JP2018000057A - Dnaプローブの作製方法及びdnaプローブを用いたゲノムdna解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程とを含む。
【選択図】図1
Description
(1)ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程とを含むDNAプローブの作製方法。
(2)上記ランダムプライマーを用いて複数の異なるゲノムDNAからそれぞれDNA断片を取得し、当該DNA断片に関する塩基配列に基づいて、これらゲノムDNAの間で相違する領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(3)上記DNA断片の塩基配列を既知の塩基配列と比較し、既知の塩基配列と異なる領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(4)上記反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(5)上記反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(6)上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(7)上記DNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする(1)記載のDNAプローブの作製方法。
(8)上記(1)乃至(7)いずれか記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片とを接触させる工程と、上記DNAプローブと上記DNA断片とのハイブリダイズを検出する工程とを含むゲノムDNA解析方法。
(9)上記解析対象のゲノムDNAと上記ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により上記DNA断片を取得する工程を更に含むことを特徴とする(8)記載のゲノムDNA解析方法。
(10)上記ゲノムDNA由来のDNA断片はDNAマーカーであり、上記DNAプローブにより当該DNAマーカーの存否を検出することを特徴とする(8)記載のゲノムDNA解析方法。
(11)上記(1)乃至(7)いずれか記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、当該DNAプローブを固定した担体とを有するDNA解析装置。
(12)上記担体は基板又はビーズであることを特徴とする(10)記載のDNA解析装置。
DNAライブラリーを作製する際に使用できるランダムプライマーとしては、その配列には何ら限定されず、例えば9〜30塩基長のヌクレオチドを使用することができる。特に、ランダムプライマーとは、任意の配列を有する、9〜30塩基長のヌクレオチドであって、ヌクレオチドの種類(配列の種類)は特に限定されず、1種類以上のヌクレオチド、好ましくは1〜10000種類のヌクレオチド、より好ましくは1〜1000種類のヌクレオチド、より好ましくは1〜100種類のヌクレオチド、最も好ましくは1〜96種類のヌクレオチドを意味する。ランダムプライマーとして上述の範囲のヌクレオチド(ヌクレオチド群)を使用することによって、より高い再現性で増幅核酸断片を得ることができる。なお、ランダムプライマーとして、複数のヌクレオチドを含む場合、全てのヌクレオチドが同じ塩基長(9〜30塩基長)である必要はなく、異なる塩基長の複数のヌクレオチドを含んでいても良い。
DNAライブラリーを作製するに際、上述したランダムプライマー及び鋳型としてゲノムDNAを用いた核酸増幅反応によって、多数のDNA断片を取得する。特に、核酸増幅反応において、反応液中のランダムプライマーの濃度を、通常の核酸増幅反応におけるプライマー濃度と比較して高濃度とする。これにより、高い再現性を達成しながら多数のDNA断片をゲノムDNAを鋳型として得ることができる。これにより、得られた多数のDNA断片は、遺伝子型判定等に利用できるDNAライブラリーとして使用することが可能となる。
本発明においてDNAプローブとは、目的とするDNA断片に対して相補的な塩基配列を有し、当該DNA断片とハイブリダイズできるDNA断片を意味する。DNAプローブとしては、特に、いわゆるオリゴヌクレオチドマイクロアレイに適用されることが好ましい。オリゴヌクレオチドマイクロアレイとは、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをDNAプローブとするマイクロアレイである。ここで、DNAプローブとなる合成オリゴヌクレオチドは、例えば20〜100塩基長、好ましくは30〜90塩基長、より好ましくは50〜60塩基長とする。
本発明に係るDNA解析装置は、以上のようにして設計されたDNAプローブを担体に固定化したものである。DNAプローブを担体に固定化してなるDNA解析装置は、DNAマイクロアレイと呼称される場合もある。すなわち、本発明に係るDNA解析装置は、基板にDNAプローブを固定化してなる、所謂DNAチップ(狭義のDNAマイクロアレイ)に限定されず、以上のようにして設計されたDNAプローブを担体上で利用可能な如何なる構成の装置をも含む意味である。
上述のように作製されたDNAプローブを使用することで、遺伝子型解析等のゲノムDNA解析を行うことができる。上述したDNAプローブは、高濃度のランダムプライマーを用いて作製されたDNAライブラリーに対応している。当該DNAライブラリーは、非常に高い再現性を有しており、次世代シーケンサーに適したサイズを有しており、ゲノム全体に亘って均一性を有している。したがって、DNAライブラリーは、DNAマーカー(遺伝マーカー、遺伝子マーカーとも称される)として使用することができる。ここで、DNAマーカーとは、遺伝的形質に関連する目印となるゲノム上の領域という意味である。DNAマーカーは、例えば遺伝子型同定、連鎖地図、遺伝子マッピング、マーカーを利用した選抜工程を含む育種、マーカーを利用した戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、バルクセグリガント分析、品種識別、又は連鎖不均衡マッピング等に利用することができる。
1.フローチャート
本実施例では、図1に示したフローチャートに従って、各種生物種から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、各種ランダムプライマーセットを用いたPCRによりDNAライブラリーを作製した。また、作製したDNAライブラリーを用いて、所謂、次世代シーケンサーを用いた配列解析を行い、得られたリードデータに基づいて遺伝子型を解析した。
本実施例では、サトウキビ品種NiF8、Ni9及びその交雑後代22系統、並びにイネ品種日本晴からDNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)を用いてゲノムDNAを抽出及び精製し、それぞれNiF8由来のゲノムDNA、Ni9由来のゲノムDNA、交雑後代22系統由来のゲノムDNA、日本晴由来のゲノムDNAとして使用した。また、本実施例では、ヒトDNAについてはタカラバイオよりHuman Genomic DNAを購入し、ヒト由来のゲノムDNAとして使用した。
3.1 PCR条件とDNA断片のサイズの関係
3.1.1 ランダムプライマーの設計
ランダムプライマーを設計するにあたり、GC含量を20〜70%の範囲とし、連続塩基数が5以下となる条件を設定した。また、塩基長については、8塩基長、9塩基長、10塩基長、11塩基長、12塩基長、14塩基長、16塩基長、18塩基長、20塩基長、22塩基長、24塩基長、26塩基長、28塩基長、29塩基長、30塩基長及び35塩基長の16種類を設定した。各塩基長について、それぞれ96種類の塩基配列を設計し、96種類のランダムプライマーからなるセットを作製した。なお、10塩基長については、6セット(各セットに96種類のランダムプライマーが含まれる)を設計した(これら6セットを、10塩基A〜10塩基Fと称する)。すなわち、本実施例では、21種類のランダムプライマーセットを作製した。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ここで説明した標準PCRを含め、ランダムプライマーを用いたPCRによって得られた多数の核酸断片をDNAライブラリーと称する。
3.1.2で得られたDNAライブラリーをMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)で精製後、Agilent 2100バイオアナライザ(Agient Technologies)で電気泳動し、蛍光ユニット(Fluorescence Unit: FU)を得た。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、種々のアニーリング温度で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、アニーリング温度として37℃、40℃及び45℃を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び2.5unit又は125unitのDNA DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、所定濃度のMgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、MgCl2濃度として、通常の2倍(2.0mM)、3倍(3.0mM)及び4倍(4.0mM)を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度0.6μMランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマーとして、上述した8塩基長(表7)、9塩基長(表8)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)を検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に所定濃度のランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。なお、本実施例においては、ランダムプライマー濃度として、2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900及び1000μMを検討した。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、本実験では、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
3.2.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.2.1で得られたDNAライブラリーから、KAPA Library Preparation Kit(Roche)を用いてMiSeq解析用シーケンスライブラリーを作製した。
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)を用いて、3.2.2で得られたMiSeq解析用シーケンスライブラリーをリード長100塩基のペアエンド条件のもと解析した。
3.2.3で得られたリードデータから、ランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントし、反復間のリード数を比較し、相関係数で再現性を評価した。
3.3.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(日本晴由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
日本晴由来ゲノムDNAから作製したDNAライブラリーを用いたシーケンスライブラリーの作製、MiSeq解析及びリードデータ解析は、それぞれ3.2.2、3.2.3及び3.2.4に記載した方法に従った。
3.3.2で得られたリードパターンについて、日本晴のゲノム情報(NC_008394〜NC_008405)に対してリードパターンをbowde2にてマッピングし、各リードパターンのゲノム位置を特定した。
3.3.3で特定した各リードパターンの位置情報に基づいて、ランダムプライマーの配列と当該ランダムプライマーがアニールするゲノム上の配列を比較し、ミスマッチ数をカウントした。
3.4.1 DNAライブラリーの作製
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA、交雑後代由来ゲノムDNA又は日本晴由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度60μMランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
3.4.1で作製した各DNAライブラリーを、それぞれ1レーン16サンプル及びリード長100塩基のペアエンド条件でタカラバイオヘ解析を委託し、それぞれからリードデータを取得した。
3.4.2で得られたリードデータからランダムプライマーの配列情報を削除し、リードパターンを特定した。そしてリードパターンごとにリード数をカウントした。
3.4.3の解析の結果として得られたリードパターンのリード数からNiF8及びNi9特有の多型を検出し、そのリードパターンをマーカーとした。また、リード数をもとに交雑後代22系統の遺伝子型を判別した。遺伝子型判別の精度は、交雑後代2系統の反復データでの再現性をもとに評価した。
3.5.1 プライマーの設計
3.4.4で特定したマーカーのうちNiF8型3マーカー、Ni9型3マーカーの合計6マーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報からプライマーをそれぞれ設計した(表22)。
TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(TAKARA)を用いて、2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA、Ni9由来ゲノムDNA又は交雑後代由来ゲノムDNA:15ng)を鋳型に、1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2 X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、3.5.1で設計した0.4μMプライマーを加え、最終反応量25μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、94℃で1分とし、その後、94℃で30秒間、60℃で30秒間及び72℃で30秒を1サイクルとして30サイクル行った後、72℃で10分間維持し、その後、4℃で保存する条件とした。増幅したDNA断片は、TapeStation(Agilent Technologies)で電気泳動した。
3.5.2で得られた電気泳動の結果から、バンドの有無によりマーカーの遺伝子型を判別し、マーカーのリード数と比較した。
3.6.1 高濃度条件下でのランダムプライマー長の影響
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に最終濃度10μMの所定の長さのランダムプライマー、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、9塩基長(表8)、10塩基長(表1、10塩基A)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)を検討した。PCRの温度サイクル条件は、9塩基長のランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、37℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。PCRの温度サイクル条件は、10塩基長以上の長さのランダムプライマーを使用する反応系では、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、所定の長さのランダムプライマーを所定の濃度となるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、ランダムプライマーの長さとして、表1〜21に示した8塩基長から35塩基長のランダムプライマーを検証し、ランダムプライマーの濃度として0.6〜300μMの範囲を検証した。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、表1に示した10塩基長からなる96種類のランダムプライマー(10塩基A)から選ばれる1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。本実験においては、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマーとして、表1のNo.1から順にランダムプライマーを選び検証した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
2.に記載したゲノムDNA(NiF8由来ゲノムDNA:15ng)に、表2〜6に示したランダムプライマーの5セットから選ばれる1セットを最終濃度60μMとなるように加え、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は
3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
2.に記載したゲノムDNA(ヒト由来ゲノムDNA:15ng)に、最終濃度60μMのランダムプライマー(10塩基A)、0.2mM dNTP mixture、1.0mM MgCl2及び1.25 unit DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)を加え、最終反応量50μlで反応液を調整した。PCRの温度サイクル条件は、先ず、98℃を2分とし、その後、98℃で10秒間、50℃で15秒間及び72℃で20秒を1サイクルとして30サイクル行った後、4℃で保存する条件とした。本実験で得られたDNAライブラリーの精製と電気泳動は3.1.3と同様の方法で行った。また、スピアマンの順位相関により反復データの再現性を評価した(ρ>0.9)。
4.1 PCR条件とDNAライブラリーのサイズの関係
通常のPCR条件に倣って、ランダムプライマーを利用したPCR(上記3.1.2)では、増幅されたDNAライブラリーのサイズは2kbp以上と高分子であり、目的のサイズとする100bp〜500bpには増幅は見られなかった(図2)。100bp〜500bpのDNAライブラリーが得られなかったのは、ランゲムプライマーが500bp以下の領域でプライマーとし機能する確率が低いためと考えられた。目的のサイズである100bp〜500bpのDNAライブラリーを作製するには、再現性良く非特異的増幅を誘発する必要があると考えられた。
上記3.2で説明したように、DNAライブラリー作製の再現性を確認するため、NiF8から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーで増幅したDNAライブラリーについて次世代シーケンサーMiSeqにより解析した結果を図48に示した。なお、上記3.2.4の結果として47,484個のリードパターンが得られた。反復間でリード数を比較した結果、電気泳動の結果と同様、反復間で相関係数r=0.991と高い相関を示した。以上の結果から、ランダムプライマーにより再現性良くDNAライブラリー作製可能と考えられた。
上記3.3で説明したように、ゲノム情報が公開されているイネ日本晴から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製し、電気泳動した結果を図49及び50に示した。図49及び50に示した結果から、ρが0.979と非常に高い値を示した。また、MiSeqによりリードデータを解析した結果を図51に示した。図51に示した結果から、相関係数rは0.992と非常に高い値を示した。これらの結果より、イネを対象としても、ランダムプライマーを使用することで非常に高い再現性を持ってDNAライブラリーを作製できることが明らかとなった。
上記3.4で説明したように、サトウキビNiF8、Ni9、及びその交雑後代22系統を用いて、ランダムプライマーによりDNAライブラリーを作製、次世代シーケンサーHiSeqで解析し、リードデータをもとに両親の多型検出及び交雑後代の遺伝子型を判別した。その結果を表24に示した。
上記3.5で説明したように、表22に示したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、リード数と比較した。NiF8型のマーカーN80521152のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図54及び55に示した。NiF8型のマーカーN80997192のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図56及び57に示した。NiF8型のマーカーN80533142のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図58及び59に示した。Ni9型のマーカーN91552391のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図60及び61に示した。Ni9型のマーカーN91653962のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図62及び63に示した。Ni9型のマーカーN91124801のリード数及び電気泳動像をそれぞれ図64及び65に示した。
上記3.6.1で説明したように、9塩基長(表8)、10塩基長(表1、10塩基A)、11塩基長(表9)、12塩基長(表10)、14塩基長(表11)、16塩基長(表12)、18塩基長(表13)及び20塩基長(表14)のランダムプライマーを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図66〜81に示した。また、表25にこれらの結果を纏めた。
上記3.7で説明したように、1種、2種、3種、12種、24種又は48種のランダムプライマー(濃度は60μM)を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図83〜94に示した。また、表27にこれらの結果を纏めた。
上記3.8で説明したように、表2〜6に示したランダムプライマーのセット(10塩基B、10塩基C、10塩基D、10塩基E及び10塩基F)それぞれを用いてDNAライブラリーを作製した結果を図95〜104に示した。また、表28にこれらの結果を纏めた。
上記3.9で説明したように、ヒト由来ゲノムDNA及び最終濃度60μMのランダムプライマー(10塩基A)を用いてDNAライブラリーを作製した結果を図105及び106に示した。図105は反復実験の一回目の結果を示し、図106は反復実験の二回目の結果を示している。図105及び106に示すように、ヒト由来のゲノムDNAを用いた場合であっても、非常に高い再現性を達成しながら低分子のDNA断片を増幅できることが明らかとなった。
本実施例2では、図107に模式的に示した工程に従って、DNAプローブを設計し、設計したDNAプローブを有するDNAマイクアレイを作製した。そして、本実施例では、当該DNAマイクロアレイを用いてDNAマーカーを検出できるか検証した。
〔DNAマイクロアレイ解析〕
上述のように作製したDNAマイクロアレイを用い、サトウキビ品種NiF8、Ni9及び交雑後代22系統についてアレイ解析を実施した結果、表30に示すように、両親間でシグナルが明瞭に異なるマーカーを3,570個同定した(図108)。
NiF8型の3つのマーカー、Ni9型の3つのマーカーの合計6つのマーカーについて、ペアエンドのマーカー配列情報から設計したプライマーを用い、NiF8とNi9、その交雑後代22系統についてPCRを行い電気泳動で遺伝子型を判別し、DNAマイクロアレイのシグナルと比較した。マーカー名:N80521152に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図110に示し、N80997192に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図111に示し、N80533142に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図112に示し、N91552391に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図113に示し、N91653962に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図114に示し、N91124801に対応するDNAプローブからのシグナル値を測定した結果を図115に示した。なお、マーカーN80521152についての電気泳動像を図55に示し、マーカーN80997192についての電気泳動像を図57に示し、マーカーN80533142についての電気泳動像を図59に示し、マーカーN91552391についての電気泳動像を図61に示し、マーカーN91653962についての電気泳動像を図63に示し、マーカーN91124801についての電気泳動像を図65に示している。これら電気泳動像の結果と、DNAプローブからのシグナル値を測定した結果を比較すると、すべてのマーカーにおいて結果が一致していることが判る。この結果より、高濃度のランダムプライマーを用いて得られたDNAライブラリーに含まれるDNA断片の塩基配列に基づいてDNAプローブを設計することで、当該DNA断片を高精度に検出できることが明らかとなった。
Claims (12)
- ゲノムDNA及び高濃度のランダムプライマーを含む反応液にて核酸増幅反応を行い、ゲノムDNAを鋳型として当該核酸増幅反応により得られたDNA断片を取得する工程と、
得られたDNA断片の塩基配列を決定する工程と、
上記工程にて得られたDNA断片の塩基配列に基づいて、当該DNA断片を検出するためのDNAプローブを設計する工程と
を含むDNAプローブの作製方法。 - 上記ランダムプライマーを用いて複数の異なるゲノムDNAからそれぞれDNA断片を取得し、当該DNA断片に関する塩基配列に基づいて、これらゲノムDNAの間で相違する領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 上記DNA断片の塩基配列を既知の塩基配列と比較し、既知の塩基配列と異なる領域を含む上記DNAプローブを設計することを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 上記反応液は4〜200μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 上記反応液は4〜100μMの上記ランダムプライマーを含むことを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 上記ランダムプライマーは、9〜30塩基長のヌクレオチドであることを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 上記DNA断片は、100〜500塩基長であることを特徴とする請求項1記載のDNAプローブの作製方法。
- 請求項1乃至7いずれか一項記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、解析対象のゲノムDNA由来のDNA断片とを接触させる工程と、
上記DNAプローブと上記DNA断片とのハイブリダイズを検出する工程と
を含むゲノムDNA解析方法。 - 上記解析対象のゲノムDNAと上記ランダムプライマーを用いた核酸増幅反応により上記DNA断片を取得する工程を更に含むことを特徴とする請求項8記載のゲノムDNA解析方法。
- 上記ゲノムDNA由来のDNA断片はDNAマーカーであり、上記DNAプローブにより当該DNAマーカーの存否を検出することを特徴とする請求項8記載のゲノムDNA解析方法。
- 請求項1乃至7いずれか一項記載のDNAプローブの作製方法により作製されたDNAプローブと、
当該DNAプローブを固定した担体と、
を有するDNA解析装置。 - 上記担体は基板又はビーズであることを特徴とする請求項10記載のDNA解析装置。
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