CN115786529A - 一种用于检测水生动物寄生虫的基因芯片、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测水生动物寄生虫的基因芯片，其包括若干检测区和将相邻的两个检测区隔开的若干间隔区；每一检测区包括加样孔、若干片基，以及将每一个片基连通至加样孔的若干微槽，每一片基上分别固定有特异性针对一种水生动物寄生虫的特征性靶基因的引物组。本发明能够对多种水产品寄生虫同步进行检测，且能够保障准确度和精确性，提升了检测效率，节省了检测时间和成本。
Description
技术领域
本发明分子生物学及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测水生动物寄生虫的基因芯片。
背景技术
基因芯片是生物芯片的一种，自20世纪80年代出现后在生命科学领域应用广泛。其原理为大量合成的DNA探针有序地固定在芯片载体表面成为基因芯片，待检样品经过扩增和标记后，与基因芯片杂交反应，扫描并分析杂交反应的信号，即可得到待检样品的基因信息，相比于传统的PCR、血清学检测技术具有高灵敏度、高通量的特点。此外，基因芯片技术减少了传统检测技术中为同时检测多种病原而增加多种引物带来的非特异性反应的发生概率，对于多种病原混合感染的诊断显示出较大的优势，可为重大动物疫病早期监控提供重要的技术保障。微流控芯片技术(microfluidic chip assay)是一种基于环等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)的高通量快速核酸检测技术。它将不同病原特异性引物固化在同一块塑料芯片不同的微孔反应槽内；这些微孔反应槽与加样孔相连，通过离心把待检核酸样本均匀地甩入各微孔反应槽内；每块塑料芯片有8个加样孔，每个加样孔与4个微孔反应槽相连，故理论上在1块芯片的8个加样孔加入同一份待检核酸，可以实现32种不同病原的同步检测。
目前在动物疫病检测中应用广泛，但在水产动物中多种疫病同步检测及寄生虫检测中报道较少。目前寄生虫分子生物学检测主要是采用单重PCR方法，检测时间较长，对人力物力都是较大的浪费，针对目前基因芯片在寄生虫领域的应用较少。
发明内容
本发明针对上述现有方法中只能针对特定标的重复操作进行检测，导致检测时间长的缺陷，提供了一种能够同步检测多种水生动物寄生虫的基因芯片，并将其应用到水生动物病原体的检测中。
本发明首先提供了一种用于检测水生动物寄生虫的基因芯片，其包括若干检测区和将相邻的两个检测区隔开的若干间隔区；每一检测区包括加样孔、若干片基，以及将每一个片基连通至加样孔的若干微槽，每一片基上分别固定有特异性针对一种水生动物寄生虫的特征性靶基因的引物组；
所述水生动物寄生虫的特征性靶基因选自：虾肝肠胞虫的spore wall protein 1(SWP1)mRNA、牡蛎包拉米虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、海水派琴虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、奥尔森派琴虫的internal transcribedspacer 1(ITS1)、大西洋鲑鱼三代虫的cytochrome oxidase subunit I(Cox1)、折光马尔太虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)和鱼华支睾吸囊蚴cytochrome oxidasesubunit I(Cox1)中的至少两种或全部所述水生动物寄生虫选自虾肝肠胞虫、牡蛎包拉米虫、海水派琴虫、奥尔森派琴虫、大西洋鲑鱼三代虫、折光马尔太虫和鱼华支睾吸虫囊蚴中的两种或多种；
所述水生动物寄生虫的特征性靶基因选自：虾肝肠胞虫spore wall protein 1(SWP1)mRNA、牡蛎包拉米虫small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、海水派琴虫smallsubunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、奥尔森派琴虫internal transcribed spacer 1(ITS1)、大西洋鲑鱼三代虫cytochrome oxidase subunit I(Cox1)、折光马尔太虫smallsubunit ribosomal RNA(SSU rRNA)和鱼华支睾吸虫囊蚴cytochrome oxidase subunit I(Cox1)。
在根据本发明的一个实施方案中，所述引物组选自下表中引物对的两组或多组：
在根据本发明的一个实施方案中，所述片基由载玻片、硅片或膜构成。
在根据本发明的一个实施方案中，还设置了阳性对照(含目的核酸序列)、阴性对照(不含目的核酸序列)、空白对照(不含有任何引物的无核酶水)。
在根据本发明的一个实施方案中，所述引物组中的每个引物分别与荧光染料混合。
在根据本发明的一个实施方案中，不同病原的荧光染料相同。
本发明还提供了一种用于同步检测多种水生动物寄生虫的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的基因芯片。
在根据本发明的一个实施方案中，所述的用于同步检测多种水生动物寄生虫的试剂盒，所述试剂盒还包括不同病原的引物组，所用引物浓度均为10μmol/L。所述引物组选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的针对虾肝肠胞虫的引物组；由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的针对牡蛎包拉米虫的引物组；由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的针对海水派琴虫的引物组；由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的针对奥尔森派琴虫的引物组；由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成的针对大西洋鲑鱼三代虫的引物组；由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的针对折光马尔太虫的引物组；以及由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的针对鱼华支睾吸囊蚴的引物组中的两种或全部。
在根据本发明的一个实施方案中，所述试剂盒反应体系如下表：
| 序号 | 组分名称 | 体积/μL |
| 1 | 反应液 | 10 |
| 2 | Bst DNA聚合酶 | 1 |
| 3 | dNTP | 2 |
| 4 | 检测标的样本或基因组DNA | 5 |
| 5 | 引物及荧光染料混合物 | 2 |
| 总反应体系 | 20 |
本发明的另一方面还提供了上述的基因芯片或上述的试剂盒在水产品检验检疫中的应用。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
上述方案中，能够对多种水产品寄生虫同步进行检测，且能够保障准确度和精确性，提升了检测效率，节省了检测时间和成本。
附图说明
图1为基因芯片结构示意图；
图2为基因芯片加样孔及局部结构图；
图3为利用混合病原阳性质粒DNA的引物特异性检测结果图；其中，A：虾肝肠胞虫；B：牡蛎包拉米虫；C：海水派琴虫；D：奥尔森派琴虫；E：大西洋鲑鱼三代虫；F：折光马尔太虫；G：鱼华支睾吸虫囊蚴；
图4为各病原检测的敏感性试验结果图谱；其中，A：虾肝肠胞虫；B：牡蛎包拉米虫；C：海水派琴虫；D：奥尔森派琴虫；E：大西洋鲑鱼三代虫；F：折光马尔太虫；G：鱼华支睾吸虫囊蚴；
图5为样本的临床检测结果图谱；其中，A：虾肝肠胞虫；B：牡蛎包拉米虫；C：海水派琴虫；D：奥尔森派琴虫；E：大西洋鲑鱼三代虫；F：折光马尔太虫；G：鱼华支睾吸虫囊蚴。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
图1为本发明使用的基因芯片的结构示意图，图2为该基因芯片的局部结构示意图。如图1和图2所示的，该基因芯片包括间隔排布的检测区和间隔区，检测区包括加样孔1、若干片基2，以及连接加样孔和片基的若干微槽2；所述微槽将相邻的两个片基间隔开来；每个片基上包被或固定有引物组和探针。样本溶液在滴加到加样孔1中，然后在虹吸作用下沿着微槽3分别到达同一检测区中载有不同引物组和/或探针的每个片基2处，并分别发生反应，从而实现对同一样本同时多种靶目标物的检测。
实施例1阳性质粒特异性检测
建立了如下的检测过程：
1)合成引物：使用北京生工生物技术有限公司合成仪合成并纯化(推荐以HPLC进一步纯化)。
2)将待测阳性质粒按Qiagen公司的DNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的DNA。
3)将Bst大片段DNA聚合酶(1μL)、聚合酶缓冲液(10μL)、dNTP(2μL)、荧光染料和不同引物组混合液(2μL)，混合后加至不同的反应槽，每种病原设置一个空白对照槽。用透明封膜将加样槽上样孔封闭。在每个加样孔中分别加入5μL以上待测阳性质粒DNA的混合核酸，用透明膜密封加样孔。将加样孔固定于微流控检测仪转盘柱上，盖好机器盖。机器运行条件：63.5℃孵育45min。反应结束后，查看荧光扩增曲线，进行结果判定。
反应体系如下：
| 序号 | 组分名称 | 体积/μL |
| 1 | 反应液 | 10 |
| 2 | Bst DNA聚合酶 | 1 |
| 3 | dNTP | 2 |
| 4 | 检测标的样本或基因组DNA | 5 |
| 5 | 引物及荧光染料混合物 | 2 |
| 总反应体系 | 20 |
4)结果如图3所示，在反应5～15min后，各病原检测孔反应扩增曲线呈“S”型，且出峰时间≤45min，空白对照不出现扩增曲线，实验有效。每个病原检测孔均只出现一条特异性扩增曲线，各病原之间未出现交叉反应。
实施例2基因芯片检测敏感性试验
1)为测试基因芯片检测方法的敏感性，将提取的各病原阳性质粒总DNA样本进行定量并10倍梯度稀释，制备浓度分别为0、10、102、103、104、105、106、107copies/mL的DNA模板，再使用基因芯片方法检测。
2)使用基因芯片方法检测不同浓度梯度的病原阳性质粒DNA模板。结果(图4)显示，基因芯片检测各病原阳性质粒DNA模板下限量为102copies/mL。
实施例3临床样本检测
将经PCR检测确认的以上病原阳性核酸(其中虾肝肠胞虫4份分别编号为1、2、3、4；牡蛎包拉米虫、海水派琴虫、奥尔森派琴虫、大西洋鲑鱼三代虫和折光马尔太虫各一份分别编号为5、6、7、8、9)及阴性核酸(其中虾肝肠胞虫、牡蛎包拉米虫、海水派琴虫、奥尔森派琴虫、大西洋鲑鱼三代虫、折光马尔太虫和鱼华支睾吸虫囊蚴各一份分别编号为10、11、12、13、14、15、16)分别加入到不同的反应管中，使用以上本发明试剂盒进行特异性扩增，设置反应程序为：63℃30s；63℃15s，63℃45s，45个循环，并于63℃45s处收集荧光信号。结果显示，所有的临床阳性样本均出现相应荧光扩增信号，而阴性样本经检测未出现荧光扩增信号。该结果与单独进行PCR检测结果一致，证明本发明的方法与单独进行PCR检测相比具有相当的准确性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于检测水生动物寄生虫的基因芯片，其特征在于，包括若干检测区和将相邻的两个检测区隔开的若干间隔区；每一检测区包括加样孔、若干片基，以及将每一个片基连通至加样孔的若干微槽，每一片基上分别固定有特异性针对一种水生动物寄生虫的特征性靶基因的引物组；
所述水生动物寄生虫的特征性靶基因选自：虾肝肠胞虫的spore wall protein 1(SWP1)mRNA、牡蛎包拉米虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、海水派琴虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)、奥尔森派琴虫的internal transcribedspacer 1(ITS1)、大西洋鲑鱼三代虫的cytochrome oxidase subunit I(Cox1)、折光马尔太虫的small subunit ribosomal RNA(SSU rRNA)和鱼华支睾吸囊蚴cytochrome oxidasesubunit I(Cox1)中的至少两种或全部。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述引物组选自
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的针对虾肝肠胞虫的引物组；
由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的针对牡蛎包拉米虫的引物组；
由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的针对海水派琴虫的引物组；
由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的针对奥尔森派琴虫的引物组；
由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成的针对大西洋鲑鱼三代虫的引物组；
由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的针对折光马尔太虫的引物组；以及
由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的针对鱼华支睾吸囊蚴的引物组中的至少两组或全部。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述片基由载玻片、硅片或膜构成。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，还包括分别固定有引物的基片。
5.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述引物组中的每个引物分别与荧光染料混合。
6.如权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，以上所述不同病原的荧光染料相同。
7.如权利要求1-6中任一项所述的基因芯片在检测水生动物寄生虫中的应用。
8.一种用于同步检测多种水生动物寄生虫的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述的基因芯片。
9.根据权利要求8所述的用于同步检测多种水生动物寄生虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括扩增引物组，所用引物浓度均为10μmol/L；所述引物组选自:
由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的针对虾肝肠胞虫的引物组；
由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的针对牡蛎包拉米虫的引物组；
由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12组成的针对海水派琴虫的引物组；
由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的针对奥尔森派琴虫的引物组；
由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成的针对大西洋鲑鱼三代虫的引物组；
由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的针对折光马尔太虫的引物组；
以及由SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的针对鱼华支睾吸囊蚴的引物组中的两种或全部。
10.如权利要求1-7中任一项所述的基因芯片或如权利要求8或9所述的试剂盒在水产品检验检疫中的应用。
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