CN110760596A

CN110760596A - 华支睾吸虫液滴式数字pcr检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN110760596A
Application number: CN201911112701.3A
Authority: CN
Inventors: 沈玉娟; 徐梦; 曹胜魁; 张小凡; 曹建平
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明公开了一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。此外，本发明还公开了用于检测华支睾吸虫的引物和探针以及所述的引物和探针在制备感染华支睾吸虫疾病诊断产品中的应用。所述引物的上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列；下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列；所述探针为如SEQ ID NO.3所示序列。本发明成功建立了一种可高效检测、华支睾吸虫粪便DNA的高灵敏的检测试剂盒，快速、敏感和特异，可用于华支睾吸虫感染，尤其是轻度感染的检测。

Description

华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种PCR检测试剂盒，尤其涉及一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。此外，本发明涉及华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒的应用。

背景技术

华支睾吸虫是一种重要的食源性疾病，最新调查显示，我国约有598万感染者，珠江三角洲城镇与城郊生态区、东北平原西部生态区及三江平原生态区的华支睾吸虫病呈高度流行状态，感染率分别为23.36%、9.44%和8.53%。食鱼生的饮食习惯是致流行区人群华支睾吸虫感染的主要危险因素。华支睾吸虫病可致275 370个伤残调整寿命年的损失，造成严重的经济负担。急性、严重感染会出现非特异性消化系统相关临床症状，如腹痛、腹泻、黄疸、胆囊炎、胆道纤维化、胆道结石等，慢性反复性感染会致肝胆管癌，2009年华支睾吸虫被国际癌症肿瘤机构列入Ι类致癌物。

目前华支睾吸虫的检测主要仍然依靠粪便镜检（改良加藤厚涂片法），该方法被认为是确诊华支睾吸虫感染依据的金标准，但其灵敏度不高，易出现漏诊、错诊，且需依赖检测人员的经验和镜检能力。近年来，随着分子生物学技术的发展，各种核酸检测方法用于华支睾吸虫感染的检测，如环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）、ELISA、PCR及实时荧光定量PCR，但这些检测方法受到样本核酸纯度、核酸抑制物或者抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。中国发明专利CN201410676271公开了华支睾吸虫实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。而荧光定量PCR方法依赖标准品和标准曲线实现样本定量检测，但目前尚无法实现绝对定量。

ddPCR（液滴式数字PCR，Droplet digital PCR）是近几年发展起来的一种全新的核酸检测方法，其首先通过将微量DNA样本进行大量稀释，利用微流控技术产生大量的独立油包水乳化反应微滴，每个微滴不含有或含有一个至数个模板分子，通过PCR反应扩增，之后通过对每个微滴的荧光信号进行统计分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例定量DNA拷贝数。ddPCR方法不需要依赖标准品和标准曲线即可实现样本的绝对定量，且不易受到DNA样本中所含核酸抑制物或抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。该方法在一定程度上弥补了以往PCR检测方法的不足，可实现低浓度核酸样本的高度灵敏和准确的绝对定量，检测敏感性更高。但是并非所有的基因对象检测都适用于ddPCR方法。目前尚未发现有采用ddPCR方法对华支睾吸虫检测的相关报道。本研究拟建立基于华支睾吸虫COI 基因的ddPCR检测试剂盒，为华支睾吸虫病的早期、快速诊断等提供技术储备，也为该病的防控提供技术支持。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。本发明以华支睾吸虫为研究对象，开发了一种快速，敏感，特异，高灵敏度的检测试剂盒。

本发明要解决的技术问题之二在于提供用于检测华支睾吸虫的引物和探针及其用途。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一方面，提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。

作为本发明优选的技术方案，所述特异性引物及荧光探针的序列如下：

其上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列；其下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列；

所述荧光探针为如SEQ ID NO.3所示序列；所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团包括：FAM、VIC、HEX、CY5和ROX，优选为FAM；荧光淬灭基团包括：MGB、BHQ1、Eclipse 和TAMRA，优选为BHQ1。

作为本发明优选的技术方案，该试剂盒包括以下液滴式数字PCR反应体系：2×ddPCR预混液（ddPCR^TM Supermix for Probes（no dUTP））10µl，DNA模板1µl，10µmol如权利要求1所述的上游引物和下游引物各1µl，10µmol如权利要求1-3任一项所述的探针0.5µl，无菌水6.5µl，共20µl。

作为本发明优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的退火温度为53℃~60℃，最佳退火温度为56℃。

作为本发明优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件如下：

作为本发明优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件中的升降温度梯度为2 ℃/s；反应总体积设为40 µl。

在本发明的另一方面，提供上述试剂盒在制备感染华支睾吸虫病诊断产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因（COI）设计特异性引物及荧光探针，开发了高灵敏度华支睾吸虫液滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）检测试剂盒，并针对该检测试剂盒进行敏感性、特异性、定量检测线性范围及重复性等方面进行评价。同时，应用现场采集华支睾吸虫阳性和阴性样本，进行华支睾吸虫ddPCR 检测方法应用评价。结果：本发明研发了华支睾吸虫ddPCR检测试剂盒。该检测试剂盒的LOB值为1 copies/20 µl，LOD值为3 copies/20 µl，具有较高的敏感性；与片形吸虫虫卵、次睾吸虫成虫、猪带绦虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫、斯氏狸殖吸虫成虫、三平正并殖吸虫成虫、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节以及蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫DNA均无交叉反应，具有较好的特异性；该检测试剂盒检测最佳线性范围在0.43copies/µl ~1 015 copies/ul DNA浓度，R²= 0.997 4；其检测CV值小于14%，有较好的重复性。基于以上数据证明本研究所建立的ddPCR检测试剂盒可对华支睾吸虫进行绝对定量，具有较好的灵敏度和特异性。现场采集样本应用结果显示，27例阳性样本，均检测为阳性，检测率为100%，且3次重复中均能检出，拷贝数在1copies/µl~72.5 copies/µl；ROC曲线下面积为0.968，具有统计学意义，该方法具有较好的诊断价值。结论：本研究成功建立了一种可高效检测华支睾吸虫粪便DNA的高灵敏的检测试剂盒，快速、敏感和特异，可用于华支睾吸虫感染，尤其是轻度感染的检测。

附图说明

图1是本发明实施例1中ddPCR退火温度的优化结果示意图，其中，A02代表60℃；B02代表59.6℃；C02代表58.8℃；D02代表57.5℃；E02代表55.8℃；F02代表54.4℃；G02代表53.5℃；H02代表53℃。

图2是本发明实施例1中华支睾吸虫ddPCR特异性检测微滴信号图，其中，A06代表华支睾吸虫；C06代表次睾吸虫；E06代表片形吸虫；G06代表卫氏并殖吸虫；A07代表斯氏狸殖吸虫；C07代表三平正并殖吸虫；E07代表多房棘球绦虫；A08代表细粒棘球绦虫；C08代表猪带绦虫；E08代表贾第虫和隐孢子虫混合样本。

图3是本发明实施例1中华支睾吸虫ddPCR检测方法拷贝数与上样量折线图。

图4是本发明实施例1中ROC曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等在《分子克隆实验指南》（科学出版社，1992）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、材料与方法

1.1 样本来源及粪便基因组DNA提取

1.1.1 样本来源

华支睾吸虫阳性粪便样本来自广西藤县经改良加藤厚涂片法镜检阳性，共27份，健康对照组粪便样本来自上海市沃德医疗中心。华支睾吸虫成虫和片形吸虫虫卵由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所许学年研究员提供；次睾吸虫成虫由黑龙江八一农垦大学王春仁教授提供；卫氏并殖吸虫、斯氏狸吸虫以及三平正吸虫成虫DNA由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所郑彬研究员提供；猪带绦虫成虫DNA由遵义医科大学郑明辉博士提供；多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫DNA以及蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫DNA由本实验室保存。

1.1.2 华支睾吸虫粪便基因组DNA提取

根据QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 试剂盒提取说明书，提取粪便样本基因组DNA；根据DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取说明书提取华支睾吸虫成虫、虫卵和次睾吸虫成虫DNA。

1.3引物及探针

本研究根据华支睾吸虫线粒体DNA COI基因设计特异性引物和探针，引物及探针由上海桑尼有限公司合成。

上游引物：5’-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3’，如SEQ ID NO.1所示序列；

下游引物：5’- ACCACCCTACCCAGACAAAC-3’ 如SEQ ID NO.2所示序列；

探针：5’-FAM-AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC-BHQ1-3’ （其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团），如SEQ ID NO.3所示序列。

1.4 华支睾吸虫ddPCR方法建立

1.4.1 ddPCR扩增反应体系

退火温度会直接影响PCR特异性，是PCR反应条件的重要参数，故本研究ddPCR反应体系中引物及探针的浓度分别为500nM和250nM，退火温度选择60℃、59.6℃、58.8℃、57.5℃、55.8℃、54.4℃、53.5℃、53℃，模板浓度为5ng/ul。进行ddPCR扩增、荧光检测和条件优化。

首先将配好的20µl PCR反应液转移至微滴发生卡样本孔中，然后将70µl微滴发生油至样本发生卡中的油孔中，把发生卡放入微滴生成器中生成微滴。再将生成的微滴（共40µl）转移至96孔PCR反应板中，并用铝箔封住，在普通PCR仪上进行扩增（PCR过程中升降温度速度控制在2℃～2.5℃以内）；将PCR扩增结果在微滴分析仪上进行分析。

1.4.2 ddPCR反应定量分析

将PCR扩增后的96孔板放入数字PCR仪微滴分析仪中，设定检测模式，检测FAM荧光信号，由软件自动统计发生PCR反应阳性微滴的比例，并对反应体系中的起始模板进行定量。

1.4.3 ddPCR检测方法特异性检验

分别将片形吸虫虫卵、次睾吸虫成虫、猪带绦虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫、斯氏狸殖吸虫成虫、三平正并殖吸虫成虫、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节以及蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫DNA稀释至5 pg/µl～10 pg/µl，按照上述ddPCR优化条件进行检测，同时设置阳性对照（华支睾吸虫成虫DNA样本）和空白对照（NTC）。

1.4.4 ddPCR检测方法空白限（LOB）和检测限（LOD）

取14份上述阴性DNA样本，按照已确定的反应体系和反应程序进行PCR扩增及荧光检测，同时设置阳性对照和空白对照。根据阴性对照结果计算假阳性率（FPR），根据FPR的泊松分布正向95 %置信区间分位数作为LOB值，同时以LOB值作为LOD负向95 %置信区间分位数推算出该检测方法的LOD值。该估计方法通过查阅泊松分布概率密度函数表实现。

1.4.5 ddPCR定量检测线性及重复性检测方法敏感性检验

将华支睾吸虫成虫DNA（5 ng/µl）样本进行10倍梯度稀释，各浓度梯度的上样量见表1。由于QX200 ddPCR目前最大检测微滴数为20 000，每个浓度梯度检测微滴数控制在20 000以内，以获得较可靠的实验结果。以10^-2稀释倍数的华支睾吸虫成虫DNA样本做为阳性参照。

表1 华支睾吸虫成虫DNA样本稀释梯度及上样量

1.4.6 ddPCR检测方法应用

将采集的27例华支睾吸虫虫卵镜检阳性样本，27份华支睾吸虫阴性样本，采用本研究建立的ddPCR检测方法进行检测，这些样本均为本实验室已进行改良加藤法镜检和PCR鉴定为华支睾吸虫阳性和阴性；同时设阳性对照和空白对照。每个样本重复2次。

2 结果与分析

2.1 ddPCR反应体系

根据不同退火温度所得阳性微滴产生的数量及阳性荧光扩增值与本底值之间的差异选最佳退火温度：根据阳性荧光扩增值与本底之间差异以及阳性液滴产生的数量，从图1可以看到A02-E02阳性荧光扩增值（上面的阳性微滴）与本底（下面的阴性微滴）之间差异越来越大，E02-H02时该差异趋于平缓，且阳性微滴数量变化不大，E02是55.8度，取整56度。优化结果得出56℃为最佳退火温度，当退火温度为56℃达到了预料不到的技术效果（见图 1）。最终确定ddPCR反应体系为：2× ddPCR预混液（ddPCR^TM Supermix for Probes（no dUTP））10µl，DNA模板1µl，10µmol引物各1µl，10µmol探针0.5µl，无菌水6.5µl，共20µl。扩增条件见表2。

本研究ddPCR检测方法中的所有样本检测所得微滴数均在10 000以上，即本实验产生的微滴数正常，数据真实可靠。

表2 华支睾吸虫ddPCR扩增条件

注：调整反应程序中的升降温度梯度为2 ℃/s；反应总体积设为40 µl

2.2 ddPCR方法空白本底检测限（LOB）和检测限（LOD）

根据14份阴性样本的实验结果，得到该方法的LOB值为1 copies/20 µl，LOD值为3copies/20 µl。

2.3 ddPCR检测方法的特异性

ddPCR实验结果表明，除华支睾吸虫成虫阳性DNA样本有特异性扩增外，片形吸虫虫卵、次睾吸虫成虫、猪带绦虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫、斯氏狸殖吸虫成虫、三平正并殖吸虫成虫、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节以及蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫DNA和NTC扩增结果均为阴性，表明建立的ddPCR反应方法具有较好的特异性（见图2）。

2.4 ddPCR检测方法定量检测线性及重复性敏感性

将稀释好的华支睾吸虫成虫DNA作为模板进行ddPCR试验。如1.4.5所描述，每个浓度设置3个重复，计算每个浓度3个测量值的变异系数，由表3可知其变异系数（CV）小于14%，表明所建立的华支睾吸虫ddPCR检测方法重复性良好，检测结果可靠。根据所加样本DNA浓度及测得的微滴数进行线性分析，获得在检测浓度为0.43copies/µl - 1015 copies/µl之间有较好的线性关系（R²=0.997 4）。见图3。

表3 华支睾吸虫ddPCR重复性实验结果

2.5 ddPCR 检测方法应用

采用ddPCR方法对27份华支睾吸虫虫卵阳性样本和27份阴性对照样本进行检测。结果27例阳性样本，均检测为阳性，检测率为100%，且3次重复中均能检出，拷贝数在1copies/µl~72.5 copies/µl；27例阴性样本，检测到5个样本微滴数在0.08 copies/µl~0.09 copies/µl。根据所得的结果绘制ROC曲线（见图4），面积为0.968（0.923~1.000），诊断界值点为2.01copies/µl，灵敏度和特异度分别为0.958和0.933，该方法在检测华支睾吸虫时有较高的诊断性。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120> 华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒及应用

<130> WH-NP-19-100485

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

ggtttggtat gattagtcac atttg 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

accaccctac ccagacaaac 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（未知）

<400> 3

agcaaacata gccaacacca agccc 25

Claims

1.一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物及荧光探针的序列如下：

所述荧光探针为如SEQ ID NO.3所示序列；所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团包括：FAM、VIC、HEX、CY5和ROX；荧光淬灭基团包括：MGB、BHQ1、Eclipse 和TAMRA。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下液滴式数字PCR反应体系：2× ddPCR预混液10µl，DNA模板1µl，10µmol如权利要求1所述的上游引物和下游引物各1µl，10µmol如权利要求1-3任一项所述的探针0.5µl，无菌水6.5µl，共20µl。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述液滴式数字PCR的退火温度为53℃-60℃。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述液滴式数字PCR的退火温度为56℃。

7.如权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件如下：

。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件中的升降温度梯度为2 ℃/s；反应总体积设为40 µl。

9.如权利要求1-9任一项所述的试剂盒在制备感染华支睾吸虫疾病诊断产品中的应用。