CN115976187A - 一种Loeys-Dietz综合征检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种Loeys‑Dietz综合征检测试剂盒，其中包括用于检测TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的试剂。本发明的试剂盒可以在PCR反应中显著高效的扩增TGFBR2DNA片段，能够高效的筛选患有或者易患Loeys‑Dietz综合征人群，为具有遗传家族史的患者可能需要的产前诊断提供依据，为Loeys‑Dietz综合征的药物研发提供新的靶点。

Description

一种Loeys-Dietz综合征检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于TGFBR2基因c.1005_1007缺失突变的Loeys-Dietz综合征检测试剂盒。

背景技术

Loeys-Dietz综合征(LDS)是一种广泛累计全身的罕见的遗传性结缔组织疾病。LDS最典型的临床三联征包括眼距过宽、悬雍垂或腭裂和主动脉瘤伴迂曲。LDS综合征包括五种类型，其中1型和2型具有许多显示临床特征，而2型具有更具侵袭性的主动脉疾病；3型显示二尖瓣脱垂和关节炎的患病率增加；4型和5型显示肌肉骨骼和心血管受累的患病率较低。在患有LDS的个体中可以看到临床特征的分布和严重程度的广泛差异，即使在具有相同致病变异的家庭中受影响的个体中也是如此。LDS综合征与马凡综合征(MFS)有许多相似的临床特征，但与MFS相比，LDS患者主动脉瘤或夹层的临床进展更快，非手术治疗的预后较差，因此需要更密切的监测和早期治疗以延长寿命。

目前，LDS的发病机制尚不完全清楚，大多数研究人员认为其与TGF-β信号通路中的一些基因突变有关，主要包括TGFBR1、TGFBR2、SMAD2等。通过基因测序的方式对疑似LDS患者及其家属进行基因突变检测，有助于LDS患者的临床诊断，同时基因分型结果可用于指导患者的临床手术方式和用药。

目前国内外尚未有技术公开用于检测LDS突变位点的筛查试剂盒。

2005年，Loeys等在疑似Loeys-Dietz综合征的患者中发现了一例p.Tyr336Asn变异，其余未在该位点附近发现TGFBR2变异^[1]。目前发现的与Loeys-Dietz综合征相关的基因突变多为错义突变，缺失突变较为少见。

[1]Loeys,B.L.；Chen,J.；Neptune,E.R.；Judge,D.P.；Podowski,M.；Holm,T.；Meyers,J.；Leitch,C.C.；Katsanis,N.；Sharifi,N.；et al.A syndrome of alteredcardiovascular,craniofacial,neurocognitive and skeletal development caused bymutations in TGFΒR1 or TGFΒR2.Nature genetics 2005,37,275-281.

发明内容

本发明提供了一个新的TGFBR2基因的缺失变异位点及其检测试剂盒，用于2型LDS患者的早期临床诊断，有助于确诊患者的早期治疗，降低患病率和死亡率，对其家系的优生优育和疾病防治也有重要的意义。

本发明通过对一个2型Loeys-Dietz综合征患者及其家族成员的全血DNA进行碱基序列分析，在发病患儿中检测到了一个从头突变的TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异(p.Glu335_Tyr336delinsAsp)，家系中的其他成员均未检测到该变异。同时对200例表型健康的对照成员进行检测，也均未检测到该变异，说明该基因变异在人群中发病率极低，与Loeys-Dietz综合征的发病密切相关。通过检测该突变体在生物样本中是否存在，可以有效地检测生物样品是否因此患Loeys-Dietz综合征，有助于在临床中明确患者的诊断和指导患者的精准治疗，同时通过妊娠期胎儿基因检测可以避免后代的遗传风险。

基于上述发现，本发明提供了一个新的Loeys-Dietz综合征相关的致病基因变异，同时提供了该变异的检测方法和试剂盒，以及它们在临床辅助诊断Loeys-Dietz综合征中的用途。

一方面，本发明提供了一种突变基因。

所述的突变基因为TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异(p.Glu335_Tyr336delinsAsp)。

所述的TGFBR2基因的野生型核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变型核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的变异使TGFBR2蛋白第335位的谷氨酸和第336的酪氨酸转变为天冬氨酸，导致TGFBR2蛋白由原来的592个氨基酸缩短为591个氨基酸。

所述的野生型TGFBR2基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，突变型TGFBR2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的变异通过PROVEAN在线软件分析显示为有害突变，得分为-14.28。

TGFBR2基因定位于人染色体3p24.1，基因长约87.54kb，主要有一个C端蛋白激酶结构域和一个N端胞外结构域组成。TGFBR2通过与细胞外微纤维释放的激活的TGFB2结合，自身磷酸化激活，通过丝氨酸/苏氨酸转换机制传递信号肽，影响细胞内的蛋白质合成。该突变位点位于TGFBR2的蛋白酶结构域中，可能通过影响蛋白质结构和功能导致疾病的发生。

另一方面，本发明还提供了检测上述人类TGFBR2基因c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的相关试剂。

所述的试剂可以包括任选的用于扩增包含人类TGFBR2基因编码区第705-1190位碱基的核酸片段的相关试剂。

检测此c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的方法包括但不限于Sanger测序、限制性片段长度多态性、单链构象多态性、荧光定量PCR。

所述的试剂为检测c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的Sanger测序试剂、荧光定量PCR试剂等。

所述的试剂中包括用于检测c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的引物。

优选地，所述的引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

本发明还提供了上述试剂在制备Loeys-Dietz综合征的基因检测试剂盒中的应用。

优选地，所述的试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

再一方面，本发明提供了一种Loeys-Dietz综合征的基因检测试剂盒。

所述的试剂盒中包括任选的用于检测人类TGFBR2基因c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的相关试剂。

优选地，所述的试剂盒中包括扩增TGFBR2基因c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的试剂，如扩增引物。

优选地，所述的扩增引物为SEQ ID NO.5-6。

优选地，所述的试剂盒为荧光定量PCR试剂盒。

优选地，所述的试剂盒中还包括其他用于荧光定量PCR检测的试剂。

所述的试剂为dNTP、缓冲液、DNA聚合酶中的一种或多种。

优选地，所述的试剂盒中还包括用于增强PCR扩增反应的金属离子，如镁离子。

优选地，所述的试剂盒中还包括测序试剂，包括但不限于Sanger测序试剂。

所述的试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

所述的阳性对照品中包括：含特定突变序列的重组质粒、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、无核酸酶水；所述的阴性对照品为无特定突变的基因组DNA、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、无核酸酶水。

基于本发明所述试剂盒的检测方法对该变异进行测序检测的方法包括以下步骤：

(1)设计针对TGFBR2基因突变位点的上下游扩增引物，并进行PCR扩增；

(2)将扩增产物经DNA纯化柱进行纯化；

(3)纯化后的PCR产物进行Sanger测序；

(4)测序结果分析。

本发明的有益效果

本发明的试剂盒可以在PCR反应中显著高效的扩增TGFBR2 DNA片段，能够高效的筛选患有或者易患Loeys-Dietz综合征人群，为具有遗传家族史的患者可能需要的产前诊断提供依据，为Loeys-Dietz综合征的药物研发提供新的靶点。

附图说明

图1为Loeys-Dietz综合征家族的谱系图。

图2为TGFBR2野生型与突变体的c.1005_1007位点示意图。

图3为TGFBR2第335-336位氨基酸位点在不同脊椎动物中的保守性分析示意图。

图4为pcDNA3.1-TGFBR2-WT质粒图谱。

图5为pCDNA3.1-TGFBR2-Mut质粒图谱。

图6为TGFBR2基因突变对细胞功能的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1患者/携带者验证实验

根据NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中TGFBR2基因的mRNA序列，在突变位点的上下游设计引物。采集Loeys-Dietz综合征患者及其家系成员的外周血样本并提取DNA，以基因组DNA为模板PCR方法扩增TGFBR2基因突变位点的上下游486bp序列。扩增产物进行琼脂糖电泳，扩增产物进行分离纯化后用于Sanger测序分析，之后与人基因组序列比对获得患者的基因序列及突变情况。

1.1用于扩增TGFBR2基因c.1005_1007delGTA突变位点的引物如下：

正向引物：5’-CAACCACAACACAGAGCTGC-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物：5’-TCACACAGGCAGCAGGTTAG-3’(SEQ ID NO.6)；

1.2用于扩增TGFBR2基因突变位点序列的PCR试剂组成如下：

1.3目的片段扩增

在PCR仪上扩增，扩增程序如下：

1.4PCR产物的分离与纯化

取3μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶以120V电压进行30min左右的电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考。电泳完成后，在紫外切胶仪中切下含有目的条带的凝胶条，装入1.5mL EP管中，利用电子天平称量凝胶块，加入等体积的溶胶液(如胶为10mg，则加10微升溶液I)，50-60℃水浴加热至胶全融，期间需每隔约3min颠倒混匀，以加速凝胶融解。将溶解的凝胶混合物加入到DNA纯化柱内，室温放置1分钟。以16000g，(约12000-14000rmp左右)离心1分钟，倒弃收集管内的液体。在DNA纯化柱内加入700微升洗涤液，16000g离心1分钟，倒弃收集管内的液体。添加500微升洗涤液，16000g离心1分钟，倒弃收集管内的液体。以16000g离心1分钟，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。将DNA纯化柱置于新的1.5毫升离心管上，向DNA纯化柱中央滴加20微升洗脱液放置5分钟。16000g离心1分钟将纯化的DNA溶液收集到离心管中，即得高纯度DNA。

1.5Sanger测序

使用AppliedBiosysterm 3500Dx系列基因分析仪进行Sanger测序。

1.6数据分析

将测序数据与目的基因TGFBR2序列进行比对，从而验证基因变异类型。分析结果显示：新突变体与野生型TGFBR2基因相比较，具有c.1005_1007delGTA碱基缺失突变，即本发明的TGFBR2基因突变体的第1005位-1007位碱基缺失，从而导致与野生型的TGFBR2蛋白相比较，具有p.Glu335_Tyr336delinsAsp突变，即TGFBR2蛋白的第335位的谷氨酸(Glu)和第336的酪氨酸(Tyr)转变为了天冬氨酸(Asp)，导致TGFBR2蛋白缩短了一个氨基酸。

1.7图1为Loeys-Dietz综合征家族的谱系图，其中，II-2为从头突变的Loeys-Dietz综合征患者，其为一名足月顺产的6月龄男性患儿，具有典型的Loeys-Dietz综合征表型，包括眼距稍增宽，高腭弓和悬雍垂裂，同时还伴有手指弯曲、垂直距骨、主动脉增宽、易过敏体质，其父亲(I-1)、母亲(I-2)以及姐姐(II-1)均为正常人。

1.8经测序，TGFBR2野生型与突变体的c.1005_1007位点示意图如图2所示。Sanger测序结果显示II-2为杂合突变携带患者，I-1成员、I-2成员、II-1成员该位点均为野生型。证实突变与Loeys-Dietz综合征表型共分离。

实施例2一种Loeys-Dietz综合征检测试剂盒

试剂盒组分如下：

实施例3无关样本验证实验

3.1实验方法

实施例1的Loeys-Dietz综合征家系，对所有家系成员进行体格、眼部、心血管系统检查，患儿II-2伴有眼距增宽、高腭弓和悬雍垂裂，为Loeys-Dietz综合征的典型症状，同时患儿伴有近视、手指弯曲、垂直距骨、主动脉增宽以及更明显的易过敏体质。根据Ghent标准初步确认其符合Loeys-Dietz综合征的特征。通过基因检测，在该家系中检查到1名患者携带TGFBR2基因突变，为Loeys-Dietz综合征的致病基因，家系其他成员未检测到相同的突变(家系图如图1所示)。

另外招募了200例正常的健康人群作为对照。使用实施例1中所述的方法扩增该家系每个成员以及对照人群的TGFBR2基因部分碱基片段，扩增完成后进行Sanger测序后进行分析。将本发明核酸突变体编码的多肽氨基酸与野生型多肽进行对比分析，得到如图3所示的TGFBR2第335-336位氨基酸位点在不同脊椎动物中的保守性分析示意图；结果表明，此位点在不同物种间具有高度保守性，说明此处具有重要的功能意义。

实施例4荧光素酶报告实验检测TGFBR2基因突变对细胞功能的影响

委托通用生物(安徽)股份有限公司合成pcDNA3.1-TGFBR2-WT(WT，质粒图谱见图4)和pCDNA3.1-TGFBR2-Mut(具有变体c.1005_1007delGTA，质粒图谱见图5)质粒。所述核酸构建体的骨架载体为pCDNA3.1，构建所述核酸构建体所用引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。含有TGF-b响应性的荧光素酶报告构建体驱动荧光素酶表达的元件的质粒p3TP-Lux在addgene上购买。HEK293T细胞培养至60％-70％汇合度融合时进行质粒转染。

主要包括以下步骤：

①制备脂质体混悬液：在EP管中加入适量Opti-MEM培养基，再加入Lipofectamine3000脂质体转染试剂(ThermoFisher)，轻轻吹打至完全混匀；

②制备Opti MEM构建体混悬液：在EP管中加入适量Opti MEM(Thermo Fisher)培养基，后加入p3000试剂(Thermo Fisher)，再加入适量p3TP-Lux质粒，然后依次添加野生型或突变型TGFBR2构建体，充分混匀；

③将Opti MEM构建体混悬液加入到脂质体混悬液中，充分混匀，室温孵育10 15分钟；

④将步骤③的混合物滴加到培养基中，轻摇混匀，放入培养箱中继续培养24小时。接下来使用5ng/mL TGF-β1(PeproTech,#100-21)在无血清培养基中处理24小时，最后收集细胞检测荧光素酶表达活性。

结果如图6所示，与WT TGFBR2相比，在TGF-β1刺激的情况下，突变TGFBR2中的转录激活明显受到抑制，表明所述TGFBR2的突变导致了TGFβ信号通路传导异常。

Claims (10)

1.检测TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的引物在制备Loeys-Dietz综合征检测试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒为荧光定量PCR试剂盒，所述引物用于扩增包含人类TGFBR2基因编码区第705-1190位碱基的核酸片段。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异使TGFBR2蛋白第335位的谷氨酸和第336的酪氨酸转变为天冬氨酸。

5.一种Loeys-Dietz综合征检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括扩增TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异的引物。

6.根据权利要求5所述的Loeys-Dietz综合征检测试剂盒，其特征在于，为荧光定量PCR试剂盒。

7.根据权利要求5所述的Loeys-Dietz综合征检测试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

8.根据权利要求5所述的Loeys-Dietz综合征检测试剂盒，其特征在于，所述的TGFBR2基因的c.1005_1007delGTA碱基缺失变异使TGFBR2蛋白第335位的谷氨酸和第336的酪氨酸转变为天冬氨酸。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括其他用于荧光定量PCR检测的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂为dNTP、缓冲液、DNA聚合酶中的一种或多种。

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