KR20210103931A - 서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소 - Google Patents

서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소 Download PDF

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Abstract

폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법은 이전에 첨가된 표지된 뉴클레오타이드의 동일성이 검출되고 있을 때 동일한 서열을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 클러스터와 함께 비표지된 뉴클레오타이드를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 검출 단계는 이전에 첨가된 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되지 않은 복제 가닥에 혼입될 비표지된 뉴클레오타이드의 첨가 시간을 제공한다. 따라서, 검출 단계의 말기에, 모든 또는 대부분의 복제 가닥은 동상에 있을 것이고, 후속 혼입 단계에서 적절한 표지된 뉴클레오타이드를 혼입할 준비가 될 것이다.

Description

서열분석 동안 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 페이싱 감소
본 발명은 다른 무엇보다도 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 관한 것이다.
주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 서열분석은 사이클 당 하나의 검출가능한 뉴클레오타이드가 복제 가닥에 혼입되는 반응의 다중 사이클을 통해 일어날 수 있다. 검출가능한 뉴클레오타이드는 전형적으로 사이클 당 하나 초과의 검출가능한 뉴클레오타이드의 혼입을 방지하도록 차단된다. 인큐베이션 시간 후, 전형적으로 임의의 혼입되지 않은 검출가능한 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 세정 단계가 수행된다. 복제 가닥에 혼입된 검출가능한 뉴클레오타이드의 동일성이 결정되는 검출 단계가 수행될 수 있다. 다음으로, 비차단 단계 및 절단 또는 마스킹 단계가 수행되며, 상기 차단제는 복제 가닥 내의 마지막 혼입된 뉴클레오타이드로부터 제거되고, 검출가능한 모이어티는 복제 가닥 내에 혼입된 마지막 뉴클레오타이드로부터 절단되거나 또는 그 상에서 마스킹된다. 일부 경우에, 검출가능한 모이어티는 차단제로서 작용하고, 검출가능한 모이어티를 제거하면 차단제를 제거할 수 있다. 그 후, 혼입 단계에서 검출가능한 뉴클레오타이드를 도입함으로써 사이클을 반복한다.
많은 경우에, 동일한 서열을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 클러스터가 동시에 서열분석된다. 클러스터는 복제 가닥에 혼입된 검출가능한 뉴클레오타이드에 의해 생성된 신호를 증폭시키는 역할을 한다. 클러스터가 동일한 서열의 다중 주형 가닥을 포함하기 때문에, 뉴클레오타이드 첨가의 각 라운드에서 상응하는 복제 가닥에 혼입된 뉴클레오타이드는 동일해야 하고, 검출가능한 뉴클레오타이드로부터의 신호는 클러스터 내의 주형 가닥의 복제 수에 비례하여 강화되어야 한다.
폴리뉴클레오타이드의 서열분석의 최근 목적은 높은 충실도를 유지하면서 서열분석을 완료하는 시간을 감소시키는 것이다. 감소된 서열분석 시간을 달성하기 위한 한 방법은 혼입 단계의 기간을 단축시킴으로써 사이클 시간을 감소시키는 것이다. 다수의 보다 효율적인 중합효소 및 변형된 뉴클레오타이드가 복제 가닥 내로의 뉴클레오타이드의 보다 효율적인 혼입을 제공하도록 개발되었다. 그러나, 혼입 단계는 서열분석되는 모든 주형 가닥에 걸쳐 뉴클레오타이드의 불완전한 혼입을 여전히 겪는 경향이 있다.
혼입 단계 동안, 뉴클레오타이드가 동일한 서열을 갖는 다중 주형 가닥을 함유하는 클러스터 내의 복제 가닥에 혼입되지 않는 경우, 뉴클레오타이드가 혼입되지 않은 복제 가닥은 혼입 단계 동안에 뉴클레오타이드가 혼입된 복제 가닥과 페이싱(phasing)이 다르다고 한다. 이상(out of phase)인 복제 가닥의 수가 추가의 사이클에 따라 증가함에 따라, 클러스터로부터의 신호는, 동상(in-phase) 복제 가닥에 혼입된 뉴클레오타이드를 결정하기에는 너무 불균질해질 수 있다.
본 개시내용은 다른 무엇보다도, 페이싱을 감소시키면서 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위한 짧은 사이클 시간을 허용하는 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법을 기재한다. 상기 방법은 이전에 첨가된 표지된 뉴클레오타이드의 동일성이 검출되고 있을 때 동일한 서열을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 클러스터와 함께 비표지된 뉴클레오타이드를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 검출 단계는 이전에 첨가된 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되지 않은 복제 가닥에 혼입될 비표지된 뉴클레오타이드의 첨가 시간을 제공한다. 따라서, 검출 단계의 말기에, 모든 또는 대부분의 복제 가닥은 동일 상에 있을 것이고, 후속 혼입 단계에서 적절한 표지된 뉴클레오타이드를 혼입할 준비가 될 것이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥이 플로우셀의 표면에 결합되는 부위를 포함하는 플로우셀에 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 도입하는 것을 포함한다. 사슬 연장 효소는, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드 중 적절한 것을 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입하도록 구성된다. 상기 방법은 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하는 단계, 및 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드가 플로우셀로부터 세정되는 동안 또는 세정된 후에 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물을 플로우셀에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물의 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드는, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 혼입에 이용가능하며, 단, 복제 가닥에서 이전에 혼입된 뉴클레오타이드는, 존재한다면, 차단되지 않는다. 상기 방법은 또한, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물이 플로우셀과 함께 인큐베이션되는 동안, 존재한다면, 복제 가닥에 혼입된 하나의 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하는 것을 포함한다.
그 후, 표지 및 블록은 복제 가닥에 혼입된, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드로부터 제거될 수 있고, 블록은, 존재하는 경우, 복제 가닥 내에 혼입된, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드로부터 제거될 수 있다. 그 후, 공정은 사전결정된 수의 사이클 동안 또는 서열분석이 완료될 때까지 반복될 수 있다.
하나 이상의 구현예들의 세부사항들은 첨부 도면들 및 아래의 설명에서 제시된다. 다른 특징들, 목적들, 및 이점들은 설명 및 도면들로부터, 그리고 청구항들로부터 명백해질 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명 모두는 본 개시내용의 요지의 구현예들을 제시하고, 청구된 바와 같은 본 개시내용의 요지의 본질 및 특성을 이해하기 위한 개요 또는 프레임워크를 제공하도록 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 첨부 도면들은 본 개시내용의 요지의 주제의 추가적인 이해를 제공하기 위해 포함되며, 본 명세서에 통합되어 본 명세서의 일부를 구성한다. 도면들은 본 개시내용의 요지의 다양한 구현예들을 예시하고, 설명과 함께 본 개시내용의 요지의 원리 및 작동을 설명하는 역할을 한다. 추가적으로, 도면들 및 설명들은 단지 예시적인 것으로 의도되며, 임의의 방식으로 청구항들의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
본 개시내용의 특정 구현예들에 대한 다음의 상세한 설명은 다음의 도면들과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 명세서에 기재된 서열분석 방법의 구현예를 설명하는 흐름도이다.
도 3은 본 명세서에 제시된 교시에 따라 이용될 수 있는 플로우셀의 구현예의 도식적 평면도이다.
도 4a 내지 도 4g는 스캐닝(검출) 단계 동안 페이싱에 대한 서열분석 및 보상의 다양한 사이클들을 설명하는 개략도이다.
도 5는 상이한 혼입 시간(46초, 23초, 및 12초)을 갖는 Illumina MiniSeqTM 서열분석기를 사용하여 페이싱(페이싱 중량%)과 PhiX 오차율(ER/%) 사이의 상관관계를 설명하는 플롯이다.
도 6은, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드가 검출 단계 동안 사용되지 않거나(표준 스캔 혼합물) 또는 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드가 검출 단계 동안에 사용되는(ScanAndFill 혼합물) 서열분석의 80 사이클에 걸친 누적 PhiX 오차율의 플롯이다.
도 7은 검출 단계 동안, 추가의 중합효소(Pol1671)와 함께 또는 추가의 중합효소를 사용하지 않은 채(No Pol) 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드가 사용된 서열분석(ScanAndFill)의 40 사이클에 걸친 페이싱, 프리-페이싱 및 %Q30 속도의 막대 그래프이다.
도 8은 광학 스캐닝에 의해 야기된 산화적 손상으로부터 DNA를 보호하는, 3 mM 아스코르베이트의 존재 및 부재 하에 검출 단계 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 (S&F)가 사용된 서열분석의 100 사이클에 걸쳐 관측된 신호 감쇠 (P90Red)의 플롯이다.
도 9는 3 mM 아스코르베이트의 존재 및 부재 하에 검출 단계 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 (S&F)를 사용한 서열분석의 100 사이클에 걸쳐 관측된 누적 PhiX 오차율 (%오류, %Q30 - 인셋)의 플롯이다
개략도는 반드시 축척에 맞는 것은 아니다. 도면에서 사용된 유사한 번호들은 유사한 구성요소들, 단계들 등을 지칭한다. 그러나, 주어진 도면 내의 구성요소를 지칭하기 위한 번호의 사용은 동일한 번호로 라벨링된 다른 도면 내의 구성요소들을 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 구성요소들을 지칭하기 위한 상이한 번호들의 사용은 상이한 넘버링된 구성요소들이 다른 넘버링된 구성요소들과 동일하거나 유사할 수 없음을 나타내도록 의도되지 않는다.
이제 본 개시내용의 요지의 다양한 구현예에 대한 참조가 더 상세히 이루어질 것이며, 그 일부 구현예는 수반되는 도면들에 예시되어 있다.
본원에서 사용되는 모든 과학적 및 기술 용어들은 달리 구체화되지 않는 한 당업계에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본원에 제공된 정의는 본원에서 흔히 사용되는 특정 용어들의 이해를 용이하게 하기 위한 것이고 본 개시내용의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확히 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "주형 폴리뉴클레오타이드 서열들"에 대한 언급은 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는 한 2개 이상의 그러한 "주형 폴리뉴클레오타이드 서열들"을 갖는 예를 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 일반적으로 내용이 달리 명시하지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용된다. 용어 "및/또는"은 열거된 요소 중 하나 또는 모두 또는 열거된 요소 중 임의의 2개 이상의 조합을 의미한다. 일부 사례에서 "및/또는"의 사용은 다른 사례에서 "또는"의 사용이 "및/또는"을 의미하지 않을 수 있다는 것을 함축하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "가진다", "갖는다", "갖는", "포함하다", "포함한다", "포함한", "함유하다", "함유한다", "포함하는" 등은 그것의 개방형 포괄적인 관점에서 사용되고, 일반적으로 "비제한적으로 포함하다", "비제한적으로 포함한다", 또는 "비제한적으로 포함하는"을 의미한다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 후속으로 기재된 사건, 상황, 또는 구성요소가 일어나거나 일어나지 않을 수 있다는 것과 본 설명은 사건, 상황, 또는 구성요소가 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"는 특정 상황 하에서 특정 이점을 부여할 수 있는 개시내용의 구현예를 지칭한다. 그러나, 다른 구현예가 또한 동일 또는 다른 상황 하에서 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 구현예의 인용은 다른 구현예가 유용하지 않다는 것을 함축하지 않으며 본 발명 기술의 범위에서 다른 구현예를 배제하려는 의도가 아니다.
또한, 종점에 의한 수치 범위의 본원에서의 인용은 그 범위 내에 포함된 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5, 등을 포함한다). 값의 범위가 "초과", "미만" 등 특정 값인 경우, 해당 값은 범위 내에 포함된다.
달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본원에 제시된 어떤 방법도 그것의 단계들이 특정 순서로 수행될 것을 요구하는 것으로 해석되는 것은 결코 아니다. 따라서, 방법 청구항이 실제로 그것의 단계들에 따른 순서를 언급하지 않거나 또는 단계들이 특정 순서로 제한되어야 한다고 청구항 또는 설명에 달리 구체적으로 언급되지 않은 경우, 어떤 특정 순서가 추론된다는 것이 결코 의도되지 않는다. 그러나, 제시된 순서는 방법이 수행될 수 있는 순서의 하나의 구현예라는 것을 이해할 것이다. 임의의 하나의 청구항에서 인용된 단일 또는 다중 특징 또는 측면은 임의의 다른 청구항 또는 청구항들에서 임의의 다른 인용된 특징 또는 측면과 조합되거나 치환될 수 있다.
특정 구현예의 다양한 특징, 요소 또는 단계들이 전환 문구 "포함하는"을 사용하여 개시될 수 있지만, 전환 문구 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"을 사용하여 설명될 수 있는 것들을 포함하는 대안적인 구현예가 암시된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 예를 들어, 혼입 단계, 검출 단계, 탈보호 단계, 및 하나 이상의 세정 단계들을 포함하는 방법에 대한 암시된 대안적인 구현예는 상기 방법이 열거된 단계들로 구성되는 구현예 및 상기 방법이 열거된 단계들로 본질적으로 구성되는 구현예를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 화합물, 조성물, 또는 물품의 맥락에서 "제공하는"은 화합물, 조성물, 또는 물품을 제조하는 것, 화합물, 조성물 또는 물품을 구매하는 것, 또는 달리 화합물, 조성물 또는 물품을 획득하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "사슬 연장 효소"는 폴리뉴클레오타이드를 주형 가닥으로 사용하여 폴리뉴클레오타이드의 카피 복제물을 생성하는 효소이다. 예를 들어, 사슬 연장 효소는 중합효소 활성을 갖는 효소일 수 있다. 전형적으로, DNA 중합효소는 주형 가닥에 결합하고 그 다음 핵산의 성장 가닥의 3' 말단에서의 유리 하이드록실 기에 뉴클레오타이드를 순차적으로 첨가하며 주형 가닥 아래로 이동한다. DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 상보성 DNA 분자를 합성하고 RNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성한다 (전사). 중합효소는 프라이머로 불리는 짧은 RNA 또는 DNA 가닥을 사용하여 가닥 성장을 시작할 수 있다. 일부 중합효소는 사슬에 염기를 부가하는 부위의 상류 가닥을 대체할 수 있다. 그와 같은 중합효소는 가닥 치환으로 언급되며, 이는 중합 효소에 의해 판독되는 주형 가닥에서 상보성 가닥을 제거하는 활성을 가짐을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 예시적인 중합효소는, 비제한적으로, Bst (바실러스 스테아로써모필루스) 중합효소, 엑소-Klenow 중합효소 또는 서열분석 등급 T7 엑소-중합효소의 큰 단편을 포함한다. 일부 중합효소는 이들 전방의 가닥을 분해하여 그것을 뒤에서 성장하는 사슬로 효과적으로 대체한다 (5' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 중합효소는 그 뒤에 있는 가닥을 분해하는 활성을 가진다 (3' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 유용한 중합효소는 돌연변이 또는 이와 달리 변형되어 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소 또는 제거한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머" 및 그것의 유도체는 일반적으로 관심 있는 표적 서열을 혼성화할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전형적으로, 프라이머는 뉴클레오타이드가 중합효소에 의해 그 위에서 중합될 수 있는 기질로 기능한다; 그러나, 일부 구현예에서, 프라이머는 합성된 폴리뉴클레오타이드 가닥 안으로 혼입될 수 있고 합성된 핵산 분자에 상보성인 새로운 가닥의 합성을 준비하도록 또 다른 프라이머가 혼성화할 수 있는 부위를 제공할 수 있다. 프라이머는 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다.
용어들 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되고 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이 용어는 단지 분자의 일차 구조를 지칭한다. 따라서, 본 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산 ("DNA"), 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산 ("RNA")을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "증폭된 표적 서열" 및 그것의 유도체는 일반적으로 표적-특이적 프라이머 및 본원에서 제공된 방법을 사용하여 표적 서열을 증폭함에 의해 생산된 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 증폭된 표적 서열은 표적 서열에 관하여 동일한 센스 (즉, 양성 가닥) 또는 안티센스 (즉, 음성 가닥) 중 어느 하나의 것일 수 있다.
제공된 방법에서 사용하기에 적합한 뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트, 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP), 및 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP)를 포함한다. 선택적으로, 표지되든 또는 비표지되든 간에, 제공된 방법에서 사용된 뉴클레오타이드는 차단 모이어티 예컨대 사슬 연장을 억제하는 가역 종결자 모이어티를 포함할 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드에 대해 사용하기에 적합한 표지는, 비제한적으로, 합텐, 방사선뉴클레오타이드, 효소, 형광 표지, 화학발광 표지, 및 발색 제제를 포함한다.
일부 경우에 핵산 유사체는, 예를 들어, 포스포르아미드 (문헌 [Beaucage 등, Tetrahedron 49(10): 1925 (1993)] 및 그 내의 참조문헌; 문헌 [Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970)]; 문헌 [Sprinzl 등, Eur. J. Biochem. 81:579 (1977)]; 문헌 [Letsinger 등, Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986)]; 문헌 [Sawai 등, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger 등, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)]; 및 문헌 [Pauwels 등, Chemica Scripta 26:141 91986)]), 포스포로티오에이트 (문헌 [Mag 등, Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991)]; 및 미국 특허 번호 5,644,048), 포스포로디티오에이트 (문헌 [Briu 등, J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989)], O-메틸포포로아미다이트 연결기 (문헌 [Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press] 참고), 및 펩타이드 핵산 골격과 연결기 (문헌 [Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992)]; 문헌 [Meier 등, Chem. Int. Ed] 참고)를 포함하는 대안적 골격을 가질 수 있지만, 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이다. 다른 유사체 핵산은 미국 특허 번호 5,235,033 및 5,034,506과, 문헌 [ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook]의 6 및 7장에 기재된 것들을 포함한, 양성 골격 (문헌 [Denpcy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)]); 비-이온성 골격 (미국. 특허 번호 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 및 4,469,863; 문헌 [Kiedrowshi 등, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991)]; 문헌 [Letsinger 등, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988)]; 문헌 [Letsinger 등, Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994)]; 문헌 [ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook]의 2 및 3장; 문헌 [Mesmaeker 등, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994)]; 문헌 [Jeffs 등, J. Biomolecular NMR 34:17 (1994)]; 문헌 [Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)]) 및 비-리보오스 골격을, 갖는 것들을 포함한다. 하나 이상의 탄소환형 당류를 함유하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 폴리뉴클레오타이드의 정의 내에 포함된다 (문헌 [Jenkins 등, Chem. Soc. Rev. (1995)]의 169-176면 참고). 몇 개의 폴리뉴클레오타이드 유사체가 문헌 [Rawls, C & E News June 2, 1997]의 35면에 기재되어 있다. 이들 모든 참고문헌은 이로써 명백하게 참고로 포함된다. 리보오스-포스페이트 골격의 이들 변형은 표지의 첨가를 용이하게 하거나, 생리적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 4가지 뉴클레오타이드 염기인: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T)의 특이적 서열을 함유할 것이다. 우라실 (U)은 또한, 예를 들어, 핵산이 RNA인 경우 티민에 대한 자연적인 대체로서 제시될 수 있다. 우라실은 또한 DNA에서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 천연 또는 비-천연 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오타이드는 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고 리보핵산은 우라실, 아데닌, 시토신 또는 구아닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 본원에 제시된 방법 또는 조성물에 사용된 데옥시리보핵산 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 우라실 염기를 포함할 수 있고 리보핵산은, 예를 들어, 티민 염기를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 천연 골격이든 또는 유사체 구조이든 간에, 핵산에 포함될 수 있는 예시적인 비-천연 염기는, 비제한적으로, 이노신, 크산타닌, 하이포크산타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티올리라실(thioLiracil), 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 선택적으로, 이소시토신 및 이소구아닌은, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 5,681,702에 일반적으로 기재된 바와 같이, 비-특이적 혼성화를 감소시키기 위해 핵산에 포함될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드에 사용된 비-천연 염기는 임의의 다른 자연 발생 염기와 염기 짝짓기가 가능하도록 보편적인 염기 짝짓기 활성을 가질 수 있다. 보편적인 염기 짝짓기 활성을 갖는 예시적인 염기는 3-니트로피롤 및 5-니트로인돌을 포함한다. 사용될 수 있는 다른 염기는 시토신, 아데닌 또는 우라실과 염기쌍을 이루는 이노신과 같은 자연 발생 염기의 하위세트와 염기 짝짓기 활성을 갖는 것들을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 가닥 안으로 뉴클레오타이드의 혼입은 뉴클레오타이드의 5' 포스페이트 기와 포스포디에스테르 결합의 형성을 통한 폴리뉴클레오타이드 가닥의 유리 3' 하이드록실 기에 대한 뉴클레오타이드의 연결을 지칭한다. 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드 주형은 DNA 또는 RNA일 수 있거나, 또는 데옥시뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드 둘 모두를 포함하는 하이브리드 분자일 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오타이드 및 자연 또는 비-천연 골격 연결기를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 무엇보다도 페이싱을 감소시키면서 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위한 짧은 주기 시간을 허용하는 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법을 기술한다. 본 방법은 미리 첨가된 표지된 뉴클레오타이드의 동일성이 검출되고 있을 때 동일한 서열을 갖는 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥의 클러스터와 함께 비표지된 뉴클레오타이드를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 검출 단계는 이전의 혼입 단계에서 이전에 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되지 않은 복제 가닥 안으로 혼입될 비표지된 뉴클레오타이드의 첨가를 위한 시간을 제공한다. 따라서, 검출 단계의 종단에서, 모든 또는 대부분의 복제 가닥은 동일 상에 있을 것이고 후속 혼입 단계에서 적절한 표지된 뉴클레오타이드를 혼입할 준비가 될 것이다.
검출 단계는, 특히 본 검출 단계가 이미지화를 포함하는 경우, 혼입 단계보다 실질적으로 많은 시간이 걸리는 경향이 있다. 따라서, 검출 단계는 혼입 단계보다 뉴클레오타이드 혼입에 대해 실질적으로 보다 많은 시간을 제공할 수 있어, 지연에 기인하여 실질적으로 페이싱을 감소시킬 수 있다. 지연 복제 가닥 안으로 혼입된 뉴클레오타이드는 비표지되기 때문에, 이들은 검출 동안 신호를 생산하지 않고 따라서 검출을 방해하지 않는다.
전반에 걸쳐 논의된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 개선된 방법이 제공된다. 예시적인 서열분석 방법이, 예를 들어, 문헌 [Bentley 등, Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, 및 US 2008/0108082에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 고처리량 또는 신속한 서열분석을 위한 하나의 유용한 방법은 합성에 의한 서열분석(SBS)이다. SBS 기술은, 비제한적으로, 게놈 분석기 시스템 (Illumina Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 트루(True) 단일 분자 서열분석 (tSMS)TM 시스템 (Helicos BioSciences Corporation, 매사추세츠주 케임브리지 소재)을 포함한다. 간단히, 표적 서열 내의 표적 위치에서 복수의 염기의 동일성을 밝히기 위해 수 많은 합성 반응에 의한 서열 분석 반응이 사용된다. 이들 반응 모두는 서열분석 프라이머가 혼성화될 제1 도메인, 및 그에 대한 서열 정보가 요구되는, 인접한 제2 도메인의 적어도 2개의 도메인을 갖는 표적 핵산 서열의 사용에 의존한다. 검정 복합체의 형성에 의해, 연장 효소가 사용되어 제1 도메인에 혼성화되는 서열분석 프라이머에 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dNTP)를 첨가하고, dNTP의 각 첨가를 판독하여 첨가된 dNTP의 동일성을 결정한다. 이것은 많은 사이클에 대해 진행될 수 있다. SBS 기술 예컨대, 게놈 분석기 시스템 (Illumina Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 트루 단일 분자 서열분석 (tSMS)TM 시스템 (Helicos BioSciences Corporation, 매사추세츠주 케임브리지 소재)은 표지된 뉴클레오타이드를 이용하여 표적 핵산 분자의 서열을 결정한다. 표적 핵산 분자는 프라이머로 혼성화될 수 있고 차단 기를 함유하는 표지된 뉴클레오타이드와 중합효소의 존재 하에 인큐베이션될 수 있다. 프라이머는 뉴클레오타이드가 혼입되도록 연장된다. 차단 기의 존재는 혼입의 단 하나의 라운드, 즉, 단일 뉴클레오타이드의 혼입을 허용한다. 표지의 존재는 혼입된 뉴클레오타이드의 확인을 허용한다. 복수의 균질한 단일 뉴클레오타이드 염기가 각 사이클 동안 첨가될 수 있고, 예컨대 트루 단일 분자 서열분석 (tSMS)TM 시스템 (Helicos BioSciences Corporation, 매사추세츠주 케임브리지 소재)에서 사용될 수 있거나 또는, 대안적으로, 4개의 뉴클레오타이드 염기 모두가 각 사이클 동안 동시에 첨가될 수 있고, 예컨대, 특히 각 염기가 구별할 수 있는 표지와 관련된 경우, 게놈 분석기 시스템 (Illumina Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재)이 사용될 수 있다. 혼입된 뉴클레오타이드를 그것의 상응하는 표지에 의해 확인한 후, 표지 및 차단 기 둘 모두가 제거될 수 있으며, 이로써 혼입 및 확인의 후속적인 라운드를 가능하게 한다. 첨가된 뉴클레오타이드 염기의 동일성을 결정하는 것은, 일부 구현예에서, 특정한 뉴클레오타이드 염기, 즉 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP의 첨가에 기인한 검출가능한 방출을 유도할 수 있는 광원에 새로 첨가된 표지된 염기의 반복된 노출을 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 이러한 SBS 기술에 특히 유용하다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 핵산 어레이로부터의 서열분석에 특히 유용할 수 있으며, 여기서 다중 서열이 어레이상의 다수의 위치로부터 동시에 판독될 수 있는데 이는 각 위치에서의 각 뉴클레오타이드가 그것의 확인가능한 표지를 기반으로 확인될 수 있기 때문이다. 예시적인 방법이 US 2009/0088327; US 2010/0028885; 및 US 2009/0325172에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다.
이제 도 1 및 2를 참고하면, 서열분석 방법의 구현예의 개요가 도시되어 있다. 본 방법은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다수의 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 부위에 제1 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 도입하는 단계 (100)를 포함한다. 제1 사슬 연장 효소는 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥 안으로 차단되고 표지된 뉴클레오타이드 중 적절한 것을 혼입하도록 구성된다. 뉴클레오타이드의 제1 라운드의 혼입 동안 또는 이전에, 폴리뉴클레오타이드 프라이머는 사전결정된 개시 위치로부터 서열분석을 용이하게 하도록 주형 가닥에 혼성화될 수 있다.
차단되고 표지된 뉴클레오타이드는 "혼입 단계"에서의 기간 동안 주형 가닥 및 사슬 연장 효소로 인큐베이션된다. 혼입 단계는 임의의 적합한 기간일 수 있다. 혼입 단계의 시간이 증가함에 따라, 복제 가닥 안으로 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위해 충분한 시간이 제공되기 때문에 페이싱은 감소하는 경향이 있다. 그러나, 더 긴 혼입 단계는 더 빠른 서열분석의 일반적인 목표를 방해한다.
많은 현행 서열분석 방법이 실행하는 주기의 수에 걸쳐 허용가능한 오류율을 제공하기에 충분히 낮은 수준으로 페이싱을 감소시키기에 충분히 긴 혼입 단계 시간을 제공하지만, 일부 구현예에서, 본 방법은 페이싱의 정정이 검출 단계 동안 발생할 수 있기 때문에 혼입 단계 동안 더 높은 수준의 페이싱을 수용할 수 있다.
본원에서 기재된 방법의 하나의 이점은 지연 복제 가닥이 검출 단계 동안 상 안으로 다시 복귀할 수 있기 때문에 혼입 단계의 시간이 앞서 허용될 수 없는 수준의 페이싱을 초래하는 수준으로 감소될 수 있다는 것이다. 혼입 단계의 시간을 감소시킴에 의해, 전체적인 서열분석 과정의 시간이 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물이 주형 폴리뉴클레오타이드로 인큐베이션되는 시간은 1초 내지 60초, 예컨대 5초 내지 45 초, 또는 10초 내지 30초이다. 일부 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물이 주형 폴리뉴클레오타이드와 함께하는 시간은 15초 이하, 예컨대 10초 이하, 또는 7.5초 이하이다.
바람직하게는, 혼입 단계는 검출 단계 동안 검출가능한 신호를 생성하도록 충분한 수의 복제 가닥에 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 허용하도록 충분히 길다.
여전히 도 1 및 2와 관련하여, 혼입 단계에서 주형 가닥 및 사슬 연장 효소로 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 인큐베이팅 후, 비혼입된 차단되고 표지된 뉴클레오타이드는 부위로부터 세정될 수 있고 (110), 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물은 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 부위에 도입될 수 있다 (120). 일부 구현예에서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물의 도입 (단계(120))은 비혼입된 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 세정하는 (단계(110)) 작용을 한다. 별도 세정 단계 (110)의 존재가, 일부 구현예에서, 바람직할 수 있다.
단계(100) 동안 복제 가닥 안으로 혼입된 표지되고 차단된 뉴클레오타이드의 동일성은 그 다음 "검출 단계"에서 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물의 존재하에 검출된다 (130). 표지되고 비차단된 뉴클레오타이드는 지연되고 이상(out of phase)인 복제 가닥 안으로 혼입될 수 있다. 즉, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드가 단계(100) 동안 복제 가닥 안으로 혼입되지 않는 경우, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드가 검출 단계(130) 동안 혼입되어 지연 복제 가닥을 상 안으로 복귀시킬 수 있다.
차단되고 비표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 구성요소는 혼입된 표지된 뉴클레오타이드의 동일성의 검출을 실질적으로 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오타이드가 형광 표지를 포함하는 경우, 조성물의 구성요소는 바람직하게는 표지된 뉴클레오타이드로부터 형광 신호를 초래하는 조건하에서 형광 신호를 생성하지 않고, 조성물의 구성요소는 바람직하게는 표지된 뉴클레오타이드에 의해 생성된 형광 신호를 방해하지 않는다.
차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 검출 단계 동안 주형 가닥으로 인큐베이션되는 시간은 바람직하게는 페이싱을 감소시키기에 충분하다. 바람직하게는, 검출 단계의 길이는 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위한 추가의 시간을 허용하도록 증가되지 않는다. 즉, 검출 단계의 기간은 바람직하게는 혼입 단계에 혼입된 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하기에 충분한 기간이다.
현행 서열분석 방법은 너무 긴 검출 단계들을 제공할 수 있지만, 휠씬 더 짧은 검출 단계들이 최적의 조건 미만에서도 페이싱의 충분한 정정 (즉, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼입)을 여전히 허용할 수 있기 쉽다. 예를 들어, 90초 검출 단계들이 종종 Illumina MiniSeqTM 시퀀서로 사용된다. 그러나, 휠씬 더 짧은 검출 시간이 검출 단계 동안 지연 가닥 안으로 뉴클레오타이드의 혼입을 허용하기에 충분할 수 있다고 여겨진다.
일부 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 검출 단계 동안 주형 가닥으로 인큐베이션되는 시간은 5초 내지 120초, 예컨대 10초 내지 90초이다. 일부 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 검출 단계 동안 주형 가닥으로 인큐베이션되는 시간은 120초 이하, 예컨대 60초 이하, 30초 이하, 10초 이하, 또는 5초 이하이다. 일부 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물이 검출 단계 동안 주형 가닥으로 인큐베이션되는 시간은 1초 이상, 예컨대 5초 이상, 또는 10초 이상이다.
여전히 도 1 및 2를 참고하면, 단계(140)에서, 본 방법은 추가로 단계(100)에서 복제 가닥 안으로 혼입된 임의의 표지되고 차단된 뉴클레오타이드를 비차단하고 비-표지하는 단계와 단계(130)에서 복제 가닥 안으로 혼입된 임의의 비표지되고 차단된 뉴클레오타이드를 비차단하는 단계를 포함할 수 있다. 비차단하는 단계는 복제 가닥에서 마지막 혼입된 뉴클레오타이드로부터 차단 모이어티를 제거하는 것을 포함하고 검출가능 모이어티는 복제 가닥 안으로 혼입된 마지막 뉴클레오타이드로부터 절단되거나 또는 그 위에 마스킹된다.
세정 단계 (도시되지 않음)는 단계들(130 및 140) 사이 또는 단계(140) 후, 또는 둘 모두에서 수행될 수 있다.
비차단하고 비-표지하는 단계(140) 후, 사전결정된 주기의 수가 수행되거나 또는 서열분석이 완료될 때까지 과정이 반복될 수 있다. 대안적으로, 사슬 연장 효소 없이 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물이 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 부위에 도입될 수 있고 (150), 단계(110)에서 개시하는 과정이 반복될 수 있다. 사슬 연장 효소는 그 부위에 잔존할 수 있다. 예를 들어, 사슬 연장 효소는 주형 가닥, 복제 가닥 또는 둘 모두에 결합될 수 있고, 다중 서열분석 사이클을 위해 활성으로 남아 있을 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 기능성 사슬 연장 효소의 양은 비차단하고 비-표지하는 단계 (140) 후에 줄어드는 경향이 있기 때문에 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물과 함께 추가의 사슬 연장 효소를 도입하는 것 (100)이 바람직하다.
도 2에서 나타낸 바와 같이 단계(125)에서, 단계(100)에서 도입된 제1 사슬 연장 효소와 동일한 효소 또는 상이한 효소일 수 있는 제2 사슬 연장 효소가 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물과 함께 포함될 수 있고 다중 주형 가닥을 포함하는 부위에 도입될 수 있다, 도 2에서 단계(125)는 도 1의 과정의 하나 이상의 사이클에서 단계(120)를 대체할 수 있다. 놀랍게도, 제2 사슬 연장 효소가 단계(125)에서 첨가된 경우보다 제2 사슬 연장 효소가 첨가되지 않은 경우 (예를 들어, 도 1에서 단계(120)에서 나타낸 바와 같은) 보다 낮은 페이싱이 발생할 수 있음이 밝혀졌다.
제공된 방법에서, 뉴클레오타이드 혼입 및 검출의 단계들은 1회 이상 반복될 수 있다. 예를 들어, 단계들은 일부 구현예에서 적어도 25회, 다른 구현예에서 적어도 75회, 및 또 다른 구현예에서 적어도 100회 반복될 수 있다. 따라서, 제공된 방법은, 비제한적으로, 일부 구현예에서 약 100 사이클 내지 약 1,000 사이클, 다른 구현예에서 약 100 사이클 내지 약 500 사이클, 및 또 다른 구현예에서 약 100 사이클 내지 약 300 사이클의 범위인 사이클 수 동안 혼입 및 검출 단계들을 반복하는 것을 포함한다.
본원에서 기재된 서열분석 방법은 임의의 적합한 장비를 사용하여 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열분석 방법은 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥이 고정화되는 고형 지지체를 이용한다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 고정화된 것은 공유 또는 비-공유결합(들)을 통해 고형 지지체에 직접 또는 간접적 부착을 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 요구된 모든 것은 지지체를 사용하기 위해 의도된 조건하에서, 예를 들어 핵산 증폭 및/또는 서열분석을 요하는 적용에서 지지체에 폴리뉴클레오타이드가 고정화되거나 또는 부착되어 유지하는 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 또는 프라이머는 3' 말단이 효소적 연장에 이용가능하고/하거나 서열의 적어도 일부분이 상보성 서열에 혼성화될 수 있도록 고정화될 수 있다. 표면 부착된 프라이머에 대한 혼성화를 통해 고정화가 일어날 수 있으며, 이 경우에 고정화된 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드는 3'-5' 지향으로 될 수 있다. 대안적으로, 고정화는 비-염기 짝짓기 혼성화, 예컨대 공유결합에 의해 일어날 수 있다.
예로써, 폴리뉴클레오타이드는 프라이머의 패치에서 하나 이상의 프라이머에 혼성화 또는 어닐링에 의해 표면에 부착될 수 있다. 혼성화는, 예를 들어, 주형 폴리뉴클레오타이드의 단부에 어댑터를 결찰함에 의해 달성될 수 있다. 어댑터의 핵산 서열은 프라이머의 핵산 서열에 상보성일 수 있으며, 따라서, 어댑터가 표면 상의 프라이머에 결합 또는 혼성화할 수 있게 한다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고 어댑터는 폴리뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 말단에 첨가될 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 이중-가닥일 수 있고, 어댑터는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 상에 결찰될 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오타이드는 상보성 프라이머에 대한 혼성화 이외의 상호작용에 의해 표면에 부착될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 화학 연결 예컨대 클릭 화학 또는 수용체-리간드 상호작용으로 인한 것 예컨대 스트렙타비딘-바이오틴 결합을 사용하여 표면에 공유적으로 부착될 수 있다.
프라이머 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프라이머는 전반적으로 상호교환가능하게 사용되고 증폭되거나 또는 서열분석되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 주형에 특이적으로 어닐링할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일반적으로, 프라이머 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 부분적으로 단일-가닥이다. 프라이머는 또한 비-천연 독립체가 프라이머의 기능을 방해하지 않는 한 비-천연 염기, 비-뉴클레오타이드 화학 변형 또는 비-천연 골격 연결기의 혼합물을 함유할 수 있다. 선택적으로, 고형 지지체의 표면 상의 프라이머의 패치는 하나 이상의 상이한 복수의 프라이머 분자를 포함할 수 있다. 예로써, 패치는 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 그 초과 복수의 프라이머 분자를 포함할 수 있고 각 복수는 상이한 서열을 갖는다. 단일 패치에서 상이한 복수의 프라이머를 갖는 구현예의 경우, 상이한 복수의 프라이머는 상이한 복수의 적어도 일부분 사이에 서열 차이가 존재하는 한 공통 서열을 공유할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 제1 복수의 프라이머는 일 복수에서의 프라이머가 다른 복수의 프라이머에서 발견되지 않는 상이한 서열을 가지는 한 제2 복수의 프라이머와 서열을 공유할 수 있다.
주형 폴리뉴클레오타이드는 고형 지지체의 표면 상에서 증폭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 증폭은 주형 및/또는 또는 그것의 보체의 하나 이상의 복제를 생성함에 의해, 존재하는 폴리뉴클레오타이드 주형 및/또는 그것의 보체의 수를 증폭 또는 증가시키는 과정을 포함한다. 증폭은, 비제한적으로, 열순환 증폭 또는 등온 증폭을 포함한 조건하에서 다양한 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 증폭을 수행하는 방법은 U.S. 공개 번호 2009/0226975; WO 98/44151; WO 00/18957; WO 02/46456; WO 06/064199; 및 WO 07/010251에 기재되어 있고; 이것은 그것의 전체로 본원에 참고로 포함된다. 간단히, 제공된 방법에서, 증폭은 폴리뉴클레오타이드 분자가 부착되는 표면 상에서 일어날 수 있다. 이러한 유형의 증폭은 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때, 표면 (예를 들어, 고형 지지체) 상에서 또는 이와 관련하여 수행된 폴리뉴클레오타이드 증폭 반응을 지칭하는 고상 증폭으로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 증폭된 생성물의 모두 또는 일부는 고정화된 프라이머의 연장에 의해 합성된다. 고상 증폭 반응은 증폭 프라이머 중 적어도 하나는 표면 (예를 들어, 고형 지지체) 상에 고정화된다는 것을 제외하면, 표준 용액상 증폭에 유사하다.
적당한 조건은 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위해 적절한 완충액/용액을 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 용액은, 예를 들어, 중합효소 활성을 갖는 효소, 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 및, 선택적으로, 첨가제 예컨대 DMSO 또는 베타인을 포함한다. 선택적으로, 증폭은, 전체적으로 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 번호 7,485,428에 기재된 바와 같이, 열 용융 없이 증폭을 허용하는 재조합효소 제제의 존재 하에 수행된다. 간단히, 예를 들어, ATP, dATP, ddATP, UTP, 또는 ATPγS의 존재 하에 재조합효소 제제 예컨대 E. 콜리로부터 RecA 단백질 (또는 다른 필라로부터의 RecA 친계)은 단일-가닥 DNA (예를 들어, 프라이머) 주위에 핵단백질 필라멘트를 형성할 것이다. 이 복합체가 상동성 서열과 접촉하는 경우 재조합효소 제제는 가닥 침습 반응 및 프라이머와 표적 DNA의 상동성 가닥의 짝짓기를 촉매할 것이다. 최초 짝짓기 가닥은 영역에서 단일가닥 DNA의 거품을 남기는 가닥 침습에 의해 대체되며, 이것은 증폭을 위한 주형으로 작용한다.
고체상 증폭은 표면에 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 중 단 하나의 종을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 증폭 반응을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표면은 복수의 제1 및 제2 상이한 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머 종을 포함할 수 있다. 고상 핵산 증폭 반응은 일반적으로 핵산 증폭, 계면 및 표면 (또는 브릿지) 증폭의 2개의 상이한 유형 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 계면 증폭에서 고형 지지체는 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 대한 혼성화에 의해 고형 지지체에 간접적으로 고정화된 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 고정화된 프라이머는 중합효소-촉매화된, 주형-지향된 신장 반응(예를 들어, 프라이머 연장)의 과정에서 연장되어 고형 지지체에 부착되어 있는 고정화된 폴리뉴클레오타이드를 생성할 수 있다. 연장 단계 후, 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 주형 및 그것의 상보성 생성물)은 주형 폴리뉴클레오타이드가 용액 안으로 방출되고 또 다른 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 대한 혼성화에 이용가능하도록 변성된다. 주형 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 연장의 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과 라운드에서 이용가능하게 될 수 있거나 또는 프라이머 연장의 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 초과 라운드 후 반응 중 세정될 수 있다.
표면 (또는 브릿지) 증폭에서, 고정화된 폴리뉴클레오타이드는 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 혼성화된다. 고정화된 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단은 고정화된 올리고뉴클레오타이드 프라이머로부터 연장되는 중합효소-촉매화된, 주형-지향된 신장 반응 (예를 들어, 프라이머 연장)에 대한 주형을 제공한다. 생성되는 이중-가닥 생성물은 2개의 프라이머를 "브릿징"하며, 양 가닥은 지지체에 공유결합된다. 다음 사이클에서, 고형 지지체에 고정화된 한 쌍의 단일 가닥 (고정화된 주형 및 연장된-프라이머 생성물)을 생성하는 변성에 이어서, 양 고정화된 가닥은 새로운 프라이머 연장을 위한 주형으로 작용할 수 있다.
증폭은 고정화된 폴리뉴클레오타이드의 콜로니를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은, 그것의 전체로 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 번호 7,115,400; U.S. 공개 번호 2005/0100900; WO 00/18957; 및 WO 98/44151에 기재된 것에 유사한 폴리뉴클레오타이드 콜로니의 클러스터링된 어레이를 생산할 수 있다. "클러스터" 및 "콜로니"는 상호교환적으로 사용되고 표면에 부착된 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들의 보체의 복수의 복제를 지칭한다. 전형적으로, 클러스터는 그것의 5' 말단을 통해 표면에 부착된 동일한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들의 보체의 복수의 복제를 포함한다. 클러스터를 구성하는 복제 폴리뉴클레오타이드는 단일 또는 이중가닥 형태일 수 있다.
따라서, 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드가 클러스터에 있을 수 있으며, 각 클러스터는 동일한 서열의 주형 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 복수의 클러스터는 서열분석될 수 있으며, 각 클러스터는 동일한 서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 제1 클러스터에서 폴리뉴클레오타이드의 서열은 제2 클러스터의 핵산 분자의 서열과 상이하다. 선택적으로, 클러스터는 주형 폴리뉴클레오타이드를 고형 표면 상의 프라이머에 어닐링하고 동일한 서열의 복수의 주형 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 클러스터를 형성하는 조건하에서 주형 폴리뉴클레오타이드를 증폭함에 의해 형성된다. 증폭은 열 또는 등온일 수 있다.
각 콜로니는 동일한 서열의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 일 콜로니의 폴리뉴클레오타이드의 서열은 또 다른 콜로니의 폴리뉴클레오타이드의 서열과 상이하다. 따라서, 각 콜로니는 상이한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 콜로니에서 모든 고정화된 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드의 증폭에 의해 전형적으로 생산된다. 일부 구현예에서, 고정화된 폴리뉴클레오타이드의 콜로니는 상이한 서열의 또 다른 폴리뉴클레오타이드가 유리 또는 미결합된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 용액의 추가의 적용시 결합할 수 있는 고정화된 폴리뉴클레오타이드 없이 하나 이상의 프라이머를 함유하는 것이 가능하다. 그러나, 콜로니에서 유리 프라이머의 충분한 수의 결여에 기인하여, 이 제2 또는 침입 폴리뉴클레오타이드는 유의미한 수로 증폭하지 않을 수 있다. 제2 또는 침입 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 단일 콜로니에서 폴리뉴클레오타이드의 총 모집단의 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.001 또는 0.0001% 미만이다. 따라서, 제2 또는 침입 폴리뉴클레오타이드는 광학적으로 검출되지 않을 수 있거나 또는 제2 또는 침입 폴리뉴클레오타이드의 검출은 배경 노이즈로 간주되거나 콜로니에서 최초, 고정화된 폴리뉴클레오타이드의 검출을 방해하지 않는다. 그와 같은 구현예에서, 콜로니는 콜로니를 검출하기 위해 사용된 방법 또는 장치의 해상도에 따라 명백하게 균질하거나 또는 균일할 것이다.
클러스터는 사용된 조건에 따라 상이한 형상, 크기 및 밀도를 가질 수 있다. 예를 들어, 클러스터는 실질적으로 둥근, 다중-면이 있는, 도넛-형상화되거나 또는 고리-형상화된 형상을 가질 수 있다. 클러스터의 직경 또는 최대 단면은 약 0.2 μm 내지 약 6 μm, 약 0.3 μm 내지 약 4 μm, 약 0.4 μm 내지 약 3 μm, 약 0.5 μm 내지 약 2 μm, 약 0.75 μm 내지 약 1.5 μm, 또는 임의의 개재하는 직경일 수 있다. 선택적으로, 클러스터의 직경 또는 최대 단면은 적어도 약 0.5 μm, 적어도 약 1 μm, 적어도 약 1.5 μm, 적어도 약 2 μm, 적어도 약 2.5 μm, 적어도 약 3 μm, 적어도 약 4 μm, 적어도 약 5 μm, 또는 적어도 약 6 μm일 수 있다. 클러스터의 직경은, 비제한적으로, 클러스터를 생성하는데 수행된 증폭 사이클의 수, 폴리뉴클레오타이드 주형의 길이, 폴리뉴클레오타이드 주형의 GC 함량, 프라이머가 부착되는 패치의 형상, 또는 클러스터가 형성되는 표면에 부착된 프라이머의 밀도를 포함한 수많은 파라미터에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러나, 상기에 논의된 바와 같이, 모든 경우에, 클러스터의 직경은 클러스터가 형성되는 패치보다 더 크지 않을 수 있다. 예를 들어, 패치가 비드인 경우, 클러스터 크기는 비드의 표면적보다 더 크지 않을 것이다. 클러스터의 밀도는 적어도 약 0.1/mm2, 적어도 약 1/mm2, 적어도 약 10/mm2, 적어도 약 100/mm2, 적어도 약 1,000/mm2, 적어도 약 10,000/mm2 내지 적어도 약 100,000/mm2의 범위일 수 있다. 선택적으로, 클러스터는, 예를 들어, 100,000/mm2 내지 1,000,000/mm2 또는 1,000,000/mm2 내지 10,000,000/mm2의 밀도를 갖는다. 본원에 제공된 방법은 대략 동일한 크기인 콜로니를 생성할 수 있다. 이것은 상이한 서열의 폴리뉴클레오타이드의 증폭의 효율성에서의 차이에 무관하게 발생한다.
클러스터는, 예를 들어, 적합한 이미지화 수단, 예컨대, 공초점 이미지화 디바이스 또는 전하 커플링된 디바이스 (CCD) 또는 CMOS 카메라를 사용하여 검출될 수 있다. 예시적인 이미지화 디바이스는, 비제한적으로, U.S. 특허 번호 7,329,860; 5,754,291; 및 5,981,956; 및 WO 2007/123744에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다. 이미지화 장치는 하나 또는 복수의 클러스터 (및/또는 이로부터 유래하는 검출가능한 신호)의 위치, 경계, 직경, 영역, 형상, 중첩 및/또는 중심과 같은 표면 상의 클러스터 또는 복수의 클러스터에서의 기준 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기준 위치는 기록되거나, 문서로 기록되거나, 주석을 달거나, 해석가능한 신호로 전환될 수 있는 등으로, 유의미한 정보를 생성할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지지체"는 폴리뉴클레오타이드를 부착하기 위한 기판을 지칭한다. 지지체는 폴리뉴클레오타이드가 부착될 수 있거나 또는 핵산이 그 위에서 합성 및/또는 변형될 수 있는 강성 또는 반-강성 표면을 갖는 물질이다. 지지체는 임의의 수지, 겔, 비드, 웰, 칼럼, 칩, 플로우셀, 멤브레인, 매트릭스, 플레이트, 필터, 유리, 제어된 기공 유리 (CPG), 중합체 지지체, 멤브레인, 종이, 플라스틱, 플라스틱 튜브 또는 정제, 플라스틱 비드, 유리 비드, 슬라이드, 세라믹, 실리콘 칩, 다중-웰 플레이트, 나일론 멤브레인, 광섬유, 및 PVDF 멤브레인을 포함할 수 있다.
지지체는 임의의 평평한 웨이퍼-유사 기판 및 웰들을 갖는 평평한 기판, 예컨대 96-웰 플레이트를 비롯한 미세적정 플레이트를 포함할 수 있다. 예시적인 평평한 기판은 칩, 슬라이드, 에칭된 기판, 미세적정 플레이트, 및 다중 미세유체 채널을 갖는 다중-레인 플로우셀 반응기를 포함한 플로우셀 반응기, 예컨대 cBot 서열분석 워크스테이션(Illumina, Inc., 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 사용된 8-채널 플로우셀을 포함한다. 예시적인 플로우셀은 본원에 전체적으로 참고로 포함된 WO 2007/123744에 기재되어 있다. 선택적으로, 플로우셀은 패턴화된 플로우셀이다. 적합한 패턴화된 플로우셀은, 비제한적으로, WO 2008/157640에 기재된 플로우셀을 포함하고, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되어 있다.
지지체는 또한 자기 비드, 중공 비드, 및 고체 비드를 포함한 비드를 포함할 수 있다. 비드는 평평한 지지체와 공조하여 사용될 수 있으며, 이러한 평평한 지지체는 선택적으로 또한 웰들을 함유한다. 비드, 또는 대안적으로 마이크로구형체는 일반적으로 강성 또는 반-강성 재료로 제작된 작은 바디를 지칭한다. 본 바디는, 예를 들어, 규칙적 또는 불규칙한 치수를 갖는 구형체, 타원형, 마이크로구형체, 또는 다른 인식된 입자 형상을 특징으로 하는 형상을 가질 수 있다. 비드의 크기는 특히, 비제한적으로, 직경이 약 1 μm, 약 2 μm, 약 3 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 20 μm, 약 30 μm, 약 40 μm, 약 60 μm, 약 100 μm, 약 150 μm 또는 약 200 μm인 것을 포함한다. 비드 및 마이크로구형체에 대해 본원에서 기재된 것에 유사한 방식으로 다른 입자가 사용될 수 있다.
지지체의 조성물은, 예를 들어, 부착의 형식, 화합물 및/또는 방법 및/또는 핵산 합성의 방법에 따라 다양할 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 지지 물질은, 비제한적으로, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 나일론, 금속, 및 다른 적합한 물질을 포함할 수 있다. 예시적인 조성물은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유기 모이어티 합성에 사용된 지지체, 및 여기에 부여된 화학적 기능성을 포함한다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 멜라민, 메틸스티렌, 아크릴 중합체, 상자성체, 토리아 솔, 탄소 흑연, 이산화티타늄, 라텍스 또는 가교결합된 덱스트란 예컨대 SepharoseTM, 셀룰로오스, 나일론, 가교결합된 교질입자 및 TeflonTM, 뿐만 아니라, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 Bangs Laboratories, Fishers IN으로부터의 문헌 "Microsphere Detection Guide"에 기재되어 찾아볼 수 있는 임의의 다른 물질을 포함한다. 지지체 입자는 가교결합된 전분, 덱스트란, 셀룰로오스, 단백질, 폴리스티렌 및 메틸스티렌을 포함한 스티렌 중합체를 포함한 유기 중합체 뿐만 아니라 다른 스티렌 공중합체, 플라스틱, 유리, 세라믹, 아크릴 중합체, 자기적 반응성 물질, 콜로이드, 토리아솔, 탄소 흑연, 이산화티타늄, 나일론, 라텍스, 또는 Teflon®으로 제조될 수 있다. 본원에 전체적으로 참고로 포함된 Bangs Laboratories, Fishers, Inc.로부터의 문헌 "Microsphere Detection Guide"는 도움이 되는 가이드이다. 본 개시내용의 범위 내에서 추가의 예시적인 지지체는, 예를 들어, 미국 출원 공개 번호 02/0102578 및 미국 특허 번호 6,429,027에 기재된 것들을 포함하며, 이 둘 모두는 전체적으로 참고로 본원에 포함된다.
예를 들어, 그리고 도 3과 관련하여, 고형 지지체(200)의 구현예, 예컨대 플로우셀이 도시되어 있다. 고형 지지체(200)는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥을 함유하는 클러스터(300)가 결합되는 표면(210)을 갖는다. 고형 지지체(200)의 표면(210)은 평면일 수 있다.
시약, 세정 완충액 등을 함유하는 유체 조성물은 고형 지지체(200)의 표면(210) 상으로 흘러 클러스터(300)에서의 주형 폴리뉴클레오타이드와 상호작용할 수 있다. 조성물의 흐름은 임의의 방향, 예컨대 도 3에서 화살표로 나타낸 방향으로 일어날 수 있다.
플로우셀(300)이 사용될 수 있는 서열분석 장치는 클러스터(300)에서의 주형 가닥과 상호작용하도록 표면(210)을 가로질러 시약 및 조성물을 흐르도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 장치는 사슬 연장 효소, 서열분석 프라이머, 뉴클레오타이드, 세정 조성물, 비차단 시약, 비-표지 시약, 등이 고형 지지체(200), 예컨대 플로우셀의 표면(210)을 가로질러 흐르게 하여 주형 가닥의 서열분석을 수행하는 적절한 시간에서 클러스터(300)에서의 주형 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하게 할 수 있다.
각 클러스터(300)는 또 다른 클러스터(300)와 동일한 주형 폴리뉴클레오타이드 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
서열분석되는 주형 폴리뉴클레오타이드는 알려진, 통상적인 방법을 사용하여 임의의 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 혈액 샘플, 생검 시료, 조직 외식편, 장기 배양물, 생체액 또는 임의의 다른 조직 또는 세포 제제, 또는 이의 분획 또는 유도체 또는 이로부터 단리된 것을 포함한다. 생물학적 샘플은 일차 세포 배양물 또는 비제한적으로 염색체로 통합되거나 또는 에피솜 재조합 핵산 서열을 함유할 수 있는 유전적으로 조작된 세포주를 포함한 배양물 순응된 세포주, 불멸화되거나 또는 불멸화가능한 세포주, 체세포 하이브리드 세포주, 분화되거나 또는 분화가능 세포주, 형질전환된 세포주, 줄기 세포, 생식세포 (예를 들어 정자, 난모세포), 형질전환된 세포주 등일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 분자는 일차 세포, 세포주, 새롭게 단리된 세포 또는 조직, 냉동된 세포 또는 조직, 파라핀 포매된 세포 또는 조직, 고정된 세포 또는 조직, 및/또는 레이저 해부된 세포 또는 조직으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 인간 또는 포유동물 및 비-포유동물을 포함한 비-인간 동물, 척추동물 및 무척추동물을 포함한 임의의 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있고, 또한 임의의 다중세포 유기체 또는 단일-세포의 유기체 예컨대 진핵 (식물 및 조류를 포함함) 또는 원핵 유기체, 아카에온(archaeon), 미생물 (예를 들어 박테리아, 고세균, 진균, 원생생물, 바이러스), 및 수생 플랑크톤일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 제공된 방법에서 사용하기 위한 상이한 서열의 복수의 폴리뉴클레오타이드 분자가 이용가능하고 알려진 다양한 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 분자 제조의 예시적인 방법은, 비제한적으로, 문헌 [Bentley 등, Nature 456:49-51 (2008)]; 미국 특허 번호 7,115,400; 및 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0128624; 2009/0226975; 2005/0100900; 2005/0059048; 2007/0110638; 및 2007/0128624에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각은 전체적으로 참고로 본원에 포함된다. 주형 폴리뉴클레오타이드는, 비제한적으로, 범용 서열 및 알려진 또는 알려지지 않은 서열을 포함한 다양한 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 5' 및/또는 3' 말단 상에 위치한 알려진 서열 중 하나 이상의 영역 (예를 들어, 어댑터)을 포함할 수 있다. 이러한 주형 폴리뉴클레오타이드는 알려지지 않은 서열의 폴리뉴클레오타이드의 단부에 어댑터를 부착함에 의해 형성될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 5' 및 3' 말단 상에 알려진 서열을 포함할 때, 상기 알려진 서열은 동일한 서열이거나 상이한 서열일 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 말단 상에 위치한 알려진 서열은 표면 상에 고정화된 하나 이상의 프라이머에 혼성화할 수 있다. 예를 들어, 5' 알려진 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 복수의 프라이머에 혼성화할 수 있는 반면 3' 알려진 서열은 제2 복수의 프라이머에 혼성화할 수 있다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 검출가능한 표지를 포함한다. 하나 이상의 검출가능한 표지는 폴리뉴클레오타이드 분자 내의 5' 말단, 3' 말단, 및/또는 임의의 뉴클레오타이드 위치에서 폴리뉴클레오타이드 주형에 부착될 수 있다. 제공된 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드는 증폭 및/또는 서열분석될 폴리뉴클레오타이드 및, 선택적으로, 5' 및/또는 3' 말단(들)에서의 짧은 핵산 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 5' 및/또는 3' 말단에 첨가되는 짧은 핵산 서열은 범용 서열일 수 있다. 범용 서열은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드에 공통인, 즉, 이에 의해 공유된 뉴클레오타이드 서열의 영역이며, 여기서 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드는 또한 서열 차이의 영역을 갖는다. 복수의 폴리뉴클레오타이드의 상이한 구성원에 존재할 수 있는 범용 서열은 범용 서열에 상보성인 단일 범용 프라이머를 사용하여 다수의 상이한 서열의 복제 또는 증폭을 허용할 수 있다. 유사하게, 폴리뉴클레오타이드의 집합의 상이한 구성원에 존재할 수 있는 적어도 하나, 두 개 (예를 들어, 쌍) 또는 그 초과의 범용 서열은 범용 서열에 상보성인 적어도 하나, 두 개 (예를 들어, 쌍) 또는 그 초과의 단일 범용 프라이머를 사용하여 다수의 상이한 서열의 복제 또는 증폭을 허용할 수 있다. 따라서, 범용 프라이머는 이러한 범용 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 상이한 표적 서열의 하나 또는 둘 모두의 단부에 범용 어댑터 (예를 들어, 비-표적 핵산 서열)를 부착하도록 변형될 수 있으며, 상기 어댑터는 범용 프라이머의 혼성화를 위한 부위를 제공한다. 이 접근법은 생성, 증폭, 서열분석된, 및/또는 달리 분석할 각 폴리뉴클레오타이드에 대한 프라이머의 특이적 쌍을 디자인할 필요가 없다는 이점; 각 폴리뉴클레오타이드가 그것의 5' 및 3' 단부에 동일한 범용 프라이머-결합 서열의 첨가에 의해 변형된다면 프라이머의 단일 쌍이 상이한 폴리뉴클레오타이드의 증폭을 위해 사용될 수 있다는 이점을 갖는다.
폴리뉴클레오타이드는 또한 표준의 알려진 방법을 사용하여 임의의 바람직한 핵산 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 추가의 서열은 주어진 핵산 서열의 증폭 생성물의 확인을 허용하기 위해, 예를 들어, 제한 효소 부위, 또는 인덱싱 태그를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용될 때 용어 상이한은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 2개의 폴리뉴클레오타이드는 다른 폴리뉴클레오타이드에 비교하여 일 폴리뉴클레오타이드의 서열에서 뉴클레오타이드의 함량 및 순서가 상이할 수 있다. 본 용어는 이들이 복제, 앰플리콘, 주형, 표적, 프라이머, 올리고뉴클레오타이드, 등 어느 것을 지칭하든 간에 폴리뉴클레오타이드를 기술하기 위해 사용될 수 있다.
이제 도 4a 내지 4g를 참고하면, 서열분석 방법의 구현예를 예시하는 개략도가 도시되어 있다. 도시된 구현예는 페이싱에 관한 문제와 본 방법이 상기 문제를 다루는 방법을 예시한다. 도 4a 내지 4g에서, 동일한 서열을 갖는 복수의 폴리뉴클레오타이드(400)가 도시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드(400)는 그것의 3' 또는 5' 말단에서 고형 지지체의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 도 3에 도시된 바와 같이 플로우셀(200) 상의 클러스터(300)에서 표면(210)에 결합될 수 있다.
도 4a는 서열분석의 개시 이전 주형 폴리뉴클레오타이드(400)를 도시한다. 도 4b는 도 1 및 2의 세정 단계(110) 후와 같이, 서열분석의 제1 라운드 동안 복제 가닥(590) 안으로 혼입된 단일의 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(510)를 도시한다. 편의상 및 명료성을 위해, 세정 단계 후 주형 폴리뉴클레오타이드(400) 상에 남에 있을 수 있는 사슬 연장 효소는 도시되지 않았다. 일부 구현예에서, 주형의 서열의 일부에 상보성인 프라이머 폴리뉴클레오타이드 (도시되지 않음)는 뉴클레오타이드(510)의 혼입을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 도 4b에 도시된 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(510)는 5개 주형 폴리뉴클레오타이드(400) 중 4개에 대해 복제 가닥(590) 안으로 혼입된다. 더 이상 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(510)가 혼입되지 않은 가닥은 페이스(phase)를 벗어날 것이다.
그러나, 도 4c에서 나타낸 바와 같이, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 1 또는 도 2에서 단계(120 또는 125))가 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(510)의 동일성의 검출(예를 들어, 도 1 및 2의 단계(130)) 동안 주형 폴리뉴클레오타이드(400)로 인큐베이션된 경우, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드(515)는 지연 가닥 안으로 혼입되어 서열분석의 다음 사이클 이전에 지연 가닥을 페이스 안으로 가져올 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드(515)는 세정 단계 (예를 들어, 도 1 및 2의 단계(110)) 후에 남아 있거나 또는 비차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 2의 단계(125))의 혼합물과 함께 도입되는 사슬 연장 효소 (도시되지 않음)에 의해 혼입될 수 있다. 혼입된 뉴클레오타이드(510, 515)는 뉴클레오타이드(510)의 경우에 비차단 및 비표지될 수 있고(예를 들어, 도 1 및 2의 단계(140)), 그리고 서열분석의 또 다른 사이클이 수행될 수 있다.
도 4d는 서열분석의 제2 사이클에서 혼입 단계 (예컨대 도 1 및 2의 단계(100)) 및 세정 단계 (예컨대 도 1 및 2의 단계(110))에 이어서 복제 가닥(590) 안으로 제2 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(520)의 혼입을 도시한다. 도 4d에 도시된 구현예에서, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(520)는 5개 주형 폴리뉴클레오타이드(400) 중 4개에 대해 복제 가닥(590) 안으로 혼입된다. 더 이상 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(510)가 혼입되지 않은 복제 가닥(590)은 페이스를 벗어날 것이다.
그러나, 도 4e에서 나타낸 바와 같이, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 도 1 또는 도 2에서 단계(120 또는 125))가 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(520)의 동일성의 검출(예를 들어, 도 1 및 2의 단계(130)) 동안 주형 폴리뉴클레오타이드(400)로 인큐베이션된 경우, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드(525)는 지연 가닥 안으로 혼입되어 서열분석의 다음 사이클 이전에 지연 가닥을 페이스 안으로 가져올 수 있다. 혼입된 뉴클레오타이드(520, 525)는 뉴클레오타이드(520)의 경우에 비차단 및 비표지될 수 있고(예를 들어, 도 1 및 2의 단계(140)), 그리고 서열분석의 또 다른 사이클이 수행될 수 있다.
도 4f는 차단되고 표지된 뉴클레오타이드(530)가 혼입 단계에 이어서 5개 복제 가닥(590) 중 4개 안으로 혼입되는 서열분석의 또 다른 사이클을 예시한다. 도 4g는 지연 가닥을 서열분석의 다음 사이클 이전에 페이스 안으로 가져오는 지연 가닥 안으로 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드(535)의 혼입을 예시한다. 도 4g에 예시된 바와 같이 서열분석의 3 사이클 후 모든 복제 가닥(590)은 페이스 안에 있다. 그러나, 검출 단계 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드를 인큐베이션하지 않으면, 5개 가닥 중 3개는 예시된 구현예에서 페이스를 벗어났을 것이다. 복제 가닥의 60%가 페이스를 벗어나면, 검출 단계 동안 생산된 신호는 상이한 표지된 뉴클레오타이드의 혼입에 기인하여 너무 이질성이어서 적절한 뉴클레오타이드를 적절하게 식별할 수 없을 것이다.
도 4a-g에 제시된 도면이 도식적이지만, 몇몇 핵심 사항을 예시한다. 예를 들어, 작은 속도의 페이싱은 서열분석의 다수의 사이클에 걸쳐 불어날 수 있다. 그러나, 비표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 통해 검출 동안 페이스 안으로 지연 복제 가닥을 가져오는 것은 혼입 라운드 후 상대적으로 낮은 수의 지연 가닥으로 인해 많은 사슬 연장 활성을 요하지 않는다. 따라서, 비표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위한 최적의 조건 미만도 비표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 위해 용인될 수 있다. 따라서, 사슬 연장 효소의 효율 및 정확도를 최적화하기 위해 의도되지 않은 조건도 용인될 수 있다.
차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 임의의 적합한 조성물이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 약 8 내지 약 10, 예컨대 약 9 내지 약 9.5의 pH를 갖는 완충 용액을 포함한다. 임의의 적합한 완충액, 예컨대 Tris 완충액이 사용될 수 있다. 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드는 임의의 적합한 농도 예컨대 약 0.001 내지 약 15 μM, 예컨대 약 0.5 μM 내지 약 5 μM, 예컨대 약 2 μM로 존재할 수 있다. 본 조성물은 임의의 적합한 양의 킬레이터, 예컨대 약 0 mM 내지 약 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 또는 약 0 mM 내지 약 2 mM EDTA, 또는 약 0 mM 내지 약 1 mM EDTA를 포함할 수 있다. 본 조성물은 임의의 적합한 양의 황산마그네슘, 예컨대 약 1 mM 내지 약 10 mM MgSO4, 약 2 mM 내지 약 6 mM MgSO4, 또는 약 4 mM MgSO4를 포함할 수 있다. 본 조성물은 임의의 적합한 양의 세제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 중량으로 약 0.05% 내지 약 1% 세제, 예컨대 중량으로 약 0.1% 내지 약 0.5% 세제, 또는 중량으로 약 0.2% 세제를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 세제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (또한 일명 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트, 또는 Tween) 또는 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 수화물 (CHAPS) 세제가 사용될 수 있다. 본 조성물은 임의의 적합한 양의 항산화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세제는 약 1 mM 내지 약 50 mM, 예컨대 약 2 mM 내지 약 40 mM, 약 3 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 15 mM 내지 약 25 mM의 조합된 총 항산화제 농도로 하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있다. 적합한 항산화제는 아스코르베이트, 아세토바닐론, 및 트롤록스를 포함한다. 바람직하게는, 본 조성물은 표지된 뉴클레오타이드가 없다.
일부 구현예에서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물은 Tris 완충액을 포함하고, 약 9 내지 약 9.5의 pH를 가지고, 세제, MgSO4, EDTA, 아스코르베이트, 및 아세토바닐론을 갖는다. 예를 들어, 본 조성물은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 구성요소를 포함할 수 있다:
Figure pct00001
본원에는, 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 그와 함께 사용될 수 있고, 그의 제조에 사용될 수 있으며, 또는 그의 생성물인 물질, 조성물 및 성분이 개시되어 있다. 이들 및 다른 물질들은 본 명세서에 개시되고, 이들 재료들의 조합들, 하위세트들, 상호작용들, 기들 등이 개시될 때, 각각의 다양한 개별 및 집합적 조합들 및 치환의 특정 참조가 명시적으로 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 본 명세서에서 구체적으로 고려되고 기재되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고 상기 방법 단계들에 대해 이루어질 수 있는 다수의 변형들이 논의되는 경우, 방법 단계들의 각각의 그리고 모든 조합 및 치환, 및 가능한 변형들은 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 임의의 하위세트 또는 이들의 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 이 개념은 본 개시내용의 모든 측면들에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 존재한다면, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있고, 각각의 이러한 조합 또는 이의 하위세트가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 한다는 것이 이해된다.
본원 전반에 걸쳐, 다양한 공보가 언급된다. 이들 공보의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1. 페이싱 증가는 감소된 혼입 시간과 상관 관계가 있다.
페이싱 및 오차율에 대한 감소된 혼입 시간의 효과를 이해하기 위해, 알려진 서열의 폴리펩티드의 서열분석을 상이한 혼입 시간을 사용하여 Illumina MiniSeqTM 서열분석기를 사용하여 서열분석하였다. 구체적으로, 혼입 시간은 46초, 23초 및 12초였다. 페이싱과 오차율 사이의 상관관계는 도 5에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 오차율 및 페이싱은 긴 혼입 시간(46초)에서 낮게 유지된다. 그러나, 혼입 시간이 감소함에 따라(예를 들어, 12초), 페이싱 및 오차율이 증가한다. 따라서, 혼입 시간의 감소는 증가된 페이싱 및 오차율을 초래하는 경향이 있다.
실시예 2. 검출 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 감소된 혼입 시간에서의 페이싱 감소
페이싱 및 오차율이 검출 단계 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 및 중합효소와 함께 인큐베이션함으로써 영향을 받는지를 평가하기 위해, 알려진 서열의 폴리뉴클레오타이드를 검출 단계 동안에 (i) 제조자의 스캔 혼합물 (차단되고 비표지된 뉴클레오타이드가 없고, 중합효소가 없음 - "표준 시약"), 및 (ii) 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 및 중합효소를 포함하는 변형된 스캔 혼합물 ["ScanAndFill"]를 사용하여 Illumina MiniSeqTM 서열분석기를 사용하여 서열분석하였다. ScanAndFill 혼합물은 중합효소 Pol812를 포함하였다. 서열분석의 80 사이클을 표준 스캔 혼합물로 25초 및 7.5초의 혼입 시간을 사용하고, ScanAndFill 혼합물 및 ScanAndFill 혼합물로 7.5초의 혼입 시간을 사용하여 수행하였다. 각 사이클에서의 오차율, 페이싱 및 프리-페이싱(복제 가닥이 동상의 복제 가닥을 넘어서 추가의 뉴클레오타이드를 혼입하는 경우)을 측정하였다. 결과는 하기 도 6 및 표 2에 나타낸다.
Figure pct00002
도 6 및 표 2에 나타낸 바와 같이, ScanAndFill 혼합물의 사용은 사이클 당 총 화학 시간을 약 32%(112초 내지 77초) 감소시키면서 기준선(2x25초에서의 표준 시약)과 다소 필적하는 메트릭을 산출하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 오차율의 감소는 페이싱의 감소로 인한 것으로 보인다.
실시예 3. 추가의 중합효소 없는 검출 동안 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드에 의한 감소된 혼입 시간에서의 페이싱 감소
페이싱, 프리-페이싱 및 오차율에 대한 ScanAndFill 혼합물에서 첨가된 중합효소의 효과를 평가하기 위해, 알려진 서열의 폴리뉴클레오타이드를 검출 단계 동안 중합효소를 갖는 및 중합효소를 갖지 않는 ScanAndFill 혼합물을 사용하는 Illumina MiniSeqTM 서열분석기를 사용하여 서열분석하였다. ScanAndFill 혼합물은, 중합효소와의 혼합물이 60 μg/ml Pol1671을 포함하는 것을 제외하고는 동일하였으며, 이는 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, 2018년 10월 31일자로 출원된 발명의 명칭이 "Polymerases, compositions, and methods of use"인 미국 특허 출원 제62/753558호에 기재되어 있다. ScanAndFill 혼합물의 다른 성분은 EA 완충액; pH 9.85; MgSO4; EDTA; 예를 들어, U.S. 공개 특허 출원 번호 2013/0079232 및 2016/0040225 (A-LN3, C-LN3, 및 T-LN3)에 기재된 바와 같이 절단가능한 LN3 링커를 갖는 형광 염료를 포함하도록 변형된 A, C, 및 T 뉴클레오타이드 트리포스페이트; Dark (비표지된) G, 및 CHAPS였다. 7.5초의 혼입 시간을 사용하였다. 각 사이클에서 Q30, 페이싱 및 프리-페이싱 값을 계산하였다. "Q30"은 Q30 품질 필터를 통과하는 판독의 백분율, 즉 1000에서 1, 또는 0.1% 이하의 오차율을 지칭한다. 결과를 도 7에 나타낸다.
나타낸 바와 같이, 페이싱은 첨가된 중합효소의 존재 및 부재 하에 낮게 유지되었고, 이는 혼입 단계로부터의 중합효소가 검출 단계 동안 활성으로 남아 있고 존재함을 시사한다. 놀랍게도, 추가의 중합효소의 부재 하에 보다 낮은 속도의 페이싱이 관측되었다. 전체 오차율은 페이싱 및 프리-페이싱 속도와 같이, 더 높은 Q30 값에 반영되는 바와 같이 감소되었다.
실시예 4. 산화방지제의 첨가는 추가로 오차율 및 신호 감쇠를 감소시킨다.
검출 단계 신호 감쇠 및 서열분석 오차율에 대한 ScanAndFill 혼합물(중합효소 없음) 중 첨가된 항산화제의 효과를 평가하기 위해, 알려진 서열의 폴리뉴클레오타이드를 검출 단계 동안, 중합효소는 없고 3 mM 아스코르베이트가 있거나 없는 ScanAndFill 혼합물을 사용하여 Illumina MiniSeqTM 서열분석기를 사용하여 서열분석하였다. ScanAndFill 혼합물은 EA 완충액, pH 9.85, MgSO4, EDTA, A-LN3, C-LN3, T-LN3, Dark G, 및 CHAPS를 포함하였다. 서열분석의 100 사이클을 7.5초의 혼입 시간을 사용하여 수행하고, 사이클 당 25초의 혼입 시간으로 표준 스캔 혼합물을 사용하여 기준선과 비교하였다. 결과를 도 8 내지 도 9에 나타낸다.
아스코르베이트의 첨가는 아스코르베이트가 없는 ScanAndFill에 비해 실질적으로 개선된 신호 감쇠 감소(도 8) 및 오차율의 감소 (도 9)를 초래하였다. 75 사이클 초과의 판독 길이는 항산화제의 첨가로 가능해진다. 도 9 삽입에 나타낸 바와 같이, 아스코르베이트는 또한 %Q30을 개선시켰다. 또한, 아스코르베이트는 % Align PhiX를 개선시켰다.
유사한 결과가 다른 농도의 아스코르베이트(최대 20 mM), 다양한 농도의 아세토바닐론 (최대 20 mM) 및 아스코르베이트와 아세토바닐론의 조합물(데이터는 도시되지 않음)로 관측되었다.
또한, pH는 변할 수 있고 유사한 결과가 얻어질 수 있다.
다수의 실시예들이 설명되었다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예들은 다음의 청구항들의 범위 내에 있다.

Claims (15)

  1. (a) 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 다중 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥이 플로우셀의 표면에 결합되는 부위를 포함하는 플로우셀에 제1 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 도입하는 단계로서, 제1 사슬 연장 효소는 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 차단되고 표지된 뉴클레오타이드 중 적절한 것을 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입하도록 구성되는 단계;
    (b) 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하는 단계;
    (c) 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하는 동안 또는 그 후에 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물을 플로우셀에 도입하는 단계로서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물의 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드는, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥으로의 혼입을 위해 이용가능하고, 단, 복제 가닥에서 이전에 혼입된 뉴클레오타이드는, 존재한다면, 차단되지 않은 것인 단계; 및
    (d) 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물이 플로우셀과 함께 인큐베이션되는 동안, 존재한다면, 복제 가닥에 혼입된 하나의 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하는 단계
    를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물은, 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정한 후에 플로우셀에 도입되는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하는 단계는, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물을 플로우셀에 도입하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물의 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드는, 복제 가닥에 혼입된 제1 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성이 검출되고 있는 경우, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥으로의 혼입을 위해 이용가능한 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 가닥에 혼입된 제1 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하는 단계는, 플로우셀을 이미지화하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 가닥에 혼입된 제1 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하는 단계는, 120초 이하의 기간에 걸쳐 일어나는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복제 가닥에 혼입된 제1 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 동일성을 검출하는 단계는, 10초 이상의 기간에 걸쳐 일어나는 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (e) 복제 가닥에 혼입된 임의의 제1 표지되고 차단된 뉴클레오타이드로부터 표지 및 차단 모이어티를 제거하고, 복제 가닥에 혼입된 임의의 제2 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드로부터 차단 모이어티를 제거하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물은, 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하기 전에 15초 이하 동안 플로우셀과 함께 인큐베이션되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물은, 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하기 전에 10초 이하 동안 플로우셀과 함께 인큐베이션되는 것인, 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 사슬 연장 효소 및 차단되고 표지된 뉴클레오타이드의 혼합물은, 혼입되지 않은 차단되고 표지된 뉴클레오타이드를 플로우셀로부터 세정하기 전에 7.5초 이하 동안 플로우셀과 함께 인큐베이션되는 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물은, 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상응하는 주형 가닥의 서열에 기초하여, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드 중 적절한 것을 복제 폴리뉴클레오타이드 가닥에 혼입하도록 구성된 제2 사슬 연장 효소를 포함하며, 단, 복제 가닥에서 이전에 혼입된 뉴클레오타이드는, 존재한다면, 차단되지 않은 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제1 사슬 연장 효소 및 제2 사슬 연장 효소는 동일한 효소 또는 상이한 효소인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 차단되고 비표지된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함하는 조성물은 9 내지 9.5의 pH를 갖고, 완충액, 세제, 황산마그네슘, EDTA 및 항산화제를 포함하는 것인, 방법.
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