CN110592233B - 一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用 - Google Patents
一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用，属于生物芯片技术领域。该常见食源性寄生虫检测基因芯片包括固定在固相载体上的探针；所述的探针包括检测蛔虫特异性寡核苷酸探针、检测蛲虫特异性寡核苷酸探针、检测肝吸虫特异性寡核苷酸探针、检测绦虫特异性寡核苷酸探针、检测鞭虫特异性寡核苷酸探针。同时提供了含有该基因芯片的试剂盒。通过本发明基因芯片，一次检测即可同时快速有效对5种常见食源性寄生虫。具有高通量、高特异、高灵敏度的特点，检测效率高，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片技术领域，具体涉及一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用。
背景技术
食源性寄生虫病是指所有能够经口随食物（水源）感染的寄生虫病的总称，分为食物寄生性（内源性）寄生虫病与食物污染性（外源性）寄生虫病。我国地域辽阔、人口众多；食源性寄生虫病种类多、分布广、感染高、危害大、疫情突发性强、各地流行程度不一，控制食源性寄生虫的流行，首先要加强食源性寄生虫病的检测的速度和灵敏性；研发一种常见食源性寄生虫基因芯片势在必行。食源性寄生虫有着广泛的宿主，不论是其感染终末宿主还是中间宿主，种类繁多，包括哺乳动物，鸟类，鱼类等多种动物。食源性寄生虫常寄生在人体各个器官，对人体器官造成严重危害，对全球公共健康产生着重大影响，成为影响社会经济发展的重要公共卫生问题。因此，食源性寄生虫病的快速检测也是保障人民身体健康的重要举措。
目前，我国对食源性寄生虫病检测主要通过显微镜镜检的方法，但具有敏感性低和不能区别虫种的缺点。目前，国外普遍采用的虫种／基因型鉴别方法主要依赖于巢式PCR，但这些方法具有容易污染和费时的缺点，无法满足临床样品检测的需要。因此有必要研究快速、定量和具有虫种区分能力的分子生物学诊断技术和免疫学方法。食源性寄生虫病的检测方法目前国内外研究很少，因此，研制和开发快速、安全、准确的食源性寄生虫基因芯片极为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用，该基因芯片可用于蛔虫-Ascaris suum、蛲虫-Enterobius vermicularis、肝吸虫-Fasciola hepatica、绦虫-Taenia solium、鞭虫-Trichuris suis 5种常见食源性寄生虫进行基因检测，具有快速、高通量、高灵敏度、高特异性的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种常见食源性寄生虫检测基因芯片，包括固定在固相载体上的探针；
所述的探针有五条，序列如下：
Trichuris suis-Pro：tttttttttttttttccgtacctgacacaagaaggattccact；
Taenia solium-Pro：ttttttttttttttttgataggagatataatgagaggtagtggtggct；
Fasciola hepatica-Pro：tttttttttttttttttggaggattgttaggttgtcgctgcta；
Ascaris suum-Pro：tttttttttttttttttattgttatgatgaaggttggtgtggctcc；
Enterobius vermicularis-Pro：tttttttttttttttctgattaagaaggagcagttgttgtctgttca。
进一步，优选的是，所述的固相载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀膜或尼龙膜。
进一步，优选的是，还包括三条固定在固相载体上的探针，序列如下：
IC-Pro：tttttttttttttttgccgaggactttgattgcacattgttgttt；
HC-Pro：tttttttttttttttagatgcgttgttacagga；
NC-Pro：ttttttttttttttt。
本发明同时提供提供含有上述常见食源性寄生虫检测基因芯片的常见食源性寄生虫检测试剂盒。
进一步，优选的是，还包括5对PCR引物对；序列如下：
Trichuris suis-FP：accaagcgtattctactgtgaac；
Trichuris suis-RP-CY3：ttattagtgtgtgggcgtaggg；
Taenia solium-FP：tgctccaacaccagtcagttc；
Taenia solium-RP-CY3：ggtacacctgctaaaccaagaac；
Fasciola hepatica-FP：tagaggttcgccgaggttatg；
Fasciola hepatica-RP-CY3：accaacacgcttatgatccaac；
Ascaris suum-FP：tgtttgtctgtctaaggggtctg；
Ascaris suum-RP-CY3：gccacaccaaccttcatcataac；
Enterobius vermicularis-FP：tttctgagggtgagagggaattg；
Enterobius vermicularis-RP-CY3：aacaagacgaaccaaccaacac。
进一步，优选的是，还包括1对PCR引物对；序列如下：
IC-FP：aaaactggaacggtgaa；
IC-RP-CY3：tcctgtaacaacgcatct。
进一步，优选的是，还包括多重PCR反应液，所述的多重PCR反应液包括dNTPs、含Mg2+的TransStart TopTaq Buffer和TransStart TopTaq DNA Polymerase。
进一步，优选的是，还包括阴性质控品，所述的阴性质控品为人基因组中看家基因β-actin。
进一步，优选的是，PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸反应5min，4℃保存。
本发明上述探针5'端都是经过氨基修饰。上述下游引物5'端都是经过CY3修饰。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
1)本发明涉及的基因芯片可以产业化生产，对人和环境无污染。其精确度、稳定性和检测效率比传统检查方法均有较大提高，芯片制备和使用方法简便；
2)本发明的常见食源性寄生虫甄别检测方法操作简单快速方便，有效克服了传统检测方式费时费力、准确度低的问题，一次检测即可同时快速有效对5种常见食源性寄生虫。具有高通量、高特异、高灵敏度的特点，检测效率高。
目前传统的实验室诊断技术有病原学、免疫学、分子生物学等技术方法，比较实用的方法是粪便中检测虫卵和血清学诊断方法。病原学中最常用的检查方法是粪便检查，要取得准确的结果，粪便必须新鲜，送检时间一般不宜超过24小时，如检查肠内原虫滋养体，最好立即检查；盛粪便的容器要干净，并防止污染与干燥；粪便不可混杂尿液等，以免影响检查结果。该方法局限性大，准确度低。免疫学诊断方法研究抗体和抗原的结合所形成的特殊键结，为诊断科学上的相当有利的工具，在抗体上可以标记放射线物质、可以呈色的酵素、以及萤光物质等，便可以当作探针来标记抗原所在。本发明相比病原学诊断，稳定性好，准确度高。本发明相比免疫学、分子生物学诊断，灵敏度高，特异型强，准确率高，其中基因芯片能够一次检测即可同时快速有效对5种常见食源性寄生虫，更加快速，易于推广应用。
附图说明
图1为本发明常见食源性寄生虫检测基因芯片的阵列示意图；
图2为基因芯片上每个阵列上具体排列布局；
图3为典型的寄生虫的芯片检测图；其中，（a）为蛔虫；（b）为蛲虫；（c）为肝吸虫；（d）为绦虫；（e）为鞭虫；
图4为阴性对照的芯片检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分数为质量百分数，比例为质量比。
本发明实施例中固相载体采用的醛基化修饰的玻璃片购自昆明寰基生物芯片产业有限公司。
本发明公开一种常见食源性寄生虫基因芯片的制备，本发明的基因芯片可用于蛔虫-Ascaris suum、蛲虫-Enterobius vermicularis、肝吸虫-Fasciola hepatica、绦虫-Taenia solium、鞭虫-Trichuris suis 5种常见食源性寄生虫进行基因检测。包含检测蛔虫-Ascaris suum的2条特异性引物和1条特异性寡核苷酸探针；检测蛲虫-Enterobiusvermicularis的2条特异性引物和1条特异性寡核苷酸探针；检测肝吸虫-Fasciolahepatica的2条特异性引物和1条特异性寡核苷酸探针；检测Taenia solium的2条特异性引物和1条特异性寡核苷酸探针；检测鞭虫-Trichuris suis的2条特异性引物和1条特异性寡核苷酸探针。探针分别分布在固相载体上。
引物序列如表1所示。
表1
探针序列如表2所示。
表2
所述的固相载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀膜或尼龙膜。
一种常见食源性寄生虫检测基因芯片的阵列示意图如图1所示，每张芯片上分布有10个相同阵列，每个阵列上具体排列布局如图2所示。其中：BC为空白点；IC为提取对照兼内对照探针IC-Pro；HC为杂交阳性对照探针HC-Pro；NC为阴性对照探针NC-Pro；Asc为蛔虫的检测探针Ascaris suum-Pro、Evs为蛲虫的检测探针Enterobius vermicularis-Pro、FHa为肝吸虫的检测探针Fasciola hepatica-Pro、Tsm为绦虫检测探针Taenia solium-Pro、Tss为鞭虫检测探针Trichuris suis-Pro。
NC为阴性对照探针，其序列为15个连续的胸腺嘧啶（OligoT15），用于检测可能与探针Liker序列发生非特异性杂交反应，监控试剂盒的检测特异性。
HC为杂交对照探针，其序列为阳性对照（IC）的标记扩增引物反向互补序列，用于检测芯片杂交系统是否正常。
IC为标本提取对照兼阳性对照探针，其序列为人基因组中看家基因β-actin片段，用于监测标本质量和监控PCR扩增体系的有效性。
本发明探针和引物都采用人工合成的方式获得，均委托上海生工合成。
本发明常见食源性寄生虫检测基因芯片的制备方法如下：
取醛基化修饰的玻璃片，用Marathon点样仪将5'端氨基修饰的上述8条寡核苷酸探针点布在醛基化修饰的玻璃表面，水合30min，室温放置过夜，用洗脱液（含质量浓度为0.25% NaBH4的2×SSC溶液）42℃条件下封闭10min，再用洗脱液（含0.1%SDS的2×SSC溶液）洗脱2次，晾干，4℃保存。
一种常见食源性寄生虫检测基因芯片的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，寄生虫病原体核酸的提取：
使用昆明寰基生物芯片产业有限公司生产的核酸提取试剂（磁珠法）进行提取；
步骤二，多重PCR扩增标记：
PCR扩增体系如下：
临床样本DNA或阴性质控模板 5μL；
2.5mM dNTP 2μL；
10×TransStartTM TopTaq Buffer 2.5μL；
TransStartTM TopTaq DNA Polymerase 0.5μL；
6对引物 7.5μL；
ddH2O 7.5μL；
总计25.0μL；
其中，每条引物的终浓度为100 mM；
多重PCR按以下循环参数进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸反应5min，4℃保存。或进行下一步实验。
步骤三，芯片杂交：
1.恒温热台升温恒定到42℃，用42℃预热的杂交模块（昆明寰基生物芯片产业有限公司，型号ZJH-01）将芯片固定好，形成多个微阵列反应室，即每条探针所在位置处形成一个单独的反应室；
2.将PCR扩增产物加热至95℃（置于PCR 仪中）变性5min，立即冰浴3min；
3.加入75μL杂交缓冲液，充分混匀，将混合物由加样孔滴加入对应微阵列反应室内（操作过程中禁止触碰到微阵列区，避免将混合液滴落到杂交模块表面），杂交60min；
杂交缓冲液包括终浓度为0.2M的Tris-HCl、终质量浓度为2.34%的TritonX-100、终质量浓度为0.16%的NaCl。
步骤四，杂交后清洗基因芯片：
芯片洗脱液配制（若10%SDS出现白色絮状沉淀，请于42℃条件加热至溶液透明后再使用）
1.在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）:20×SSC:10%SDS=100:5:1的体积比配制洗脱液Ⅰ，洗脱液配制总体积800mL或应满足浸没芯片；
2.在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）:20×SSC:10%SDS=400:1:4的体积比配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积800mL或应满足浸没芯片；
洗脱前将洗脱液在37℃预热，小心将芯片从杂交模块中取出，立即放入洗脱容器中，37℃下浸洗。
洗脱流程：洗脱液
，震荡洗脱1min；洗脱液
，震荡洗脱1min。洗脱完毕后，将芯片自然晾干或低速甩干即可进行扫描。所述的低速优选为100r/min
步骤五，扫描：
1.将干燥后的芯片置于激光扫描仪（北京博奥生物生产的“Lux Scan 10K-B”激光扫描仪）中，使用532nm波长激光扫描，获得扫描图谱及数据，之后按照获得扫描图谱及数据对检测数据进行分析。
步骤六，数据分析：
判定值：对于任意探针位点，其荧光值中值≥1.5倍荧光背景中值，判断该位点为“阳性”，否则该位点判断为“阴性”。
对于Trichuris suis-Pro、Taenia solium-Pro、Fasciola hepatica-Pro、Ascaris suum-Pro、Enterobius vermicularis-Pro这五条探针所在位置，阳性说明检出相对应的寄生虫，阴性说明没有被相对应的寄生虫感染。部分检测图如图3和图4所示。
本发明常见食源性寄生虫检测基因芯检测限不高于5×103copies/mL，各种寄生虫探针之间没有交叉反应。
应用实例
由吉林大学基础医学院提供25例寄生虫标本，其中蛔虫5例、蛲虫5例、肝吸虫5例、绦虫5例、鞭虫5例。使用本产品对这25例标本进行检测。本实验中共检测了25例寄生虫标本，检测结果与已确定的标本结果一致。检出蛔虫5例、蛲虫5例、肝吸虫5例、绦虫5例、鞭虫5例。因此本产品具有准确性高，灵敏度强，各寄生虫探针之间无交叉反应。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种常见食源性寄生虫检测基因芯片及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
accaagcgta ttctactgtg aac 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttattagtgt gtgggcgtag gg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgctccaaca ccagtcagtt c 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ggtacacctg ctaaaccaag aac 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tagaggttcg ccgaggttat g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
accaacacgc ttatgatcca ac 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
tgtttgtctg tctaaggggt ctg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gccacaccaa ccttcatcat aac 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
tttctgaggg tgagagggaa ttg 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
aacaagacga accaaccaac ac 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
tttctgaggg tgagagggaa ttg 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
aacaagacga accaaccaac ac 22
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
tttttttttt tttttccgta cctgacacaa gaaggattcc act 43
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tttttttttt ttttttgata ggagatataa tgagaggtag tggtggct 48
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
tttttttttt tttttttgga ggattgttag gttgtcgctg cta 43
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
tttttttttt tttttttatt gttatgatga aggttggtgt ggctcc 46
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
tttttttttt tttttctgat taagaaggag cagttgttgt ctgttca 47
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
tttttttttt tttttgccga ggactttgat tgcacattgt tgttt 45
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
tttttttttt tttttagatg cgttgttaca gga 33
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
tttttttttt ttttt 15
Claims (7)
1.一种常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，包括固定在固相载体上的探针；
所述的探针有五条，序列如下：
Trichuris suis-Pro：tttttttttttttttccgtacctgacacaagaaggattccact；
Taenia solium-Pro：ttttttttttttttttgataggagatataatgagaggtagtggtggct；
Fasciola hepatica-Pro：tttttttttttttttttggaggattgttaggttgtcgctgcta；
Ascaris suum-Pro：tttttttttttttttttattgttatgatgaaggttggtgtggctcc；
Enterobius vermicularis-Pro：tttttttttttttttctgattaagaaggagcagttgttgtctgttca；
还包括5对PCR引物对；序列如下：
Trichuris suis-FP：accaagcgtattctactgtgaac；
Trichuris suis-RP-CY3：ttattagtgtgtgggcgtaggg；
Taenia solium-FP：tgctccaacaccagtcagttc；
Taenia solium-RP-CY3：ggtacacctgctaaaccaagaac；
Fasciola hepatica-FP：tagaggttcgccgaggttatg；
Fasciola hepatica-RP-CY3：accaacacgcttatgatccaac；
Ascaris suum-FP：tgtttgtctgtctaaggggtctg；
Ascaris suum-RP-CY3：gccacaccaaccttcatcataac；
Enterobius vermicularis-FP：tttctgagggtgagagggaattg；
Enterobius vermicularis-RP-CY3：aacaagacgaaccaaccaacac。
2.根据权利要求1所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，所述的固相载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀膜或尼龙膜。
3.根据权利要求1所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，还包括三条固定在固相载体上的探针，序列如下：
IC-Pro：tttttttttttttttgccgaggactttgattgcacattgttgttt；
HC-Pro：tttttttttttttttagatgcgttgttacagga；
NC-Pro：ttttttttttttttt。
4.根据权利要求1所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，还包括1对PCR引物对；序列如下：
IC-FP：aaaactggaacggtgaa；
IC-RP-CY3：tcctgtaacaacgcatct。
5.根据权利要求1或4所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR反应液，所述的多重PCR反应液包括dNTPs、含Mg2+的TransStart TopTaq Buffer和TransStart TopTaq DNA Polymerase。
6.根据权利要求1或4所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品，所述的阴性质控品为人基因组中看家基因β-actin。
7.根据权利要求1或4所述的常见食源性寄生虫检测试剂盒，其特征在于，PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s、57℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸反应5min，4℃保存。
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| CN1932034A (zh) * | 2006-08-10 | 2007-03-21 | 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 | 用于检测蛔虫卵的实时荧光pcr引物和探针 |
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Also Published As
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