CN105442052A - 一种检测诊断主动脉夹层病致病基因的dna文库及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测主动脉夹层致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据33个主动脉夹层致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的33个基因检测区域能够检测包括：家族性主动脉瘤或夹层(FTAAD)、Marfan综合征(MFS)、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、Loeys-Dietz综合征(LDS)以及主动脉扭曲综合征(ATS)等多种常见主动脉夹层相关疾病，对主动脉夹层的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断主动脉夹层致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据主动脉夹层致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术
主动脉夹层是心血管系统较常见的一种严重威胁患者生命安全的主动脉疾病，起病急，预后差，死亡率高，病因复杂，日益受到人们的重视。目前，针对该病尚无治疗效果满意的特异性药物，因此能否早期筛查诊断出潜在患病人群对于该病的防治就显得至关重要。
传统的主动脉夹层诊断主要依靠临床表现(突发撕裂样剧烈胸痛或腰腹痛)和传统生物标记物(平滑肌肌球蛋白重链smMHC、钙调蛋白calponin、弹力蛋白降解产物sELAF、C反应蛋白CRP、DD二聚体D-Dimer)和影像学检查(经食管超声心电图、主动脉超声、主动脉CT及核磁共振)。然而，临床上由于主动脉夹层患者出现临床症状的时间差异大，很多患者甚至没有明显的胸痛和腰腹痛，首发症状即为猝死。传统生物标记物预测和诊断主动脉夹层特异性差。传统的影像学检查诊断方法存在确诊时间晚(症状出现后)，难以判断预后等问题。
主动脉夹层既可以独立发病，也可以作为临床综合征的一种表现。与主动脉夹层相关的临床综合征有：Marfan综合征(MFS)、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、Loeys-Dietz综合征(LDS)以及主动脉扭曲综合征(ATS)。
随着测序技术近年来的迅猛发展，人类基因检测方法变得越来越简单快捷，检测成本也日益下降，使得基因诊断应用在临床一线的常规检查中成为可能。而且，基因诊断敏感性高，能早期诊断，即：可在症状出现前和不可逆病理改变前做出诊断，临床医生也可以根据基因型判断恶性临床转归和预后，早期干预。在各种高通量测序平台中，新进出现的基于半导体测序技术的扩增子测序以其快速的运行时间，灵活的通量选择，较低的运行成本和相对简单的操作方法脱颖而出。
因此，有必要寻求一种新的基于高通量半导体测序技术的检测主动脉夹层致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种覆盖包括：家族性主动脉瘤或夹层(FTAAD)、Marfan综合征(MFS)、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、Loeys-Dietz综合征(LDS)以及主动脉扭曲综合征(ATS)等多种常见主动脉夹层相关疾病，包含33个主动脉夹层致病相关基因的DNA文库。本发明是目前已知检测主动脉夹层最全面的靶向测序基因检测试剂盒，33个基因的选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)以及发明者自己的课题研究内容。这33个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。其中33个基因及其导致的相关疾病如下：
本发明根据33个主动脉夹层致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确主动脉夹层的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供以下技术方案：
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断主动脉夹层。
本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断主动脉夹层。优选的，所述诊断装置是测序芯片。
进一步，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部33个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过基因检测确诊的FBN1基因突变Marfan综合征患者，应考虑定期行主动脉和心脏彩超随访，终生口服ARB类药物及倍他受体阻滞剂等治疗，改善预后。
本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含33个主动脉夹层的致病基因的DNA文库。
本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含33个主动脉夹层的致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。
本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用上述的DNA文库从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部31个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过基因检测确诊的FBN1基因突变Marfan综合征患者，应考虑定期行主动脉和心脏彩超随访，终生口服ARB类药物及倍他受体阻滞剂等治疗，改善预后。
采用本发明的DNA文库对主动脉夹层病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：
1.及时发现无痛性主动脉夹层患者及尚未出现临床症状的主动脉夹层患者：一些主动脉夹层患者如：可以在血管破裂前无胸痛等症状，首发症状即是猝死，尤其是已经有猝死家族史的病人，猝死风险更高。而对于已诊断遗传性综合征性主动脉夹层患者的直系血亲，有很大概率遗传了同样的致病突变，只不过因为年龄尚幼，疾病还未表现出来。对于这种早期“隐匿型”主动脉夹层患者，未发病时传统的检查方法无法对其进行确诊。因此而基因诊断则成为了诊断这些患者的重要手段；
2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案：通过基因诊断筛选出已知的主动脉夹层致病突变携带患者，哪怕还未发病，应更加积极地考虑药物治疗和影像学检查随访，一旦发现主动脉损伤，应更积极考虑手术治疗，以最小代价换取最大治疗收益。如：根据已报道的大型临床试验结果，筛查到FBN1已知致病突变的，有猝死家族史的Marfan综合征患者，哪怕还没有主动脉病理性改变，应开始进行预防性药物治疗，并定期行主动脉和心脏彩超检测随访。一旦发现主动脉有溃疡，应及时行主动脉支架植入术，及时控制病情，避免猝死发生。
3.本申请的DNA文库是申请人从众多的主动脉夹层致病基因中选择的33个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。国际上缺乏大规模的中国汉族人群主动脉夹层基因诊断相关信息，绝大多数已知主动脉夹层致病基因都主要来自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期的临床观察和大规模中国汉族人群主动脉夹层的基因诊断研究。
4.本发明的DNA文库能够检测包括：家族性主动脉瘤或夹层(FTAAD)、Marfan综合征(MFS)、Ehlers-Danlos综合征(EDS)、Loeys-Dietz综合征(LDS)以及主动脉扭曲综合征(ATS)等多种常见主动脉夹层相关疾病。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测33种主动脉夹层的遗传缺陷；
5.本发明中采用基于IonTorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的33个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到96人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到98.90％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；
6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因很多主动脉夹层患者面临猝死的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。主动脉夹层多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对主动脉夹层具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1一次IonTorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图；
图2一次对33个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；
图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；
图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
1.该方法中所用到的试剂：
IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0，IonPGMTMTemplateOT2200Kitv3，IonSequencing200Kitv2，IonXpressBarcodeAdaptors1-16Kit，Ion318TMChipKitv2
2.标本采集和保存
(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。
(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。
3.检测步骤和结果分析：
(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。
(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的33个基因全外显子为检测区域，基于IonAmpliSeqTMDesigner自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:
a.目标区域的扩增：
反应条件：
b.扩增产物二合一，酶切：
反应条件：
c.连接接头：
反应条件：
22℃30min
72℃10min
10℃Upto1h
d.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：
反应条件：
e.片段选择：片段选择步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit2.0Fluorometer定量后即建库完成。
(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照IonPGMTMTemplateOT2200Kitv3及IonSequencing200Kitv2操作手册进行：
a.油包水PCR反应：
将上述反应体系加入IonOneTouch2中进行油包水PCR反应。
b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的IonPGMTemplateOT2200IonSphereParticles经过IonOnetouchES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：
室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序。
(4)数据分析：测序数据经过coverageanalysis和variantcaller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过IonReporter在线注释后，得到对主动脉夹层诊断有意义的突变位点。
(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。
结果说明及分析
通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对10个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为967M(TotalBase)，能够总共得到6446002的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为161bp。10个标本平均能够被测到634630(512755-823123)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variantCaller分析，每个标本平均有163个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过IonReporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4例举的那样，图4箭头所指处显示FBN1基因c.1585C>T(p.Arg529X)杂合突变,最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。也为患者家族中带有该突变尚未有临床症状的下一代提供诊断依据及治疗依据。
本发明的临床应用例证
利用本发明所提供的方法，对702名患有主动脉夹层但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出243例患者带有致病基因突变。该方法对主动脉夹层检出的总阳性率达到34.62％，结合临床影像学检查，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的87.57％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据702名受测患者的临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对主动脉夹层的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。
实施例2：
本发明中引物池里包含发明者新发现的主动脉夹层致病基因17个，如下表：
新发现的17个主动脉夹层致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的主动脉夹层致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国汉族病人大样本量病例样本库中对候选的致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述17个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中均出现完全共分离。
对一系列的筛选到的新致病基因及其致病突变进行功能学实验，对相关致病通路进行功能学检测，对部分重要受累基因进行大鼠基因敲除建模，观察疾病在动物模型中的再现情况，从而进一步对候选基因的致病性进行评估。本发明发现，患者的白细胞以及转染上述突变基因的VSMC血管平滑肌细胞系或NIH3T3成纤维细胞系细胞中上述17个基因的表达和功能均出现改变，在基因敲除大鼠模型中，基因敲除动物可以再现主动脉夹层的病理表现，最终，筛选出了这17个新的国际上尚未报道的致病基因，并在汉族大样本病例中对其致病性进行了初步评估。同时，建立了600名汉族正常对照人群的所有致病基因的非致病多态性位点库，弥补了国际上通用数据库中汉族人样本少，非致病多态性位点严重不全的漏洞，对未来的基因检测和数据分析提供了坚实基础。
Claims (10)
1.一种基于IonTorrentTM高通量测序技术诊断主动脉夹层的DNA文库，其特征在于，该文库包括33个离子通道病相关的致病基因。
2.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断主动脉夹层。
3.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用于诊断主动脉夹层。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
5.如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：
(1)提供受试者样本的基因组DNA；
(2)利用权利要求1所述的DNA文库从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖全部31个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；
(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；
(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序；
(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；
(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。
7.如权利要求2-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。
8.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。
9.一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。
10.如权利要求9的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。
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