CN108559776A - 一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。所述CpG甲基化位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区。所述试剂盒包括检测上述甲基化位点的定量PCR引物。在本发明中,外周血白细胞较易获得,无需其他组织,属于无创性检查;外周血白细胞DAZ3基因启动子区甲基化反映的是机体整体的病理、生理情况,以其作为突发性弱精辅助诊断的生物标志物可以提高检测的准确性;所述试剂盒简化了定量PCR引物库,减少制作成本和生产时间,增加了针对性和实用性,提高了检测的灵敏度和特异性;所述标志物、方法、试剂盒能够用于突发性弱精辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用。
背景技术
引起男性弱精症的因素复杂,有遗传因素、生殖道感染及精索静脉曲张等,其中遗传缺陷是引起男性无精及弱精症的重要原因之一。染色体数量或者结构异常可以引起男性生殖器官异常,影响精子的发生进而降低其生育能力。本病以克氏综合征多见,核型为47,XXY。发病机制是X染色体在减数分裂时不分离,导致患者睾丸小而质硬,睾酮合成功能低下,发生严重弱精或无精子症。
突发性弱精属弱精症的一种,但其病因尚不明确。患有突发性弱精的男性临床表现为生殖器官结构和功能均正常,可正常排精,精液常规检查除了精子活力低下这一项,其余指标均在参考范围内。研究表明, Y染色体长臂上AZF(azoospermia factor)基因与男性不育密切相关。AZF划分为AZFa、AZFb、AZFc 3 个相互独立的区域,这些区域包括一些影响男胚细胞发育和维持的基因和基因家族,会影响精子的发生。 Reijo利用Y染色体特异性DNA探针发现了成人睾丸组织转录编码一种与减数分裂相关的RNA结合蛋白的基因DAZ(deleted in azoospermia),它恰恰在AZFc区域中。该基因在减数分裂前期的生殖细胞,尤其是精原细胞,发育中的各期精子细胞以及精子尾部均有表达,提示其在精子发生的各期均有调控作用。
临床实验室通过G显带技术对患者的染色体进行检测。操作人员将中期染色体制片经胰酶处理后,再用吉姆萨进行染色,得到染色体区带。然而,G显带技术只能显示染色体带的位置、宽度和深浅等,无法对染色体结构进行更细微的分辨。而患有突发性弱精的男性其染色体检测结果是正常的。其他对突发性弱精的主要检查手段有精液常规、激素检测、B超等。但这些均为疾病排除性检测,不可辅助诊断。近年来,随着分子生物技术的不断发展,利用荧光原位杂交技术,将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记,可以精确地检测染色体上DNA链单个碱基的突变/缺失,从而大大提高染色体核型分析的精度。比如Mozdarani推荐的PRINS和FISH两种技术相结合方法对精子胞核中DAZ基因微缺失进行筛查检测,但由于其处理程序繁琐,对实验人员操作技术要求高,因而未在临床上推广应用。当前,尚没有利用无创伤性、取材方便的血液样本检测与突发性弱精辅助诊断的生物标志物相关的特异性定量PCR引物及检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足,提供一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点。
本发明的另一目的是提供一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物。
本发明的又一目的是提供所述的CpG甲基化位点或其定量PCR引物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点,该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区;所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为:-312~-313。
上述定量PCR引物的筛选方法包括以下步骤(见图1):
(1)分别收集17例有子嗣的健康男性和13例年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本,提取总DNA;
(2)采用商品化试剂盒EZ-96DNA methylation kit(Zymo research公司)对DNA进行亚硫酸氢盐处理;
(3)使用Methprimer服务器设计用于DAZ1-3基因启动子区CpG位点甲基化水平定量检测的PCR引物;
(4)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的Sequenom MassARRAY甲基化定量检测分析平台 (CapitalBio公司)进行DAZ1-3基因启动子区CpG位点定量检测,筛选在有子嗣的健康男性和突发性弱精男性间存在差异甲基化水平的CpG位点;
(5)用实时荧光定量PCR方法对一组样本进行逐个检测,复筛出甲基化水平差异显著的CpG位点;
(6)进一步用实时荧光定量PCR方法对其他样本进行逐个验证,筛选出稳定的甲基化水平差异显著的 CpG位点;
(7)用实时荧光定量PCR方法对100例有子嗣的健康男性EDTA抗凝血样本进行逐个检测,确定健康男性外周血白细胞DAZ3基因启动子区该CpG位点甲基化检测结果ΔCT值参考范围。
具体来说,上述筛选方法包括以下步骤:(1)收集有子嗣的健康男性和年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本,提取总DNA;(2)对上述DNA进行亚硫酸氢盐处理;(3)设计用于CpG位点甲基化水平定量检测的测序引物;(4)运用Sequenom MassARRAY甲基化定量检测分析平台进行CpG位点甲基化水平定量检测,初筛出在有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性间存在差异甲基化水平的CpG 位点;(5)采用荧光定量PCR对初筛出的CpG位点进行复筛;(6)进一步用实时荧光定量PCR方法对其他样本进行逐个验证,挑选出稳定、甲基化水平差异显著的CpG位点;(7)采用荧光定量PCR确定健康男性外周血白细胞DAZ3基因启动子区该CpG位点甲基化检测结果ΔCT值参考范围。
一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物,该定量PCR引物由本发明所述的CpG 位点的定量PCR引物组成。
所述CpG位点的定量PCR引物序列优选如SEQ ID No.1和No.2所示。
表1上述定量PCR引物为以下序列所示的定量PCR引物:
本发明所述的CpG甲基化位点作为检测靶点在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。
本发明所述的定量PCR引物在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。
一种用于突发性弱精辅助诊断的试剂盒,该试剂盒包含本发明所述的定量PCR引物。
所述试剂盒包括Sybergreen、内参定量PCR引物和该定量PCR引物(英潍捷基公司提供)。
本发明使用的检测方法可以选自:RT-PCR方法、Real-time PCR方法中的一种或几种。例如,EDTA抗凝全血样本中DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平检测方法包括以下步骤:
(1)使用DNA blood mini kit(Qiagen公司)提取外周血白细胞总DNA;
(2)采用商品化试剂盒EZ-96DNA methylation kit(Zymo research公司)对DNA进行亚硫酸氢盐处理;
(3)利用定量PCR引物法进行PCR反应;
(4)读取CT值。
本发明的有益效果:
通过对有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性的外周血白细胞DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平进行检测和比对,分析DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平与精子活力的关系,联系患者的染色体、精液常规、B超、激素等其他临床实验室检查结果,筛选一个与突发性弱精相关的外周血白细胞DAZ 基因启动子区CpG甲基化位点,并利用这个位点的定量PCR引物制备出适用于临床辅助诊断用途的试剂盒,为突发性弱精患者提供特异性的以及迅速的无创伤性检测手段。
首先,EDTA抗凝全血样本相对其他组织较易获得,与精液常规检查相比,检测前无需做特殊准备,极大地方便了医疗人员的使用,更减少了患者的不便;
其次,外周血白细胞DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平反映的是机体整体的病理、生理情况,其检测结果具有精确而详细的指导意义;
第三,所筛选出的CpG位点对突发性弱精辅助诊断的特异性和灵敏度显著高于目前临床实验室使用的染色体、精液常规、B超、激素等疾病排除性检查项目,大大提高了诊断的准确性。此外,外周血白细胞 DAZ基因启动子区CpG位点甲基化水平检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因表观遗传学调控状态,并为突发性弱精的治疗提供了潜在靶点。
第四,本发明的试剂盒所包含的定量PCR引物同样是基于甲基化定量检测分析平台、定量PCR技术筛选出的在筛选有子嗣的健康男性和年龄相匹配的患有突发性弱精男性间存在差异甲基化水平的一个定量 PCR引物,这样可以增加检测的灵敏度和特异性,提高检测水平。
综上所述,本发明提供的特异的CpG位点甲基化水平检测结果作为突发性弱精辅助诊断的中间结果,有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行突发性弱精患者的诊断。检测外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG甲基化位点简单易行且效果优越。基于此制备的用于检测CpG位点甲基化水平的试剂盒投入实践使用,仅仅需要病人的EDTA抗凝全血样本而不需要任何其他组织,通过最精简的定量PCR引物来检测外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点甲基化水平能拓展突发性弱精的检测指标,提高检测的灵敏度,丰富突发性弱精辅助诊断的生物标志物,这个CpG位点有望成为突发性弱精患者辅助诊断的重要标志分子,具有极重要的临床实验室应用潜力和价值。
附图说明
图1为突发性弱精辅助诊断的试剂或工具的主要开发流程图。
图2为外周血白细胞DAZ1(图A)、DAZ2(图B)、DAZ3(图C)基因启动子区各CpG位点在有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性之间的甲基化水平差异。
图3为实时荧光定量PCR方法复筛出外周血白细胞DAZ3基因启动子区具有甲基化水平差异的CpG位点 (-312~-313)(NZ:n=17,IAZ:n=13,*P<0.05)
图4为外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平在有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性之间差异的ROC曲线。横坐标表示特异性,达82.3%;纵坐标表示敏感性,达84.6%(NZ:n =17,IAZ:n=13,*P<0.05)
图5为举一例突发性弱精患者外周血白细胞染色体检测结果。
图6为举一例突发性弱精患者精液常规结果。
图7为举一例突发性弱精患者血清激素检测结果。
图8为举一例突发性弱精患者睾丸B超结果。
图9为举一例突发性弱精患者其外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平实时荧光定量PCR方法扩增曲线。
图10为实时荧光定量PCR方法检测有子嗣的健康男性的外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点甲基化ΔCT值参考范围(n=100)。
图11为举一例门诊患者精液常规结果。
图12为该门诊患者外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平实时荧光定量PCR 方法扩增曲线。
图13为该门诊患者精液常规复查结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1样本的收集
我们共收集了17例有子嗣的健康男性和13例年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝全血样本,具体信息见下:
表1样本信息表
数据以平均数±SD表示。***P<0.001。
实施例2有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性外周血白细胞DAZ1-3基因启动子区各CpG位点甲基化水平定量检测
最初筛选阶段,通过对17例有子嗣的健康男性和13例年龄相匹配的患有突发性弱精男性进行外周血白细胞DAZ1-3基因启动子区CpG位点定量检测,筛选存在甲基化水平差异的CpG位点。结果发现,DAZ3 基因的启动子区一特定CpG位点(-312~-313)甲基化水平在两组中有差异(P<0.05;见表2和图2)。表2Sequenom MassARRAY甲基化定量检测分析平台初筛出的有子嗣的健康男性和患有突发性弱精男性外周血白细胞中DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平
实施例3外周血白细胞中DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平的实时荧光定量PCR 实验
采用定量PCR方法对批量样本逐个验证从甲基化定量检测分析平台初筛出的CpG位点。定量PCR的实验原理及实验步骤同RT-PCR一样。仪器为Roche Cobas z 480。
(1)使用DNA blood mini kit(Qiagen公司)提取外周血白细胞总DNA
a)向1.5mL EP管底加入20μL Qiagen Protease;
b)加入200μL EDTA抗凝血样本;
c)加入200μL Buffer AL,漩涡振荡15s;
d)56℃水浴10min;
e)将1.5mL EP管瞬时离心;
f)加入200μL无水乙醇,漩涡振荡15s,瞬间离心;
g)将混合溶液过柱,6000g,1min离心,更换收集管;
h)加入500μL Buffer AW1,6000g,1min离心,更换收集管;
i)加入500μL Buffer AW2,20 000g,3min离心;
j)将柱子放置在新1.5mL EP管中,加入200μL Buffer AE,室温孵育1min,6000g,1min离心。
(2)采用EZ-96DNA methylation kit(Zymo research公司)对DNA进行亚硫酸氢盐处理
a)吸取20μL DNA样本至含130μL CT Conversion Reagent的PCR管中,混匀,瞬时离心;
b)PCR:98℃8min,64℃3.5h,4℃保存;
c)向Zymo-Spin IC柱加入600μL M-Binding Buffer,置入收集管中;
d)将PCR的样本加入柱中,上下颠倒混匀;
e)10 000g,30s离心,弃液;
f)加入100μL M-Wash Buffer,12 000g,30s离心;
g)加入200μL M-Desulphonation Buffer,室温静置15min,12 000g,30s离心;
h)加入200μL M-Wash Buffer,12 000g,30s离心,重复清洗一次;
i)将柱子置于新1.5mL EP管中,加入10μL M-Elution Buffer,12 000g,30s离心。
(3)qRT-PCR:用20ul体系进行qRT-PCR,体系包括4μL探针(英潍捷基公司提供),1μL DNA模板,5 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)。所用仪器为RocheCobas z 480,PCR的反应条件是:95℃5min,95℃15s,60℃1min,40个循环。
(4)数据分析与处理:扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值,然后根据内参的CT值计算出每个样本的ΔCT值。
结果发现,使用实时荧光定量PCR方法可以区分有子嗣男性与患有突发性弱精男性的外周血白细胞中 DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平,差异具有统计学意义(P<0.05;见图3)。进一步绘制ROC曲线,结果表明该定量PCR方法对突发性弱精的检测特异性达82.3%,敏感性达84.6%(见图4)。
实施例4用实时荧光定量PCR方法对其他样本进行检测,筛选出稳定的甲基化水平差异显著的CpG位点
用定量PCR方法对其他10例有子嗣的健康男性和10例年龄相匹配的患有突发性弱精男性的EDTA抗凝血样本进行逐个检测(具体步骤参见实施例3),结果发现,与初筛结果一致,外周血白细胞DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平在两组间有显著性差异(P<0.05;见表3和图5-9)。
表3定量PCR方法检测20例样本DAZ3基因启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平
实施例5筛选出的CpG位点临床价值评估
我们从外周血白细胞DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)甲基化水平角度通过对100例有子嗣的健康男性EDTA抗凝血样本进行检测,确定健康男性外周血白细胞DAZ3基因启动子区CpG位点甲基化ΔCT参考范围:≤5.90(见图10)。
在验证过程中,我们遇到一位弱精患者(见图11),但使用定量PCR方法结果显示ΔCT在参考范围内 (见图12)。我们与该患者进行了充分沟通,得知他近半年饮酒过量,并且经常熬夜。我们建议他规范正常饮食和作息规律,至少三个月后再来复查。复查结果显示正常(图13),该患者并非患有突发性弱精。
实施例6用于突发性弱精辅助诊断的试剂盒
用于突发性弱精辅助诊断的试剂盒的制作工艺和操作流程是基于甲基化定量检测分析平台和定量PCR 技术所测结果将针对外周血白细胞DAZ3基因的启动子区CpG位点(-312~-313)的定量PCR引物收集到 PCR试剂盒(RT-PCR或Real-time PCR)中制备特定定量PCR引物的突发性弱精辅助诊断的试剂盒。
所述试剂盒的具体组成(每份样本)如下:
本试剂盒的价值在于以特异的定量PCR引物检测外周血白细胞DAZ3基因启动子区的CpG位点(-312~ -313)甲基化水平,检测结果作为突发性弱精辅助诊断的中间结果,有助于医师结合临床症状、病史或其他检查信息进行突发性弱精患者的诊断。因此,该试剂盒投入实践使用可以拓展突发性弱精的检测指标,提高检测的灵敏度,丰富突发性弱精辅助诊断的生物标志物,这个CpG位点有望成为突发性弱精患者辅助诊断的重要标志分子,具有极重要的临床实验室应用潜力和价值。
序列表
<110> 张洁心
张世昌
<120> 一种用于突发性弱精辅助诊断的生物标志物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgtctccc tctgttttcc acagac 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcacacccac cccaaaatct 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggtgatgga ggaggtttag taag 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaccaataaa acctactcct cccttaa 27
Claims (7)
1.一个用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点,其特征在于该CpG位点在外周血白细胞DAZ3基因启动子区;所述的DAZ3基因启动子区CpG位点位置为:-312~-313。
2.一种用于突发性弱精辅助诊断的CpG甲基化位点定量PCR引物,其特征在于该定量PCR引物由权利要求1所述的CpG位点的定量PCR引物组成。
3.根据权利要求2所述的定量PCR引物,其特征在于所述CpG位点的定量PCR引物序列为:SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
4.权利要求1所述的CpG甲基化位点作为检测靶点在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。
5.权利要求2或3所述的定量PCR引物在制备突发性弱精辅助诊断的试剂或工具中的应用。
6.一种用于突发性弱精辅助诊断的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含权利要求2或3所述的定量PCR引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还可以包括Sybergreen和内参定量PCR引物。
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