CN109811048A - 一种用于检测遗传性主动脉疾病的致病/易感基因的探针组 - Google Patents
一种用于检测遗传性主动脉疾病的致病/易感基因的探针组 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断主动脉疾病的产品中的应用,所述的试剂可以捕获与主动脉疾病的致病和/或易感的多种基因,可最多检测34个相关基因。本发明所述的试剂、含有试剂的产品可以解释主动脉疾病患者的病因,评估患有主动脉疾病的风险、危险因素,为患病个体分子遗传学诊断,高发人群普查、筛查家属中的发病高危人群以及进行相应的遗传咨询及产前诊断干预提供参考,以期减少主动脉疾病的发病率。同时,本发明所述的探针组、芯片及试剂盒具有高效、检测位点多、准确、操作简便、特异性好、灵敏度高、快速、实用性强且成本低廉的优势。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程及分子遗传学技术领域,具体涉及一种用于遗传性主动脉疾病的致病和/或易感基因的个性化捕获、测序的探针组及试剂盒。
背景技术
遗传性主动脉疾病以主动脉扩张、主动脉瘤夹层为特征,可发生于马凡综合征、Loeys-Dietz综合征、血管型Ehlers-Danlos综合征、家族性胸主动脉脉瘤/夹层等多种疾病,其共同特点是主动脉瘤发生破裂的风险高,必须通过手术置换损伤部位动脉而避免发生致命性动脉瘤破裂。通常情况下,当患者主动脉直径达到5.0~5.5cm时,医生会建议进行预防性手术干预。然而研究结果显示,多达60%的急性A型主动脉夹层在直径<5.5cm时即发生了破裂。在过去十年对MFS及相关疾病的研究中,人们已经积累了一定的经验,了解到特定基因的突变可预示着患者主动脉直径<5.0cm时即有发生破裂的风险,以及患者预后情况。综上,这些疾病有着不同程度的临床表型重合,仅靠临床症状往往难以区分确诊。基因检测可以对一些潜在高危的遗传性主动脉疾病患者进行预警,对于遗传性主动脉疾病的临床诊断和预后评估中有着重要作用。主动脉疾病的相关诊断治疗指南中也明确推荐患者进行相关基因的检测进行临床诊断和预后评估。专利CN105442052B公开了一种通过靶向高通量半导体测序检测主动脉疾病的致病基因突变的DNA文库及其应用,其中包括33个主动脉夹层致病基因的引物池,能够检测家族性主动脉瘤或夹层、马凡综合征、Loeys-Dietz综合征、血管型Ehlers-Danlos综合征以及主动脉扭曲综合征。
马凡综合征(Marfansyndrome,MFS)是一种常染色体显性遗传的结缔组织疾病,其特征是周围结缔组织营养不良、骨骼异常、内眼疾病和心血管异常,发病率约为1:3 000~1:5000。病变累及多个器官系统,主要涉及心血管、骨骼和眼睛。其中,心血管系统异常包括主动脉瘤/夹层,是导致马凡综合征患者死亡的最主要原因。若无干预,患者平均寿命约为32岁。若得到适当干预和治疗,其平均寿命可接近于正常人。儿童首次诊断马凡综合征大多数是根据近视、脊检侧弯或蜘蛛指(趾)等其他畸形。成年患者的除体格异常与关节松弛外,主要是心脏功能不全及由于升主动脉瘤压迫出现的症状,如心悸、胸闷、气短、胸痛。当出现急性内膜破裂而形成主动脉夹层时,则会出现主动脉夹层相应的症状,如心前区剧痛等。鉴于MFS临床表现的高度异质性,需要更多层面的诊断依据,分子诊断(致病性基因突变筛查)也纳入了主要诊断条件之中,对马凡综合征的诊断有着重要意义。专利CN104120132B公开了FBN1基因突变体及其应用,具体涉及分离的编码FBN1突变体的核酸,分离的多肽,筛选易患马凡氏综合征的生物样品的方法,筛选易患马凡氏综合征的生物样品的系统,以及用于筛选易患马凡氏综合征的生物样品的试剂盒。FBN1是马凡综合征唯一致病基因,编码原纤维蛋白(fibrillin)-1,是细胞外微纤维的重要组成部分。目前已发现的FBN1突变已有上千个,多数是单个家庭特有的。其中,错义突变是最常见类型,半胱氨酸的单碱基置换占绝大多数。现有的FBN1基因型-表型关联分析提示,FBN1基因半胱氨酸发生错义突变的患者发生晶体异位的几率高于其它突变类型。临床研究数据显示,MFS患者主动脉直径<5.5cm时发生急性破裂的风险较小,其它动脉发生动脉瘤的几率较低。FBN1基因的常见变异位点(基因多态性位点)可增加普通人群患胸主动脉瘤的风险,这对于通过分子诊断去判断哪些患者适宜采用与MFS患者相似的治疗方案有着重要指导意义。
主动脉夹层是指血液通过主动脉内膜裂口进入主动脉壁并造成动脉壁的分离,导致呈现出一种主动脉管腔真假两腔并存的状态。根据夹层的破口及其累及范围,可将主动脉夹层分为Stanford A型和B型,Stanford A型主动脉夹层是指夹层累及升主动脉,主动脉破口可位于升主动脉、主动脉弓及降主动脉,Stanford B型主动脉夹层是指夹层在左锁骨下动脉已远的降主动脉。伴随着影像学技术及医疗设备条件的进步,主动脉夹层检出率呈上升趋势。主动脉夹层起病急骤,发展迅速,预后凶险,是最常见的主动脉疾病之一,年发病率为5-10/100000,是腹主动脉瘤破裂发生率的2~3倍,死亡率约1.5/100000,男女发病率之比为2~5:1。遗传性因素、高血压、主动脉中层的退行性变及囊性样变、动脉粥样硬化、免疫炎性疾病、糖尿病、高尿酸血症、创伤、妊娠、吸烟、饮酒等均与主动脉夹层相关。主动脉夹层生成机制与遗传学密切相关,其相关易感基因是目前主动脉夹层遗传学研究热点,从基因角度分析与主动脉夹层相关的易感基因很有意义。
家族性胸主动脉瘤及夹层,20%的非综合征型胸主动脉瘤/夹层(TAAD)患者具有家族史,意味着是由遗传因素导致的疾病。针对这些家族性胸主动脉瘤及夹层(FTAAD)家系进行分析,发现FTAAD主要是常染色体显性遗传、外显度不高的单基因疾病。不同家系乃至同一家系不同患者间疾病表现程度可能有所不同,主要表现在发病年龄、直径<5.0cm时升主动脉破裂的风险、病变累及主动脉根部或升主动脉或两者都累及等方面。另外,患者还可不同程度地具有心血管系统其它并发症状,如二叶主动脉瓣、动脉导管未闭和其它血管疾病(如颅内动脉瘤、闭塞性动脉疾病)等。目前已发现数个基因与FTAAD有关:TGFBR1、TGFBR2、SMAD3突变已在6%~8%的无马凡综合征或Loeys-Dietz综合征特征的FTAAD家系中发现,提示这些综合征和FTAAD的主动脉瘤形成可能有着相似的病理机制。ACTA2、MYH11、MYLK、PRKG1、SMAD4等基因也被发现与FTAAD有关,其中ACTA2是最为常见的FTAAD致病基因,约占患者人数的14%。ACTA2突变除了引起TAAD外,还易引起小动脉闭塞性疾病,如早发性冠状动脉疾病、中风以及原发性肺动脉高压等。ACTA2突变患者主动脉瘤常常同时累及主动脉根部和升主动脉,与马凡综合征患者相比,此类患者更容易发生急性动脉瘤破裂。1/3的患者主动脉直径<5.0cm时发生了动脉破裂。因此对携带ACTA2突变的TAAD患者,当主动脉直径达到4.5cm时,即可考虑进行预防性手术。
随着基因测序技术的发展,基因组序列测定的费用越来越低,收集个体样本遗传信息的速度也越来越快。第二代高通量测序技术(next-generation sequencingtechnology)具有快速、准确、低成本的优点,可同时对多个基因的各种类型突变进行检测,已经被广泛应用于遗传缺陷的病因检测和分子遗传学诊断,然而到目前为止,一直尚未有专门针对遗传性主动脉疾病的致病/易感基因检测的高通量探针、芯片或试剂盒,使得本病相关领域的进展严重滞后,发病率高居不下,遗传咨询和必要的产前干预措施无法施行,本应早发现、早明确病因、早干预治疗甚至部分可治愈的本病患者不能及早得到关注,不仅给患者和其家庭带来的巨大的痛苦和沉重的经济负担,也严重阻碍了我国整体人口素质的大幅度提高。目前商售人类全基因组外显子测序的价格在6千到8千人民币之间,而本发明的探针组的基因测序成本只有2千到3千人民币,可以大大降低患者的经济负担,是一种非常实用的遗传性主动脉疾病的筛查工具。
综上所述,开发一种高效、准确、快速、低价的遗传性主动脉疾病的致病/易感基因的试剂盒,用于遗传性主动脉疾病的致病/易感基因的基因筛查和分子遗传学诊断,意义非常重大。
发明内容
本发明人通过创造性劳动筛选出约34种与主动脉疾病的致病和/或易感相关的基因,根据这些基因的任意组合提供相应组合的探针组、芯片或试剂盒,可以判断是否患有主动脉疾病、解释主动脉疾病患者的病因、评估个体患主动脉疾病的风险、用于孕前预警指示突变基因携带者的后代患有主动脉疾病的风险或以主动脉疾病的致病和/或易感相关的基因的变异位点作为靶点,为治疗主动脉疾病提供一种全新的思路和手段。为个体提供分子学遗传诊断,对患病家属的家系筛查,以及对突变携带者的早期干预治疗具有重要的临床意义,也可对再次妊娠的风险进行精确评估。
同时,本发明所述的探针组、芯片及试剂盒具有高效、检测位点多、准确、快速、实用性强且成本低的优势。
优选的,所述筛选的方法为结合大量数据库检索和/或对患者基因测序结果进行筛选。进一步优选的,所述的数据库为OMIM数据库,通过查询OMIM数据库及权威文献,确定以主动脉疾病为临床表型的疾病的致病基因。
本发明的第一方面,提供了作为主动脉疾病诊断的生物标志物,所述的生物标志物选自基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合以及各基因表达的蛋白或蛋白的组合。
优选的,所述的生物标志物选自基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
优选的,上述的各生物标志物的基因发生突变会使主动脉疾病发生的风险剧增。
本发明所述的各生物标志物均可单独作为诊断或评估主动脉疾病的依据。
优选的,主动脉疾病诊断的依据为各基因或其组合的突变,或者,各基因或其组合基因的表达量的多少。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的主动脉疾病诊断的依据为各基因或其组合的突变。
优选的,通过基因测序的方法进行各基因或其基因组合的突变检测。
本发明的第二方面,提供了一种检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断主动脉疾病的产品中的应用,或者,在诊断主动脉疾病患病与否、解释主动脉疾病患者的病因、主动脉疾病患病风险度评估、主动脉疾病患者预后评估、孕前预警指示后代患病的风险度、筛选治疗或预防主动脉疾病的药物及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。
优选的,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
进一步优选的,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、TNXB、B3GALT6、PRKG1、MFAP5、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1和/或TGFBR1。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3和或CBS的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂为检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的突变位点试剂;所述的突变位点为FBN1基因的p.C1622R、p.I1909T、p.C950R、p.Y2849_D2850delinsX、p.M2690R、p.L1421P、p.G1434D、p.R1428C或TGFBR1基因的p.S241L。
优选的,所述的试剂选自探针组、引物组或基因芯片。所述的产品包含所述的试剂或所述的产品为试剂盒或药物。
本发明的第三方面,提供了一种筛选用于治疗或预防主动脉疾病的药物的方法,包括如下步骤:
a)将能够表达突变型的上述基因或其组合的生物样品置于存在候选药物的条件下培养;
b)将能够表达突变型的上述基因或其组合的生物样品置于不存在候选药物的条件下培养;
c)确定生物样品在步骤a)和步骤b)两种情况下是否患有主动脉疾病以及动物的死亡率变化,以此结果指示候选药物是否可以用于治疗或预防主动脉疾病。
优选的,所述的生物样品为动物模型。进一步优选的,所述的动物模型选自大鼠、小鼠、兔或猴。
本发明的第四方面,提供了一种治疗或预防主动脉疾病的药物,所述的药物以上述各标志物基因或基因的组合作为靶点。
本发明的第五方面,提供了一种探针组,所述探针组检测的各基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中,所述探针组检测的各基因为LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、TNXB、B3GALT6、PRKG1、MFAP5、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
在本发明的另一个具体实施方式中,所述的探针组检测的各基因为LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、TNXB、B3GALT6、PRKG1、MFAP5、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、RPS6KA3及CBS。
在本发明的另一个具体实施方式中,所述的探针组包含能同时特异性捕获34个致病基因的探针,所述探针组检测的各致病基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3及CBS。
优选的,所述的基因为主动脉疾病致病和/或易感相关的基因。
优选的,根据上述各基因通过公知、通用的方法设计并合成探针序列,对目的片段进行特异性捕获、扩增、测序,以达到检测样本的目的。
本发明所述的基因或各基因的组合作为主动脉疾病的生物标志物。
本发明所述的基因或各基因的组合可以用于治疗或预防主动脉疾病的药物的筛选。
本发明所述的治疗或预防主动脉疾病的药物以上述各标志物基因或基因的组合作为靶点。
本发明所述的主动脉疾病以主动脉扩张、主动脉瘤或主动脉夹层为特征;优选的,所述的主动脉疾病选自马凡综合征、Loeys-Dietz综合征、血管型Ehlers-Danlos综合征、Ehlers-Danlos综合征VI型、主动脉扭曲综合症、家族性胸主动脉瘤或家族性胸主动脉夹层。
本发明的第六方面,提供了主动脉疾病的致病和/或易感基因在制备诊断主动脉疾病的产品中的应用,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
本发明的第七方面,提供了一种应用本发明所述的探针组进行基因检测的方法,包括将待检DNA与所述的探针组混合。
优选的,所述的基因检测包括检测所述基因的有或无,或者,突变的有或无。进一步优选的,所述的突变选自剪切位点突变、无义突变或移码突变。
优选的,所述的基因检测包括检测所述基因的水平。
本发明所述的基因检测的方法可以为非诊断目的或诊断目的。
本发明所述的非诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因组合中各基因的突变有或无以及检测上述基因组合中各基因的水平。
本发明所述的诊断目的为应用所述的探针组检测上述基因后诊断或预测疾病。
本发明的第八方面,提供了一种含有本发明所述的探针组的基因芯片。
优选的,所述的基因芯片还包括固相载体。进一步优选的,所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。
优选的,所述的基因芯片还包括相应的引物组。
优选的,所述探针固定在固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。
其中,将基因芯片中的探针固定在所述的固相载体上。优选的,将探针序列密集有序地排列固定在固相载体预先设置的区域内,形成微型检测器件。
本发明的第九方面,提供了一种含有本发明所述的探针组或本发明所述的基因芯片的试剂盒。
优选的,所述的试剂盒还包括杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。
进一步优选的,所述试剂盒还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、漂洗液、NaOH溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液。
本发明的第十方面,提供了一种所述的含有探针组的试剂盒的制备方法,包括:
1)根据上述主动脉疾病的各致病和/或易感基因制备相应的探针序列;
2)为步骤1)获得的探针序列加上生物素标记;
3)配制所需杂交液和/或缓冲液和/或洗涤液。
本发明的第十一方面,提供了一种主动脉疾病的致病和/或易感基因的检测方法,包括:
(1)提取待检测的DNA,制备全基因组文库;
(2)将步骤(1)获得的全基因组文库与检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂混合,进行PCR;
(3)纯化步骤(2)所述的PCR产物;
(4)对步骤(3)纯化后的PCR产物进行测序;
(5)对步骤(4)的测序结果进行分析。
优选的,所述的分析包括SNP分析和/或InDel分析。
优选的,所述的试剂为探针组、引物组或基因芯片
本发明的第十二方面,提供了一种本发明所述的探针组、或本发明所述的基因芯片,或本发明所述的试剂盒在制备检测/预防主动脉疾病的致病和/或易感基因的产品中的应用,或者,在诊断主动脉疾病患病与否、解释主动脉疾病患者的病因、主动脉疾病患病风险度评估、主动脉疾病患者预后评估、孕前预警指示后代患病的风险度及为临床治疗提供决策支持的产品中的应用。
优选的,所述的产品选自探针组、试剂盒、基因芯片或药物。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1本发明探针组的设计和制备
一、致病和/或易感基因的筛选
本实施例中的致病和/或易感基因为:FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3及CBS。
对100位主动脉疾病患者(患者为医院临床确诊的主动脉疾病,各患者均签署知情及自愿协议,并经医院医学伦理委员会批准)进行全外显子组测序,覆盖、检测范围为人类基因组已知的全部3万余个基因的所有外显子,其中,主动脉疾病患者的突变基因高度集中,基因组的其余基因(占绝大多数)虽然也有累及,但突变频率非常低,很多甚至只在单一患者有发现,其与疾病的相关性难以确定。因此在设计本发明探针组时,纳入在本病患者发生突变概率最高的上述34个基因,其突变累及频率均大于5,这样能够在最大限度地增加检出致病和/或易感基因的同时合理控制检测成本。
二、探针的制备
根据上述致病和/或易感基因的基因组序列,本领域技术人员可以通过公知、通用的方法设计并合成探针序列(例如专利WO2013/003585),本实施例中对合成的探针序列进行生物素标记:采用本领域公知方法合成探针序列,均匀混合在总体积1.2mL的dH2O中,取其中15μL利用通用的PCR引物(5’端序列为GACTACATGGGACAT(SEQ ID NO:1)、3’端的序列为GGAACCTACGACGTA(SEQ ID NO:2)),分三管进行PCR扩增,其中引物GACTACATGGGACAT(SEQID NO:1)为带有生物素标记的引物。
PCR扩增体系:上述探针溶液,5μL;正向引物(25μM),2μL;反向引物(25μM),2μL;MgCl2(50mM),4μL;10x Platinum Taq聚合酶缓冲液(购自Life Technologies),5μL;dNTPs(每种10mM),4μL;Platinum Taq聚合酶(5U/μL,购自Life Technologies),1μL;H2O,27μL;总体积50μL。
扩增条件:98℃,30s;(98℃,30s,60℃,25s,72℃,45s)35个循环;72℃,5min。
将PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(购自Life Technologies)纯化后,取500ng,用MyOne链酶亲和素磁珠(购自Invitrogen)将PCR产物结合下来。然后加入碱性NaOH将没有生物素的互补链变性、洗脱下来;然后将整个磁珠用100℃的甲酰胺液体洗涤,使探针从磁珠上分离下来。用乙醇沉淀后即得到生物素标记的本实施例的探针组。
实施例2:本发明试剂盒组成、制备及使用
本实施例所述的用于检测遗传性主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂盒,是通过检测实施例1所述34个致病和/或易感基因的突变来进行受检个体的分子遗传学诊断或发病风险预测的试剂盒。
一、试剂盒的组成
所述试剂盒包含的成分为:实施例1所获得的探针组(160μL,150ng/μL)、富集缓冲液(208μL)、杂交缓冲液(800μL)、结合缓冲液(3.2mL)、漂洗液1(9mL)、漂洗液2(45mL)、NaOH溶液(0.1M,1mL)、Tris-HCl缓冲液(1M,pH 7.5,1.2mL)、PCR反应液(580μL)、TE缓冲液(800μL,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH至8.0,水定容至500mL)。其中各缓冲液组成如下:
(1)富集缓冲液(每20μL):
人cot-1DNA(购自Invitrogen),7μL;鲑鱼精DNA(购自Invitrogen),3μL;
特异性封闭引物,共10μL,每种引物浓度为1nmol/μL:
引物1:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT(SEQ ID NO:3);
引物2:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC(SEQ ID NO:4);
(2)杂交缓冲液:5倍浓度的SSPE(购自AMRESCO公司),5倍浓度的Denhardt溶液(购自USB公司),5mM EDTA(0.5M,pH8.0,购自Mediatech公司),0.1%SDS;
(3)结合缓冲液:1M NaCl,10mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA;
(4)漂洗液1:1倍浓度的SSC溶液(NaCl 175g,柠檬酸三钠88g,调pH至7.4,dH2O定容至1升),0.1%SDS;
(5)漂洗液2:0.1倍浓度的SSC溶液(NaCl 175g,柠檬酸三钠88g,调pH至7.4,dH2O定容至1升),0.1%SDS;
(6)PCR反应液:2μL dNTPs(每种10mM),
0.5μL引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G(SEQ ID NO:5),50pmol),
0.5μL引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(SEQ ID NO:6),50pmol),20μL 5倍浓度的Phusion缓冲液(购自New England Biolab公司),1μL Hotstart Phusion酶(购自NewEngland Biolabs),5μL DMSO,51μL dH2O;*表示中间有硫代修饰;
二、试剂盒的应用
1、DNA提取及全基因组文库制备
使用Qiagen DNA mini kit(250)(购自Qiagen)试剂盒提取外周血中的DNA。用分光光度计定量,琼脂糖凝胶电泳检测样本质量,完整的基因组DNA电泳条带通常应不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到75ng/μL,总量3-5μg DNA随机打断、扩增,从而建立全基因组文库。
2、目标致病和/或易感基因片段的特异性捕获及测序
1)制备以下混合体系:取1μg步骤1的构建好的全基因组文库,13μL富集缓冲液,5μL实施例1的本发明探针组;置于PCR仪上:95℃,7min,之后65℃,2min;
2)取65℃预热的杂交缓冲液23μL加入到上述步骤1)得到的混合液中,然后于PCR仪上65℃杂交22小时,得到富集体系混合物。
3)将MyOne C1链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen)漩涡震荡使磁珠充分悬浮,短暂离心,使磁珠离心至管底部,取50μL MyOne C1链霉亲和素磁珠到新的1.5mL的离心管。
4)将装有50μL MyOne C1链霉亲和素磁珠的1.5mL离心管漩涡震荡至少5s,使磁珠充分悬浮,短暂离心后放入磁力架上保持静止一分钟(不要旋转离心管),小心吸弃上清。
5)取下离心管,加入50μL的1倍浓度的结合缓冲液,旋窝震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟,小心吸弃上清,重复三次。
6)取下离心管,加入100μL的2倍浓度的结合缓冲液,旋窝震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟。
7)将步骤2)得到的富集体系混合物加入到骤6)的离心管中,旋窝震荡至少5s(不用离心),置于旋转仪上室温旋转1小时(60转/分钟)。
8)然后,利用漂洗液1室温清洗步骤7)的磁珠一次,15分钟,然后再用漂洗液2清洗3次,65℃,每次15分钟。
9)将步骤8)的磁珠用0.1M NaOH室温下洗脱10分钟,然后将洗脱液漩涡震荡至少5s,短暂离心后放入磁力架上静止一分钟,然后将上清液转移到含有70μL Tris-HCl缓冲液(1M,pH 7.5)的干净离心管中。
10)采用Qiagen MinElute Column(购自Qiagen)对步骤9)得到的DNA溶液进行纯化,其纯化步骤参照Qiagen MinElute Kit的实验操作手册。
11)纯化的DNA通过PCR最终扩增15个循环:
PCR反应液:2μL dNTPs(每种10mM),
0.5μL引物1(AATGATACGGCGACCACCGA*G(SEQ ID NO:5),50pmol),
0.5μL引物2(CAAGCAGAAGACGGCATACG*A(SEQ ID NO:6),50pmol),20μL 5倍浓度的Phusion缓冲液(购自New England Biolabs),1μL Hotstart Phusion酶(购自New EnglandBiolabs),5μL DMSO,51μL dH2O;*表示中间有硫代修饰。PCR程序:98℃,30s(1cycle);98℃,25s,65℃;30s,72℃;30s(15cycles);72℃,5min(1cycle)。
12)利用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒(购自Beckman Coulter),根据使用手册纯化步骤11)的PCR产物。
13)将步骤12)得到的DNA产物在Illumina Nexseq 500测序仪上进行测序。
3、生物信息学分析流程及结果输出:
(1)SNP分析流程
①获取原始短序列;
②去除测序数据中的接头和低质量数据等;
③把短序列用SOAPaligner软件定位到人MHC3.6M基因组数据相应的位置上,所用到参数:soap2.20-a-b-t-v 3-l 42-s 63-m100-x 400,其中序列错配数为3,具体参数含义参考:http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html;
④统计测序结果信息,短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;
⑤SOAPsnp用于在目标区域找出位点的基因型,所用到参数:soapsnp-i-d-o-r0.00005-e 0.0001-M-t-u-L-s-2–T,具体参数含义参考:http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html;
⑥过滤低质量值(质量值>=20)和低覆盖度(深度>=10)的SNP;
⑦利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对SNP进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、SNP功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测SNP影响蛋白功能预测等;
⑧根据疾病样品和正常样品信息,选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的SNP作为候选的SNPs,在候选的SNPs中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人MHC3.6M基因组、其他外显子测序项目中出现的SNP。同时,过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的SNPs作为最后疾病相关的候选SNPs;
(2)InDel分析流程
①把去除接头序列和低质量的测序数据用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比对到人MHC3.6M基因组上,所用到参数:bwa aln-L-l 31-i 10-k2-t 7-e 40,具体参数含义参考:http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml;
②用GATK软件找出序列中所含有的插入/缺失(InDel)的信息;
③利用CCDS、人基因组数据库(NCBI 37.2)、dbSNP(v138)信息对InDel进行注释,确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、编码区域序列的改变、对氨基酸的影响、InDel功能(氨基酸插入/氨基酸缺失/移码突变)。
实施例3:本发明试剂盒的使用效果验证
利用本发明所述试剂盒(实施例2制备获得)检测60例样本,结果证实目的致病和/或易感基因的捕获率满意,95.6%以上的原始短序列都能被比对回目标区域的参考序列,目标区域的平均有效测序数据量达到233.5Mb,目标区域的平均测序深度为589X(见表1),远远高于一般的遗传疾病诊断要求(一般为20X)。
表1目的致病和/或易感基因测序数据质量
实施例4:本发明探针组及试剂盒的临床诊断实例
利用本发明实施例1制备的探针组及实施例2制备的试剂盒对8例主动脉疾病患者做出的分子遗传学诊断。患者为医院临床确诊的主动脉相关疾病,各患者均签署知情及自愿协议,并经医院医学伦理委员会批准。
按照实施例2所述的试剂盒的组成、制备及应用的步骤进行本实施例的患者的分子遗传学诊断。其分子遗传学诊断结果见表2。
表2分子遗传学诊断结果
1、六例马凡综合征患者分子遗传学诊断
①患儿(编号:HAD17C058673),女,22h,生后发现手足畸形,孕40周顺产,无窒息史。母25岁,父25岁,无异常家族史。母孕期无异常病史。体格检查发现:角膜呈毛玻璃样,瞳孔不规则,对光反射不清晰。双手垂腕,手指细长呈蜘蛛样,双足狭长,双腿细长,ECG提示窦性心动过速,心电轴右偏,P波高尖。心脏彩超提示二三尖瓣脱垂并关闭不全,房间隔缺损,主动脉瓣中度返流,肺动脉瓣轻度返流。利用本发明所述试剂盒检测患儿外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个错义突变:p.C1622R。检测患儿父母样本后确定该突变为新生突变。已知此基因的新生无义突变可导致马凡综合征,我们在追查病历后发现本患儿的容貌特征、心血管系统症状等临床表现符合该综合征诊断。
②患者(编号:HAD18C001886),女,24岁,因双眼视力下降,并逐渐加重。入院就诊。眼科检查:视力双眼0.04,直接检眼镜给予-10.00DS+小孔镜获得最佳矫正视力:右0.4,左0.4+2,裂隙灯下见双眼巩膜呈蓝色,瞳孔3.5mm,晶状体位置上移,眼底检查未见明显异常。眼压正常。全身检查:肢体细长,双肘关节过伸,指关节屈曲,蜘蛛样指(趾),心电图检查未见明显异常。家族史:其祖父及父亲均因心脏相关疾病40岁前去世。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个错义突变:p.I1909T。患者父母未收样(父已去世)。通过临床诊断和分子遗传学诊断均判断该患者患有马凡综合征。
③患儿(编号:HAD17C057902),男,6天,马凡综合征疑诊,利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了TGFBR1基因的一个错义突变:p.S241L。患者父母均无该位点变异。此变异为自发突变,该位点为致病性变异,结合临床表型诊断为Loeys-Dietz综合征1型。与马凡综合征相比,Loeys-Dietz综合征病程进展更快,主动脉夹层的发病率和病死率更高,早期鉴别诊断马凡综合征和Loeys-Dietz综合征,对指导后续干预治疗具有十分重要的临床意义。
④患儿(编号:HAD18C002018),男,6岁,因近两年视力差,近1个月患关节病就医。否认马凡综合征家族病史。视力:右眼指数/20cm,左眼手动/眼前。双眼眼眶无畸形,眼睑无水肿,眼球各方向活动自如。双眼结膜无充血,虹膜震颤,晶体向鼻上方移位,玻璃体轻度混浊。右眼颞上周边约11点处可见裂孔,左眼裂孔位于锯齿缘。眼压:右眼10mmHg,左眼4mmHg。体格检查发现中踝中部关节脱位形成平足;韧带、肌腱及关节囊伸长、松弛,关节过度伸展。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个错义突变:p.C950R。通过临床诊断和分子遗传学诊断均判断该患者患有马凡综合征。
2、两例马凡综合征患者的可以致病突变
①患者(编号:HAD18C017173),女,51岁,临床诊断为马凡综合征,父母均无类似症状,利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个无义突变:p.Y2849_D2850delinsX。高度怀疑为本病致病突变。
②患儿(编号:HAD18CA02022),男,11岁,临床诊断为马凡综合征,另见颅高压,原因待查。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个错义突变:p.M2690R。高度怀疑为本病致病突变。
3、两例主动脉夹层患者分子遗传学诊断
①患者(编号:HAD17C052424),女,32岁,临床表现为:高度近视、手指、脚趾略长,2016年2月首次出现主动脉夹层,以腹主动脉夹层就诊。家族史概况:爸爸、奶奶手脚指长;爸爸的舅舅肢端像猩猩,60岁去世。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的一个错义突变:p.L1421P。高度怀疑为本病致病突变。
②患儿(编号:HAD18C003424),女,4天。临床诊断为主动脉夹层。利用本发明所述试剂盒检测患者外周血DNA样本后发现了FBN1基因的两个错义突变:p.L1421P、p.G1434D。高度怀疑为本病致病突变。
以上8例患者,利用本发明试剂盒,检测出2个致病和/或易感基因的不同位点突变,突变类型包含错义突变、无义突变、缺失突变。这些突变对蛋白功能产生了影响,(可能)参与疾病发生,因而很可能为上述患者的致病突变。这些除已知致病基因之外的其他致病和/或易感基因的纳入,将可能为临床上约90%的患者的分子遗传学诊断提供机会,新的致病和/或易感基因突变类型、突变频率和突变谱的检出,对完善疾病病因学假说会有很大帮助。
综上所述,本发明提供的用于检测遗传性主动脉疾病的致病和/或易感基因的探针组及试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高等特点,可以同时最多检测、明确34个致病和/或易感基因的各种类型突变,因此本发明的探针组和试剂盒可应用于患病个体的分子遗传学诊断,同时还可用筛查遗传性主动脉疾病患者家属中的发病高危人群,以及进行相应的遗传咨询或产前干预提供参考。由于遗传性主动脉疾病具有临床异质性强、急性发作致死率高等特点,早发现、早诊断、早干预、早治疗是降低患者死亡率、提高患者生存质量的重要策略。本发明的使用可以为尽早确立诊断和对患者采取正确、合理的干预、治疗措施提供依据,符合精准医疗的发展趋势。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
北京迈基诺基因科技股份有限公司
<120> 一种用于检测遗传性主动脉疾病的致病/易感基因的探针组
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gactacatgg gacat 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaacctacg acgta 15
<210> 3
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc 50
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcagaag acggcatacg a 21
Claims (10)
1.一种检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂在制备诊断主动脉疾病的产品中的应用,其特征在于,所述主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述主动脉疾病的致病和/或易感基因为LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、TNXB、B3GALT6、PRKG1、MFAP5、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1和/或TGFBR1。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用,其特征在于,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3和CBS。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用,其特征在于,所述的主动脉疾病以主动脉扩张、主动脉瘤或主动脉夹层为特征;优选的,所述的主动脉疾病选自马凡综合征、Loeys-Dietz综合征、血管型Ehlers-Danlos综合征、Ehlers-Danlos综合征VI型、主动脉扭曲综合症、家族性胸主动脉瘤或家族性胸主动脉夹层。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用,其特征在于,所述的检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂选自探针组、引物组或基因芯片;所述的产品包括所述的试剂或所述的产品为试剂盒。
7.一种主动脉疾病的诊断标志物,其特征在于,所述的诊断标志物为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
8.主动脉疾病的致病和/或易感基因在制备诊断主动脉疾病的产品中的应用,其特征在于,所述的主动脉疾病的致病和/或易感基因为FBN1、TGFBR1、TGFBR2、LTBP2、COL1A2、FBN2、SKI、CHST14、DSE、COL3A1、PLOD1、COL5A1、COL5A2、COL1A1、TNXB、B3GALT6、MYH11、ACTA2、MYLK、PRKG1、MFAP5、SMAD3、SMAD4、TGFB2、TGFB3、SLC2A10、PKD1、COL4A1、ADA2、EFEMP2、MAT2A、TGFBR3、RPS6KA3或CBS中的两种或两种以上的组合。
9.一种主动脉疾病的致病和/或易感基因的检测方法,其特征在于,包括:
(1)提取待检测的DNA,制备全基因组文库;
(2)将步骤(1)获得的全基因组文库与检测主动脉疾病的致病和/或易感基因的试剂混合,进行PCR;
(3)纯化步骤(2)所述的PCR产物;
(4)对步骤(3)纯化后的PCR产物进行测序;
(5)对步骤(4)的测序结果进行分析;
其中,所述的试剂为探针组、引物组或基因芯片。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,所述的分析包括SNP分析和/或InDel分析。
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