드 공간적으로 엔코딩된 생물학적 검정
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
WO2011140489A2 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Ibis Biosciences, Inc. Integrated sample preparation systems and stabilized enzyme mixtures
SG10201503534RA (en) 2010-05-06 2015-06-29 Sequenta Inc Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
AU2011255641A1 (en) 2010-05-18 2012-12-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2576827A2 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Esoterix Genetic Laboratories, LLC Enumeration of nucleic acids
WO2011159942A1 (en) 2010-06-18 2011-12-22 Illumina, Inc. Conformational probes and methods for sequencing nucleic acids
CA2802111A1 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
EP2426214A1 (en) 2010-09-01 2012-03-07 Koninklijke Philips Electronics N.V. Method for amplifying nucleic acids
EP2635553A4 (en) 2010-09-16 2015-11-18 Ibis Biosciences Inc STABILIZATION OF OZONE LABILERS OF FLUORESCENT DYES BY THIN BOIL
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
WO2012050920A1 (en) 2010-09-29 2012-04-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US10093981B2 (en) 2010-10-19 2018-10-09 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
US10233501B2 (en) 2010-10-19 2019-03-19 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
EA022475B1 (ru) * 2010-10-19 2016-01-29 Ооо "Центр Инновационных Технологий-Нано" Способ секвенирования днк
US20150218639A1 (en) 2014-01-17 2015-08-06 Northwestern University Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
US20150225792A1 (en) 2014-01-17 2015-08-13 Northwestern University Compositions and methods for identifying depressive disorders
EP2633069B1 (en) 2010-10-26 2015-07-01 Illumina, Inc. Sequencing methods
EP3928867A1 (en) 2010-10-27 2021-12-29 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
EP2652148B1 (en) 2010-12-17 2016-11-30 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
US20120152743A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 General Electric Company Method for electroeluting genetic material from dried samples
JP5616773B2 (ja) 2010-12-21 2014-10-29 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US9109222B2 (en) 2010-12-27 2015-08-18 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sample preparation methods and compositions
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
US9217132B2 (en) 2011-01-20 2015-12-22 Ibis Biosciences, Inc. Microfluidic transducer
CN103443338B (zh) 2011-02-02 2017-09-22 华盛顿大学商业化中心 大规模平行邻接作图
US20130344540A1 (en) * 2011-02-03 2013-12-26 Mark T. Reed Methods for minimizing sequence specific bias
CN108220297A (zh) 2011-03-09 2018-06-29 细胞信号科技公司 用于生成单克隆抗体的方法和试剂
DK3567124T3 (da) 2011-04-12 2022-03-07 Verinata Health Inc Opløsning af genomfraktioner ved anvendelse af polymorfisme-optællinger
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
EP3907299A1 (en) 2011-04-15 2021-11-10 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
WO2012170936A2 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
KR102003660B1 (ko) 2011-07-13 2019-07-24 더 멀티플 마이얼로머 리서치 파운데이션, 인크. 데이터 수집 및 분배 방법
WO2013022778A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid sequencing by electrochemical detection
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
ES2752653T3 (es) 2011-09-23 2020-04-06 Illumina Inc Métodos y composiciones para la secuenciación de ácidos nucleicos
AU2012316218B2 (en) 2011-09-26 2016-03-17 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
EP2768983A4 (en) 2011-10-17 2015-06-03 Good Start Genetics Inc METHODS OF IDENTIFYING MUTATIONS ASSOCIATED WITH DISEASES
CA2852949A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
US9279159B2 (en) 2011-10-21 2016-03-08 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
WO2013063308A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 University Of Massachusetts An enzymatic method to enrich for capped rna, kits for performing same, and compositions derived therefrom
AU2012328662B2 (en) 2011-10-28 2015-12-17 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
CN103890161A (zh) 2011-10-31 2014-06-25 株式会社日立高新技术 核酸扩增方法、核酸基板、核酸分析方法及核酸分析装置
AU2012347460B2 (en) 2011-12-09 2017-05-25 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
US20130189679A1 (en) 2011-12-20 2013-07-25 The Regents Of The University Of Michigan Pseudogenes and uses thereof
EP3269820A1 (en) 2011-12-22 2018-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Kit for the amplification of a sequence from a ribonucleic acid
WO2013096819A2 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule positioning by electrical potential
US9334491B2 (en) 2011-12-22 2016-05-10 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids from cellular samples
US9803188B2 (en) 2011-12-22 2017-10-31 Ibis Biosciences, Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
EP3211100A1 (en) 2011-12-22 2017-08-30 Ibis Biosciences, Inc. Amplification primers and methods
US9823246B2 (en) 2011-12-28 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescence enhancing plasmonic nanoscopic gold films and assays based thereon
US9506113B2 (en) 2011-12-28 2016-11-29 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid ligation systems and methods
WO2013102081A2 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Ibis Biosciences, Inc. Macromolecule delivery to nanowells
EP2872523B1 (en) 2011-12-30 2018-01-17 Abbott Molecular Inc. Microorganism nucleic acid purification from host samples
WO2013104990A1 (en) 2012-01-09 2013-07-18 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for analysis of colorectal cancer
EP3434789A1 (en) 2012-01-13 2019-01-30 Data2Bio Genotyping by next-generation sequencing
GB2513793B (en) 2012-01-26 2016-11-02 Nugen Tech Inc Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
EP2814959B1 (en) 2012-02-17 2018-01-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for accurately identifying mutations
US9506117B2 (en) 2012-02-21 2016-11-29 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
JP6302847B2 (ja) 2012-03-05 2018-03-28 アダプティヴ バイオテクノロジーズ コーポレーション 頻度が一致したサブユニットからの、対をなす免疫受容体鎖の決定
NO2694769T3 (cs) 2012-03-06 2018-03-03
EP2823059A2 (en) 2012-03-06 2015-01-14 Oslo Universitetssykehus HF Gene signatures associated with efficacy of postmastectomy radiotherapy in breast cancer
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
WO2013152114A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 The Regents Of The University Of Michigan Biomarker associated with irritable bowel syndrome and crohn's disease
WO2013151622A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
EP2844772B1 (en) 2012-05-02 2018-07-11 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
EP2844767A4 (en) 2012-05-02 2015-11-18 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING
ES2683978T3 (es) 2012-05-02 2018-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Secuenciación de ADN
EP3783111A1 (en) 2012-05-02 2021-02-24 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
CN107586832B (zh) 2012-05-08 2021-03-30 适应生物技术公司 用于测量和校准多重pcr反应中的扩增偏倚的组合物和方法
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP2861787B1 (en) 2012-06-18 2017-09-20 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
WO2014005076A2 (en) 2012-06-29 2014-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods and biomarkers for detection of kidney disorders
WO2014008448A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
EP2875173B1 (en) 2012-07-17 2017-06-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
CN111748607B (zh) 2012-08-14 2024-04-30 10X基因组学有限公司 微胶囊组合物及方法
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9422602B2 (en) 2012-08-15 2016-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for determining nucleic acid degradation
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
CA2881823C (en) 2012-08-20 2019-06-11 Illumina, Inc. Method and system for fluorescence lifetime based sequencing
SI2897978T1 (sl) 2012-09-19 2017-05-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Postopki za identifikacijo protiteles z zmanjšano imunogenostjo
CA2886647A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Adaptive Biotechnologies Corporation Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization
JP6510978B2 (ja) 2012-10-16 2019-05-08 アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド 核酸を配列決定する方法および装置
US9365896B2 (en) 2012-10-19 2016-06-14 Agilent Technologies, Inc. Addition of an adaptor by invasive cleavage
EP2912197B1 (en) 2012-10-24 2019-08-07 Takara Bio USA, Inc. Template switch-based methods for producing a product nucleic acid
WO2014070462A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 The Johns Hopkins University Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancers
WO2014081511A1 (en) 2012-11-21 2014-05-30 Courtagen Life Sciences Inc. Method for preventing carry-over contamination in nucleic acid amplification reactions
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
CN105190656B (zh) 2013-01-17 2018-01-16 佩索纳里斯公司 用于遗传分析的方法和系统
CN108753766A (zh) 2013-02-08 2018-11-06 10X基因组学有限公司 多核苷酸条形码生成
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
AU2013380645B2 (en) 2013-03-08 2018-03-15 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
EP2964624B1 (en) 2013-03-08 2017-01-04 Illumina Cambridge Limited Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
DK2969479T3 (da) 2013-03-13 2021-08-02 Illumina Inc Væskeanordninger i flere lag og fremgangsmåder til deres fremstilling
AU2013382098B2 (en) 2013-03-13 2019-02-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2014160233A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for isolating nucleic acids
ES2732012T3 (es) 2013-03-14 2019-11-20 Abbott Molecular Inc Minimización de errores utilizando uracil-ADN-N-glicosilasa
US9701999B2 (en) 2013-03-14 2017-07-11 Abbott Molecular, Inc. Multiplex methylation-specific amplification systems and methods
US20140287946A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. Nucleic acid control panels
EP2971159B1 (en) 2013-03-14 2019-05-08 Molecular Loop Biosolutions, LLC Methods for analyzing nucleic acids
US9890425B2 (en) 2013-03-15 2018-02-13 Abbott Molecular Inc. Systems and methods for detection of genomic copy number changes
US9255265B2 (en) 2013-03-15 2016-02-09 Illumina, Inc. Methods for producing stranded cDNA libraries
EP2971140B1 (en) 2013-03-15 2019-01-16 Ibis Biosciences, Inc. Methods to assess contamination in dna sequencing
WO2014142981A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Enzyme-linked nucleotides
EP2970366B1 (en) 2013-03-15 2019-01-16 Ibis Biosciences, Inc. Nucleotide analogs for sequencing
US9822408B2 (en) 2013-03-15 2017-11-21 Nugen Technologies, Inc. Sequential sequencing
WO2014171898A2 (en) 2013-04-17 2014-10-23 Agency For Science, Technology And Research Method for generating extended sequence reads
EP2986762B1 (en) 2013-04-19 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
WO2014197377A2 (en) 2013-06-03 2014-12-11 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
US9868979B2 (en) 2013-06-25 2018-01-16 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
AU2014284584B2 (en) 2013-07-01 2019-08-01 Illumina, Inc. Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
ES2628485T3 (es) 2013-07-03 2017-08-03 Illumina, Inc. Secuenciación mediante síntesis ortogonal
EP3024947B1 (en) 2013-07-25 2020-10-28 DCH Molecular Diagnostics, Inc. Methods and compositions for detecting bacterial contamination
EP3030682B1 (en) 2013-08-05 2020-06-03 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized gene libraries
CA3091557C (en) 2013-08-08 2022-10-18 Illumina, Inc. Fluidic system for reagent delivery to a flow cell
CA2921620C (en) 2013-08-19 2021-01-19 Abbott Molecular Inc. Next-generation sequencing libraries
CA2920390A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Illumina, Inc. Manipulation of droplets on hydrophilic or variegated-hydrophilic surfaces
GB2534067B (en) 2013-08-30 2021-07-21 Personalis Inc Methods and systems for genomic analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
WO2015051275A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Personalis, Inc. Methods for analyzing genotypes
US10294511B2 (en) 2013-10-17 2019-05-21 Illumina, Inc. Methods and compositions for preparing nucleic acid libraries
JP6602294B2 (ja) * 2013-10-17 2019-11-06 タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド アダプタを核酸に追加する方法、及びこの方法を実行するための組成物
US11041203B2 (en) 2013-10-18 2021-06-22 Molecular Loop Biosolutions, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
US10415083B2 (en) 2013-10-28 2019-09-17 The Translational Genomics Research Institute Long insert-based whole genome sequencing
CN105849264B (zh) 2013-11-13 2019-09-27 纽亘技术公司 用于鉴别重复测序读数的组合物和方法
CA2931533C (en) 2013-12-09 2023-08-08 Illumina, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
CA3133543C (en) 2013-12-10 2023-05-02 Illumina, Inc. Biosensors for biological or chemical analysis and methods of manufacturing the same
WO2015089438A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Northwestern University Biomarkers for post-traumatic stress states
WO2015095355A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detection of an antibody against a pathogen
US9719136B2 (en) 2013-12-17 2017-08-01 Takara Bio Usa, Inc. Methods for adding adapters to nucleic acids and compositions for practicing the same
EP3084523B1 (en) 2013-12-19 2019-07-03 Illumina, Inc. Substrates comprising nano-patterning surfaces and methods of preparing thereof
ES2890078T3 (es) 2013-12-20 2022-01-17 Illumina Inc Conservación de la información de conectividad genómica en muestras de ADN genómico fragmentado
US10537889B2 (en) 2013-12-31 2020-01-21 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
WO2015107430A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection and prognosis of cervical cancer
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
KR102001554B1 (ko) 2014-01-16 2019-07-18 일루미나, 인코포레이티드 고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱
EP3108009B1 (en) 2014-02-18 2021-03-24 Illumina, Inc. Methods and compositions for dna profiling
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
EP3114240B1 (en) 2014-03-05 2019-07-24 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
KR102596508B1 (ko) 2014-04-10 2023-10-30 10엑스 제노믹스, 인크. 시약을 캡슐화 및 구획화하기 위한 유체 디바이스, 시스템, 및 방법, 및 이의 응용
ES2777529T3 (es) 2014-04-17 2020-08-05 Adaptive Biotechnologies Corp Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células
CN106460070B (zh) 2014-04-21 2021-10-08 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
US11053548B2 (en) 2014-05-12 2021-07-06 Good Start Genetics, Inc. Methods for detecting aneuploidy
WO2015175832A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Illumina, Inc. Nucleic acid synthesis techniques
CA2949984C (en) 2014-05-27 2021-10-19 Illumina, Inc. Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge
BR112016027939B8 (pt) 2014-06-05 2022-04-26 Illumina Inc Sistemas e métodos incluindo uma válvula rotativa para pelo menos um entre preparação de amostra ou análise de amostra
GB201410022D0 (en) * 2014-06-05 2014-07-16 Orion Diagnostica Oy Method
WO2015188178A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing and diagnosing periodontal disease
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
GB201410420D0 (en) 2014-06-11 2014-07-23 Illumina Cambridge Ltd Methods for estimating cluster numbers
EP3155125A1 (en) 2014-06-13 2017-04-19 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
GB201410646D0 (en) 2014-06-14 2014-07-30 Illumina Cambridge Ltd Methods of increasing sequencing accuracy
KR102425438B1 (ko) 2014-06-23 2022-07-27 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 서열결정에 의해 평가된 DSB의 게놈 전체에 걸친 비편향된 확인 (GUIDE-Seq)
EP3161157B1 (en) 2014-06-24 2024-03-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital pcr barcoding
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
CN106795553B (zh) 2014-06-26 2021-06-04 10X基因组学有限公司 分析来自单个细胞或细胞群体的核酸的方法
AU2015279546B2 (en) 2014-06-26 2021-04-08 10X Genomics, Inc. Processes and systems for nucleic acid sequence assembly
US9777340B2 (en) 2014-06-27 2017-10-03 Abbott Laboratories Compositions and methods for detecting human Pegivirus 2 (HPgV-2)
AU2015284464B2 (en) 2014-06-30 2021-06-17 Illumina, Inc. Methods and compositions using one-sided transposition
EP3835430B1 (en) 2014-07-24 2023-08-16 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for the detection and analysis of mycobacterium tuberculosis
CA2956925C (en) 2014-08-01 2024-02-13 Dovetail Genomics, Llc Tagging nucleic acids for sequence assembly
JP6803327B2 (ja) 2014-08-06 2020-12-23 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値
JP2017529199A (ja) 2014-08-12 2017-10-05 ネクストジェン ジェイン， インコーポレイテッド 採取された体液に基づく健康をモニタリングためのシステムおよび方法
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
EP3183577B1 (en) 2014-08-21 2020-08-19 Illumina Cambridge Limited Reversible surface functionalization
US11408024B2 (en) 2014-09-10 2022-08-09 Molecular Loop Biosciences, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
CA2961743A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Ibis Biosciences, Inc. Sequencing by synthesis using pulse read optics
CA2960840A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data
EP3224595A4 (en) 2014-09-24 2018-06-13 Good Start Genetics, Inc. Process control for increased robustness of genetic assays
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
MX2017004354A (es) 2014-10-09 2017-12-12 Illumina Inc Metodo y dispositivo para la separacion de liquidos inmiscibles para aislar de modo efectivo al menos uno de los liquidos.
CA2964799A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
JP2017532042A (ja) 2014-10-29 2017-11-02 １０エックス ゲノミクス，インコーポレイテッド 標的化核酸配列決定のための方法及び組成物
EP3212790B1 (en) 2014-10-29 2020-03-25 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US10125399B2 (en) 2014-10-30 2018-11-13 Personalis, Inc. Methods for using mosaicism in nucleic acids sampled distal to their origin
CN107108822B (zh) 2014-10-31 2020-02-07 伊鲁米纳剑桥有限公司 聚合物以及dna共聚物涂层
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US20160146799A1 (en) 2014-11-05 2016-05-26 Nirmidas Biotech, Inc. Metal composites for enhanced imaging
EP3218513B1 (en) 2014-11-11 2018-10-31 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using crispr-cas systems
US10030268B2 (en) 2014-11-11 2018-07-24 Abbott Molecular Inc. Hybridization probes and methods
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US11789906B2 (en) 2014-11-19 2023-10-17 Arc Bio, Llc Systems and methods for genomic manipulations and analysis
US10233490B2 (en) 2014-11-21 2019-03-19 Metabiotech Corporation Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
EP3498866A1 (en) 2014-11-25 2019-06-19 Adaptive Biotechnologies Corp. Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
EP3227461A1 (en) 2014-12-05 2017-10-11 Amyris, Inc. High-throughput sequencing of polynucleotides
EP4095261A1 (en) 2015-01-06 2022-11-30 Molecular Loop Biosciences, Inc. Screening for structural variants
KR102321863B1 (ko) 2015-01-12 2021-11-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
EP4092681A1 (en) 2015-01-13 2022-11-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016126987A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
MX2017010142A (es) 2015-02-09 2017-12-11 10X Genomics Inc Sistemas y metodos para determinar variacion estructural y ajuste de fases con datos de recuperacion de variantes.
AU2016220404B2 (en) 2015-02-17 2021-05-27 Mgi Tech Co., Ltd. DNA sequencing using controlled strand displacement
US10208339B2 (en) 2015-02-19 2019-02-19 Takara Bio Usa, Inc. Systems and methods for whole genome amplification
EP3259602B9 (en) 2015-02-20 2021-05-19 Takara Bio USA, Inc. Method for rapid accurate dispensing, visualization and analysis of single cells
US11047008B2 (en) 2015-02-24 2021-06-29 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
BR112017018054A2 (pt) 2015-02-24 2018-07-24 10X Genomics Inc métodos para a cobertura de sequências de ácidos nucleicos direcionadas
US10697000B2 (en) 2015-02-24 2020-06-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
EP3274692B1 (en) 2015-03-24 2022-08-10 Illumina, Inc. Methods for imaging samples for biological or chemical analysis
ES2846730T3 (es) 2015-03-31 2021-07-29 Illumina Cambridge Ltd Concatemerización en superficie de moldes
WO2016161273A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target
ES2955916T3 (es) 2015-04-10 2023-12-11 Spatial Transcriptomics Ab Análisis múltiplex de especímenes biológicos de ácidos nucleicos espacialmente distinguidos
AU2016250281A1 (en) 2015-04-15 2017-10-26 The General Hospital Corporation LNA-based mutant enrichment next-generation sequencing assays
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
WO2016170179A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on solid support
ES2961374T3 (es) * 2015-04-24 2024-03-11 Atila Biosystems Incorporated Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada
US11085073B2 (en) 2015-04-24 2021-08-10 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support
US10844428B2 (en) 2015-04-28 2020-11-24 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS)
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
FI3760737T3 (fi) 2015-05-11 2023-07-17 Illumina Inc Alusta lääkinnällisten aineiden löytämiseen ja analysoimiseen
US10395759B2 (en) * 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
EP3298168A4 (en) * 2015-05-18 2019-02-20 10X Genomics, Inc. STABILIZED REDUCING AGENTS AND METHODS OF USE
GB201508858D0 (en) 2015-05-22 2015-07-01 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels
AU2016271049B9 (en) 2015-05-29 2019-07-18 Illumina, Inc. Sample carrier and assay system for conducting designated reactions
EP3303614B1 (en) 2015-05-29 2020-03-11 Illumina Cambridge Limited Enhanced utilization of surface primers in clusters
US11274333B2 (en) 2015-05-29 2022-03-15 Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) LLC Compositions and methods for preparing sequencing libraries
CN107924121B (zh) 2015-07-07 2021-06-08 亿明达股份有限公司 经由纳米压印的选择性表面图案化
ES2902125T3 (es) 2015-07-14 2022-03-25 Abbott Molecular Inc Purificación de ácidos nucleicos utilizando óxidos de cobre-titanio u óxidos de magnesio-titanio
WO2017011565A1 (en) 2015-07-14 2017-01-19 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for identifying drug resistant tuberculosis
ES2945607T3 (es) 2015-07-17 2023-07-04 Illumina Inc Láminas de polímero para aplicaciones de secuenciación
CA2992616C (en) 2015-07-23 2023-01-03 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating a/t-rich segments
EP3329007B1 (en) 2015-07-30 2021-02-24 Illumina, Inc. Orthogonal deblocking of nucleotides
US11929149B2 (en) 2015-08-06 2024-03-12 Arc Bio, Llc Systems and methods for genomic analysis
WO2017027653A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
US10976334B2 (en) 2015-08-24 2021-04-13 Illumina, Inc. In-line pressure accumulator and flow-control system for biological or chemical assays
WO2017037078A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Illumina Cambridge Limited Systems and methods of improving droplet operations in fluidic systems
JP2018530320A (ja) 2015-09-09 2018-10-18 キアゲン ゲーエムベーハー ポリメラーゼ酵素
JP2018530536A (ja) 2015-09-11 2018-10-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション ヌクレアーゼＤＳＢの完全照合およびシーケンシング（ＦＩＮＤ−ｓｅｑ）
CN108368482A (zh) 2015-09-18 2018-08-03 特韦斯特生物科学公司 寡核酸变体文库及其合成
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
GB201516987D0 (en) 2015-09-25 2015-11-11 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
JP2018529353A (ja) 2015-09-30 2018-10-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 配列決定法による切断事象の包括的生体外報告（ＣＩＲＣＬＥ−ｓｅｑ）
WO2017087724A1 (en) 2015-11-17 2017-05-26 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US9895673B2 (en) 2015-12-01 2018-02-20 Twist Bioscience Corporation Functionalized surfaces and preparation thereof
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
KR102006320B1 (ko) 2015-12-07 2019-08-02 지머젠 인코포레이티드 Htp 게놈 공학 플랫폼에 의한 미생물 균주 개량
WO2017100376A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen, Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
EP3400298B1 (en) 2016-01-08 2024-03-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiple beads per droplet resolution
CN108474745A (zh) 2016-01-11 2018-08-31 伊鲁米那股份有限公司 具有显微荧光计、流体系统和流动池闩锁夹持模块的检测装置
EP3414324B1 (en) 2016-02-08 2021-01-20 Rgene, Inc. Multiple ligase compositions, systems, and methods
WO2017138984A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
US20190062827A1 (en) 2016-03-14 2019-02-28 RGENE, Inc. HYPER-THERMOSTABLE LYSINE-MUTANT ssDNA/RNA LIGASES
US10597717B2 (en) 2016-03-22 2020-03-24 Myriad Women's Health, Inc. Combinatorial DNA screening
ES2861350T3 (es) 2016-03-28 2021-10-06 Illumina Inc Micromatrices de planos múltiples
EP3442706A4 (en) 2016-04-13 2020-02-19 NextGen Jane, Inc. SAMPLE COLLECTION AND PRESERVATION DEVICES, SYSTEMS AND METHODS
EP3656873A3 (en) 2016-05-11 2020-07-29 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment and amplification using argonaute systems
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
CN109313396B (zh) 2016-05-18 2022-11-22 Illumina公司 使用图案化疏水性表面进行的自组装图案化
WO2017201302A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 The University Of Chicago Btk mutation and ibrutinib resistance
US11299783B2 (en) 2016-05-27 2022-04-12 Personalis, Inc. Methods and systems for genetic analysis
FI3464628T3 (fi) 2016-06-06 2024-05-03 Redvault Biosciences Lp Kohdereportterikonstruktit ja niiden käyttö
WO2017214557A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Counsyl, Inc. Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof
CN109642252A (zh) 2016-06-17 2019-04-16 加州理工学院 核酸反应及相关方法和组合物
JP2019519241A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド グルコース透過酵素ライブラリーを生成するための方法およびその使用
KR102345899B1 (ko) 2016-06-30 2021-12-31 지머젠 인코포레이티드 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
WO2018013509A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for diagnosing and treating arrhythmias
CN106086203A (zh) * 2016-07-12 2016-11-09 深圳绿倍生态科技有限公司 一种小球藻核酸模板的制备方法及其应用
EP3485032B1 (en) 2016-07-12 2021-02-17 Life Technologies Corporation Compositions and methods for detecting nucleic acid regions
CA3020629A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 Takara Bio Usa, Inc. Multi-z imaging and dispensing with multi-well devices
US11535883B2 (en) 2016-07-22 2022-12-27 Illumina, Inc. Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
CA3034739A1 (en) 2016-08-22 2018-03-01 Biolumic Limited System, device and methods of seed treatment
EP3500672A4 (en) 2016-08-22 2020-05-20 Twist Bioscience Corporation NOVO SYNTHESIZED NUCLEIC ACID BANKS
US11543417B2 (en) 2016-08-29 2023-01-03 Oslo Universitetssykehus Hf ChIP-seq assays
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
US11530352B2 (en) 2016-10-03 2022-12-20 Illumina, Inc. Fluorescent detection of amines and hydrazines and assaying methods thereof
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
MY194951A (en) 2016-10-14 2022-12-28 Illumina Inc Cartridge assembly
CN110168648A (zh) 2016-11-16 2019-08-23 伊路米纳有限公司 序列变异识别的验证方法和系统
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
GB2573069A (en) 2016-12-16 2019-10-23 Twist Bioscience Corp Variant libraries of the immunological synapse and synthesis thereof
WO2018118971A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet tagging contiguity preserved tagmented dna
JP2020504074A (ja) 2016-12-22 2020-02-06 イルミナ ケンブリッジ リミテッド クマリン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN110418847A (zh) 2017-01-04 2019-11-05 考利达基因组股份有限公司 通过非标记的可逆终止子或天然核苷酸的分步测序
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP3571616B1 (en) 2017-01-18 2021-05-19 Illumina, Inc. Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
EP3354746B1 (en) 2017-01-30 2019-05-29 Gregor Mendel Institute of Molecular Plant Biology GmbH Novel spike-in oligonucleotides for normalization of sequence data
US10968447B2 (en) 2017-01-31 2021-04-06 Myriad Women's Health, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
WO2018144217A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Counsyl, Inc. Methods and compositions for enrichment of target polynucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
US20200002689A1 (en) 2017-02-13 2020-01-02 Qiagen Sciences, Llc Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148727A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148723A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi
WO2018148724A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
WO2018148726A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from phage t4
WO2018152162A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Omniome, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
WO2018156792A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
EP3595674A4 (en) 2017-03-15 2020-12-16 Twist Bioscience Corporation BANKS OF VARIANTS OF IMMUNOLOGICAL SYNAPSE AND THEIR SYNTHESIS
EP3601593B1 (en) 2017-03-24 2021-12-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal hairpin primers
US11584958B2 (en) 2017-03-31 2023-02-21 Grail, Llc Library preparation and use thereof for sequencing based error correction and/or variant identification
WO2018187013A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
CN111094584A (zh) * 2017-04-23 2020-05-01 伊鲁米那股份有限公司 用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法
US10934584B2 (en) 2017-04-23 2021-03-02 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
SG11201909916YA (en) 2017-04-23 2019-11-28 Illumina Cambridge Ltd Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2018259202B2 (en) 2017-04-23 2022-03-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
US11028435B2 (en) 2017-05-01 2021-06-08 Illumina, Inc. Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing
EP3622089A1 (en) 2017-05-08 2020-03-18 Illumina, Inc. Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples
EP3625715A4 (en) 2017-05-19 2021-03-17 10X Genomics, Inc. DATA SET ANALYSIS SYSTEMS AND METHODS
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
EP3625351A1 (en) 2017-05-19 2020-03-25 Zymergen Inc. Genomic engineering of biosynthetic pathways leading to increased nadph
SG11201901822QA (en) 2017-05-26 2019-03-28 10X Genomics Inc Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
ES2875579T3 (es) 2017-06-06 2021-11-10 Zymergen Inc Plataforma de ingeniería genómica de HTP para mejorar Escherichia coli
JP7227162B2 (ja) 2017-06-06 2023-02-21 ザイマージェン インコーポレイテッド 真菌株を改良するためのｈｔｐゲノム操作プラットフォーム
US20200115705A1 (en) 2017-06-06 2020-04-16 Zymergen Inc. A high-throughput (htp) genomic engineering platform for improving saccharopolyspora spinosa
WO2018226810A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. High throughput transposon mutagenesis
SG11201911730XA (en) 2017-06-07 2020-01-30 Univ Oregon Health & Science Single cell whole genome libraries for methylation sequencing
CN110997711A (zh) 2017-06-08 2020-04-10 布里格姆妇女医院 用于鉴定表位的方法和组合物
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
KR102628876B1 (ko) 2017-06-12 2024-01-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법
US11186862B2 (en) 2017-06-20 2021-11-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. MDA using bead oligonucleotide
CA3068034A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 Universitat Fur Bodenkultur Wien Novel biomarkers for detecting senescent cells
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
AU2018302034B2 (en) 2017-07-18 2021-05-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method of chemically modifying plastic surfaces
EP3662482A1 (en) 2017-07-31 2020-06-10 Illumina Inc. Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation
CA3067048C (en) 2017-08-01 2024-03-05 Illumina, Inc. Hydrogel beads for nucleotide sequencing
EP4209597A1 (en) * 2017-08-01 2023-07-12 MGI Tech Co., Ltd. Nucleic acid sequencing method
WO2019028047A1 (en) 2017-08-01 2019-02-07 Illumina, Inc SPATIAL INDEXING OF GENETIC MATERIAL AND PREPARATION OF PHARMACOTOQUE USING HYDROGEL BALLS AND FLOW CELLS
EP3665297A4 (en) 2017-08-11 2021-05-12 Atila Biosystems Incorporated DIGITAL AMPLIFICATION WITH LIMITED NUCLEOTIDIC COMPOSITION PRIMERS
JP2021500531A (ja) 2017-08-15 2021-01-07 オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． 化学的および生物学的検体の検出に有用なスキャン装置および方法
WO2019038594A2 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Biolumic Limited TRANSGENIC PLANTS WITH HIGH GROWTH AND HIGH RUSTICITY
SG11202002194UA (en) 2017-09-11 2020-04-29 Twist Bioscience Corp Gpcr binding proteins and synthesis thereof
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
WO2019060640A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Guardant Health, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR DIFFERENTIATING SOMATIC VARIANTS AND GERMINAL LINE VARIANTS
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
EP3691662A4 (en) 2017-10-06 2021-05-12 The University of Chicago T-LYMPHOCYTES SCREENING FOR CANCER-SPECIFIC ANTIGENS
WO2020081122A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Illumina, Inc. Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks
WO2019079202A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Illumina, Inc. ABERRANT CONNECTION DETECTION USING CONVOLUTION NEURAL NETWORKS (CNN)
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
AU2018352203B2 (en) 2017-10-16 2021-09-30 Illumina, Inc. Semi-supervised learning for training an ensemble of deep convolutional neural networks
WO2019079593A1 (en) 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
JP7066840B2 (ja) 2017-10-20 2022-05-13 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション ポリヌクレオチド合成のための加熱されたナノウェル
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
WO2019084165A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS
EP4180534A1 (en) 2017-11-02 2023-05-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Transposase-based genomic analysis
CA3036161C (en) 2017-11-13 2023-03-28 The Multiple Myeloma Research Foundation, Inc. Integrated, molecular, omics, immunotherapy, metabolic, epigenetic, and clinical database
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
US10815484B2 (en) 2017-11-22 2020-10-27 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating cancer
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019136058A1 (en) 2018-01-02 2019-07-11 The Regents Of The University Of Michigan Multi-droplet capture
CN112041438A (zh) 2018-01-04 2020-12-04 特韦斯特生物科学公司 基于dna的数字信息存储
NZ759656A (en) 2018-01-08 2022-07-01 Illumina Inc Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection
US11561196B2 (en) 2018-01-08 2023-01-24 Illumina, Inc. Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection
NZ759659A (en) 2018-01-15 2022-07-01 Illumina Inc Deep learning-based variant classifier
WO2019152539A1 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Optical Biosystems, Inc. Method for detecting particles using structured illumination
CN111699253A (zh) 2018-01-31 2020-09-22 生物辐射实验室股份有限公司 用于解卷积分区条码的方法和组合物
CA3090102A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Dovetail Genomics, Llc Sample prep for dna linkage recovery
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
KR102437660B1 (ko) 2018-02-13 2022-08-29 일루미나, 인코포레이티드 하이드로겔 비드를 사용한 dna 서열분석
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
CA3091228A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Zymergen Inc. A htp platform for the genetic engineering of chinese hamster ovary cells
CN111051524A (zh) 2018-03-22 2020-04-21 伊鲁米纳公司 从rna和dna制备核酸文库
EP3775278A1 (en) 2018-04-02 2021-02-17 Illumina Inc. Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing
CA3095292A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
EP3553182A1 (en) 2018-04-11 2019-10-16 Université de Bourgogne Detection method of somatic genetic anomalies, combination of capture probes and kit of detection
WO2019200338A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant classifier based on deep neural networks
US11512002B2 (en) 2018-04-18 2022-11-29 University Of Virginia Patent Foundation Silica materials and methods of making thereof
WO2019203986A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
KR20240052875A (ko) 2018-04-20 2024-04-23 일루미나, 인코포레이티드 단일 세포를 캡슐화하는 방법, 캡슐화된 세포 및 이의 용도
WO2019209426A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 Omniome, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
WO2019213619A1 (en) 2018-05-04 2019-11-07 Abbott Laboratories Hbv diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
CA3067434A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Illumina, Inc. Compositions and methods for chemical cleavage and deprotection of surface-bound oligonucleotides
SG11202011467RA (en) 2018-05-18 2020-12-30 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
US11339428B2 (en) 2018-05-31 2022-05-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
US10801064B2 (en) 2018-05-31 2020-10-13 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
US11814750B2 (en) 2018-05-31 2023-11-14 Personalis, Inc. Compositions, methods and systems for processing or analyzing multi-species nucleic acid samples
WO2019236478A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free nucleic acids
KR102393414B1 (ko) 2018-06-04 2022-05-02 일루미나, 인코포레이티드 고속 대량 단일 세포 전사체 라이브러리 그리고 이의 제조 및 사용 방법
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
CN110684829A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 深圳华大智造科技有限公司 一种高通量的单细胞转录组测序方法和试剂盒
US20200251183A1 (en) 2018-07-11 2020-08-06 Illumina, Inc. Deep Learning-Based Framework for Identifying Sequence Patterns that Cause Sequence-Specific Errors (SSEs)
JP7466519B2 (ja) 2018-07-23 2024-04-12 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 腫瘍遺伝子変異量を腫瘍割合およびカバレッジによって調整するための方法およびシステム
US11421262B2 (en) 2018-07-24 2022-08-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Serial formation of ternary complex species
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
EP3837381A1 (en) 2018-08-15 2021-06-23 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving library enrichment
EP3841202B1 (en) 2018-08-20 2023-10-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleotide sequence generation by barcode bead-colocalization in partitions
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
EP3844307A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic dna in a biological sample
JP2021536232A (ja) 2018-08-30 2021-12-27 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 試料間の汚染を検出するための方法およびシステム
SG11202101400UA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Guardant Health Inc Microsatellite instability detection in cell-free dna
JP2021534803A (ja) 2018-09-04 2021-12-16 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム
KR102339206B1 (ko) 2018-09-20 2021-12-14 타미르나 게엠베하 간기능 장애의 예측을 위한 micro-rna 시그니처
CA3113270A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
CN113272449B (zh) 2018-10-26 2024-03-12 Illumina公司 调整聚合物小珠以进行dna处理
JP2022512848A (ja) 2018-10-31 2022-02-07 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド エピジェネティック区画アッセイを較正するための方法、組成物およびシステム
US10876148B2 (en) 2018-11-14 2020-12-29 Element Biosciences, Inc. De novo surface preparation and uses thereof
US10768173B1 (en) * 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
US20240011086A1 (en) 2018-11-15 2024-01-11 Omniome, Inc. Electronic detection of nucleic acid structure
JP2022513561A (ja) 2018-11-30 2022-02-09 イルミナ インコーポレイテッド 単一アッセイを使用した複数の分析物の分析
GB2585608B (en) 2018-12-04 2021-11-03 Omniome Inc Mixed-phase fluids for nucleic acid sequencing and other analytical assays
CA3103736A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
KR20210103931A (ko) 2018-12-14 2021-08-24 일루미나 케임브리지 리미티드 서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소
AU2019411267A1 (en) 2018-12-17 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Primer oligonucleotide for sequencing
KR102594019B1 (ko) 2018-12-17 2023-10-26 일루미나 케임브리지 리미티드 폴리뉴클레오타이드 서열분석에 사용하기 위한 조성물
CN112739830A (zh) 2018-12-18 2021-04-30 伊卢米纳剑桥有限公司 使用单一表面引物进行配对末端测序的方法和组合物
EP3899037B1 (en) 2018-12-19 2023-10-18 Illumina, Inc. Methods for improving polynucleotide cluster clonality priority
EP3899032A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
WO2020132628A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Guardant Health, Inc. Methods, compositions, and systems for improving recovery of nucleic acid molecules
US11293061B2 (en) 2018-12-26 2022-04-05 Illumina Cambridge Limited Sequencing methods using nucleotides with 3′ AOM blocking group
US20220081714A1 (en) 2019-01-04 2022-03-17 Northwestern University Storing temporal data into dna
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
EP3908678A1 (en) 2019-01-10 2021-11-17 Iovance Biotherapeutics, Inc. System and methods for monitoring adoptive cell therapy clonality and persistence
CN113661249A (zh) 2019-01-31 2021-11-16 夸登特健康公司 用于分离无细胞dna的组合物和方法
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020168013A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
WO2020167574A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Omniome, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
EP3927467A4 (en) 2019-02-20 2022-12-14 Pacific Biosciences of California, Inc. SCANNING APPARATUS AND METHODS FOR DETECTING CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYTES
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
KR20210143766A (ko) 2019-02-26 2021-11-29 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 Glp1 수용체에 대한 변이체 핵산 라이브러리
AU2020227802A1 (en) 2019-02-26 2021-10-14 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
WO2020176659A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Guardant Health, Inc. Methods and systems for determining the cellular origin of cell-free dna
WO2020180778A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. High-throughput single-nuclei and single-cell libraries and methods of making and of using
WO2020178162A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina Cambridge Limited Exocyclic amine-substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
NL2023327B1 (en) 2019-03-01 2020-09-17 Illumina Inc Multiplexed fluorescent detection of analytes
WO2020178231A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. Multiplexed fluorescent detection of analytes
EP3931190A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Illumina Cambridge Limited Tertiary amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
EP3938537A1 (en) 2019-03-11 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
WO2020205296A1 (en) 2019-03-21 2020-10-08 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11676685B2 (en) 2019-03-21 2023-06-13 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based quality scoring
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11421271B2 (en) 2019-03-28 2022-08-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11738336B2 (en) 2019-04-12 2023-08-29 Western Digital Technologies, Inc. Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing
US11579217B2 (en) 2019-04-12 2023-02-14 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors
US11112468B2 (en) 2019-04-12 2021-09-07 Western Digital Technologies, Inc. Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11327073B2 (en) 2019-04-12 2022-05-10 Western Digital Technologies, Inc. Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11609208B2 (en) 2019-04-12 2023-03-21 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles
US11423306B2 (en) 2019-05-16 2022-08-23 Illumina, Inc. Systems and devices for characterization and performance analysis of pixel-based sequencing
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2020243722A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Guardant Health, Inc. Methods and systems for improving patient monitoring after surgery
US11644406B2 (en) 2019-06-11 2023-05-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Calibrated focus sensing
CN114729342A (zh) 2019-06-21 2022-07-08 特韦斯特生物科学公司 基于条形码的核酸序列装配
EP3997223A1 (en) 2019-07-12 2022-05-18 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for preparing nucleic acid sequencing libraries using crispr/cas9 immobilized on a solid support
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
CN114728996B (zh) 2019-09-10 2022-11-29 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 核苷酸的可逆修饰
US11208682B2 (en) 2019-09-13 2021-12-28 Western Digital Technologies, Inc. Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags
BR112021026562A2 (pt) 2019-09-20 2022-11-29 Illumina Inc Métodos e composições para identificar ligantes em arranjos com o uso de índices e códigos de barras
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US11111507B2 (en) 2019-09-23 2021-09-07 Zymergen Inc. Method for counterselection in microorganisms
US11788137B2 (en) 2019-09-30 2023-10-17 Diagenode S.A. Diagnostic and/or sequencing method and kit
CN114599795A (zh) 2019-10-18 2022-06-07 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对核酸加帽的方法和组合物
ES2938896T3 (es) 2019-10-21 2023-04-17 Univ Freiburg Albert Ludwigs Un ensayo in vitro verdaderamente imparcial para perfilar la actividad fuera de objetivo de una o más nucleasas programables específicas de objetivo en células (ABNOBA-SEQ)
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
US11747329B2 (en) 2019-11-22 2023-09-05 Western Digital Technologies, Inc. Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection
CA3157560A1 (en) 2019-11-26 2021-06-03 Dustin Howard HITE Methods, compositions and systems for improving the binding of methylated polynucleotides
CN114829369A (zh) 2019-11-27 2022-07-29 伊鲁米纳剑桥有限公司 含环辛四烯的染料和组合物
CN114008199A (zh) 2019-12-19 2022-02-01 伊路敏纳公司 高通量单细胞文库及其制备和使用方法
US20210189483A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 Mgi Tech Co. Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
US11498078B2 (en) 2019-12-23 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell receiver and methods of use
US11747262B2 (en) 2019-12-23 2023-09-05 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell carrier and methods of use
SG11202106899SA (en) 2019-12-23 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for spatial analysis using rna-templated ligation
IL294459A (en) 2019-12-31 2022-09-01 Singular Genomics Systems Inc Polynucleotide barcodes for long read sequencing
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
WO2021152586A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of analyzing microbiome, immunoglobulin profile and physiological state
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
WO2021158511A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Omniome, Inc. Flow cells and methods for their manufacture and use
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
WO2021163637A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Zymergen Inc. Metagenomic library and natural product discovery platform
WO2021162028A1 (ja) * 2020-02-14 2021-08-19 東レ株式会社 バイオチップの製造方法
CN115136244A (zh) 2020-02-20 2022-09-30 因美纳有限公司 基于人工智能的多对多碱基判读
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
ES2965266T3 (es) 2020-03-09 2024-04-11 Illumina Inc Métodos para la secuenciación de polinucleótidos
CA3145466A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Illumina, Inc. Improvements in nucleic acid sequencing
US20230129228A1 (en) 2020-03-18 2023-04-27 Mgi Tech Co. Ltd. Restoring phase in massively parallel sequencing
WO2021214766A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of diagnosing viral infections and vaccines thereto
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
EP4143338A1 (en) 2020-04-30 2023-03-08 Guardant Health, Inc. Methods for sequence determination using partitioned nucleic acids
US20230183798A1 (en) 2020-05-05 2023-06-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for modifying polymerase-nucleic acid complexes
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
WO2021224677A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
US20210355518A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Illumina, Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
EP4150113A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Guardant Health, Inc. Homologous recombination repair deficiency detection
EP4153775A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
AU2021283174A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
EP4158054A1 (en) 2020-06-02 2023-04-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
JP2023531009A (ja) 2020-06-22 2023-07-20 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ３’アセタールブロッキング基を有するヌクレオシド及びヌクレオチド
CN116034166A (zh) 2020-06-25 2023-04-28 10X基因组学有限公司 Dna甲基化的空间分析
CA3177299A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Illumina Inc. Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna
MX2022014718A (es) 2020-07-02 2023-03-06 Illumina Inc Un metodo para calibrar la eficiencia de siembra de genotecas de ácidos nucleicos en celdas de flujo.
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
CN116018412A (zh) 2020-07-08 2023-04-25 Illumina公司 作为转座体载体的小珠
WO2023282916A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Guardant Health, Inc. Methods of detecting genomic rearrangements using cell free nucleic acids
EP4153606A2 (en) 2020-07-13 2023-03-29 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
WO2022026761A1 (en) 2020-07-30 2022-02-03 Guardant Health, Inc. Methods for isolating cell-free dna
AU2021320307A1 (en) 2020-08-06 2023-02-16 Illumina Cambridge Limited Preparation of RNA and DNA sequencing libraries using bead-linked transposomes
EP4193363A1 (en) 2020-08-07 2023-06-14 Oxford Nanopore Technologies plc Methods of identifying nucleic acid barcodes
IL299783A (en) 2020-08-18 2023-03-01 Illumina Inc Sequence-Specific Targeted Transposition, Selection and Sorting of Nucleic Acids
EP4205126A1 (en) 2020-08-25 2023-07-05 Guardant Health, Inc. Methods and systems for predicting an origin of a variant
MX2023001400A (es) 2020-09-11 2023-04-25 Illumina Cambridge Ltd Metodos para enriquecer una secuencia diana a partir de una genoteca de secuenciación usando adaptadores de horquilla.
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
JP2023544720A (ja) 2020-09-30 2023-10-25 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド Ｄｎａメチル化分配アッセイのシグナル対ノイズ比を改善するための方法およびシステム
WO2022087150A2 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Illumina, Inc. Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20220195518A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2022140629A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Guardant Health, Inc. Methods and systems for analyzing methylated polynucleotides
KR20230154303A (ko) 2021-01-29 2023-11-07 일루미나, 인코포레이티드 폴리뉴클레오티드로 플로우 셀의 시딩 효율을 개선하기위한 방법, 조성물 및 키트
JP2024506304A (ja) 2021-02-04 2024-02-13 イルミナ インコーポレイテッド トランスポソーム結合ビーズ上でのロングインデックス付き連結リード生成
US11486001B2 (en) 2021-02-08 2022-11-01 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
WO2022174054A1 (en) 2021-02-13 2022-08-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
JP2024513668A (ja) 2021-03-05 2024-03-27 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 分子応答を分析するための方法および関連する態様
JP2024512372A (ja) 2021-03-09 2024-03-19 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド オフターゲットポリヌクレオチド配列決定データに基づく腫瘍の存在の検出
WO2022197752A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina, Inc. Tile location and/or cycle based weight set selection for base calling
EP4301870A1 (en) 2021-03-18 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
CN117222747A (zh) 2021-03-22 2023-12-12 伊鲁米纳剑桥有限公司 用于改善核酸簇克隆性的方法
CA3214282A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Illumina, Inc. Compositions and methods for assessing dna damage in a library and normalizing amplicon size bias
KR20230161979A (ko) 2021-03-29 2023-11-28 일루미나, 인코포레이티드 개선된 라이브러리 제조 방법
BR112023019959A2 (pt) 2021-03-30 2024-01-30 Illumina Inc Métodos aprimorados de preparação isotérmica de biblioteca e dna complementar
AU2022249289A1 (en) 2021-03-31 2023-08-17 Illumina Cambridge Limited Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
US20220336054A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Illumina, Inc. Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures
KR20240009435A (ko) 2021-05-20 2024-01-22 일루미나, 인코포레이티드 합성에 의한 시퀀싱을 위한 조성물 및 방법
CN117677435A (zh) 2021-06-15 2024-03-08 伊鲁米纳公司 用于测序的不含水凝胶的表面官能化
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11236388B1 (en) 2021-06-17 2022-02-01 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
WO2022272260A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Illumina, Inc. Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
EP4364155A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Illumina, Inc. Self-learned base caller, trained using oligo sequences
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
WO2023287617A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
KR20240031968A (ko) 2021-07-19 2024-03-08 일루미나, 인코포레이티드 염기 호출에 대한 보간 및 적응을 갖는 강도 추출
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
CA3226451A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Sam Reed Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
US20230116852A1 (en) 2021-07-23 2023-04-13 Illumina, Inc. Methods for preparing substrate surface for dna sequencing
CA3223746A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Rohan PAUL Quality score calibration of basecalling systems
KR20240035413A (ko) 2021-08-03 2024-03-15 일루미나, 인코포레이티드 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023035003A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Elegen Corp. Multi-way bead-sorting devices, systems, and methods of use thereof using pressure sources
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2023056328A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Illumina, Inc. Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples
AU2022371198A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 Illumina, Inc. Methods for capturing library dna for sequencing
WO2023086847A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023086635A1 (en) 2021-11-15 2023-05-19 Vir Biotechnology, Inc. Virological and molecular surrogates of response to sars-cov-2 neutralizing antibody sotrovimab
CN117813390A (zh) 2021-12-16 2024-04-02 因美纳有限公司 用于表面结合的多核苷酸的金属定向裂解的方法
AU2022409487A1 (en) 2021-12-16 2024-01-18 Illumina, Inc. Hybrid clustering
AU2022413263A1 (en) 2021-12-17 2024-01-18 Illumina, Inc. Orthogonal hybridization
CN117813399A (zh) 2021-12-20 2024-04-02 因美纳有限公司 用于化学裂解表面结合的多核苷酸的高碘酸盐组合物和方法
WO2023122491A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Periodate compositions and methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
US20230212667A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Cambridge Limited Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
WO2023135485A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof
AU2023208743A1 (en) 2022-01-20 2024-01-04 Illumina, Inc. Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
WO2023152568A2 (en) 2022-02-10 2023-08-17 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing lung cancer
EP4341425A2 (en) 2022-03-15 2024-03-27 Illumina, Inc. Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on concatenated polynucleotides for methylation detection
WO2023175041A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Illumina, Inc. Concurrent sequencing of forward and reverse complement strands on concatenated polynucleotides
AU2023246676A1 (en) 2022-03-28 2024-01-18 Illumina Inc. Labeled avidin and methods for sequencing
WO2023186819A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Chromenoquinoline dyes and uses in sequencing
AU2023246691A1 (en) 2022-03-30 2024-01-18 Illumina, Inc. Methods for chemical cleavage of surface-bound polynucleotides
WO2023187061A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Paired-end re-synthesis using blocked p5 primers
US20230357845A1 (en) 2022-03-31 2023-11-09 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
US20230332197A1 (en) 2022-03-31 2023-10-19 Illumina Singapore Pte. Ltd. Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group
CA3223722A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Illumina, Inc. Altered cytidine deaminases and methods of use
US20230348967A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
US20230360725A1 (en) 2022-05-09 2023-11-09 Guardant Health, Inc. Detecting degradation based on strand bias
WO2023232829A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Illumina, Inc Compositions and methods for nucleic acid sequencing
WO2023240093A1 (en) 2022-06-06 2023-12-14 Element Biosciences, Inc. Methods for assembling and reading nucleic acid sequences from mixed populations
WO2024003087A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024039516A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Illumina, Inc. Third dna base pair site-specific dna detection
WO2024057280A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Illumina Cambridge Limited Nanoparticle with polynucleotide binding site and method of making thereof
WO2024061799A1 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Illumina, Inc. Deformable polymers comprising immobilised primers
US20240102067A1 (en) 2022-09-26 2024-03-28 Illumina, Inc. Resynthesis Kits and Methods
US20240124929A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Mesophilic compositions for nucleic acid amplification
US20240140939A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing
US20240110221A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of modulating clustering kinetics
US20240110234A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Amplification Compositions and Methods
US20240124914A1 (en) 2022-09-30 2024-04-18 Illumina, Inc. Thermophilic compositions for nucleic acid amplification
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
GB202215624D0 (en) 2022-10-21 2022-12-07 Dnae Diagnostics Ltd Clonal amplification

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4957858A (en) 1986-04-16 1990-09-18 The Salk Instute For Biological Studies Replicative RNA reporter systems
EP0224126A3 (en) 1985-11-25 1989-02-01 The University of Calgary Covalently linked complementary oligodeoxynucleotides as universal nucleic acid sequencing primer linkers
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
WO1989001050A1 (en) 1987-07-31 1989-02-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US6107023A (en) * 1988-06-17 2000-08-22 Genelabs Technologies, Inc. DNA amplification and subtraction techniques
GB8818020D0 (en) 1988-07-28 1988-09-01 Ici Plc Method for amplification of nucleotide sequences
CA2004326A1 (en) 1988-12-23 1990-06-23 Nanibushan Dattagupta Assay of sequences using amplified genes
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
US5800992A (en) * 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
CA2036946C (en) * 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
US5326692B1 (en) * 1992-05-13 1996-04-30 Molecular Probes Inc Fluorescent microparticles with controllable enhanced stokes shift
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
WO1993003151A1 (en) 1991-08-10 1993-02-18 Medical Research Council Treatment of cell populations
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
EP0543484B1 (en) 1991-08-30 2001-01-31 Research Development Corporation of Japan A method of DNA amplification
AU3728093A (en) * 1992-02-19 1993-09-13 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
EP0656068B1 (en) * 1992-07-24 1999-12-15 University Of South Australia Amplification and detection process
RU2048522C1 (ru) * 1992-10-14 1995-11-20 Институт белка РАН Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления
US5436142A (en) * 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
US5514539A (en) * 1993-06-29 1996-05-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 gene of 51 isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
JPH07203998A (ja) 1994-01-26 1995-08-08 Hamamatsu Photonics Kk 核酸塩基配列決定方法
JPH10500862A (ja) 1994-05-28 1998-01-27 テプネル・メディカル・リミテッド 核酸のコピーの産生
US6060288A (en) * 1994-08-03 2000-05-09 Mosaic Technologies Method for performing amplification of nucleic acid on supports
US5641658A (en) * 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
CA2218188A1 (en) 1995-04-11 1996-10-17 Trustees Of Boston University Solid phase sequencing of biopolymers
US5753439A (en) * 1995-05-19 1998-05-19 Trustees Of Boston University Nucleic acid detection methods
EP0862656B1 (en) 1995-11-21 2001-03-07 Yale University Unimolecular segment amplification and detection
US5939291A (en) * 1996-06-14 1999-08-17 Sarnoff Corporation Microfluidic method for nucleic acid amplification
US6218142B1 (en) * 1997-03-05 2001-04-17 Michael Wassenegger Nucleic acid molecules encoding polypeptides having the enzymatic activity of an RNA-directed RNA polymerase (RDRP)
EP1591541B1 (en) 1997-04-01 2012-02-15 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
JP2001517948A (ja) 1997-04-01 2001-10-09 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸配列決定法
US6235471B1 (en) 1997-04-04 2001-05-22 Caliper Technologies Corp. Closed-loop biochemical analyzers
WO1998045474A1 (en) 1997-04-04 1998-10-15 Innogenetics N.V. Isothermal polymerase chain reaction by cycling the concentration of divalent metal ions
ATE358177T1 (de) 1997-07-07 2007-04-15 Medical Res Council Ein in vitro sortierverfahren
US6326489B1 (en) * 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
US6124120A (en) * 1997-10-08 2000-09-26 Yale University Multiple displacement amplification
US6511803B1 (en) * 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6248558B1 (en) * 1998-03-31 2001-06-19 Vanderbilt University Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity
US6316229B1 (en) * 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
AR021833A1 (es) * 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
AU2410500A (en) 1999-01-11 2000-08-01 President And Fellows Of Harvard College Isothermal amplification of dna
US6300070B1 (en) * 1999-06-04 2001-10-09 Mosaic Technologies, Inc. Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids
JP6049051B2 (ja) 2011-07-29 2016-12-21 日東電工株式会社 両面真空成膜方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1325458A (zh) 2001-12-05
HUP0105052A2 (hu) 2002-04-29
JP2002525125A (ja) 2002-08-13
EP1117827B1 (en) 2005-11-30
NO20011303L (no) 2001-05-22
DE69928683T2 (de) 2006-08-24
BR9914159A (pt) 2001-06-26
EP1117827A1 (en) 2001-07-25
US9297006B2 (en) 2016-03-29
NO20011303D0 (no) 2001-03-14
AR021833A1 (es) 2002-08-07
EE200100195A (et) 2002-06-17
EP1634963B1 (en) 2013-06-19
AU6108899A (en) 2000-04-17
US7115400B1 (en) 2006-10-03
EP1634963A1 (en) 2006-03-15
CA2344575A1 (en) 2000-04-06
US10370652B2 (en) 2019-08-06
HUP0105052A3 (en) 2003-12-29
BG105363A (bg) 2001-12-31
TR200100911T2 (tr) 2001-07-23
NZ510599A (en) 2003-06-30
EA200100402A1 (ru) 2001-10-22
US8652810B2 (en) 2014-02-18
EP1117827B8 (en) 2010-06-02
HK1042525A1 (zh) 2002-08-16
ZA200102420B (en) 2001-09-26
US20080160580A1 (en) 2008-07-03
PL347125A1 (en) 2002-03-25
WO2000018957A1 (en) 2000-04-06
IL142178A0 (en) 2002-03-10
AU771073B2 (en) 2004-03-11
KR20010085860A (ko) 2001-09-07
US20160319274A1 (en) 2016-11-03
SK4292001A3 (en) 2001-12-03
DE69928683D1 (de) 2006-01-05
EA004271B1 (ru) 2004-02-26
ATE311474T1 (de) 2005-12-15
US20140228254A1 (en) 2014-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20011183A3 (cs) Způsob amplifikace a sekvenování nukleové kyseliny
JP5916166B2 (ja) 組織試料中の核酸の局在化された検出、又は空間的検出のための方法及び生成物
US9758825B2 (en) Centroid markers for image analysis of high density clusters in complex polynucleotide sequencing
JP2018510662A (ja) 生物学的試料の空間識別されるマルチプレックスな核酸分析
CZ20031582A3 (cs) Izotermická amplifikace nukleových kyselin na pevném povrchu
CA2803693A1 (en) Methods for nucleic acid capture and sequencing
JP2017512071A (ja) ゲノム適用および治療適用のための、核酸分子のクローン複製および増幅のためのシステムおよび方法
KR20180014054A (ko) 뉴클레오타이드의 직교 비블록화
JP2019514371A (ja) 細胞成分をマトリックスに結合させるための方法
US20060263790A1 (en) Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
US20100285970A1 (en) Methods of sequencing nucleic acids
MXPA01003266A (en) Methods of nucleic acid amplification and sequencing
WO2006003638A2 (en) Novel method for labeling nucleic acid in a sequence-specific manner, and method for detecting nucleic acid using the same