CN112639126A - 降低测序期间用未标记的核苷酸的定相 - Google Patents

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Abstract

多核苷酸测序方法包括当检测先前添加的标记的核苷酸的身份时，将未标记的核苷酸与具有相同序列的模板多核苷酸链的簇一起温育。检测步骤为添加待掺入拷贝链中的未标记的核苷酸提供了时间，在该拷贝链中先前添加的标记的核苷酸未得以掺入。因此，在检测步骤结束时，所有或大部分拷贝链将处于同相，并准备在随后的掺入步骤中掺入适当的标记的核苷酸。

Description

降低测序期间用未标记的核苷酸的定相
技术领域
本公开尤其涉及多核苷酸的测序。
背景技术
模板多核苷酸链的测序可以通过多个循环的反应进行，借此每循环将一个可检测的核苷酸掺入拷贝链中。可检测的核苷酸通常被封闭以防止每循环掺入超过一个可检测的核苷酸。在温育时间之后，通常进行洗涤步骤以去除任何未掺入的可检测的核苷酸。然后可以进行检测步骤，其中确定掺入拷贝链中的可检测的核苷酸的身份。接下来，进行解封闭步骤和切割或掩蔽步骤，其中从拷贝链中最后掺入的核苷酸去除封闭剂，并从最后掺入拷贝链中的核苷酸切割可检测的部分或者在其上进行掩蔽。在一些情况下，可检测的部分充当封闭剂，且可检测的部分的去除可以去除封闭剂。然后通过在掺入步骤中引入可检测的核苷酸来重复该循环。
在许多情况下，具有相同序列的模板多核苷酸链的簇同时进行测序。簇用于放大由掺入拷贝链中的可检测的核苷酸所产生的信号。由于簇含有多条相同序列的模板链，所以在每一轮核苷酸添加时掺入相应拷贝链中的核苷酸应该是相同的，且可检测核苷酸的信号应该与簇中模板链的拷贝数成比例地增强。
多核苷酸测序的一个近期目标是在保持高保真度的同时减少完成测序的时间。实现减少测序时间的一种方法是通过缩短掺入步骤的持续时间来减少循环时间。一些更有效率的聚合酶和修饰的核苷酸已经被开发出来，以提供更有效率的核苷酸掺入拷贝链中。然而，掺入步骤仍然倾向于在经测序的所有模板链上经历核苷酸的不完全掺入。
当在掺入步骤期间核苷酸未掺入含有多条具有相同序列的模板链的簇中的拷贝链中时，其中未掺入核苷酸的拷贝链被称为与在掺入步骤期间其中掺入核苷酸的那些拷贝链异相(out of phase)。当异相的拷贝链的数量随着进一步的循环而增加时，来自簇的信号可能变得太不均匀，从而无法确定掺入同相(in-phase)拷贝链中的核苷酸。
发明内容
本公开尤其描述了多核苷酸测序方法，该方法在减少定相的同时允许掺入标记的核苷酸的短循环时间。方法包括当检测先前添加的标记的核苷酸的身份时，将未标记的核苷酸与具有相同序列的模板多核苷酸链的簇一起温育。检测步骤为添加待掺入拷贝链中的未标记的核苷酸提供了时间，在该拷贝链中先前添加的标记的核苷酸未得以掺入。因此，在检测步骤结束时，所有或大部分拷贝链将处于同相，并准备在随后的掺入步骤中掺入适当的标记的核苷酸。
在一些实施方案中，多核苷酸测序方法包括将链延伸酶和封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到流动池(flow cell)，该流动池包含位点，在该位点处多条具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链与该流动池的表面结合。基于与拷贝多核苷酸链相对应的模板链的序列，将链延伸酶配置为将适当的封闭的、标记的核苷酸中的一个掺入拷贝多核苷酸链中。方法进一步包括将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从流动池洗去，并在将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从流动池洗去期间或之后，将包含封闭的、标记的核苷酸的混合物的组合物引入流动池。基于与拷贝多核苷酸链相对应的模板链的序列，封闭的、未标记的核苷酸的混合物的一个封闭的、未标记的核苷酸可用于掺入拷贝多核苷酸链中，条件是拷贝链中先前掺入的核苷酸(如果有的话)未被封闭。方法还包括检测掺入拷贝链中的一个封闭的、标记的核苷酸(如果有的话)的身份，同时将封闭的、未标记的核苷酸的混合物与流动池一起温育。
然后，可以从掺入拷贝链中的封闭的、标记的核苷酸去除标记物和封闭物，并可从掺入拷贝链中的封闭的、未标记的核苷酸(如果有的话)去除封闭物。然后，可以将该过程重复进行预定循环数或直到测序完成。
一个或多个实施方案的细节在附图和以下说明书中阐述。其他特征、目的和优点根据说明书和附图以及根据权利要求书将是显而易见的。
应当理解的是，前面的一般描述和下面的详细描述都呈现了本公开主题的实施方案，并且旨在提供用于理解本公开要求保护的主题的性质和特征的概述或框架。包括附图以提供对本公开主题的进一步理解，并且附图被并入本说明书中并构成本说明书的一部分。附图示出了本公开主题的各种实施方案，并且与说明书一起用于解释本公开主题的原理和操作。另外，附图和说明书仅是说明性的，并不以任何方式限制权利要求的范围。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可以最佳地理解本公开的具体实施方案的以下详细描述。
图1-2是说明本文所述序列方法的实施方案的流程图。
图3是根据本文提出的教导可以采用的流动池的实施方案的示意性平面图。
图4A-G是说明在扫描(检测)步骤期间测序和定相补偿的各种循环的示意图。
图5是说明使用具有不同掺入时间(46秒、23秒和12秒)的Illumina MiniSeqTM测序仪的定相(定相权重％)和PhiX错误率(ER/％)之间的相关性的图。
图6是在80个测序循环中的累积PhiX错误率的图，其中在检测步骤期间没有使用封闭的、未标记的核苷酸(标准scan mix)或在检测步骤期间使用封闭的、未标记的核苷酸(ScanAndFill mix)。
图7是在40个测序循环中的定相、预定相和％Q30率的条形图，其中在具有另外的聚合酶(Pol1671)或没有另外的聚合酶(无Pol)的情况下，在检测步骤期间使用封闭的、未标记的核苷酸(ScanAndFill)。
图8是在100个测序循环中观察到的信号衰减(P90红色)的图，其中在存在和不存在3mM抗坏血酸盐(其保护DNA免受光学扫描造成的氧化损伤)的情况下，在检测步骤期间使用封闭的、未标记的核苷酸(S&F)。
图9是在100个测序循环中观察到的累积PhiX错误率(％错误，％Q30-插图)的图，其中在存在和不存在3mM抗坏血酸盐的情况下，在检测步骤期间使用封闭的、未标记的核苷酸(S&F)。
示意图不一定按比例绘制。附图中使用的相同数字指代相同的组分，步骤等。然而，将理解的是，在指定附图中使用数字来指代组分并非旨在限制另一附图中用相同数字标记的组分。另外，使用不同的数字来指代组分并非旨在指示不同编号的组分不能与其他编号的组分相同或相似。
具体实施方式
现在将更详细地参考本公开主题的各种实施方案，其中一些实施方案在附图中示出。
除非另有说明，否则本文中使用的所有科学和技术术语具有本领域中通常使用的含义。本文提供的定义是为了促进理解本文中经常使用的某些术语，并不意味着限制本公开的范围。
如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“模板多核苷酸序列”包括具有两个或更多个此类“模板多核苷酸序列”的实例，除非上下文另外明确指出。
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，术语“或”通常以包括“和/或”的意义使用，除非内容另外明确指出。术语“和/或”是指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。在某些情况下使用“和/或”并不意味着在其他情况下使用“或”不能意味着“和/或”。
如本文所用，“具有”，“包括”，“包含”等以其开放式包容性含义使用，并通常意指“包括但不限于”。
“任选”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或组分可能存在或可能不存在，并且该描述包括事件、情况或组分发生的实例，以及事件、情况或组分不发生的实例。
词语“优选”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本公开的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的叙述并不意味着其他实施方案没有用，并且不旨在将其他实施方案排除在本发明技术范围之外。
另外，本文通过端点对数值范围的叙述包括归入该范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。当值的范围“大于”，“小于”等特定值的情况下，该值包括在该范围内。
除非另有明确说明，绝不意图将本文阐述的任何方法解释为要求其步骤以特定顺序进行。因此，在方法权利要求没有实际列举其步骤要遵循的顺序的情况下，或者在权利要求书或说明书中没有以其他方式具体说明步骤应被限制为特定顺序的情况下，绝不意图推断任何特定的顺序。然而，将理解的是，所提出的顺序是可以实施该方法的顺序的一个实施方案。任何一项权利要求中的任何所述单个或多个特征或方面可与任何其他一项或多项权利要求中的任何其他所述特征或方面进行组合或重新排列。
尽管可以使用过渡短语“包含”来公开特定实施方案的各种特征、要素或步骤，但是应理解的是，隐含了替代实施方案，包括可使用过渡短语“由……组成”或“基本上由……组成”来描述的那些实施方案。因此，例如，包括掺入步骤、检测步骤、去保护步骤和一个或多个洗涤步骤的方法的隐含替代实施方案包括其中方法由列举的步骤组成的实施方案和其中方法基本上由所列举的组成的实施方案。
如本文所用，在化合物、组合物或制品的上下文中，“提供”是指制备该化合物、组合物或制品，购买该化合物、组合物或制品，或者以其他方式获得该化合物、组合物或制品。
如本文所用，术语“链延伸酶”是使用多核苷酸作为模板链产生多核苷酸的拷贝副本的酶。例如，链延伸酶可以是具有聚合酶活性的酶。通常，DNA聚合酶与模板链结合，然后沿模板链向下移动，从而依次向核酸的生长链3’末端处的游离羟基基团添加核苷酸。DNA聚合酶通常从DNA模板合成互补DNA分子，而RNA聚合酶通常从DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可使用被称为引物的短RNA或DNA链来开始链生长。一些聚合酶可以置换它们向链中添加碱基的位点上游的链。此类聚合酶被认为是链置换的，意味着它们具有从被聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于大片段的Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))聚合酶，exo-Klenow聚合酶或测序级T7 exo-聚合酶。一些聚合酶降解其前面的链，从而有效地将其替换为后面的生长链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有降解其后面的链的活性(3’核酸外切酶活性)。已经通过突变或其他方式修饰了一些有用的聚合酶，以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物”及其衍生词通常是指可与感兴趣的靶序列杂交的任何多核苷酸。通常，引物起底物的作用，核苷酸可在其上通过聚合酶聚合；然而，在一些实施方案中，引物可掺入到合成的多核苷酸链中并提供可杂交另一个引物的位点，以引发与所合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可由核苷酸或其类似物的任何组合组成。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链-，双链-和单链-脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链-、双链-和单链-核糖核酸(“RNA”)。如本文所用，“扩增的靶序列”及其衍生词通常是指通过使用靶特异性引物和本文提供的方法扩增靶序列而产生的多核苷酸序列。相对于靶序列，所扩增的靶序列可以是有义的(即正链)或反义的(即负链)。
在所提供方法中使用的合适的核苷酸包括但不限于，三磷酸脱氧核苷酸、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)和三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)。任选地，在所提供方法中使用的核苷酸，无论是标记的或未标记的，都可包括抑制链延伸的阻断部分，例如可逆终止子部分。适用于标记的核苷酸上的标记物包括但不限于半抗原、放射性核苷酸、酶、荧光标记、化学发光标记和显色剂。
多核苷酸将通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下核酸类似物可具有替代的主链，包括例如磷酰胺(Beaucage et al.,Tetrahedron 49(10):1925(1993))和其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl et al.,Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger et al.,Nucl.Acids Res.14:3487(1986)；Sawai et al,Chem.Lett.805(1984),Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；和Pauwelset al.,Chemica Scripta 26:141 91986))，硫代磷酸酯(Mag et al.,Nucleic AcidsRes.19:1437(1991)；和美国专利号5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu et al.,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989))，O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)，以及肽核酸主链和连接(参见Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier et al.,Chem.Int.Ed)。其他类似物核酸包括具有正主链(Denpcy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995)；非离子主链(美国专利号5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi et al.,Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991)；Letsinger et al.,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger et al.,Nucleoside&Nucleotide 13:1597(1994)；Chapters 2and3,ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch",Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook；Mesmaeker et al.,Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4:395(1994)；Jeffs et al.,J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；TetrahedronLett.37:743(1996))，以及非核糖主链，包括描述于美国专利号5,235,033和5,034,506,以及Chapters 6and 7,ASC Symposium Series 580,"Carbohydrate Modifications inAntisense Research",Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook中的主链的类似物核酸。包含一种或多种碳环糖的多核苷酸也包括在多核苷酸的定义内(参见Jenkins et al.,Chem.Soc.Rev.(1995)pp169-176)。几种多核苷酸类似物描述于Rawls,C&E News June2,1997page 35中。所有这些参考文献在此明确地通过引用并入。可进行核糖-磷酸主链的这些修饰以促进标记物的添加，或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
多核苷酸通常包含四个核苷酸碱基的特定序列：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)。当核酸是RNA时，还可存在尿嘧啶(U)例如作为胸腺嘧啶的天然替代物。尿嘧啶也可在DNA中使用。多核苷酸还可包括天然或非天然碱基。在这方面，天然脱氧核糖核酸多核苷酸可具有一个或多个选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基，而核糖核酸可具有一个或多个选自尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的碱基。应当理解的是，在本文阐述的方法或组合物中使用的脱氧核糖核酸多核苷酸可包括例如尿嘧啶碱基，而核糖核酸可包括例如胸腺嘧啶碱基。核酸中可包括的示例性非天然碱基，无论具有天然主链还是类似结构，包括但不限于肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤尿嘧啶、15-卤胞嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。任选地，核酸中可包含异胞嘧啶和异鸟嘌呤以减少非特异性杂交，如一般描述于美国专利号5,681,702，其通过引用整体并入本文。
多核苷酸中使用的非天然碱基可具有通用碱基配对活性，使得其能够与任何其他天然存在的碱基进行碱基配对。具有通用碱基配对活性的示例性碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。可以使用的其他碱基包括与天然存在的碱基的子集具有碱基配对活性的那些碱基，如肌苷，其与胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶碱基配对。
将核苷酸掺入多核苷酸链是指通过与核苷酸的5’磷酸基团形成磷酸二酯连接将核苷酸连接至多核苷酸链的游离3’羟基基团。待测序的多核苷酸模板可以是DNA或RNA，或甚至是包括脱氧核苷酸和核糖核苷酸两者的杂合分子。多核苷酸可包括天然存在和/或非天然存在的核苷酸和天然或非天然的主链连接。
本公开尤其描述了多核苷酸测序方法，该方法在减少定相的同时允许掺入标记的核苷酸的短循环时间。方法包括当检测先前添加的标记的核苷酸的身份时，将未标记的核苷酸与具有相同序列的模板多核苷酸链的簇一起温育。检测步骤为添加待掺入拷贝链中的未标记的核苷酸提供了时间，在该拷贝链中来自先前掺入步骤的先前标记的核苷酸未得以掺入。因此，在检测步骤结束时，所有或大部分拷贝链将处于同相，并准备在随后的掺入步骤中掺入适当的标记的核苷酸。
检测步骤倾向于比掺入步骤花费实质上更多的时间，特别是如果检测步骤包括成像。因此，检测步骤可以为核苷酸掺入提供比掺入步骤实质上更多的时间，这可以大大减少由于滞后(lagging)造成的定相。由于掺入滞后拷贝链中的核苷酸是未标记的，因此它们在检测期间不产生信号，并因此不干扰检测。
如全文所讨论，提供了用于测序多核苷酸的改进方法。示例性测序方法描述于例如Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US2008/0108082，其各自通过引用并入本文。高通量或快速测序的一种有用方法是边合成边测序(SBS)。SBS技术包括但不限于Genome Analyzer系统(Illumina Inc.,San Diego,CA)和True Single Molecule Sequencing(tSMS)TM系统(Helicos BioSciences Corporation,Cambridge,MA)。简而言之，通过合成反应进行的许多测序用于阐明靶序列内靶位置多个碱基的身份。所有这些反应均依赖于使用具有至少两个结构域的靶核酸序列；将与测序引物杂交的第一结构域，以及期望序列信息的相邻的第二结构域。在形成测定复合物后，使用延伸酶将三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)添加至与第一结构域杂交的测序引物，并读取每次添加的dNTP以确定所添加的dNTP的身份。这可能会进行许多循环。SBS技术，例如Genome Analyzer系统(Illumina Inc.,San Diego,CA)和True Single Molecule Sequencing(tSMS)TM系统(Helicos BioSciences Corporation,Cambridge,MA)，利用标记的核苷酸来确定靶核酸分子的序列。靶核酸分子可与引物杂交，并在聚合酶和含有封闭基团的标记核苷酸的存在下温育。延伸引物使得核苷酸被掺入。封闭基团的存在仅允许一轮掺入，即单个核苷酸的掺入。标记物的存在允许鉴定所掺入的核苷酸。可在每个循环期间添加多个同类单个核苷酸碱基，例如使用于True Single Molecule Sequencing(tSMS)TM系统(Helicos BioSciencesCorporation,Cambridge,MA)，或可选择地，可在每个循环期间同时添加所有四种核苷酸碱基，例如使用于Genome Analyzer系统(Illumina Inc.,San Diego,CA)，尤其是当每种碱基都与可区别的标记物缔合时。在通过其相应的标记物鉴定所掺入的核苷酸后，可去除标记物和封闭基团两者，从而允许随后一轮的掺入和鉴定。在一些实施方案中，确定所添加核苷酸碱基的身份包括将新添加的标记的碱基重复暴露于由于添加了特定的核苷酸碱基即dATP、dCTP、dGTP或dTTP而能诱导可检测的发射的光源。本文公开的方法和组合物对于此类SBS技术特别有用。此外，本文所述的方法和组合物对于从核酸阵列测序可能是特别有用的，其中可从阵列上的多个位置同时读取多个序列，因为可基于其可鉴别的标记来鉴别每个位置的每个核苷酸。示例性方法描述于US 2009/0088327；US 2010/0028885；和US 2009/0325172，其各自通过引用并入本文。
现在参考图1-2，显示了测序方法的实施方案的概述。该方法包括将第一链延伸酶和封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到包含多个具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链的位点(100)。基于与拷贝多核苷酸链相对应的模板链的序列，将第一链延伸酶配置为将适当的封闭的、标记的核苷酸中的一个掺入拷贝多核苷酸链中。在核苷酸掺入的第一轮期间或之前，可以将多核苷酸引物与模板链杂交，以促进从预定的起始位置进行测序。
在“掺入步骤”中，将封闭的、标记的核苷酸与模板链和链延伸酶温育一段时间。掺入步骤可以采取任何合适的时间量。随着掺入步骤时间的增加，定相趋于减少，因为提供了足够的时间将封闭的、标记的核苷酸掺入拷贝链中。然而，较长的掺入步骤阻止了加快测序的共同目标。
尽管许多当前的测序方法提供了足够长的掺入步骤时间以将定相降低到足够低的水平，以在运行的循环数中提供可接受的错误率，但是在一些实施方案中，本发明的方法可以在掺入步骤期间适应更高水平的定相，因为在检测步骤期间可能发生定相的校正。
本文描述的方法的一个优点是，掺入步骤的时间可以减少到导致先前不可接受的定相水平的水平，因为滞后拷贝链可以在检测步骤期间被带回相位(phase)。通过减少掺入步骤的时间，整个测序过程的时间可以减少。
在一些实施方案中，包含封闭的、标记的核苷酸的混合物的组合物与模板多核苷酸温育的时间为1秒和60秒之间，如5秒至45段，或10秒至30秒。在一些实施方案中，包含封闭的、标记的核苷酸的混合物的组合物与模板多核苷酸的时间为15秒或更少，如10秒或更少，或7.5秒或更少。
优选地，掺入步骤足够长，以允许在足够数量的拷贝链中掺入封闭的、标记的核苷酸，以在检测步骤期间产生可检测的信号。
仍参照图1-2，在掺入步骤中将封闭的、标记的核苷酸与模板链和链延伸酶温育后，可以将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从位点洗去(110)，并将包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到包含多个模板多核苷酸链的位点(120)。在一些实施方案中，引入包含封闭的、未标记的核苷酸混合物的组合物(步骤120)用于将未掺入的封闭的、标记的核苷酸洗去(步骤110)。在一些实施方案中，单独的洗涤步骤(110)的存在可以是优选的。
然后在“检测步骤”中，在存在封闭的、未标记的核苷酸的混合物的情况下，检测在步骤100期间掺入拷贝链中的标记的、封闭的核苷酸的身份(130)。可以将标记的、未封闭的核苷酸掺入到滞后且异相的拷贝链中。也就是说，如果在步骤100期间未将封闭的、标记的核苷酸掺入拷贝链中，则在检测步骤130期间可以将封闭的、未标记的核苷酸掺入，以将滞后拷贝链带回相位。
包含封闭的、未标记的核苷酸的组合物的组分不应实质性地干扰对掺入的标记的核苷酸的身份的检测。例如，如果标记的核苷酸包含荧光标签，则该组合物的组分优选在导致标记的核苷酸产生荧光信号的条件下不产生荧光信号，并且该组合物的组分优选不干扰由标记的核苷酸产生的荧光信号。
在检测步骤期间，包含封闭的、标记的核苷酸的组合物与模板链温育的时间优选足以减少定相。优选地，检测步骤的长度不增加，以允许另外的时间用于掺入封闭的、标记的核苷酸。也就是说，检测步骤的持续时间优选为足以检测在掺入步骤中掺入的封闭的、标记的核苷酸的身份的持续时间。
虽然目前的测序方法可以提供很长的检测步骤，但即使在小于最佳条件下，很可能短得多的检测步骤仍然可以允许对定相进行充分的校正(即，掺入封闭的、未标记的核苷酸)。例如，90秒的检测步骤经常与Illumina MiniSeqTM测序仪一起使用。然而，据信短得多的检测时间可能足以允许核苷酸在检测步骤期间掺入滞后链中。
在一些实施方案中，在检测步骤期间包含封闭的、标记的核苷酸的组合物与模板链温育的时间在5秒和120秒之间，如在10秒和90秒之间。在一些实施方案中，在检测步骤期间，包含封闭的、标记的核苷酸的组合物与模板链温育的时间为120秒或更少，如60秒或更少、30秒或更少、10秒或更少或5秒或更少。在一些实施方案中，在检测步骤期间，包含封闭的、标记的核苷酸的组合物与模板链温育的时间为1秒或更多，如5秒或更多，或10秒或更多。
仍参考图1-2，在步骤140中，该方法可以进一步包括在步骤100中解封闭和解标记任何掺入拷贝链中的标记、封闭的核苷酸，以及在步骤130中解封闭任何掺入拷贝链中的未标记的、封闭的核苷酸。解封闭步骤涉及从拷贝链中最后掺入的核苷酸去除封闭部分，并从最后掺入拷贝链中的核苷酸切割可检测的部分或者在其上进行掩蔽。
洗涤步骤(未显示)可以在步骤130和140之间或在步骤140之后进行，或者两者都进行。
在解封闭和解标记(140)之后，可以重复该过程，直到已运行预定数量的循环或完成测序。或者，可以在不具有链延伸酶的情况下将封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到包含多个模板多核苷酸链的位点(150)，并且可以重复该过程，从步骤110开始。链延伸酶可以保留在该位点。例如，链延伸酶可以与模板链、拷贝链或两者结合，并可以对多个测序循环保持活性。然而，在一些实施方案中，优选将另外的链延伸酶与封闭的、标记的核苷酸的混合物一起引入(100)，因为在解封闭和解标记步骤(140)之后，功能性链延伸酶的量趋于减少。
如图2中步骤125所示，第二链延伸酶(其可以是与步骤100引入的第一链延伸酶相同的酶或不同的酶)可以与包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物一起纳入，并引入到包含多个模板链的位点。图2中的步骤125可以取代图1过程的一个或多个循环中的步骤120。令人惊讶的是，已经发现，若不添加第二链延伸酶(例如，如图1中的步骤120中所示)，与在步骤125若添加第二链延伸酶相比，可能发生较少的定相。
在所提供的方法中，核苷酸掺入和检测的步骤可以重复一次或多次。例如，在一些实施方案中，步骤可以重复至少25次，在其他实施方案中至少75次，并在其他实施方案至少100次。因此，所提供的方法包括但不限于，重复掺入和检测步骤一定循环数，所述循环数在一些实施方案中，在约100个循环至约1000个循环的范围内，在其他实施方案中，在约100个循环至约500个循环的范围内，以及在其他实施方案中，在约100个循环至约300个循环的范围内。
本文所述的测序方法可使用任何合适的设备以任何合适的方式进行。在一些实施方案中，测序方法采用固体支持物，其上固定化有多个模板多核苷酸链。本文所用的术语“固定化”旨在涵盖经由共价或非共价键直接或间接附着于固体支持物。在具体实施方案中，所需要的是在意图使用支持物的条件下，例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中，多核苷酸保持固定化或附着于支持物。例如，可使寡核苷酸或引物固定化，使得3’末端可用于酶促延伸和/或序列的至少一部分能够与互补序列杂交。固定化可通过与表面附着的引物杂交来实现，在这种情况下，固定化的引物或寡核苷酸可以处于3’-5’定向。可选择地，固定化可通过非碱基配对的杂交如共价附着来实现。
举例来说，可通过与引物的斑块(patch)中的一个或多个引物杂交或退火来将多核苷酸附着于表面。杂交可例如通过将衔接子连接至模板多核苷酸的末端来完成。衔接子的核酸序列可与引物的核酸序列互补，因而允许衔接子与表面上的引物结合或杂交。任选地，多核苷酸可以是单链或双链的，并且可将衔接子添加至多核苷酸的5’和/或3’末端。任选地，多核苷酸可以是双链的，并且可将衔接子连接到双链多核苷酸的3’末端上。任选地，可使用没有任何衔接子的多核苷酸。在一些实施方案中，可通过除与互补引物杂交以外的相互作用将模板多核苷酸附着于表面。例如，可使用化学连接将多核苷酸共价附着于表面，所述化学连接例如由点击化学或由诸如链霉抗生物素蛋白-生物素结合的受体-配体相互作用产生的那些化学连接。
引物寡核苷酸、寡核苷酸引物和引物在全文中可互换使用，并且是能够与一种或多种待扩增或测序的多核苷酸模板特异性退火的多核苷酸序列。通常，引物寡核苷酸是单链或部分单链的。引物还可含有非天然碱基、非核苷酸化学修饰或非天然主链连接的混合物，只要非天然实体不干扰引物的功能即可。任选地，固体支持物表面上的引物的斑块可包含一种或多种不同的多个引物分子。举例来说，斑块可包含第一、第二、第三、第四或更多的多个引物分子，每种多个具有不同的序列。将理解的是，对于在单个斑块中具有不同的多个引物的实施方案，不同的多个引物可以共享共有序列，只要不同的多个引物的至少一部分之间存在序列差异。例如，第一多个引物可与第二多个引物共享序列，只要一种多个中的引物具有在另一种多个中的引物中未发现的不同序列。
模板多核苷酸可在固体支持物的表面上扩增。多核苷酸扩增包括通过产生模板和/或其互补物的一个或多个拷贝来扩增存在的多核苷酸模板和/或其互补物或者增加其数目的过程。扩增可通过多种已知方法在包括但不限于热循环扩增或等温扩增的条件下进行。例如，用于进行扩增的方法描述于美国公开号2009/0226975；WO 98/44151；WO 00/18957；WO 02/46456；WO 06/064199；和WO 07/010251；其通过引用整体并入。简而言之，在所提供的方法中，扩增可发生在多核苷酸分子所附着的表面上。这种类型的扩增可被称为固相扩增，当用于提及多核苷酸时，其是指在表面(例如，固相支持物)上进行或与表面有关的任何多核苷酸扩增反应。通常，所扩增产物的全部或部分通过固定化引物的延伸来合成。固相扩增反应类似于标准溶液相扩增，不同之处在于扩增引物中的至少一种固定于表面(例如固体支持物)。
合适的条件包括提供用于扩增多核苷酸的合适的缓冲液/溶液。此类溶液包括，例如具有聚合酶活性的酶，三磷酸核苷酸，以及任选地，诸如DMSO或甜菜碱的添加剂。任选地，如美国专利号7,485,428(通过引用整体并入本文)中所述，扩增在存在重组酶试剂的情况下实施，其允许在没有热解链的情况下进行扩增。简而言之，诸如来自大肠杆菌的RecA蛋白(或来自其他门的RecA亲缘物)的重组酶试剂，在存在例如ATP、dATP、ddATP、UTP或ATPγS的情况下，将在单链DNA(例如引物)周围形成核蛋白丝。当该复合物与同源序列接触时，重组酶试剂将催化链侵入反应，并将引物与靶DNA的同源链配对。最初的配对链因链侵入而被置换，在该区域中留下单链DNA泡(bubble)，其用作扩增的模板。
固相扩增可包括包含仅一个种类的固定化于表面的寡核苷酸引物的多核苷酸扩增反应。可选择地，该表面可包含多个第一和第二不同的固定化的寡核苷酸引物种类。固相核酸扩增反应通常包括两种不同类型的核酸扩增中的至少一种，即界面和表面(或桥式)扩增。例如，在界面扩增中，固体支持物包含通过与固定化寡核苷酸引物杂交而间接固定化于固体支持物的模板多核苷酸，固定化引物可在聚合酶催化的模板指导的延长反应过程中延伸(例如引物延伸)，以产生保持附着于固相支持物的固定化多核苷酸。在延伸阶段之后，使多核苷酸(例如，模板及其互补产物)变性，使得模板多核苷酸被释放到溶液中并且可用于与另一固定化寡核苷酸引物杂交。模板多核苷酸可在1、2、3、4、5或更多轮引物延伸中获得，或者可在1、2、3、4、5或更多轮引物延伸后从反应物洗出。
在表面(或桥式)扩增中，固定化的多核苷酸与固定化寡核苷酸引物杂交。固定化的多核苷酸的3’末端为从固定化寡核苷酸引物延伸的聚合酶催化的模板指导的延长反应(例如，引物延伸)提供了模板。所产生的双链产物“桥连”两条引物，并且两条链共价附着于支持物。在下一个循环中，变性后产生一对固定化于固体支持物的单链(固定化模板和延伸引物产物)，两条固定化的链都可用作新引物延伸的模板。
可将扩增用于产生固定化多核苷酸的克隆。例如，该方法可产生多核苷酸克隆的簇状阵列，类似描述于美国专利号7,115,400；美国公开号2005/0100900；WO 00/18957；和WO 98/44151中的那些，其通过引用整体并入本文。“簇”和“克隆”可互换使用，并且是指附着于表面具有相同序列和/或其互补物的多核苷酸的多个拷贝。通常，簇包含具有相同序列和/或其互补物的多核苷酸的多个拷贝，其通过其5’端附着于表面。组成簇的多核苷酸拷贝可以是单链或双链的形式。
因此，多个模板多核苷酸可处于簇中，每个簇包含相同序列的模板多核苷酸。可对多个簇进行测序，每个簇包含相同序列的多核苷酸。任选地，第一簇中的多核苷酸的序列不同于第二簇中的核酸分子的序列。任选地，簇通过将模板多核苷酸与固体表面上的引物退火，并在形成包含多个相同序列的模板多核苷酸的簇的条件下扩增模板多核苷酸来形成。扩增可以是加热或等温的。
每个克隆可包含相同序列的多核苷酸。在具体实施方案中，一个克隆的多核苷酸的序列不同于另一克隆的多核苷酸的序列。因此，每个克隆包含具有不同核酸序列的多核苷酸。克隆中所有固定化的多核苷酸通常通过扩增相同的多核苷酸来产生。在一些实施方案中，固定化多核苷酸的克隆可能包含一种或多种不具有固定化的多核苷酸的引物，在另外施加含有游离或未结合多核苷酸的溶液时，另一种不同序列的多核苷酸可与该固定化的多核苷酸结合。然而，由于克隆中没有足够数量的游离引物，该第二或侵入的多核苷酸可能无法扩增至显著数量。第二或侵入的多核苷酸通常小于单个克隆中多核苷酸总群体的1、0.5、0.25、0.1、0.001或0.0001％。因此，第二或侵入的多核苷酸可能无法被光学检测到，或者第二或侵入的多核苷酸的检测被认为是背景噪音，或不干扰克隆中原始固定化的多核苷酸的检测。在此类实施方案中，根据用于检测克隆的方法或装置的分辨率，克隆将显然是同质的或均匀的。
取决于所使用的条件，簇可以具有不同的形状、大小和密度。例如，簇可以具有基本上为圆形、多边形、圆环形或环形的形状。簇的直径或最大横截面可以为约0.2μm至约6μm，约0.3μm至约4μm，约0.4μm至约3μm，约0.5μm至约2μm，约0.75μm至约1.5μm，或任何介于中间的直径。任选地，簇的直径或最大横截面可以为至少约0.5μm，至少约1μm，至少约1.5μm，至少约2μm，至少约2.5μm，至少约3μm，至少约4μm，至少约5μm或至少约6μm。簇的直径可受许多参数影响，包括但不限于产生簇中进行的扩增循环数、多核苷酸模板的长度、多核苷酸模板的GC含量、引物附着的斑块形状、或附着至形成簇的表面的引物的密度。然而，如上所述，在所有情况下，簇的直径将不大于在其上形成簇的斑块。例如，如果斑块是珠子，则簇的大小将不大于珠子的表面积。簇的密度范围可以为至少约0.1/mm2,至少约1/mm2,至少约10/mm2,至少约100/mm2,至少约1,000/mm2,至少约10,000/mm2至至少约100,000/mm2。任选地，簇具有例如100,000/mm2至1,000,000/mm2或1,000,000/mm2至10,000,000/mm2的密度。本文提供的方法可产生大小大致相等的克隆。这与不同序列的多核苷酸的扩增效率的差异无关。
簇，例如可以使用合适的成像手段如共聚焦成像设备或电荷耦合设备(CCD)或CMOS摄像机来检测。示例性成像装置包括但不限于描述于美国专利号7,329,860；5,754,291；和5,981,956；以及WO 2007/123744中的那些，其各自通过引用整体并入本文。可将成像设备用于确定表面上一个簇或多个簇的参考位置，例如一个或多个簇的位置、边界、直径、面积、形状、重叠和/或中心(和/或由此产生的可检测信号)。此类参考位置可被记录、归档、注释、转换为可解释的信号等，以产生有意义的信息。
如本文所用，术语支持物是指用于附着多核苷酸的基底。支持物是具有刚性或半刚性表面的材料，可将多核苷酸附着于其上或核酸可在其上被合成和/或修饰。支持物可包括任何树脂、凝胶、珠、孔、柱、芯片、流动池、膜、基质、板、过滤器、玻璃、可控孔玻璃(CPG)、聚合物支持物、膜、纸、塑料、塑料管或片、塑料珠、玻璃珠、玻片、陶瓷、硅芯片、多孔板、尼龙膜、光纤和PVDF膜。
支持物可以包括任何平的晶片状基底和具有孔的平基底，例如微量滴定板，包括96孔板。示例性平基底包括芯片、载玻片、蚀刻基底、微量滴定板和流动池反应器，包括具有多个微流体通道的多泳道流动池反应器，例如cBot测序工作站中使用的八通道流动池(Illumina,Inc.,San Diego,CA)。示例性流动池描述于WO 2007/123744，其通过引用整体并入本文。任选地，流动池是图案化(patterned)流动池。合适的图案化流动池包括但不限于WO2008/157640(其通过引用整体并入本文)中描述的流动池。
支持物还可以包括珠子，包括磁性珠、空心珠和固体珠。珠子可与平的支持物结合使用，此类平的支持物任选地还含有孔。珠子或可选择地微球，通常是指由刚性或半刚性材料制成的小物体。该物体可以具有特征为，例如球形、椭圆形、微球形或无论具有规则或不规则尺寸的其他公认的颗粒形状的形状。珠子的大小特别包括但不限于直径为约1μm、约2μm、约3μm、约5μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约60μm、约100μm、约150μm或约200μm。可以与本文针对珠子和微球所描述的那些相似的方式使用其他颗粒。
支持物的组成可根据例如形式，化学和/或附着方法和/或核酸合成方法而变化。可根据本公开使用的支持物材料包括但不限于聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、尼龙、金属和其他合适的材料。示例性组合物包括在多肽、多核苷酸和/或有机部分合成中使用的支持物和赋予其的化学功能。此类组合物包括，例如塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、三聚氰胺、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联葡聚糖如SepharoseTM、纤维素、尼龙、交联胶束和TeflonTM、以及描述于例如来自Bangs实验室(Fishers IN)的“Microsphere Detection Guide”的任何其他材料，该文献通过引用并入本文。支持物颗粒可由交联淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物，其包括苯乙烯聚合物(包括聚苯乙烯和甲基苯乙烯)以及其他苯乙烯共聚物、塑料、玻璃、陶瓷、丙烯酸聚合物、磁响应性材料、胶体、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、尼龙、乳胶或
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来自Bangs实验室(Fishers,Inc.)的“Microsphere Detection Guide”是有用的指南，其在此通过引用整体并入。本公开范围内的其他示例性支持物包括，例如描述于美国申请公开号02/0102578和美国专利号6,429,027(两者均通过引用整体并入本文)中的那些。
例如并且参考图3，显示了固体支持物200的实施方案，如流动池。固体支持物200具有表面210，含有多个具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链的簇300与该表面210结合。固体支持物200的表面210可以是平坦的。
含有试剂、洗涤缓冲液等的流体组合物可以在固体支持物200的表面210上流动，以与簇300中的模板多核苷酸相互作用。组合物的流动可以沿任何方向发生，如图3中箭头所示的方向。
可以与流动池300一起使用的测序装置可以配置为使试剂和组合物流过表面210以与簇300中的模板链相互作用。例如，该装置可以引起链延伸酶、测序引物、核苷酸、洗涤组合物、解封闭试剂、解标记试剂等流过固体支持物200(如流动池)的表面210，以在适当的时间与簇300中的模板多核苷酸相互作用以进行模板链的测序。
每个簇300可以含有与另一个簇300相同的模板多核苷酸或不同的多核苷酸。
待测序的模板多核苷酸可使用已知的常规方法从任何生物样品获得。合适的生物样品包括但不限于血液样品、活检标本、组织外植体、器官培养物、生物流体或任何其他组织或细胞制品，或其部分或衍生物或从中分离。生物样品可以是原代细胞培养物或经培养适应的细胞系，包括但不限于可包含染色体整合或游离型重组核酸序列的基因工程改造的细胞系、已永生化或可永生化的细胞系、体细胞杂交细胞系、已分化或可分化的细胞系、转化的细胞系、干细胞、生殖细胞(如精子、卵母细胞)、转化的细胞系等。例如，多核苷酸分子可获自原代细胞、细胞系、新鲜分离的细胞或组织、冷冻的细胞或组织、石蜡包埋的细胞或组织、固定的细胞或组织、和/或激光切割的细胞或组织。生物样品可获自任何受试者或生物来源，包括例如人类或非人类动物，包括哺乳动物和非哺乳动物、脊椎动物和无脊椎动物，也可以是任何多细胞生物体或单细胞生物体，例如真核生物体(包括植物和藻类)或原核生物体、古细菌(archaeon)、微生物(例如细菌、古生菌(archaea)、真菌、原生生物、病毒)和水生浮游生物。
一旦获得了多核苷酸，就可使用各种可获得且已知的标准技术来制备在所提供方法中使用的不同序列的多种多核苷酸分子。多核苷酸分子制备的示例性方法包括但不限于Bentley et al.,Nature 456:49-51(2008)；美国专利号7,115,40；和美国专利申请公开号2007/0128624；2009/0226975；2005/0100900；2005/0059048；2007/0110638；和2007/0128624中描述的那些，其各自通过引用整体并入本文。模板多核苷酸可包含多种序列，包括但不限于通用序列和已知或未知序列。例如，多核苷酸可包含位于5’和/或3’末端的已知序列的一个或多个区域(例如，衔接子)。此类模板多核苷酸可通过将衔接子附着于未知序列的多核苷酸的末端来形成。当多核苷酸在5’和3’末端上包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。任选地，位于多核苷酸5’和/或3’末端的已知序列能够与固定化于表面的一个或多个引物杂交。例如，包含5’已知序列的多核苷酸可与第一多个引物杂交，而3’已知序列可与第二多个引物杂交。任选地，多核苷酸包含一个或多个可检测的标记物。一个或多个可检测的标记物可在多核苷酸分子内的5’末端、3’末端和/或任何核苷酸位置附着于多核苷酸模板。在所提供方法中使用的多核苷酸可包含待扩增和/或测序的多核苷酸，以及任选地5’末端和/或3’末端的短核酸序列。
添加到多核苷酸5’末端和/或3’末端的短核酸序列可以是通用序列。通用序列是两种或更多种多核苷酸共有的，即由两种或更多种多核苷酸共享的，核苷酸序列的区域，其中两种或更多种多核苷酸也具有序列差异区域。可存在于多种多核苷酸的不同成员中的通用序列可允许使用与通用序列互补的单一通用引物来复制或扩增多种不同序列。类似地，可存在于多核苷酸集合的不同成员中的至少一个、两个(例如，一对)或更多个通用序列可允许使用与通用序列互补的至少一个、两个(例如，一对)或更多个单一通用引物来复制或扩增多种不同序列。因此，通用引物包括可与此类通用序列特异性杂交的序列。多核苷酸可被修饰以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)附着至不同靶序列的一个或两个末端，所述衔接子为通用引物的杂交提供位点。该方法的优点在于不必为待产生、扩增、测序和/或以其他方式分析的各个多核苷酸设计特定的引物对；可使用单一引物对扩增不同的多核苷酸，条件是每个多核苷酸均通过在其5’末端和3’末端添加相同的通用引物结合序列进行修饰。
使用标准的已知方法，多核苷酸也可被修饰以包括任何期望的核酸序列。此类另外的序列可包括，例如限制性内切酶位点或索引标签，以允许鉴定给定核酸序列的扩增产物。
如本文所用，术语不同的用于提及两种或更多种多核苷酸时，是指两种或更多种多核苷酸具有不相同的核苷酸序列。例如，两种多核苷酸的不同之处可以在于与另一种多核苷酸相比的一种多核苷酸序列中的含量和核苷酸的顺序。该术语可用于描述多核苷酸，无论它们被称为拷贝、扩增子、模板、靶标、引物、寡核苷酸等。
现在参考图4A-G，显示了说明测序方法的一个实施方案的示意图。所描绘的实施方案说明了定相的问题，以及该方法如何解决该问题。在图4A-G中，显示了多个具有相同序列的多核苷酸400。多核苷酸400可以在其3’或5’末端与固体支持物的表面结合。例如，如图3中所示，多核苷酸可以与流动池200上的簇300的表面210结合。
图4A显示了开始测序之前的模板多核苷酸400。图4B显示了在第一轮测序期间，如在图1-2的洗涤步骤110之后，将单个封闭的、标记的核苷酸510掺入拷贝链590中。为了方便和清楚起见，未显示在洗涤步骤后可能保留在模板多核苷酸400上的链延伸酶。在一些实施方案中，可以使用与模板序列的一部分互补的引物多核苷酸(未显示)来促进核苷酸510的掺入。在图4B中描绘的实施方案中，对于五个模板多核苷酸400中的四个，将封闭的、标记的核苷酸510掺入拷贝链590中。在没有更多的情况下，其中没有掺入封闭的、标记的核苷酸510的链将是异相的。
然而，如图4C中所示，如果在检测封闭的、标记的核苷酸510的身份期间(例如图1-2的步骤130)，将封闭的、未标记的核苷酸(例如图1或图2的步骤120或125)与模板多核苷酸400温育，则可以将封闭的、未标记的核苷酸515掺入滞后链中，以在下一个测序循环之前将滞后链带入相位。如上所述，可以通过链延伸酶(未显示)掺入封闭的、未标记的核苷酸515，该链延伸酶在洗涤步骤(例如图1-2的步骤110)后残留的链延伸酶或与未封闭的、未标记的核苷酸的混合物一起引入(例如图2的步骤125)。然后，在核苷酸510的情况下，可以将掺入的核苷酸510、515解封闭和解标记(例如图1-2的步骤140)，并进行另一个测序循环。
图4D显示了在第二测序循环中的掺入步骤(如图1-2的步骤100)和洗涤步骤(如图1-2的步骤110)之后，将第二封闭的、标记的核苷酸520掺入拷贝链590中。在图4D中描绘的实施方案中，对于五个模板多核苷酸400中的四个，将封闭的、标记的核苷酸520掺入拷贝链590中。在没有更多的情况下，其中没有掺入封闭的、标记的核苷酸510的拷贝链590将是异相的。
然而，如图4E中所示，如果在检测封闭的、标记的核苷酸520的身份期间(例如，图1-2的步骤130)，将封闭的、未标记的核苷酸(例如，图1或图2的步骤120或125)与模板多核苷酸400温育，则可以将封闭的、未标记的核苷酸525掺入滞后链中，以在下一个测序循环之前将滞后链带入相位。在核苷酸520的情况下，可以将掺入的核苷酸520、525解封闭和解标记(例如图1-2的步骤140)，并可以进行另一个测序循环。
图4F说明了另一个测序循环，其中在掺入步骤之后将封闭的、标记的核苷酸530掺入五个拷贝链590中的四个。图4G说明了将封闭的、未标记的核苷酸535掺入滞后链中，以在下一个测序循环之前将滞后链带入相位。在如图4G中所示的三个测序循环之后，所有拷贝链590均处于同相。然而，在没有在检测步骤期间温育封闭的、未标记的核苷酸的情况下，在图示的实施方案中，五个链中的三个将是异相的。在60％的拷贝链异相的情况下，在检测步骤期间产生的信号将可能太不均匀以致于无法正确鉴别适当的核苷酸(由于掺入了不同的标记的核苷酸)。
虽然图4A-G中呈现的图是示意性的，但它们说明了几个关键点。例如，小的定相速率在多个测序循环中可以是复合的。然而，由于一轮掺入后滞后链的数量相对较低，因此在检测期间通过掺入未标记的核苷酸将滞后拷贝链带入相位不需要大量的链延伸活性。因此，对于未标记的核苷酸的掺入，可以容忍掺入未标记的核苷酸的小于最佳条件。因此，可以容忍不意图优化链延伸酶的效率和准确性的条件。
可以使用任何合适的包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含具有约8至约10，如约9至约9.5的pH的缓冲溶液。可以使用任何合适的缓冲液，如Tris缓冲液。封闭的、未标记的核苷酸可以以任何合适的浓度存在，如约0.001至约15μM，如约0.5μM至约5μM，例如约2μM。该组合物可以包含任何合适量的螯合剂，如约0mM至约5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，或约0mM至约2mM EDTA，或约0mM至约1mM EDTA。该组合物可以包含任何合适量的硫酸镁，如约1mM至约10mM MgSO4，约2mM至约6mM MgSO4，或约4mM MgSO4。该组合物可以包含任何合适量的去污剂。例如，该组合物可以包含约0.05％至约1％(重量)的去污剂，如约0.1％至约0.5％(重量)的去污剂，或约0.2％(重量)的去污剂。可以使用任何合适的去污剂。例如，可以使用聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(也称为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，或Tween)或3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸水合物(CHAPS)去污剂。该组合物可以包含任何合适量的抗氧化剂。例如，该去污剂可以包含一种或多种抗氧化剂，其组合总抗氧化剂浓度为约1mM至约50mM，如约2mM至约40mM，约3mM至约20mM，或约15mM至约25mM。合适的抗氧化剂包括抗坏血酸盐、香草乙酮和Trolox。优选地，该组合物不含标记的核苷酸。
在一些实施方案中，包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物包含Tris缓冲液，具有约9至约9.5的pH，具有去污剂、MgSO4、EDTA、抗坏血酸盐和香草乙酮。例如，该组合物可一包括如下表1中所述的组分。
试剂 浓度
Tris缓冲液 200mM
pH 9至9.5
封闭的、未标记的核苷酸 各2μM
CHAPS 0.2％(重量)
MgSO<sub>4</sub> 4mM
EDTA 0至1mM
抗坏血酸盐 3至20mM
香草乙酮 10至15mM
公开了可用于所公开方法和组合物的材料、组合物和组分，可与所公开方法和组合物联合使用的材料、组合物和组分，可用于制备所公开方法和组合物的材料、组合物和组分，或作为所公开方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。在本文中公开了这些材料和其他材料，并且应当理解的是，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，尽管可能没有明确地公开每个单独的和集体的组合和排列的具体参考，但是每个都是在本文中具体考虑和描述。例如，如果公开并讨论了方法并讨论了可对方法步骤进行的许多修改，则除非有相反的明确指示，否则具体考虑了方法步骤的每一个组合和排列以及可能的修改。同样地，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。该概念适用于本公开的所有方面。因此，如果可进行多种另外的步骤，则应当理解的是，这些另外的步骤中的每一个都可以用所公开方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且每个此类组合或组合的子集被具体考虑并且应当被认为是公开的。
在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体在此并入本申请。
实施例
实施例1.定相的增加与掺入时间的减少相关
为了了解减少的掺入时间对定相和错误率的影响，使用Illumina MiniSeqTM测序仪使用不同的掺入时间对已知序列的多肽进行测序。具体而言，掺入时间为46秒、23秒和12秒。定相和错误率之间的相关性如图5中所示。如所示，错误率和定相在长的掺入时间(46秒)保持较低。然而，随着掺入时间减少(例如12秒)，定相和错误率增加。因此，掺入时间的减少倾向于导致定相和错误率的增加。
实施例2.在检测期间用封闭的、未标记的核苷酸在减少的掺入时间时降低的定相
为了评估在检测步骤期间与封闭的、未标记的核苷酸和聚合酶温育是否影响定相和错误率，使用Illumina MiniSeqTM测序仪对已知序列的多核苷酸进行测序，在检测步骤期间使用(i)制造商的scan mix(无封闭的、未标记的核苷酸且无聚合酶—“标准试剂”)，以及(ii)包括封闭的、未标记的核苷酸和聚合酶的修改的scan mix[“ScanAndFill”]。ScanAndFill mix包括聚合酶Pol812。使用掺入时间25秒和7.5秒与标准scan mix和掺入时间7.5秒与ScanAndFill mix和ScanAndFill mix运行80个测序循环。测定了各个循环的错误率、定相和预定相(其中拷贝链掺入同相(in-phase)拷贝链外的一个另外的核苷酸)。结果呈现于图6和下面的表2中。
表2.错误率、定相和预定相。
Scan Mix 掺入时间 密度 ％PF ％比对 定相 预定相 ％错误
标准试剂 2x 25s 122 95.6 99.2 0.07 0.08 0.13
标准试剂 2x 7.5s 122 95.6 99.2 0.65 0.04 0.86
ScanAndFill 2x 7.5s 133 92.5 97.9 0.10 0.09 0.35
如图6和表2中所示，ScanAndFill mix的使用产生了与基线(标准试剂在2x25秒下)略微相当的度量，而将每循环的总化学时间减少约32％(112秒至77秒)。如表2中所示，错误率的降低似乎是由于定相的减少。
实施例3.在没有另外的聚合酶的情况下，在检测期间，用封闭的、未标记的核苷酸在减少掺入时间时降低的定相
为了评估ScanAndFill mix中添加的聚合酶对定相、预定相和错误率的影响，在检测步骤期间使用有聚合酶和无聚合酶的ScanAndFill mix，使用Illumina MiniSeqTM测序仪对已知序列的多核苷酸进行测序。ScanAndFill mix是相同的，除了具有聚合酶的mix包括60μg/ml Pol1671，其描述于2018年10月31日提交的题为“Polymerases,compositions,andmethods of use”的临时美国专利申请号62/753,558中，其全部内容通过引用并入本文。ScanAndFill mix的其他组分是EA缓冲液；pH 9.85；MgSO4；EDTA；A、C和T核苷酸三磷酸盐，其经修饰以包括例如描述于美国公布的专利申请号2013/0079232和2016/0040225中的具有可切割的LN3接头的荧光染料(A-LN3、C-LN3和T-LN3)；Dark(未标记)G和CHAPS。使用7.5秒的掺入时间。计算各个循环的Q30、定相和预定相值。“Q30”是指通过Q30质量过滤器(即错误率小于或等于1/1000，或0.1％)的读段的百分比。结果呈现在图7中。
如所示，在存在和不存在添加的聚合酶的的情况下，定相仍然很低，这表明来自掺入步骤的聚合酶在检测步骤期间仍然保持活性和存在。令人惊讶的是，在不存在另外的聚合酶的情况下，观察到较低的定相率。总的错误率降低了，如较高的Q30值所反映，定相和预定相的速率也降低了。
实施例4.添加抗氧化剂进一步减少错误率和信号衰减
为了评估在ScanAndFill mix(无聚合酶)中添加的抗氧化剂对检测步骤信号衰减和测序错误率的影响，在检测步骤期间使用无聚合酶以及具有或不具有3mM抗坏血酸盐的ScanAndFill mix，使用Illumina MiniSeqTM测序仪对已知序列的多核苷酸进行测序。ScanAndFill mix包括EA缓冲液，pH 9.85，MgSO4，EDTA，A-LN3，C-LN3，T-LN3，Dark G和CHAPS。使用7.5秒的掺入时间运行100个测序循环，并将其与使用标准scan mix与每循环25秒掺入时间的基线进行比较。结果如图8-9中所示。
抗坏血酸盐的添加导致相对于没有抗坏血酸盐的ScanAndFill，信号衰减减少(图8)和错误率的降低(图9)得到大幅改善。添加抗氧化剂能够实现大于75个循环的读段长度。如图9插图中所示，抗坏血酸盐也改善了％Q30。此外，抗坏血酸盐还改善了％比对PhiX。
用其他浓度的抗坏血酸盐(高达20mM)、不同浓度的香草乙酮(高达20mM)以及抗坏血酸盐和香草乙酮的组合也观察到类似的结果(数据未显示)。
此外，可以改变pH，并且可以获得类似的结果。
已经描述了多个实施方案。然而，将理解，可以进行各种修改。因此，其他实施方案也在所附权利要求的范围内。

Claims (15)

1.多核苷酸测序方法，其包括：
(a)将第一链延伸酶和封闭的、标记的核苷酸的混合物引入到包含位点的流动池，在所述位点处多条具有相同核苷酸序列的模板多核苷酸链与所述流动池的表面结合，其中所述第一链延伸酶配置为基于与拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列将所述封闭的、标记的核苷酸中的合适的一个核苷酸掺入所述拷贝多核苷酸链中；
(b)将未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去；
(c)在所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去期间或之后，将包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池，其中所述封闭的、未标记核苷酸的混合物的封闭的、未标记的核苷酸可用于基于与所述拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列掺入所述拷贝多核苷酸链中，条件是如果有的话，所述拷贝链中先前掺入的核苷酸未被封闭；和
(d)在将所述封闭的、未标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育时，如果有的话，检测掺入所述拷贝链中的一个封闭的、标记的核苷酸的身份。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之后，将所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去包括将所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物引入到所述流动池。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中当检测掺入所述拷贝链中的所述第一封闭的、标记的核苷酸的身份时，所述封闭的、未标记的核苷酸的混合物的所述封闭的、未标记的核苷酸可用于掺入所述拷贝多核苷酸链中。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份包括对所述流动池进行成像。
6.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份发生在120秒或更少的时间段内。
7.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述检测掺入所述拷贝链中的第一封闭的、标记的核苷酸的身份发生在10秒或更多的时间段内。
8.根据权利要求1至7中的任一项的方法，其进一步包括：
(e)从掺入所述拷贝链中的任何第一标记的、封闭的核苷酸去除标记物和封闭部分，并从掺入所述拷贝链中的任何第二封闭的、未标记的核苷酸去除封闭部分。
9.根据权利要求8的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(d)。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育15秒或更少。
11.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育10秒或更少。
12.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中在将所述未掺入的封闭的、标记的核苷酸从所述流动池洗去之前，将所述第一链延伸酶和所述封闭的、标记的核苷酸的混合物与所述流动池一起温育7.5秒或更少。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物包含第二链延伸酶，所述第二链延伸酶配置为基于与所述拷贝多核苷酸链相对应的所述模板链的序列将所述封闭的、未标记的核苷酸中的合适的一个核苷酸掺入所述拷贝多核苷酸链中，条件是如果有的话，所述拷贝链中先前掺入的核苷酸未被封闭。
14.根据权利要求13的方法，其中所述第一链延伸酶和所述第二链延伸酶是相同的酶或不同的酶。
15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中所述包含封闭的、未标记的核苷酸的混合物的组合物具有9至9.5的pH，并且包含缓冲液、去污剂、硫酸镁、EDTA和抗氧化剂。
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