JP2011120558A - Dnaマイクロアレイにおけるプローブ設計方法、当該方法により設計されたプローブを有するdnaマイクロアレイ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係るプローブの設計方法は、対象とする生物由来のゲノムDNAに含まれる、制限酵素が認識する制限酵素認識部位によって挟み込まれる断片について、当該断片内の少なくとも一部をカバーする1又は複数の領域を特定するステップ、特定した1又は複数の領域を、供試生物における上記断片を検出するためのプローブとして設計するステップを含む。
【選択図】図1
Description
すなわち、本発明に係るプローブの設計方法は、対象とする生物由来のゲノムDNAに含まれる、制限酵素が認識する制限酵素認識部位によって挟み込まれる断片について、当該ゲノムDNA断片より短い塩基長を有し、当該断片内の少なくとも一部をカバーする1又は複数の領域を特定するステップ、特定した1又は複数の領域を、供試生物における上記断片を検出するためのプローブとして設計するステップを含む。
(1a)上記ゲノムDNAを抽出する工程
(1b)抽出したゲノムDNAを上記制限酵素で消化する工程
(1c)上記(1b)で得られたゲノムDNA断片にアダプターを連結する工程
(1d)上記アダプターにハイブリダイズするプライマーを用いて上記ゲノムDNA断片を増幅する工程
(1e)増幅した上記ゲノムDNA断片の塩基配列を決定する工程
(1f)決定した塩基配列に基づいて上記1又は複数の領域を決定する工程
(2a)上記ゲノムDNAに関する塩基配列情報から上記制限酵素の認識配列を検索し、上記ゲノムDNAを上記制限酵素で消化した場合に生ずるゲノムDNA断片の塩基配列を特定する工程
(2b)上記特定した塩基配列に基づいて上記1又は複数の領域を決定する工程
ここで、上記(2b)において決定する領域は、例えば20〜10000塩基長、好ましくは100〜8000塩基長、より好ましくは200〜6000塩基長とする。
(3a)上記ゲノムDNAを抽出する工程
(3b)抽出したゲノムDNAを上記制限酵素で消化する工程
(3c)上記(3b)で得られたゲノムDNA断片にアダプターを連結する工程
(3d)上記アダプターにハイブリダイズするプライマーを用いて上記ゲノムDNA断片を増幅する工程
(3e)増幅した上記ゲノムDNA断片を他の制限酵素で消化する工程
(3f)上記(3e)で消化して得られたDNA断片を分離してプローブとする工程
本発明において設計するプローブは、特に、いわゆるオリゴヌクレオチドマイクロアレイに適用されることが好ましい。オリゴヌクレオチドマイクロアレイとは、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとするマイクロアレイである。ここで、プローブとなる合成オリゴヌクレオチドは、例えば20〜100塩基長、好ましくは30〜90塩基長、より好ましくは50〜75塩基長とする。
以上のようにして設計されたプローブを有するDNAマイクロアレイは、従来公知の手法によって作製することができる。例えば、図1又は図2に示す方法で設計された各プローブの塩基配列に基づいて、担体上にて目的の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することで、図1又は図2に示す方法で設計されたプローブを有するDNAマイクロアレイを作製することができる。ここで、オリゴヌクレオチドを合成する方法としては、特に限定されず従来公知の手法を適用することができる。例えば、フォトリソグラフィー技術と光照射化学合成技術を組み合わせて担体上にてオリゴヌクレオチドを合成する方法を適用することができる。また、担体表面との親和性の高いリンカー分子を末端に付加したオリゴヌクレオチドを、図1又は図2に示す方法で設計された各プローブの塩基配列情報に基づいて別途合成し、その後、担体表面の所定の位置に固定する方法を適用することもできる。
以上のように作製されたDNAマイクロアレイを使用することで、ゲノムDNAに存在する変異を検出することができる。ここで、変異とは、同種生物間に存在する一塩基多型等の多型、近縁種の間に存在する塩基配列の相違、若しくは所定の生物に対して人為的に導入された突然変異を意味する。
本実施例では、全シークエンス情報及び変異情報を使用せず、図1に示した手順に従ってプローブを設計することで、サトウキビ品種NiF8及びNi9の対立遺伝子における変異を検出できることを示した。
サトウキビ品種NiF8及びNi9を用いた。
サトウキビ品種NiF8及びNi9からそれぞれゲノムDNAを定法に従って抽出した。ゲノムDNA(750ng)を制限酵素PstI(NEB社、25unit)で37℃、2時間処理後、制限酵素BstNI(NEB社、25unit)を添加、60℃、2時間処理した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(120ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号1)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ (配列番号2))とT4 DNA Ligase(NEB社、800 unit)を加え、16℃、一昼夜処理した。これにより、(2)で処理したゲノムDNA断片のうち、両末端にPstI認識配列を有するゲノムDNA断片に対して選択的にアダプターを付加した。
(3)で得られたアダプターを有するゲノムDNA断片(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号3))とTaq polymerase(TAKALA社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR( 98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片についてサンガー法により塩基配列を決定した。その結果、NiF8由来の2種類のゲノムシークエンス情報(A_1(配列番号4)及びB_1(配列番号5))を取得した。また、ゲノムシークエンスA_1及びB_1の配列情報を用い、Ni9の対立遺伝子座領域のゲノムシークエンス情報(A_2(配列番号6)及びB_2(配列番号7))を取得した
(5)のゲノムシークエンス情報(A_1、B_1)をもとに50〜70bpのプローブをそれぞれ5及び6個設計した。すなわち、本実施例では、サトウキビ品種NiF8についてプローブを設計した。A_1とA_2のアライメント及び設計したプローブの位置を図5に示す。また、B_1とB_2のアライメント及び設計したプローブの位置を図6に示す。
設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した(Roche社に委託)。
上述した(2)〜(4)の方法により、サトウキビ品種NiF8及びNi9からそれぞれPCR増幅断片を調整した。PCR増幅断片をカラム(Qiagen社)で精製後、Cy3-labeled 9mers(TriLink社、1O.D.)を加え、98℃、10分間処理後、氷上で10分間静置した。その後、Klenow(NEB社、100unit)を加え37℃、2時間処理した。そして、エタノール沈殿によりラベル化サンプルを調整した。
(8)のラベル化サンプルを用い、NimbleGen Array User’s Guideに従い、(7)で作製したDNAマイクロアレイを用いてハイブリダイズを行い、ラベルに基づくシグナルを検出した。
変異割合は、各プローブ内のNiF8及びNi9の対立遺伝子座領域のゲノムシークエンスの相同性をもとに算出した。
シグナル強度比は、NiF8をサンプルとしたアレイのシグナル強度に対しNi9をサンプルとしたアレイのシグナル強度で割った値を用いた。
シグナル強度を測定した結果及びそれから算出したシグナル強度比を表1及び表2に示す。
本実施例では、実施例1で作製したNiF8由来のプローブに人工的に変異を導入し、変異導入割合とオリジナルプローブに対するシグナル強度割合により、変異検出能力を評価した。
サトウキビ品種NiF8を用いた。
実施例1の(2)〜(4)に従いNiF8のPCR増幅断片を作製し、サンガー法によりゲノムシークエンスを決定した。独立したゲノムシークエンス情報をもとに50〜75bpの基本プローブを6個作成した(表3)。
(2)の基本プローブに対し、それぞれ1、2、3、4、5、10、15、20、25塩基の挿入変異、欠失変異、塩基置換変異を導入したプローブを作成した。
実施例1の(7)〜(9)に従って同様にDNAマイクロアレイを作製、サンプルを調整し、ハイブリダイズ反応、その後シグナル検出を行った。
シグナル強度割合は、基本プローブシグナル強度に対し、変異プローブシグナル強度を割った値を用いた。グラフおよび近似曲線はExcel 2007により作成した。
プローブに導入した変異割合と、検出されたシグナル強度との関係を図7に示した。図7に示すように、プローブの変異割合とシグナル強度割合には高い相関関係があった(y=0.0804x-0.518、R2=0.8068)。この相関関係より、変異割合が3%以上になるとシグナル強度割合が50%以下になる傾向が見られた。プローブよっては1bpの変異でも、シグナル強度比が50%を下回るプローブが存在した。以上の結果から、サンプルとなるゲノムDNA断片よりも短い塩基長のプローブを用いて1〜数塩基以上の変異が高精度に検出可能であることが明らかとなった。
本実施例では、サトウキビ品種NiF8及びNi9のゲノムシークエンス情報(5,848個)を用い、各ゲノムシークエンス情報あたり数十bpからなるプローブを5〜15個設計し、両サンプル間の変異検出を実施した。
サトウキビ品種NiF8及びNi9を用いた。
実施例1の(2)〜(4)に従いNiF8及びNi9のPCR増幅断片を作成し、サンガー法によりゲノムシークエンス情報を取得した。具体的には、5,848個のPCR増幅断片のゲノムシークエンス情報が得られた。
(2)で得られたゲノムシークエンス情報について50〜75bpのプローブそれぞれ5〜15個設計した。より具体的には、ゲノムシークエンス情報5,848個について、59,462のプローブを設計した。
実施例1の(7)〜(9)に従って同様にDNAマイクロアレイを作製、サンプルを調整し、ハイブリダイズ反応、その後シグナル検出を行った。
NiF8をサンプルとしたアレイのシグナル強度に対するNi9をサンプルとしたアレイのシグナル強度比が2倍以上又は2分の1以下のプローブを変異部位プローブとした。
各シークエンス情報あたりの変異部位プローブ数に対し、各シークエンス情報あたりの作成プローブ数で割った値を用いた。
ゲノムシークエンス情報5,848個より、59,462のプローブを設計した。そのうち、シグナル強度比が2倍を上回ったプローブは5,596個で、これらのプローブを一つ以上含むシークエンス情報は1,497個だった。これらのシークエンス情報のうち全てのプローブでシグナル強度比が2倍以上のものは189個で 全体の12.6%だった(図8)。このシークエンス情報内の変異は、制限酵素認識配列内および数kbpの大きな挿入欠失によるものと考えられた。一方、一部のプローブでも変異が検出されたシークエンス情報は全体の87.4%だった。これは、数十bpのプローブを内部に複数設計することで、変異検出能力が向上したと考えられる。以上の結果から、今回変異が検出されたシークエンス情報は、全てのプローブでシグナル強度比が2倍以上だったシークエンス情報の7.9倍にあたり、サンプルとなるゲノムDNA断片よりも短い数十bpのプローブを複数設計することで変異検出能力が向上することが明らかとなった。
本実施例では、他生物の既知シークエンス情報により設計したプローブを有するDNAマイクロアレイの利用可能性を検証するため、図2に示した手順に従って、ソルガムの全シークエンス情報から設計したプローブを有するDNAマイクロアレイを作製し、サトウキビのゲノムDNAの変異を検出した。
サトウキビ品種NiF8及びNi9を用いた。
ゲノムDB (Gramene: http://www.gramene.org/)のソルガム全ゲノム配列情報からPstI認識配列間シークエンス情報を取得した。
(2)のシークエンス情報をもとに50〜75bpのプローブを設計した。
実施例1の(7)〜(9)に従って同様にDNAマイクロアレイを作製、サンプルを調整し、ハイブリダイズ反応、その後シグナル検出を行った。
NiF8をサンプルとしたアレイのシグナル強度に対するNi9をサンプルとしたアレイのシグナル強度比が2倍以上もしくは2分の1以下のプローブを変異部位プローブとした。
本実施例では、ソルガムゲノムシークエンス情報より、表4に示すように、1,744,104個のプローブを設計した
Claims (20)
- 対象とする生物由来のゲノムDNAに含まれる、制限酵素認識部位によって挟み込まれるゲノムDNA断片について、当該ゲノムDNA断片より短い塩基長を有し、当該ゲノムDNA断片内の少なくとも一部をカバーする1又は複数の領域を特定するステップ、
特定した1又は複数の領域をプローブとして設計するステップを含む、プローブの設計方法。 - 上記1又は複数の領域は、以下の工程によって特定することを特徴とする請求項1記載のプローブの設計方法。
(1a)上記ゲノムDNAを抽出する工程
(1b)抽出したゲノムDNAを上記制限酵素で消化する工程
(1c)上記(1b)で得られたゲノムDNA断片にアダプターを連結する工程
(1d)上記アダプターにハイブリダイズするプライマーを用いて上記ゲノムDNA断片を増幅する工程
(1e)増幅した上記ゲノムDNA断片の塩基配列を決定する工程
(1f)決定した塩基配列に基づいて上記1又は複数の領域を決定する工程 - 上記(1b)において複数の制限酵素で上記ゲノムDNAを消化することを特徴とする請求項2記載のプローブの設計方法。
- 上記(1c)では、上記複数の制限酵素から選ばれる1つの制限酵素若しくは、使用した上記複数の制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを連結することを特徴とする請求項3記載のプローブの設計方法。
- 上記アダプターとしては、上記(1b)で得られたゲノムDNA断片の突出末端に相補的な配列を有することを特徴とする請求項2記載のプローブの設計方法。
- 上記1又は複数の領域は、上記ゲノムDNAに関する塩基配列情報を用いて以下の工程によって特定することを特徴とする請求項1記載のプローブの設計方法。
(2a)上記ゲノムDNAに関する塩基配列情報から上記制限酵素の認識配列を検索し、上記ゲノムDNAを上記制限酵素で消化した場合に生ずるゲノムDNA断片の塩基配列を特定する工程
(2b)上記特定した塩基配列に基づいて上記1又は複数の領域を決定する工程 - 上記(2a)において複数の制限酵素で上記ゲノムDNAを消化した場合に生ずるゲノムDNA断片の塩基配列を決定することを特徴とする請求項6記載のプローブの設計方法。
- 上記(2b)では、上記複数の制限酵素から選ばれる1つの制限酵素若しくは、使用した上記複数の制限酵素のうち一部の制限酵素によって挟み込まれるゲノムDNA断片に対して上記1又は複数の領域を決定することを特徴とする請求項7記載のプローブの設計方法。
- 上記1又は複数の領域は、以下の工程によって特定することを特徴とする請求項1記載のプローブの設計方法。
(3a)上記ゲノムDNAを抽出する工程
(3b)抽出したゲノムDNAを上記制限酵素で消化する工程
(3c)上記(3b)で得られたゲノムDNA断片にアダプターを連結する工程
(3d)上記アダプターにハイブリダイズするプライマーを用いて上記ゲノムDNA断片を増幅する工程
(3e)増幅した上記ゲノムDNA断片を他の制限酵素で消化する工程
(3f)上記(3e)で消化して得られたDNA断片を分離してプローブとする工程 - 上記(3b)において複数の制限酵素で上記ゲノムDNAを消化することを特徴とする請求項9記載のプローブの設計方法。
- 上記(3c)では、上記複数の制限酵素から選ばれる1つの制限酵素若しくは、使用した上記複数の制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを連結することを特徴とする請求項3記載のプローブの設計方法。
- 上記アダプターとしては、上記(3b)で得られたゲノムDNA断片の突出末端に相補的な配列を有することを特徴とする請求項9記載のプローブの設計方法。
- 20〜100塩基長のプローブを設計することを特徴とする請求項1記載のプローブの設計方法。
- 請求項1乃至13いずれか一項記載のプローブの設計方法により設計されたプローブと、当該プローブを固定した担体とを備えるDNAマイクロアレイ。
- 上記プローブは、上記担体上にて配列情報に基づいて合成されたものであることを特徴とする請求項14記載のDNAマイクロアレイ。
- 検査対象の生物由来のゲノムDNAを抽出する工程;
請求項1乃至13いずれか一項記載のプローブの設計方法において使用した制限酵素と同じ認識配列を有する制限酵素によって当該ゲノムDNAを消化する工程;
制限酵素処理で得られたゲノムDNA断片にアダプターを連結する工程;
上記アダプターにハイブリダイズするプライマーを用いて上記ゲノムDNA断片を増幅する工程;及び
増幅した上記ゲノムDNA断片を請求項14又は15記載のDNAマイクロアレイに接触させ、当該ゲノムDNA断片とプローブとのハイブリダイズを検出する工程
を含むDNAマイクロアレイを用いた変異検出方法。 - 上記ゲノムDNAを消化する工程では、複数の制限酵素で上記ゲノムDNAを消化することを特徴とする請求項16記載のDNAマイクロアレイを用いた変異検出方法。
- 上記アダプターを連結する工程では、上記複数の制限酵素から選ばれる1つの制限酵素若しくは、使用した上記複数の制限酵素のうち一部の制限酵素に対応するアダプターを連結することを特徴とする請求項17記載のDNAマイクロアレイを用いた変異検出方法。
- 上記アダプターとしては、上記(3b)で得られたゲノムDNA断片の突出末端に相補的な配列を有することを特徴とする請求項16記載のDNAマイクロアレイを用いた変異検出方法。
- 上記検査対象の生物は、上記DNAマイクロアレイを作製する際に使用した生物とは異種の生物であることを特徴とする請求項16記載のDNAマイクロアレイを用いた変異検出方法。
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