CN103421909A

CN103421909A - Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用

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Publication number: CN103421909A
Application number: CN2013103936663A
Authority: CN
Inventors: 陈金中; 赵翊均
Original assignee: SHANGHAI LANMING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI LANMING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-02
Filing date: 2013-09-02
Publication date: 2013-12-04

Abstract

本发明属于生物制品技术领域，涉及一种Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用，采用Taqman MGB探针的定量PCR技术，用于检测Citrin缺乏症基因SLC25A13的9个突变位点中的一个或多个，可以检测发现绝大部分的致病突变。本发明的诊断试剂可以使用定量PCR仪和常规PCR试剂，通过扩增检测9个Citrin缺乏症突变基因位点，可在3到5个小时内得出检测结果。该诊断试剂检测Citrin缺乏症在具有定量PCR仪的单个实验室闭管完成，可有效避免高浓度样本污染，并可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备产业化推广的条件。

Description

Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用。

背景技术

Citrin是一种线粒体内钙结合天冬氨酸/谷氨酸载体(Aspartate/Glutamate Carrier,AGC)蛋白，在尿素循环及其他代谢过程中发挥重要作用。Citrin缺乏症包含成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症(Adult Onset TypeⅡCitrullinemia,CTLN2)和Citrin缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症(NeonatalIntrahepatic Cholestasis caused by Citrin Deficiency,NICCD)两种不同表型，为常染色体隐性遗传。Citrin缺乏症对应基因SLC25A13基因突变杂合子携带率在东亚各国常见，日本1/69，中国1/79，韩国1/50。发病率约为1/17,000-34,000（J Inherit Metab Dis.2007Apr；30(2):139-44.Mol Aspects Med.2013Apr-Jun；34(2-3):465-84.）。

Citrin缺乏症可以通过食物、药物治疗和手术治疗。其预后除与疾病本身严重性有关外，早期诊断、早期治疗对改善疾病预后有重要作用（Mol Genet Metab.2013May；109(1):9-13.）。

目前Citrin缺乏症的诊断主要依赖于临床生化检测和基因检测。确定基因型的方法主要采用突变热点的基因测序技术。日本使用常规新生儿半乳糖和氨基酸筛查外结合SLC25A13基因突变测序。生化筛查结合基因测序检测技术对样本要求高，技术设备较复杂，检测需要较长时间，费用较高，难于大规模开展（《中华医学遗传学杂志》2006年第6期655-658；BMC Med Genet.2013Feb10；14:24.doi:10.1186/1471-2350-14-24.）。最近有研究人员试图用HRM技术筛选Citrin缺乏症所涉及的几个基因突变取得了一定成功，但是相应仪器普及性有限，并且该仪器检测目前还没有获得SFDA认证。

SLC25A13基因突变筛查结果显示有50多种突变可引起蛋白功能异常，其中851del4(20%)、S225X(25%)、IVS11+1G﹥A（45%）在日本人中常见；851del4(70%)和IVS6+5G﹥A（23%）在中国人中常见（《中华医学遗传学杂志》2006年第6期655-658；《中华医学遗传学杂志》2012年第2期:167-71）。在该背景条件下，开发基于主要突变位点的基因检测方法的前提下，开展基于Taqman探针的定量PCR检测有望方便、可靠地检测相应基因突变。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用，以解决现有技术中存在的问题。本发明提供的Citrin缺乏症的基因诊断试剂可以在具有定量PCR的实验室完成，检测时间仅仅需要3到5个小时；可以在单个实验室全闭管完成，可避免高浓度模板污染。

一种Citrin缺乏症的基因诊断试剂，采用Taqman MGB探针定量PCR技术，用于检测Citrin缺乏症基因SLC25A13的9个突变位点中的一个或多个突变位点；所述Citrin缺乏症的基因诊断试剂包括基因片段特异性扩增引物和位点特异性Taqman MGB探针序列。

其中，所述9个突变位点所对应的9个Citrin缺陷突变基因，其核苷酸序列分别如c.615+5G>A(IVS6+5G>A)（SEQ ID No.1），c.851_854del(851del4)（SEQ ID No.2），c.1177+1G>A(IVS11+1G>A)（SEQ ID No.3），c.1750+72_1751-4dup17ins(IVS16ins3kb)（SEQ ID No.4（J Hum Genet：（2008）53：534-545）），c.615+1G>C(IVS6+1G>C)（SEQID No.5），c.1311+1G>A(IVS13+1G>A)（SEQ ID No.6），c.550C>T R184X（SEQ ID No.7），c.674C>A S225X（SEQ ID No.8），c.1078C>T R360X（SEQ ID No.9）所示。

其中，对应如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11所示，对应如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示，其中野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.10到SEQ ID No.13如下所示：

SEQ ID No.10：5′-CATCATGGTCACCATCCGCCCCCAT-3′

SEQ ID No.11：5′-CTGAGTTAAACCACTTCATTAGGGCAAG-3′

SEQ ID No.12：Fam-5′-TAAGTTGTAAC-3′

SEQ ID No.13：Tet-5′-TAAATTGTAAC-3′。

其中，对应如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15所示，对应如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.14到SEQ ID No.17如下所示：

SEQ ID No.14：5′-CAGCTCAGAAATTTGGTCAGGTTAC-3′

SEQ ID No.15：5′-CCAGAGGAGCAATCCGTTCAATGTC-3′

SEQ ID No.16：Fam-5′-CGTATGACCT-3′

SEQ ID No.17：Tet-5′-CGACCTTAGC-3′。

其中，对应如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.18和SEQ ID No.19所示，对应如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.18到SEQ ID No.21如下所示：

SEQ ID No.18：5′-CAGCTTTGACTGTTTTAAGAAAGTGC-3′

SEQ ID No.19：5′-ACCTTTGAGTGTTATTTCACCTAACAGG-3′

SEQ ID No.20：Fam-5′-ATAGAGGTTAGT-3′

SEQ ID No.21：Tet-5′-ATAGAGATTAGT-3′。

其中，对应如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示，对应如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的位点特异性Taqman MGB探针序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.22到SEQ ID No.26如下所示：

SEQ ID No.22：ATGTGTTCTTAACTAACTCTTTGGTATCAG

SEQ ID No.23：5′-CACCAAACTGGGGTGAGGATCGAAATACACG-3′

SEQ ID No.24：5′-GATTTGGAAAGCATGGTCTACAATTG-3′

SEQ ID No.25：Fam-5′-CCATTTTTTTAA-3′

SEQ ID No.26：Tet-5′-TCAAGTGTATT-3′。

其中，对应如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.27和SEQ ID No.28所示，对应如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.27到SEQ ID No.30如下所示：

SEQ ID No.27：5′-CATCATGGTCACCATCCGCCCCCAT-3′

SEQ ID No.28：5′-CTGAGTTAAACCACTTCATTAGGGCAAG-3′

SEQ ID No.29：Fam-5′-AGTAGCTGTAA-3′

SEQ ID No.30：Tet--5′-AGTAGCTCTAA-3′。

其中，对应如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.31和SEQ ID No.32所示，对应如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.31到SEQ ID No.34如下所示：

SEQ ID No.31：5′-TGGTTCGGTCCCACTTGCAGCAG-3′

SEQ ID No.32：5′-AGTGATATATATGTGAAACAAGTC-3′

SEQ ID No.33：Fam-5′-TGCGTAAGTAC-3′

SEQ ID No.34：Tet-5′-TGCATAAGTAC-3′。

其中，对应如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.35和SEQ ID No.36所示，对应如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.35到SEQ ID No.38如下所示：

SEQ ID No.35：5′-CAACGGGACAATGCTAGGACTGGG-3′

SEQ ID No.36：5′-ATTCTTCTACAAAAGGAGTCAAGACATG-3′

SEQ ID No.37：Fam-5′-ACTTCCGAGAC-3′

SEQ ID No.38：Tet-5′-ACTTCTGAGAC-3′。

其中，对应如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.39和SEQ ID No.40所示，对应如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.39到SEQ ID No.42如下所示：

SEQ ID No.39：5′-CTGGAGGTACCACATCCCATCAAG-3′

SEQ ID No.40：5′-CCAGAGTGCTATAGATCTTTCTAATG-3′

SEQ ID No.41：Fam-5′-AATTCGCTCC-3′

SEQ ID No.42：Tet-5′-AATTAGCTCC-3′。

其中，对应如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44所示，对应如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet。SEQ ID No.43到SEQ ID No.46如下所示：

SEQ ID No.43：5′-CTGTTGGAGCCACTGCTGTGTATC-3′

SEQ ID No.44：5′-TTATACATGAGTTCTCCCACAAAAGAGC-3′

SEQ ID No.45：Fam-5′-CCAACGATCAA-3′

SEQ ID No.46：Tet-5′-CCAATGATCAA-3′。

本发明的检测Citrin缺乏症的9个基因位点检测引物，确保基因扩增时间在45秒，退火温度差异5%，野生型和突变型基因Taqman MGB探针分别用Fam和Tet标记。

本发明的Citrin缺乏症9个基因位点检测引物，分位点包装为9管，单引物浓度为1到5μM，设计为10倍浓度，使用时终浓度为1倍浓度。

本发明的Citrin缺乏症的9个基因位点检测引物与模板、PCR扩增试剂混合，在定量PCR仪上扩增并收集Ct值，依据Ct值确定位点基因型。

本发明的Citrin缺乏症的基因诊断试剂的应用，可以作为确定个体Citrin缺乏症的SLC25A13基因类型诊断试剂进行应用，也可以作为确定具有Citrin缺乏症的SLC25A13基因突变的携带者或患病者的诊断试剂进行应用。

本发明使用Taqman探针定量PCR确定Citrin缺乏症的9个基因位点的基因型。综合9个位点的基因型确定个体SLC25A13基因型，结合临床和家系数据可以确定个体为携带者或患者。本发明提供的试剂可以在具有定量PCR的实验室完成，可以使用定量PCR仪和常规PCR试剂，通过扩增检测9个Citrin缺乏症常见突变基因位点，检测时间仅仅需要3到5个小时，可以检测发现绝大部分的致病突变；检测仪器（如AB7500定量PCR仪）和方法（Taqman MGB探针定量PCR）获得SFDA认证；可以在单个实验室全闭管完成，可避免高浓度模板污染；该发明试剂可以稳定实施，可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测，具备大规模产业化推广的条件。

附图说明

图1为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点1的突变型和野生型基因检测验证图。

图2为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点2的突变型和野生型基因检测验证图。

图3为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点3的突变型和野生型基因检测验证图。

图4为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点4的突变型和野生型基因检测验证图。

图5为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点5的突变型和野生型基因检测验证图。

图6为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点6的突变型和野生型基因检测验证图。

图7为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点7的突变型和野生型基因检测验证图。

图8为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点8的突变型和野生型基因检测验证图。

图9为本发明SLC25A13基因9个位点突变型中位点9的突变型和野生型基因检测验证图。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。本实施例仅用于对本发明的说明，而不构成对本发明的限制。

实施例1：SLC25A13单倍体基因型标准品制备

1）正常人基因组DNA制备

采取正常人血滤纸，Chlex100抽提制备，用基因特异性引物扩增，常规克隆于pMD18-T载体（Takara），用M13通用引物测序，确认SLC25A13基因序列与NT_079595一致。正常人基因组DNA浓度调节到10ng/μl，或含SLC25A13片段的T载体浓度为1ng/μl作为10倍正常对照模板。

2）SLC25A13突变基因型标准品制备

依据SLC25A13序列和突变，人工合成含单一突变的9种常见Citrin缺陷突变基因：c.615+5G>A(IVS6+5G>A)（SEQ ID No.1），c.851_854del(851del4)（SEQ ID No.2），c.1177+1G>A(IVS11+1G>A)（SEQ ID No.3），c.1750+72_1751-4dup17ins(IVS16ins3kb)（SEQ ID No.4），c.615+1G>C(IVS6+1G>C)（SEQ ID No.5），c.1311+1G>A(IVS13+1G>A)（SEQ ID No.6），c.550C>T R184X（SEQ ID No.7），c.674C>A S225X（SEQ ID No.8），c.1078C>T R360X（SEQ ID No.9）以及侧翼序列，具体序列分别参见SEQ ID No.1到SEQ ID No.9。含上述片段的T载体浓度调节为1ng/ul作为10倍突变阳性模板。

实施例2：Citrin缺陷突变基因扩增引物和MGB探针设计合成

按扩增基因序列长度差异不超过10%，延伸时间不超过45秒，引物退火温度差异不超过5%的要求设计合成引物，野生型报告探针标记Fam，突变型探针标记Tet（如表1所示）。验证荧光定量PCR引物特异性扩增目标基因片段，Taqman MGB位点特异性探针报告对应荧光信号。人工合成基因片段特异性扩增引物和位点特异性Taqman MGB报告探针。基因片段特异性引物和位点特异性Taqman MGB探针序列如表1所示（参见SEQ ID No.10到SEQ ID No46）。

表1

实施例3：SLC25A13Taqman定量PCR基因分型

1）标准基因型验证

反应体系：引物混合物2.5μl，2倍Multiplex PCR Mix（Qiagen，德国）12.5μl，标准模板2.5μl，5倍Easy Buffer5μl，ddH₂O2.5μl。

定量PCR仪：AB7500（AB，美国）。

反应条件：95℃5分钟;94℃30秒--60℃30秒--72℃45秒，40循环。

结果读取：检测到信号确定为成功，确认存在基因位点。无扩增确定为阴性，确定位点不存在。吻合度要求100%。正常人基因组所有野生位点检测到信号，所有突变信号检测不到。

2）样本分型检测

反应体系：引物混合物2.5μl，2倍Multiplex PCR Mix（Qiagen，德国）12.5μl，样本基因组DNA（10μg/μl）2.5ul，5倍Easy Buffer5μl，ddH₂O2.5μl。

定量PCR仪：AB7500（AB，美国）。

反应条件：95℃5分钟;94℃30秒--60℃30秒--72℃45秒,40循环。

实施例4：结果读取

对于单一位点，检测到信号确定为成功，单个荧光信号判断为纯合子；两个荧光信号判断为杂合子。

对于个体，9个位点基因型组成个体基因型。个体含一个突变（单位点杂合子）诊断为携带者，单位点纯合子突变诊断为患者，二个以上杂合突变需结合双亲基因分型分析，如果突变为单亲来源确定为双突变携带者，如果突变为双亲来源则确定为患者。

经检测分别获得SLC25A13基因9个位点突变型和野生型基因检测验证图，如图1-9所示，其中各图中Undetermined代表无法判断,Allele X代表TET所标记的基因型,Allele Y代表FAM所标记的基因型,NTC代表空白对照。

由图1可知在基因位点c.615+5G>A(IVS6+5G>A)的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图2可知在基因位点c.851_854del(851del4)的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图3可知在基因位点c.1177+1G>A(IVS11+1G>A)的检测结果：FAM信号（AlleleY）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图4可知在基因位点c.1750+72_1751-4dup17ins(IVS16ins3kb)的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。由图5可知在基因位点c.615+1G>C(IVS6+1G>C)的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图6可知在基因位点c.1311+1G>A(IVS13+1G>A)的检测结果：FAM信号（AlleleY）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图7可知在基因位点c.550C>T R184X的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

由图8可知在基因位点c.674C>A S225X的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。由图9可知在基因位点c.1078C>T R360X的检测结果：FAM信号（Allele Y）为野生型,TET信号（Allele X）为突变型。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为落入本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种Citrin缺乏症的基因诊断试剂，采用Taqman MGB探针定量PCR技术，用于检测Citrin缺乏症基因SLC25A13的9个突变位点中的一个或多个突变位点；所述Citrin缺乏症的基因诊断试剂包括基因片段特异性扩增引物和位点特异性Taqman MGB探针序列。

2.根据权利要求1所述的Citrin缺乏症的基因诊断试剂，其特征在于，所述9个突变位点所对应的9个Citrin缺陷突变基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8和SEQID No.9所示。

3.根据权利要求1或2所述的Citrin缺乏症的基因诊断试剂，其特征在于，

其中，对应如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11所示，对应如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13所示；

其中，对应如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.14和SEQ ID No.15所示，对应如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17；

其中，对应如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.18和SEQ ID No.19所示，对应如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21；

其中，对应如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示，对应如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的位点特异性Taqman MGB探针序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26；

其中，对应如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.27和SEQ ID No.28所示，对应如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.29和SEQ ID No.30；

其中，对应如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.31和SEQ ID No.32所示，对应如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34；

其中，对应如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.35和SEQ ID No.36所示，对应如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38；

其中，对应如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.39和SEQ ID No.40所示，对应如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；

其中，对应如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的基因片段特异性扩增引物如SEQ IDNo.43和SEQ ID No.44所示，对应如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列的位点特异性TaqmanMGB探针序列如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46。

4.根据权利要求1-3任一所述的Citrin缺乏症的基因诊断试剂的应用，其特征在于，所述Citrin缺乏症的基因诊断试剂为确定个体Citrin缺乏症的SLC25A13基因类型诊断试剂，或者作为确定具有Citrin缺乏症的SLC25A13基因突变的携带者或患病者的诊断试剂。