CN101096709B - 利用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用可视薄膜感受器芯片技术检测特异核苷酸序列和SNP标记(或点突变)的方法。将特异序列的单链寡核苷酸作为捕捉探针通过乙醛共价结合于肼衍生的感受器芯片表面；然后通过生物素标记的PCR产物与捕捉探针杂交，可以鉴定特异的DNA序列，或者捕捉探针、在生物素标记的检测探针和PCR产物同时进行杂交和连接反应，可以鉴定位点突变序列(如SNP位点)；最后将芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体温育，加底物显色，如果PCR产物中存在特异目标序列，那么芯片的表面会有肉眼可辨的颜色变化，金色变为蓝色或紫色。这项检测技术快速、准确、低廉、灵敏度高、特异性强，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济实惠。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种快速检测和鉴定植物及其他机体中特异核苷酸序列和单核苷酸多态性的方法。
背景技术
在植物科学研究领域，能够快速、准确的鉴定特异核苷酸序列非常必要。目前，在基因组水平上鉴定物种和生态型以及追踪遗传模式已经是常规的实验方法。另外，海关和政府的检查员、作物育种者、商业食品加工部门经常需要检测植物商品中遗传修饰作物和病原体是否符合相应的法规要求。对于植物商品的外源基因序列检测的需求日益升高，为了满足这种需求，需要发明了一种应用广泛、价格低廉、高度特异性并且使用方便的测定方法。
目前已有的鉴定特异核苷酸序列和多态性的方法可以分为三大类：
1)以多聚酶链反应(PCR)为基础的检测方法。PCR是一种广泛使用的扩增特定DNA序列的方法。用凝胶电泳技术可以显示被扩增序列的存在，同时也可以确定DNA的数量、大小、甚至序列(Chiueh et al.，2002；German et al.，2003；Gilliland et al.，1990；Holst-Jensen etal.，2003；Miraglia et al.，2004；Rogers and Parkes，1999；Su et al.，2003)。实时PCR是一种普遍用来定量检测特异核苷酸片段的方法，使用荧光信号对扩增产物进行实时定量。实时PCR技术要求特殊的热循环仪和荧光探针，虽然快速灵敏，但价格昂贵，并且容易产生假阳性信号(Baric and Dalla-via，2004；Hernandez et al.，2004；Shibata et al.，1998；Stubner，2002)。
2)以分子标记为基础的检测方法。采用DNA标记鉴定植物物种已经成为一种常用的方式(Andersen and Lübberstedt，2003)。最常用的分子标记包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)。RFLP技术是将样本中的DNA消化后与探针进行杂交(Bai et al.，2000；Cavallotti et al.，2003；Yu et al.，1995；Zhang et al.，1995)，包括限制性内切酶消化、凝胶电泳、转膜、与标记的探针杂交。这个方法得到的结果精确但费时费力。RAPD技术是对植物基因组进行随机PCR扩增，它需要进行大量的PCR实验，并且随着每个PCR反应的具体实验条件结果变化差异很大(Bai et al.，2000；Ilbi，2003；Luo et al.，2002)。SSR标记或者叫做微卫星标记是分散于整个基因组中独特的串联重复序列，可以用位于这些标记两侧的引物进行PCR扩增(Cordeiroet al.，2000；Edwards et al.，1998)。变性的DNA模板SSR区域的两条DNA链由于核苷酸组成的复杂度低其再聚合的倾向性高，在GenBank中可以查到相关物种的SSR位点，或者通过基因组文库搜索来设计SSR引物。
SNP是由于等位基因中的单个核苷酸差异而引起的植物基因组的多样性和自然变异(Maloof et al.，2001)。SNP普遍用于鉴别同一物种的不同品系和栽培种。例如，将两种主要的拟南芥生态型(Col和Ler)的基因组序列进行比较发现，平均每3.3kb就会有一个SNP(即125Mb中的SNP总数超过37,000)(http://www.arabidopsis.org/cereon/)。比较水稻的两个主要亚种indica9311(Yu et al.，2005)和japonica Nipponbare(IRGSP，2005)发现，相同单位基因序列中的SNP标记数目是拟南芥的10倍。对于已建立的SNP技术平台的调查显示，高通量的检测技术(InvaderTM and SNiPerTM)需要非常昂贵的仪器设备投入(Mashima etal.，2004；Pati et al.，2004)，而低通量的检测技术，尽管不需要昂贵的仪器但是费时费力。
可视薄膜感受器芯片是一种经过特殊处理的硅晶片，其结构可分为三层：即直径10厘米的硅基质为基底层；上面有一层475埃的氮化硅，构成可视层；在可视层之上涂上便于进行分子反应的T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷构成反应层。基底层和可视层构成薄膜硅质基片，涂上反应层后它可以将分子反应转化为肉眼可见的信号，这个过程主要包括：当检测物与反应层分子发生相互作用时，物质沉积在薄膜表面，产生酶催化反应，通过可视层改变反射光波长，最后导致膜表面可见的颜色变化，从而将分子反应转化为肉眼可见的信号(Sandstrom，T.，Steinberg，M.&Nygren，H.(1985)Appl.Opt.24，472-479.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用可视薄膜感受器芯片技术快速、准确、低廉的检测特异核苷酸序列和SNP标记(或点突变)的方法。
本发明的技术方案简要地讲，首先将特异序列的单链寡核苷酸作为捕捉探针通过乙醛共价结合于肼衍生的感受器芯片表面；然后通过生物素标记的PCR产物与感受器表面的捕捉探针杂交，可以鉴定特异的DNA序列，或者PCR产物与感受器表面的捕捉探针在生物素标记的检测探针和热稳定的连接酶的混合物中进行杂交反应，可以鉴定位点突变序列(如SNP位点)，只有目标序列与探针完全匹配的情况下生物素标记的检测探针才能通过连接酶作用共价结合于芯片的表面，即便是一个核苷酸不匹配也不可以；最后，将杂交后的芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体温育，再加入辣根过氧化物酶的底物，如果PCR产物中存在特异性的目标序列，那么芯片的表面会有颜色的变化，金色变为蓝色或紫色，能够被人的裸眼所分辨。整个检测过程在30分钟内即可完成。这项检测技术具有准确、灵敏度高和特异性强的特点，并且低通量和高通量可自由选择，非常经济实惠。
采用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的原理如图1所示，捕捉探针通过5’端的乙醛基与芯片表面的肼基共价结合而固定于芯片上(见图1A)，然后将生物素标记的PCR片段与其进行杂交。其中：
一、检测特异的基因或DNA片段时，需要合成正反向两个引物并且将带有正向链序列的捕捉探针点在芯片表面。其中，反向引物的5’端带有共价结合的生物素(参见表1和图1B)。捕捉探针的5’端带有乙醛基团，从5’到3’依次是10-12个脱氧腺嘌呤残基(作为间隔)和35-50个的与PCR扩增子完全匹配的正向链序列，捕捉探针的5’端与芯片表面共价结合(参见表1和图1A)。用正反向两个引物对待测样品进行PCR扩增，靶DNA的扩增产物中生物素标记的链与芯片表面的探针序列互补并特异性杂交，然后采用抗生物素的抗体进行显色反应(参见图1B)。反应的产物沉淀于芯片上从而增加薄膜的厚度，由于薄膜厚度的改变使其表面的颜色发生变化，由金色变为蓝色或紫色，从而肉眼可进行辨别或采用数字成像系统进行记录。
二、检测SNP位点或点突变时，合成一对寡聚核苷酸作为P1捕捉探针，通过5’端与芯片表面共价结合(参见图1A和图1C)。这两个P1探针分别由10-12个碱基的间隔序列和35-50个碱基的序列组成，该35-50个碱基的序列互补于靶基因中相关SNP位点(或点突变位点)一侧的DNA序列，它们的差别仅在于其3’末端核苷酸分别与该SNP(或点突变)的不同等位基因相对应。P2探针互补于该SNP(或点突变)位点另一侧的相邻序列，其3’端有生物素标记，5’端带有磷酸基。在杂交体系中加入热稳定的连接酶以便进行P1—P2连接，在55-65℃条件下完成DNA杂交过程和连接反应，反应时间不超过20分钟。用氢氧化钠进行严格洗涤以去除未连接的DNA分子，当P1与靶DNA完全匹配时带有生物素标记的P2附着于芯片上，使用HRP标记的抗生物素IgG和可沉淀的底物进行检测(参见图1C)。
具言之，本发明利用可视薄膜感受器芯片检测特异DNA序列的方法包括如下步骤：
1)将特异序列的单链寡核苷酸探针通过乙醛共价结合于肼衍生的可视薄膜感受器芯片表面，该探针从5’到3’端依次是10—12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35—50个碱基的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列；
2)PCR扩增待测样品的目标DNA序列，其中反向引物5’端带有共价结合的生物素；
3)将变性后的PCR产物与芯片进行杂交，洗涤；
4)芯片与辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素抗体杂交，洗涤；
5)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，如与四甲基联苯胺室温反应5min，然后水洗，干燥，观察结果，芯片表面从金色变为蓝色或紫色表明样品中含有该特异DNA序列。
上述步骤1)具体又可通过下列步骤实现：
1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含1—10μM的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的pH8.2的0.1M硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗干净，备用；
1-2)合成捕捉探针，该探针从5’到3’端依次是10—12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35—50个碱基的与特异DNA序列完全匹配的正向链序列，并用乙醛基团修饰探针的5’端；
1-3)将5’端带有乙醛基团的探针稀释为不同浓度，取1—200nl点样至芯片上，室温反应2小时后用去离子水浸洗，60℃浸于0.1％SDS中2小时，水洗，干燥。
上述步骤3)杂交液为5×SSC(1×SSC溶液含有柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)2.2克，氯化钠4.4克，定容至500毫升蒸馏水)和5mg/ml酸解酪蛋白溶液，45℃杂交10-15分钟，在这个过程中目标PCR扩增子中生物素标记的反向链通过碱基配对与捕捉探针结合，然后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片以去除非特异性的结合。
上述步骤4)杂交液为5×SSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10％甘油溶液，在杂交液中18-25℃温育5min后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片，其中HRP标记的生物素抗体通常是抗生物素的IgG。
本发明利用可视薄膜感受器芯片检测特异DNA位点(SNP位点或点突变)的方法包括如下步骤：
1)将一对特异序列的单链寡核苷酸捕捉探针P1通过乙醛共价结合于肼衍生的可视薄膜感受器芯片表面的不同点样点，所述P1探针从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35—50个碱基组成的序列，两个P1探针的3’末端碱基分别与SNP或点突变的不同等位基因相对应，其余的34—49个碱基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点突变位点一侧的相邻序列；
2)合成一个P2探针，P2探针互补于SNP或点突变位点另一侧的相邻序列，其3’端有生物素标记，5’端带有磷酸基；
3)PCR扩增待测样品的目标DNA序列；
4)在共价结合了P1探针的芯片上加P2探针和变性后的PCR产物，在热稳定连接酶的存在下同时进行DNA杂交反应和P1—P2连接反应；
5)用0.01M的NaOH60℃严格洗涤芯片，然后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片；
6)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；
7)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面从金色变为蓝色或紫色表明该点样点的P1探针与样品的SNP位点或点突变相匹配。
上述步骤1)具体又可通过下列步骤实现：
1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含1—10μM的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的pH8.2的0.1M硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗干净，备用；
1-2)合成一对捕捉探针P1，从5’到3’端依次是10-12个碱基的脱氧腺嘌呤残基和35—50个碱基组成的序列，两个P1探针的3’末端碱基分别与SNP或点突变的不同等位基因相对应，其余的34—49个碱基组成的序列与靶基因中相关SNP或点突变位点一侧的相邻序列互补，用乙醛基团修饰P1探针的5’端；
1-3)将5’端带有乙醛基团的一对P1探针稀释为不同浓度，分别取1—200nl点样至芯片上的不同位置处，室温反应2小时后用去离子水浸洗，60℃浸于0.1％SDS中2小时，水洗，干燥。
上述步骤4)先在芯片上加P2探针和变异Ampligase，在含20mM Tris-HCl，pH8.3，25mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM烟酰胺腺苷酸二核苷酸，0.01％Triton X-100和5mg/ml酸解酪蛋白的连接反应体系中55—65℃预热，然后加入变性后的PCR产物，于55-65℃同时进行DNA杂交反应和P1—P2连接反应。
上述步骤6)杂交液为5×SSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10％甘油溶液，在杂交液中18-25℃温育5min后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片，其中HRP标记的生物素抗体通常是抗生物素的IgG。
本发明利用可视薄膜感受器芯片技术检测植物或其他机体基因组的特异核苷酸序列和分子标记，具有下列优点：
●可以替代其它检测特异核苷酸序列的方法，包括：
实时PCR：此方法的特点是快速、灵敏，但是价格昂贵，要求特定的热循环仪和特定的荧光探针，并且易于产生假阳性信号；
限制性片段长度多态性：此方法冗长费时；
随机扩增多态性DNA：要求大量PCR扩增工作，并且对实验条件敏感，重复性差；简单序列重复：易于造成错误信息；
单核苷酸多态性：需要采用昂贵的仪器进行高通量的分析，或不采用昂贵的仪器但是比较费时费力；
微阵列技术：要求昂贵的仪器和训练有素的技术人员。
●结果可肉眼看见
●方法快速、强大、灵敏度高、特异性高
●不需要昂贵的仪器投资，此方法可应用于任何可进行基本的PCR操作的分子生物实验室
●灵敏度比凝胶电泳高1000倍以上。
这项技术可针对任何核苷酸序列的检测进行定制，可以广泛应用于作物育种、性状基因测序、谷物和食品及环境中的病源微生物检测、转基因植物及其产品的鉴定、外来植物物种入侵和植物疫情的快速检测及生物物种资源的快速检测等任何需要进行特异核苷酸序列鉴定的工作中。具体说来，其应用领域包括：
快速、经济的检测和鉴定
●特异的单核苷酸对
●用于快速的植物后代基因分型
●商品化食品样品中的植物转基因的存在
●检测植物的交叉授粉
●检测植物疫情
●植物物种资源
●食品和环境中的病原体的存在
●任何有机体的基因突变
●转基因动物中转基因的存在
总之，本发明提供了一种利用可视薄膜感受器芯片检测有机体或环境中特异核苷酸序列的新方法，该方法的突出优点是采用了可视薄膜感受器芯片，使得实验结果肉眼可见。同时，该方法快速、易用、高通量、灵敏度高、特异性强、应用广泛，并且与已存在的实验方法相比价格低廉，无需昂贵的设施和仪器，可以广泛用于可进行普通PCR实验的实验室。这项技术首先可应用于遗传修饰植物，也可用于动物和微生物的检测。对于普遍的植物基因探针，完全选择性的灵敏度可达10-15M。可以定制芯片用于从已商业化的遗传修饰植物中检测转基因标记，芯片上信号的强弱与特定基因标记的浓度相关。这项技术可以在干扰核酸浓度高于靶核酸100倍的混合物体系中精确检测出靶核酸序列。
附图说明
图1是采用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的原理示意图。其中：
A示意了捕捉探针通过5’端的乙醛基与芯片表面的肼基共价结合而固定于芯片上；
B示意了用可视薄膜感受器芯片检测遗传修饰作物的原理，进行PCR反应的反向引物的5’端标记有生物素，扩增产物中一条生物素标记的链与芯片表面的探针序列互补并特异性杂交，然后采用抗生物素的抗体进行显色反应；
C示意了利用可视薄膜感受器芯片进行SNP检测的原理。
图2显示了用可视薄膜感受器芯片检测遗传修饰作物中的转基因的特异性和敏感性。其中：
A显示了用手工进行不同浓度的捕捉探针点样时检测的特异性和敏感性。lectic基因和CaMV35S启动子的捕捉探针(浓度分别为0.001，0.01，0.1，1μM，分别手工点样200nl于芯片表面上(左栏)。CaMV35S启动子的PCR产物(浓度分别为100μl的反应体系中含0，0.1，1，10和100fmol)分别加样于五个同样的芯片上(右栏)。
B显示了计算机控制的移液器进行捕捉探针点样时检测的特异性和敏感性。每个点点样40nl的1.0μM探针溶液。捕捉探针的点样顺序显示在左栏，其中：M是生物素-dA20，正对照标记；点1—4是内源基因：1.Lectin凝集素(大豆)；2.Ivr1(玉米)；3.Accg8(油菜)；4.Sad1(棉花)；点5—8是筛选标记：5.CaMV35S promoter，花椰菜花叶病毒的35S启动子；6.NOS terminator；胭脂碱合成酶基因终止子；7.nptII，新霉素-3’-磷酸转移酶基因；8.GUSgene；点9—12是鉴定标记：9.CryIAb，苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因；10.CryIAc，苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryAc基因；11.BAR(pat)草丁膦乙酰转移酶基因；12.cp4-epsps，农杆菌CP4的5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因。Accg8PCR扩增子(浓度分别每100ul反应体系含0，0.1，1，10，100fmol)用于5个同样的芯片上。
图3显示了用可视薄膜感受器芯片对遗传修饰作物进行检测的结果。其中：
A是遗传修饰作物种子中的转基因和内源基因的PCR产物的凝胶电泳检测图；
B是PCR产物的混合物与芯片进行杂交，对遗传修饰作物的转基因和内源基因进行检测的结果照片。
图4显示了用可视薄膜感受器芯片对水稻、拟南芥、番茄中的SNP标记进行检测的结果。
其中：
A显示了四个SNP捕捉探针的点样位置(左栏)和不同水稻(indica and japonica)的SNP检测结果代表图(右栏)；
B显示了两个生态型特异的SNP(1—4)和COP1基因的两个点突变(5-8)的捕捉探针的点样位置(左栏)，以及Col，Ler，cop1-4，cop1-6的PCR产物检测结果代表图(右栏)；
C显示了番茄育种图中的两个母本和六个F2子代的SNP基因分型图。
图5显示了样品中的特异SNP分子的丰度与芯片检测信号强度的相关性。其中：
上部为芯片检测结果图，下部为定量图，当两种SNP的比例范围小于1000时，信号与两种PCR产物的相对量成比例关系。
图6是用可视薄膜感受器芯片SNP技术对一个新的突变进行染色体作图的示意图。
以拟南芥2号染色体下部的COP1位点为例，其中：
A收集突变体分离的F2代群体并进行作图过程的说明。F2代群体汇集为一个池，提取DNA，进行基因组范围的SNP标记分离分析。
B拟南芥Col-和Ler-生态型2号染色体中特异的SNP频率。SNP标记在靠近COP1位点时，会偏向产生原始突变的亲本。
具体实施方式
下面通过具体实验及其结果进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
材料与方法
1.可视薄膜感受器芯片的设计和制作
可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片购自Inverness Medical-Biostar，Louiville，CO.USA，是直径10厘米、表面覆盖475埃氮化硅的晶片。利用旋转涂布方式在晶片表面涂布145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，此层吸收了聚(苯丙氨酸-赖氨酸)。将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的晶片在25毫升含1—10μM的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的0.1M硼酸钠(pH8.2)中处理2小时，去离子水洗干净，备用。在寡核苷酸的5’端合成乙醛亚磷酸胺。用0.1M硼酸钠(pH7.8)将乙醛标记的寡核苷酸稀释为不同浓度，取1—200nl点样至晶片上。室温(20-25℃)反应2小时后，用去离子水浸洗晶片，60℃浸于0.1％SDS中2小时，水洗，干燥。制备好的芯片可以在室温保存6个月。
在本发明的具体实验中，对于检测遗传修饰作物(GMO)中的特异核苷酸序列，在GenBank数据库中检索序列来设计PCR引物和捕捉探针。PCR引物来自于四个转基因作物：大豆、玉米、油菜籽、棉花，序列如表1所示。反向引物的5’端标记有生物素用来显示结果。捕捉探针的5’端有乙醛基团修饰，可以与薄膜上的肼基团反应，从而将捕捉探针固定于芯片上，以10个脱氧腺嘌呤为间隔，与互补于靶序列的40个核苷酸成为一条链。寡核苷酸由Invitrogen(USA)合成。
表1.GMO检测中所用PCR引物和捕捉探针的寡核苷酸序列
*F，正向PCR引物；R，反向PCR引物；P，探针；ALD，甲醛修饰。
对于SNP检测，寡核苷酸设计如表2所示。对于每一个SNP设计一对50个核苷酸的P1捕捉探针，它们唯一的差异在于其3’末端的碱基相对应于不同的SNP型。P1捕捉探针的5’端被修饰以便与芯片表面反应，紧接着是10个脱氧腺嘌呤残基组成的间隔和互补于靶序列的40个核苷酸。第二个探针(生物素—P2)含有与SNP位点紧密相邻的20个核苷酸组成的序列(图1C)，其3’端标记有生物素，5’端带有磷酸基用来与特异等位基因进行连接。P1、P2探针由Invitrogen公司合成(50nmole)。
表2.SNP检测中所用P1、P2和PCR引物的寡核苷酸序列
| P1、P2和PCR引物序列 | PCR产物长度(bp) | 序列号 | |
| 水稻 | |||
| SNP-479409位于10号染色体位置16406758 | P1-A indica：ALD-aaaaaaaaaactacaaggagacaaataaacaaggtgttgtatataacaaaP1-T japonica：ALD-aaaaaaaaaactacaaggagacaaataaacaaggtgttgtatataacaatP2：5’-phosphate-aataaacacatacctggata-biotin-3’Primer forward：tgccgagcctgtgtattatgPrimer reverse：gctaaactattttgtgtccccc | 150 | 3738394041 |
| SNP-33400位于4号染色体位置27582119 | P1-G indica：ALD-aaaaaaaaaaaaagaaatttgacctatctaccataaacaattccaaagcgP1-A japonica：ALD-aaaaaaaaaaaaagaaatttgacctatctaccataaacaattccaaagcaP2：5’-phosphate-cttcgccgcaacaaatatct-biotin-3’Primer forward：ggttgcatcatctgtatctcagPrimer reverse：cagcatcaatgacattaaccac | 199 | 4243444546 |
| SNP-33402位于4号染色体位置27582637 | P1-C indica：ALD-aaaaaaaaaacaactgtgtagctttatatagcagaaaaatatagtaaagcP1-T japonica：ALD-aaaaaaaaaacaactgtgtagctttatatagcagaaaaatatagtaaagtP2：5’-phosphate-gcatatagaattgaaataat-biotin-3’ | 126 | 474849 |
| Primer forward：gcagaataggatcatgagtagcPrimer reverse：agtcctggatctgttcaaaatc | 5051 | ||
| SNP-481007位于4号染色体位置27385971 | P1-G indica：ALD-aaaaaaaaaaaccaggaagctccatttcttgcagaaatcagcatggaatgP1-C japonica：ALD-aaaaaaaaaaaccaggaagctccatttcttgcagaaatcagcatggaatcP2：5’-phosphate-tgagcctttagcatcaagtt-biotin-3’Primer forward：cagccaaggttggtagttcPrimer reverse：agtaggccatacaccatgatac | 161 | 5253545556 |
| 拟南芥 | |||
| SNP COP1位置690 | P1-G Columbia：ALD-aaaaaaaaaaaatagatttataccgagctagggacagatattctgtatagP1-A Landsberg：ALD-aaaaaaaaaaaatagatttataccgagctagggacagatattctgtataaP2：5’-phosphate-ttgcggatgctcggagatga-biotin-3’ | 575859 | |
| SNP COP1位置1722 | P1-C Columbia：ALD-aaaaaaaaaaacacaagaaagcagtttcctatgttaaatttttgtccaacP1-T Landsberg：ALD-aaaaaaaaaaacacaagaaagcagtttcctatgttaaatttttgtccaatP2：5’-phosphate-aacgagctcgcttctgcgtc-biotin-3’ | 606162 | |
| cop1-4突变 | P1-C wildtype：ALD-aaaaaaaaaagggctaccaaagaaggatgcgctgagtgggtcagattcgcP1-T mutantincop1-4：ALD-aaaaaaaaaagggctaccaaagaaggatgcgctgagtgggtcagattcgtP25’-phosphate-aaagtttgaatcagtcaact-biotin-3’ | 636465 | |
| cop1-6突变 | P1-G wild type：ALD-aaaaaaaaaagcacagattgcctaattctgttaaagtgtcttgtcttgtgP1-A mutantin cop1-6ALD-aaaaaaaaaagcacagattgcctaattctgttaaagtgtcttgtcttgtaP2：5’-phosphate-gttcaatgatttacaagaat-biotin-3’ | 666768 | |
| PCR引物 | Forward：5’-tgccgttgagagacatagaatag-3’Reverse：5’-gtgtgctatctgtggacgcag-3’ | 1123 | 6970 |
| 番茄 | |||
| SNPTG576 | P1-G L.esculentum：ALD-aaaaaaaaaatgaccaggttctatctctctcattctctttctttgatgtgP1-T L.pim pinellifolium：ALD-aaaaaaaaaatgaccaggttctatctctctcattctctttctttgatgttP2：5’-phosphate-ctggttattgtttctgaaac-biotin-3’Primer forward：tcatcacttggatggtaatgcPrimer reverse：tgaaactaggcagaaaagcag | 150 | 7172737475 |
| SNP BAC33R | P1-A L.esculentum：ALD-aaaaaaaaaaaaattttaaattttgaatccgcgagcataaataatgtcgaP1-G L.pimpinellifolium：ALD-aaaaaaaaaaaaattttaaattttgaatccgcgagcataaataatgtcggP2：5’-phosphate-agagtgatatgtgttacaac-biotin-3’Primer forward：aaaacattaactacttcatccgPrimer reverse：ttttccccagaggagagtac | 133 | 7677787980 |
2.植物材料和PCR反应条件
大豆、玉米、油菜籽、棉花的遗传修饰作物种子和负对照均由中国天津海关检疫局提供。本发明所用的遗传修饰作物包括Roundup Ready(RUR)牌的大豆(Glycine max)，玉米(Zea mays)BT11，油菜籽(Brassica napus)RUR和棉花(Gossypium hirsutum)SGK9708。采用
试剂盒(Promega，USA)提取基因组DNA。
水稻indica和japonica基因组DNA由中国科学院遗传发育生物所的朱立煌教授提供。拟南芥Col，Ler及两个copl突变体的基因组DNA提取自种子，所用试剂盒为Qiagen DNA提取试剂盒。番茄亚种L.esculentum和L pimpinellifolium的基因组DNA由俄亥俄州立大学的Dr.Esther van der Knaap提供。
利用PCR从植物基因组DNA中扩增靶序列。采用DS Gene软件(Accerlrys，San Diego，CA)设计引物，目标产物的大小为110到350碱基对。20μl的PCR反应体系含有PCR缓冲液(AmpliTaq Gold，AppliedBiosystem)，2.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，200nM正、反向引物，100ng基因组DNA，1单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶。PCR反应程序为95℃10分钟后，94℃15秒，56℃30秒，72℃30秒，40个循环，72℃延伸5分钟。采用Quant-iTPicogreen dsDNA Kits(Molecular Probe/Invitrogen)进行PCR产物定量，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量。
3.可视薄膜感受器芯片检测遗传修饰作物种子中的转基因成分
用手工或计算机控制的纳升移液器(BioDot dispense arrayer AD3200)以每点200或40nl的体积将乙醛标记的探针点在芯片上。1.0μM的寡聚核苷酸探针溶于0.1M磷酸钠缓冲液中，pH7.8。PCR扩增产物(100—350bp)浓度为100fmol/100μl反应体系，首先进行变性，然后与芯片45℃杂交10分钟，杂交液为5×SSC和5mg/ml ATC(酸解酪蛋白)。用0.1×SSC洗三次之后，芯片与HRP标记的抗生物素IgG(Jackson ImmunoResearch)在杂交液中温育5分钟，其中HRP标记的抗生物素IgG的母液浓度为1mg/ml，使用前用5×SSC/5mg ml-1ATC/10％甘油稀释1,000倍。然后用0.1×SSC洗芯片三次，在芯片上加入100μl的四甲基联苯胺(TMB)(BioFx Laboratories，Owings Mills，MD))室温温育5分钟。用双蒸水(ddH2O)洗芯片，空气干燥，用肉眼观察或显微镜(Olympus，SZX12)照相。
4.可视薄膜感受器芯片检测SNP
在可视薄膜感受器芯片上手工点样P1捕捉探针(ThermoBioStar，Louisville，CO)如图4所示。P1捕捉探针溶液组成为0.2μl的1μM的P1(用0.1M磷酸缓冲液配制)，pH7.8，10％甘油。室温温育2小时后，芯片用0.1％SDS和ddH2O进行洗涤，空气中干燥。连接反应体系包括20mM Tris-HCl，pH8.3，25mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM烟酰胺腺苷酸二核苷酸，0.01％Triton X-100，5mg/ml酸解酪蛋白，10nM生物素标记的P2探针和0.04单位/μl的变异Ampligase(Lys294Arg of T.thermophillus ligase)，将连接反应混合物上样至芯片表面，60℃预热。浓度为100fmol的10μl PCR产物95℃变性3分钟后，将10μl的变性液立刻加入已预热好的连接反应混合物中，60℃温育10分钟。先用0.01M NaOH于60℃严格洗涤三次，再在室温下用0.1×SSC简单洗涤三次。将芯片与100μlHRP标记的抗生物素IgG(Jackson ImmunoResearch Lab)室温温育5分钟，其中HRP标记的抗生物素IgG的的母液浓度为1mg/ml，使用前用含5×SSC和5mg/ml酸解酪蛋白的缓冲液稀释1,000倍。用0.1×SSC溶液简单洗涤3次后，在芯片表面加100μl的四甲基联苯胺(BioFX Lab)，室温温育5分钟，双蒸水洗涤，空气干燥。观察芯片表面的颜色变化或用带有数码相机的显微镜进行照相记录。
结果
1.可视薄膜感受器芯片的灵敏度和特异性参数
为了获得芯片表面的最适探针密度，选用凝集素基因lectin和CaMV35S启动子的探针，将它们稀释成系列的梯度，如图2A左所示，每种探针的浓度分别为0.001，0.01，0.1，1μM的200nl溶液手工点样在芯片表面。芯片与CaMV35S启动子PCR产物(分别为0，0.1，1，10和100fmol于100μl的反应体系中)42℃杂交10分钟。室温下用0.1×SSC溶液洗芯片一次，与HRP标记的抗生物素IgG温育5分钟，再与底物TMB温育5分钟。然后进行洗涤、干燥、检测(图2A右)。检测结果显示，只有含有CaMV35S启动子探针的点被检测到，而含有lectin基因的点没有信号，表明此项检测有较高的特异性。随着靶DNA序列浓度的降低，信号的强度也降低，最高浓度的探针(1μM)可检测到低至0.1fmol的靶序列。如果靶PCR的量为100fmol，使用浓度为0.01μM的探针即可检测到信号。探针浓度高于1μM并不能提高检测的灵敏性，因此，后续实验所采用的探针浓度皆为1μM。
本发明进一步做了点样尺寸大小和靶DNA浓度对于探针灵敏度影响的研究(图2B)。采用计算机控制的纳升级移液器(BioDot dispense arrayer AD3200)点样，每点体积为40nl，浓度为1.0μM(图2B左)，进行三次重复点样。根据靶基因的特点将探针分为三组：第一组是待检植物物种的内源基因，包括大豆凝集素基因lectin、玉米转化酶基因(Ivr1)、油菜籽ACC合成酶基因(Accg8)、棉花硬脂酰—ACP—去饱和酶基因(纤维特异性的酰基载体蛋白)(Sadl)；第二组包括检测启动子、标记基因和常用转基因终止子的探针，例如CaMV35S启动子、nptII，、GUS和NOS的终止子。第三组是鉴别性状基因(如除草剂耐受性或昆虫抗性)的探针，包括来自于CP4农杆菌的抗除草剂基因：5—烯醇—丙酮醛—3—磷酸合成酶基因(cp4-epsps)、草丁膦乙酰转移酶基因(pat)、Bt毒素基因(CryIAb，CryIAc)(参见表1)。选择Accg8基因作为靶基因进行杂交反应，其浓度范围是100μl反应体系中0.1—100femtomoles。结果显示，采用1—100femtomoles的靶DNA可以检测到清晰的信号，100femtomoles时信号达到饱和(图2B右)。此实验提示反应体系为100μl时，最适的靶基因含量为1—100femtomoles。在已检测浓度下，靶基因与其它探针都不存在交叉反应，从而验证了本检测方法的特异性非常高。研究表明每张芯片可以根据需要设计不同的探针密度，范围从16至2500个点不等。
2.可视薄膜感受器芯片来检测遗传修饰作物中的转基因
用图2B左所示的芯片来检测遗传修饰作物(大豆、玉米、油菜籽、棉花)样本中的转基因成分。利用PCR成功扩增得到靶DNA片段(图3A)，将之与芯片杂交。例如，RoundupReady大豆样品中扩增出5个与预期大小相符合的靶DNA片段，它们分别为Lectin，CaMV35S promoter，NOS terminator，cp4-epsps，and nptII(图3A)。相同体积的以上5种PCR产物混合，用于100μl体系的杂交反应，芯片上五组预期的相应点显色(图3B，下左)。用玉米基因组为模板扩增Ivr1，CaMV35S启动子，NOS终止子，BAR(pat)and CryIA(b)的相应片段(图3A)，将它们混合用于芯片的检测(图3B)结果呈阳性.；油菜籽Roundup Ready样本和Bt棉花SGK9708样本中也获得了阳性结果(图3A和3B)。在上述实验中，所有五种探针都与预期的靶DNA杂交并且产生了阳性信号。在检测中没有出现假阳性信号。而来源于非转基因的对照样品，结果显示只有在内源基因的点上有信号(数据没有显示)。以上结果显示用户特制的芯片可以用来检测这4种遗传修饰作物，并且通过对芯片的改进，可满足检测其他已商品化的遗传修饰作物的需要。
值得关注的是，在检测基因特异的PCR片段方面，本发明所用的薄膜感受器芯片技术优于凝胶电泳的检测方法，主要体现在以下几方面：芯片检测更灵敏，至少高于凝胶检测的1000倍，因此能够用较少的样本量检测转基因；芯片技术可以排除非特异的PCR片段，而在凝胶电泳和实时PCR检测中这种非特异性的扩增会产生假阳性信号。
3.利用可视薄膜感受器芯片检测技术进行植物检疫
结合检疫口岸各种病毒检出的频率统计、病毒的性质(RNA病毒/DNA病毒)和国内植物病毒爆发情况，确定以豆科植物和茄科植物的RNA病毒为检测对象。有29种病毒既能侵染豆科植物也能侵染茄科植物；有11种病毒是特异侵染豆科植物；有6种病毒是特异侵染茄科植物的。选用的病毒为：苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus，AMV)、南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaic virus，BlCMV)、豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)、香石竹环斑病毒(Carnation ringspotvirus，CRSV)。与图2B左图相同的芯片用来检测口岸检疫病毒。采用PCR成功地扩增出了目标靶片段，并且将其与芯片杂交。所有的五种探针都与预期的靶DNA杂交并且产生了阳性信号。在这些检测中没有发现假阳性信号(数据没有显示)。结果显示特制的芯片可以用来高通量快速检测植物病毒，满足日益增长的进出口需要。
4.可视薄膜感受器芯片检测食品和环境中的病原微生物
食品卫生检验一个重要的内容是及时准确的检出致病性微生物，食品检验微生物包括常见的致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌等。我们选择金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行芯片实验，采用的策略与图2B左相同。采用PCR成功地扩增出了目标靶片段，并且将其与芯片杂交。所有的探针都与预期的靶DNA相杂交并且产生了阳性信号。在这些检测中没有发现假阳性信号(数据没有显示)。这个芯片技术可以及时快速的检测食品或环境中致病菌的存在。
5.可视薄膜感受器芯片检测indica和japonica特异的SNP
从indica/japonica SNP数据库中(http://plantgenome.agtec.uga.edu/snp)选出四个SNP标记，来检测可视薄膜感受器芯片技术是否具有通过基因组特异的SNP鉴别区分indica和japonica水稻的能力。这4个SNP号码分别为33400G/A(indica/japonica)、33402C/T、481007G/C、479709A/T。提取两个水稻亚种9311(indica)和Nipponbare(japonica)的基因组DNA。用位点特异的4对引物同时进行PCR反应对SNP特异的目标序列进行扩增(参见材料与方法)。四个已选的SNP P1捕捉探针(表2)手工点样排列于芯片上，indica的探针位于左边，japonica的探针位于右边(图4A左)。将扩增产物与芯片进行杂交，只有相应的基因组特异的SNP P1捕捉探针的四个点产生信号(图4A右)。Japonica的靶DNA与两个Indica特异的SNP探针有微弱的交叉反应(第1点和第5点)。通过增加杂交和洗涤的严格度即可容易地消除这种交叉反应(数据未显示)。获得靶DNA的PCR片段后，后续的检测过程30分钟即可完成，并且所用实验仪器简单(温育为50—65℃水浴，以60℃为最适，变性DNA时为95℃热休克)，实验结果肉眼可见，不需要任何其它的图像处理仪器。
6.拟南芥的SNP位点和点突变的检测
采用可视薄膜感受器芯片SNP技术平台进行拟南芥生态型(Columbia(Col)andLandsberg erecta(Ler))的检测和目标基因点突变的检测。拟南芥COP1基因的SNP和点突变的检测如图4B所示。COP1基因(组成型的光形态发生位点1)编码拟南芥的光形态发生发育中一个非常重要的调控蛋白。COP1基因位于2号染色体下臂中部，并且据报道该基因具有几个生态型特异的SNP和点突变(McNellis et al.，1994)。本发明检测了两个生态型的SNP690G/A和1722C/T(Col vs.Ler，从COP1基因的起始密码子的A碱基开始计数)，及两个COP1基因突变：cop1-4在889位点C/T(Col野生型/突变型)和cop1-6在945位点G/A。四对SNP P1的捕捉探针手工点样于芯片上(图4B左)。PCR扩增Col，Ler，cop1-4和cop1-6的靶DNA，产物是覆盖所有四个COP1SNPs的长为1.1kb的单片段。结果显示所有的靶DNA都与匹配的P1探针反应，并且四个SNP标记的鉴定的结果明确清晰(图4B右)。
7.SNP检测作为标记工具辅助番茄育种
可视薄膜感受器芯片SNP技术平台用于育种中对分子标记的遗传传递性检测，是一种简单、快速、价格低廉的技术，本发明以番茄的育种为例进行研究，利用两个紧密连锁的番茄SNP标记(TG576和BAC33R)对F2子代进行基因分型(图4C)。如图4C左所示，在芯片的上排手工重复点样TG576P1捕捉探针，左边的两点为TG576P1-G(基因型为L.esculentum)，右边的两点为TG576P1-T(基因型为L.pimpinellifolium.)。在下排重复点样BAC33R P1捕捉探针，左边的两个点为P1-A(L.esculentum)，右边的两个点为P1-G(L.pimpinellifolium)。两个亲本Sun1642(L.esculentum)和LA1589(L.pimpinellifolium)以及有代表性的F2子代的SNP靶DNA区域的PCR产物于硅片上进行基因分型。两个亲本和六个F2子代的两个SNP标记的基因分型如图4C所示。结果显示这种简单的SNP检测方法可以通过这两个SNP位点鉴定所有F2子代的基因型。
8.在DNA混合物中进行SNP的丰度定量
可视薄膜感受器芯片SNP检测技术中靶DNA的有效浓度范围广泛，并且信号的强度与靶DNA浓度呈正相关性。因此，本发明探索了通过测定信号的强度来定量靶分子丰度的可行性。对水稻两个亚种的DNA样本进行PCR扩增，PCR产物覆盖SNP-470409，以不同比例将两个样品混合(0.1:100—100:0.1femtomoles)。水稻的SNP-479409捕捉探针P1-A(indica)和P1-T(japonica)手工点样于芯片上，设置4个重复，每个点体积为200nl(1μM)。来自于indica和japonica的SNP-479409的两个PCR产物的混合物(如上所述的比例)与芯片进行杂交。如图5所示，信号的强度和靶DNA的浓度呈严格的正相关，完全没有交叉反应(图5上)。通过扫描图像对信号强度定量后作图(图5下)。结果发现，当两个等位基因的特异DNA片段比例范围为100倍(1/100or100/1)时，可视薄膜感受器芯片SNP检测技术可以定量两个SNP种类的相对丰度。因此这项技术可以从样品中检测出1/100的特定序列。
讨论
本发明提供了一种快速、准确、低廉的采用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸或SNP标记的方法。在30分钟内即可高度灵敏地完成对PCR片段的检测。由于实验所需的化学和生物试剂成本低，并且感受器芯片的尺寸小，这种方法价格低廉。而且，这种方法具有高度的灵敏性和特异性，可以根据需要进行高、中、低通量的检测。更重要的是，与其它高通量方法比起来花费要低得多。这项技术还可以根据需要特制芯片以检测某些特异的核苷酸序列，具有广泛的应用前景，如性状基因克隆、植物商品的基因修饰检测、标记辅助育种、SNP标记辅助的植物种系鉴定、病原体的检测等方面。
采用可视薄膜芯片检测植物转基因的存在
自从1996年第一个遗传修饰作物的商品化以来，已有一些遗传修饰作物进入了全球市场(http://www.agbios.com，http://www.isaaa.org，Conneretal，2003；Napetal.，2003；Burke，2005；Pray et al，2002)，遗传修饰作物的引入迫切需要一种快速、可靠、价格低廉的方法检测作物中的转基因的存在。目前，国际上多数转基因作物商品化的国家要求标明转基因食品，所以对于食品的转基因身份确认非常重要。此外，自然环境中鉴定转基因和非转基因作物和可能的交叉授粉也要求快速廉价的检测技术(Cockburn，2002；Engel etal，2002；Halford and Shewry，2000；Koniga et al，2004)。目前，有三种基本方法检测转基因：1)检测DNA，主要是对特定的DNA序列进行PCR扩增，然后鉴定产物，这种方法费时、昂贵、易产生假阳性(Chiueh et al，2002；Su et al，2003；Hernandes et al.，2004)；2)检测转基因作物中特异表达的蛋白，经常使用直接双抗和间接三抗三明治ELISA方法检测转基因作物中是否含有特定蛋白及其表达水平(Allen，1990；Lipp etal.，2000；Miraglia et al.，2003)。这个方法具有简单、特异性高、易定量的优点，但它的灵敏度低，并且对于已加工的食品不适用。例如，在绿色组织中表达的基因(如玉米的CryIAb)，在核、果实中用蛋白则检测不到；3)微阵列法，此方法可以对一个样本同时进行不同转基因的检测(Birch et al.，2001；Miragliaet al.，2003；Taton et al.，2000)，这项检测所需仪器昂贵，超出许多实验室的承受能力。可视薄膜感受器芯片技术在成本、灵敏度、使用方便性和检测速度方面，优于其它现有的技术。这项技术应用范围广，例如，设计特异的探针可以利用可视薄膜感受器芯片可以检测食品中的病原体。
可视感受器芯片用于植物中SNP标记的基因分型
植物基因组中有大量SNP标记，是进行分子育种、性状作图、和基因型鉴定的理想标记。例如，可以用一组SNP标记的存在与否来辨别纯合型种系或者杂交后代的亲本。同时SNP标记也是用来分析遗传多样性、遗传性状的连锁分析、突变作图和染色体性状位点分析最普遍的一种标记。因此使用快速、可靠、价格低廉的SNP检测方法可以显著加快植物学研究(作物育种、种系鉴定等)。
如果SNP标记覆盖整个基因组，利用可视薄膜芯片技术可以作为基因组范围的SNP检测。其原因是SNP技术可以高度特异、灵敏、快速地鉴别靶DNA。可视薄膜芯片具有较强化学稳定性，不需使用昂贵的仪器就可以获得信号。利用这种技术可以在作物育种时进行快速的后代基因分型，而通常，后代基因分型和筛选过程是作物育种过程的限速步骤。SNP是等显性标记，使用可视薄膜感受器芯片技术可以检测基因组DNA任意特定位点的SNP形式，使用本技术可以加快作物育种的进程。此外，由于易用、低成本、不需要昂贵的仪器，这种方法能被育种实验室尤其是发展中国家的实验室所接受，相比而言，目前其它检测SNP的方法都需要昂贵的仪器。
利用间隔比例合适的覆盖模式植物基因组的SNP标记芯片可以使突变研究中的染色体作图过程简化。F2代中的突变个体在突变位点保留原始突变植株的基因型。将几百个来自于F2代突变个体的DNA汇集，并进行SNP标记鉴定，在突变位点附近的SNP标记性状会向产生原始突变的植株偏离(参见图6)，但在其它位点带有父本和母本SNP标记性状的几率相等。如图5所示，可视薄膜SNP检测技术可以对靶DNA中单个位点的SNP标记丰度进行定量。利用这项技术也可对子代中偏离产生突变亲本基因型的位点进行描述和定位。
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序列表(SEQUENCE LISTING)
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<120>利用可视薄膜感受器芯片检测特异核苷酸序列的方法
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Claims (3)
1.一种利用可视薄膜感受器芯片检测SNP位点或点突变的方法，包括以下步骤：
1)将一对特异序列的单链寡核苷酸捕捉探针P1通过乙醛共价结合于肼衍生的可视薄膜感受器芯片表面的不同点样点，所述P1探针从5’到3’端依次是10-12个脱氧腺嘌呤残基和35-50个脱氧核苷酸残基组成的序列，两个P1探针的3’末端脱氧核苷酸残基分别与SNP或点突变的不同等位基因相对应，其余的34-49个脱氧核苷酸残基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点突变位点一侧的相邻序列；
2)合成一个P2探针，P2探针互补于SNP或点突变位点另一侧的相邻序列，其3’端有生物素标记，5’端带有磷酸基；
3)PCR扩增待测样品的目标DNA序列；
4)在共价结合了P1探针的芯片上加P2探针和变性后的PCR产物，在热稳定连接酶的存在下同时进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应，而且其中先在芯片上加P2探针和变异Ampligase，在含20mM Tris-HCl，pH 8.3，25mM KCl，10mM MgCl2，0.5mM烟酰胺腺苷酸二核苷酸，0.01％Triton X-100和5mg/ml酸解酪蛋白的连接反应体系中55-65℃预热，然后加入变性后的PCR产物，于55-65℃同时进行DNA杂交反应和P1-P2连接反应，其中所述变异Ampligase是带有Lys294Arg的T.thermophillus连接酶；
5)用0.01M的NaOH 60℃严格洗涤芯片，然后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片；
6)芯片与辣根过氧化物酶标记的生物素抗体杂交，洗涤；
7)在芯片上加辣根过氧化物酶的底物进行反应，水洗，干燥后观察结果，芯片表面从金色变为蓝色或紫色表明该点样点的P1探针与样品的SNP位点或点突变相匹配；
而且步骤1)具体通过下列步骤实现：
1-1)利用旋转涂布方式在构成可视薄膜感受器芯片的薄膜硅质基片表面涂布145埃T型聚氨基碱性聚二甲基硅氧烷，然后将含有聚(苯丙氨酸-赖氨酸)的芯片在含1-10μM的琥珀酰亚氨基烟酸沙星的pH8.2的0.1M硼酸钠溶液中处理2小时，去离子水洗干净，备用；
1-2)合成一对捕捉探针P1，从5’到3’端依次是10-12个脱氧腺嘌呤残基和35-50个脱氧核苷酸残基组成的序列，两个P1探针的3’末端脱氧核苷酸残基分别与SNP或点突变的不同等位基因相对应，其余的34-49个脱氧核苷酸残基组成的序列互补于靶基因中相关SNP或点突变位点一侧的相邻序列，用乙醛基团修饰P1探针的5’端；
1-3)将5’端带有乙醛基团的一对P1探针稀释为不同浓度，分别取1-200nl点样至芯片上的不同位置处，室温反应2小时后用去离子水浸洗，60℃浸于0.1％SDS中2小时，水洗，干燥。
2.如权利要求1所述的检测SNP位点或点突变的方法，其特征在于，所述步骤6)杂交液为5×SSC、5mg/ml酸解酪蛋白及10％甘油溶液，在杂交液中18-25℃温育5min后用0.1×SSC溶液室温洗涤芯片。
3.如权利要求1所述的检测SNP位点或点突变的方法，其特征在于，所述步骤7)所用的辣根过氧化物酶的底物为四甲基联苯胺，室温反应5min。
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