CN1156586C - 一种基因芯片的膜转印检测法 - Google Patents
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Abstract
一种基因芯片的膜转印检测法,在待检测样品的PCR扩增过程中,加入地高辛或生物素标记,然后将PCR产物与芯片进行杂交,杂交以后用抗体与地高辛或生物素标记结合,再用浸润了显色液的尼龙膜或硝酸纤维膜将杂交结果转印到膜上,使杂交信号强度大大提高,以提高检测灵敏度,可用一般的光学扫描仪检测杂交结果。
Description
技术领域
本发明涉及基因芯片,特别是一种基因芯片的膜转印检测法。
背景技术
基因芯片是利用微电子芯片技术的集约化和平行处理原理,将大量具有生物学意义的特点序列的生物样品有序地固化在硅衬底或玻璃上构成,利用基因芯片可以快速地获取或处理大量的生命信息(包括基因的识别、基因突变检测、基因表达谱检测等),其在基因表达、基因突变、基因多态性研究和基因诊断等领域获得成功应用。
使用基因芯片时,靶标样品核酸往往需经过聚合酶链式反应(PCR,以下简称PCR)扩增或克隆或逆转录(mRNA),同位素或荧光标记则在扩增或逆转录过程中进行,然后打碎成文库,经一定的化学处理,靶标样品中核酸与探针进行选择性反应,即杂交反应,接着冲洗去非特异性的DNA,然后用一定的检测设备检测标记信号。完全杂交则发出强的标记信号,不完全的杂交信号较弱,若不能杂交则检测不到信号,经计算机处理得到所需的待测信号。
目前,基因芯片杂交结果的检测方法主要有荧光标记检测法和同位素标记检测法,同位素标记检测法由于操作复杂,有污染,获取数据速度慢等缺点,逐步为荧光标记检测技术所替代,荧光标记检测法以其自身所特有的毒副作用小,灵敏度高,可以多样品平等处理(不同的荧光分子具有不同的波长,可用激光共聚焦扫描仪对不同波长的荧光同时进行扫描而达到多样品同时检测的目的)等优势独树一帜,得到各界人士的青睐。但是由于其信号读取设备价格昂贵,从而大大制约了芯片技术在医学临床诊断方面的应用。目前我国也仅有少数科研组织和公司具备配备该设备的能力。
发明内容
基于上述原因,在芯片的应用领域出现了一种新的检测方法——显色法,该方法采用了传统的酶促反应使杂交信号通过底物颜色呈现于芯片表面,其杂交结果一方面可以使用价格低廉的普通光学扫描仪进行扫描,并将所得图谱输入电脑进行图像分析和数据整理工作,另一方面在信息量较少的情况下也可使用放大镜或裸眼直接观察。从而改善了目前芯片价格昂贵和芯片检测设备价格昂贵而难以推广的现状。但目前应用中的显色方法由于芯片表面对底物的吸附作用较弱,所以杂交信号较弱,检测灵敏度低于荧光检测法,当样品中DNA含量较低的时候,则不容易被检测出来。
鉴于这种情况,本发明的要解决的技术主题就是提供一种基因芯片的膜转印检测法,它结合了生物芯片的高密度性以及膜对显色底物良好的吸附性能,使得杂交的信号强度大大提高,其检测灵敏度与荧光法基本相同,以弥补目前生物芯片显色法的不足。
本发明的技术解决方案是:
一种基因芯片的膜转印检测法,其特点在于利用了传统的酶促反应使杂交信号通过底物颜色呈现于膜表面,从而可以用廉价的光学扫描设计读取数据,具体地说,该方法即在待检测样品的PCR扩增过程中,加入地高辛或生物素标记,然后与芯片进行杂交,杂交以后用抗体与地高辛或生物素标记结合,再用浸润显色液的尼龙膜或硝酸纤维膜将杂交结果转印到膜上;
所说的样品处理和标记的过程是:
将抽提好的DNA溶液2μl与12μl聚合酶链式反应混合液以及1单位TagPlus混合均匀,在聚合酶链式反应热循环仪上通过以下热循环过程制备地高辛标记的DNA样品目的片断,上游及下游引物分别为5′-TCA AAAAGT TGC GTG CTG-3′,扩增条件为:首先94℃,5分钟,以94℃,40秒,55℃,40秒,72℃,40秒循环30次,最后,72℃延伸5分钟。用电泳检测PCR产物;
所说的扩增产物与芯片的杂交的过程是:
取扩增产物1μl与9μl杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片。置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。
在室温下,取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗10分钟,然后将芯片放入洗液II中平衡1分钟,再取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取20μl抗体溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30分钟,使抗体与地高辛或生物素充分结合,同时封阻芯片上的蛋白非特异性结合位点。
去除盖玻片,吸除多余液体,然后置洗液II中荡洗1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体。
所说的转印显色和结果检测的过程包括:
取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取一块1×1cm2的尼龙膜浸润显色液后盖于芯片表面,闭光静置1小时。
揭下芯片表面的尼龙膜并高温拷干,用普通光学扫描仪扫描记录尼龙膜上的信息。
所说的样品处理和标记,是在待检测样品DNA的聚合酶链式反应扩增过程中,在dUTP上加上地高辛或生物素标记,或在引物上加上地高辛或生物素标记。
所述的转印显色是采用硝酸纤维膜浸润显色液后盖在芯片表面。闭光静置1小时,从而将杂交结果转印到膜上。
附图说明
图1是用芯片显色法检测,普通光学扫描仪扫描所得结果。
图2是用本发明方法检测;普通光学扫描仪扫描所得结果。
图3是用荧光法检测,激光诱导的荧光检测仪扫描所得结果。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例及其附图对本发明作进一步说明。
本发明基因芯片的膜转印检测法的具体方法如下:
1、准备材料与试剂
①DNA芯片:自制;
②PCR混合液:200μM dATP,200μM dGTP,200μM dCTP,200μM dTTP,1.25U ptu DNA聚合酶,各0.2μM的上游及下游引物,引物的5′端用地高辛或生物素进行标记。如果引物未加地高辛或生物素标记,则将dTTP浓度改为80μM,另外加入40μM地高辛或生物素标记的dUTP;
③EasyHtyb:购于Roche公司;
④洗液I:150mM NaCl,15mM柠檬酸钠,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS);
⑤洗液II:100mM马来酸(Maleic acid),150mM NaCl,0.3%(v/v)Tween22,pH7.5;
⑥抗体:1U/ml Anti-Digoxigenin-Ap或Anti-Biotin-Ap,1%(w/v)Blocking Reagent(购于Roche公司);
⑦平衡液:100mMTris-HCl,100mM NaCl,pH9.5;
⑧显色液:BCIP/NBT Solution(购于Roche公司);
⑨尼龙膜(购于Roche公司)。
2、具体步骤
(1)将抽提好的DNA溶液2μl与12μl PCR混合液以及1单位Tag Plus(购于上海生物工程公司)混合均匀于PCR热循环仪通过以下热循环过程制备地高辛或生物素标记的DNA样品目的片断,上游及下游引物分别为5′-TGA AAA AGT TGC ATG GTG CTG-3′,5′-CTT TTT CAC CTC TGC CTAATC-3′,扩增条件为:首先94℃,5分钟,以94℃40秒,55℃40秒,72℃40秒循环30次,最后,72℃延伸5分钟,用电泳检测PCR产物;
(2)分别取扩增产物1μl与9μl杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。
(以下步骤均室温下进行)
(3)取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗10分钟,再将芯片放入洗液II中平衡1分钟。(注意不要使芯片变干)
(4)从洗液II中取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取20μl抗体溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30分钟,使抗体与地高辛或生物素充分结合,同时封阻芯片上的蛋白非特异性结合位点。
(5)去除盖玻片,吸除多余液体,然后置洗液II中荡洗1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体。
(6)取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取一块1×1cm2的尼龙膜浸润显色液后盖于芯片表面,闭光静置1小时。
(7)揭下芯片表面的尼龙膜并高温烤干,以终止显色反应,用普通光学扫描仪扫描记录膜上的结果。
下面进行下列实验:
实验一 芯片显色法和膜转印法的样品处理和标记
从病人血清中抽提乙肝病毒基因组DNA(常规方法:蛋白酶K裂解、酚氯仿提取法),将上述抽提的DNA溶液2μl与12μl PCR混合液以及1单位Tag Plus(购于上海生物工程公司)混合均匀于PCR热循环仪通过以下热循环过程制备地高辛标记的DNA样品目的片断,上游及下游引物分别为5′-TGA AAA AGT TGC ATG GTG CTG-3′,5′-CTT TTT CAC CTC TGCCAT ATC-3′,扩增条件为:首先94℃,5分钟,以94℃40秒,55℃40秒,72℃40秒循环30次,最后,72℃延伸5分钟,用电泳检测PCR产物;
实验二 芯片显色法和膜转印法的杂交和洗涤
取扩增产物1μl与9μl杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。
在室温下,取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗10分钟,再将芯片放入洗液II中平衡1分钟。再取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取20μl抗体溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30分钟,使抗体与地高辛或生物素充分结合,同时封阻芯片上的蛋白非特异性结合位点。
去除盖玻片,吸除多余液体,然后置洗液II中荡洗1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体。
实验三 芯片显色法显色和检测
取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取15μl显色液滴于芯片表面,盖上盖玻片,闭光静置1小时。
用去离子水冲掉芯片表面显色液,去离子水冲洗后自然风干,用普通光学扫描仪扫描记录膜上的信息(结果如图1所示)。
实验四 膜转印显色法显色和检测
取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取一块1×1cm2的尼龙膜浸润显色液后盖于芯片表面,闭光静置1小时。
揭下芯片表面的尼龙膜并高温烤干,以终止显色反应,用普通光学扫描仪扫描记录膜上的信息(结果如图2所示)。
实验五 样品的处理和荧光标记
从病人血清中抽提乙肝病毒基因组DNA(常规方法:蛋白酶K裂解、酚氯仿提取法),将上述抽提的DNA溶液2μl与12μl PCR混合液(200μMdATP,200μM dGTP,200μM dCTP,120μM dTTP,80μM的CY3)以及1单位Tag Plus(购于上海生物工程公司)混合均匀于PCR热循环仪通过以下热循环过程制备荧光标记的DNA样品目的片断,上游及下游引物分别为5′-TGA AAA AGT TGC ATG GTG CTG-3′,5′-CTT TTT CAC CTC TGC CATATC-3′,扩增条件为:首先94℃,5分钟,以94℃40秒,55℃40秒,72℃40秒循环30次,最后,72℃延伸5分钟,用电泳检测PCR产物。
实验六 杂交的荧光检测
取扩增产物1μl与9μl杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合。
取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗10分钟。用GeneralScanning芯片信号分析系统Scanarray 3000扫描记录并分析结果(结果如图3所示)。
由图1、图2和图3可以看出,本发明的优点和效果如下:
(1)本发明的膜转印显色检测法可以进行突变检测,具有与芯片显色法和荧光检测法相同的杂交特异性。膜转印法的检测灵敏度与荧光检测法相当,但远远高于芯片显色的方法。
(2)本发明的膜转印显色检测法,同样不需昂贵的荧光检测仪,只需一般的光学扫描仪。
(3)本发明的膜转印显色检测法,可以将较高密度芯片(大于400点/cm2)的杂交结果在膜上显示。
Claims (6)
1、一种基因芯片的膜转印检测法,其特征在于利用了传统的酶促反应使杂交信号通过底物颜色呈现于膜表面,从而可以用廉价的光学扫描仪读取数据,具体地说,包括:首先进行的样品处理和标记过程:在待检测样品的PCR扩增过程中,加入地高辛或生物素标记;其次进行的扩增产物与芯片的杂交过程:将其与芯片进行杂交,杂交以后用抗体与地高辛或生物素标记结合;最后进行的转印显色和结果检测过程:用浸润显色液的尼龙膜或硝酸纤维膜将杂交结果转印到膜上后进行检测。
2、根据权利要求1所述的基因芯片的膜转印检测法,其特征在于所说的样品处理和标记的过程是:
将抽提好的DNA溶液2μl与12μl聚合酶链式反应混合液以及1单位TagPlus混合均匀,在聚合酶链式反应热循环仪上通过以下热循环过程制备地高辛标记的DNA样品目的片段,上游及下游引物分别为5′-TCA AAA ATGAGT TGC GTG CTG-3′,5′-CTT TTT CAC CTC TGC CTA ATC-3′,扩增条件为:首先94℃,5分钟,以94℃,40秒,55℃,40秒,72℃,40秒循环30次,最后,72℃延伸5分钟,用电泳检测PCR产物。
3、根据权利要求1所述的基因芯片的膜转印检测法,其特征在于所说的扩增产物与芯片的杂交的过程是:
取扩增产物1μl与9μl杂交液混和,滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,置于40℃预热的杂交盒中保温20-30分钟,使DNA样品与芯片上的特异性寡核苷酸探针结合;
在室温下,取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗10分钟,然后将芯片放入洗液II中平衡1分钟,再取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取20μl抗体溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30分钟,使抗体与地高辛或生物素充分结合,同时封阻芯片上的蛋白非特异性结合位点;
去除盖玻片,吸除多余液体,然后置洗液II中荡洗1分钟,取出芯片,用吸水纸吸除多余液体。
4、根据权利要求1所述的基因芯片的膜转印检测法,其特征在于所说的转印显色和结果检测的过程包括:
取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取一块1×1cm2的尼龙膜浸润显色液后盖于芯片表面,闭光静置1小时;
揭下芯片表面的尼龙膜并高温烤干,用普通光学扫描仪扫描记录尼龙膜上的信息。
5、根据权利要求1或2所述的基因芯片的膜转印检测法,其特征在于所说的样品处理和标记,是在待检测样品DNA的聚合酶链式反应扩增过程中,在dUTP上加上地高辛或生物素标记,或在引物上加上地高辛或生物素标记。
6、根据权利要求1或4所述的基因芯片的膜转印检测法,其特征在于所述的转印显色是采用硝酸纤维膜浸润显色液后盖在芯片表面,闭光静置1小时,从而将杂交结果转印到膜上。
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