CN106987637A - 一种检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物、试剂盒及应用，该扩增引物包括两个引物池，分别为引物池1和引物池2，所述引物池1包括序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示的核苷酸序列，所述引物池2包括序列表SEQ ID NO：201至SEQ ID NO：400所示的核苷酸序列。本发明涉及的DNA扩增引物和试剂盒具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，对家族性视网膜色素变性具有很好的辅助诊断价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学分子生物学检测技术领域，具体涉及一种用于检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物、试剂盒及应用。
背景技术
视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa，RP)是一类由视网膜光感受器和视网膜色素上皮变性引起的进行性视网膜退行性病变，临床以夜盲、进行性视野缩小与视力下降、视网膜色素沉着、视盘呈蜡黄色萎缩、视网膜电图异常为特征的遗传性致盲性眼病。流行病学调查表明，我国RP患者多达40万人，群体患病率约为1:3500～1:5000。视网膜色素变性是儿童和青少年人群致盲的主要病因，是最常见的眼科遗传性疾病。该病具有高度遗传异质性，相同基因突变的不同患者发病年龄、临床表型、严重程度、进展情况各不相同；同时，不同的基因突变也可以导致类似的RP表型。这使得根据患者表型来判断基因型带来了困难。RP遗传方式多样，可分为常染色体显性遗传(autosomal dominant RP，ADRP，约占20-25％)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive RP，ARRP，约占15-20％)、X-连锁隐性遗传(X-linked RP，XLRP，约占10-15％)、散发的RP患者(约占30％)，以及一些少见的遗传方式，包括双基因遗传和线粒体DNA遗传。据统计，与视网膜感光细胞变性相关的基因超过140种，其中已有明确致病报道且被克隆鉴定的RP致病基因超过67个(https://sph.uth.edu/ retnet/sumdis.htm)，其中ADRP致病基因23个，ARRP致病基因41个，X-连锁致病基因3个。
RHO基因编码视紫红质蛋白，是参与视觉转导途径的主要蛋白，大约30-40％的ADRP患者存在RHO基因突变；PRPF31基因是前体mRNA剪切因子31基因(PRP31pre-mRNAprocessing factor 31 homolog)的简称，参与前体mRNA的剪切过程。在中国ADRP患者中，约8-10％是由PRPF31基因突变导致的。PRPH2基因，又称视网膜慢变性基因，对于锥杆细胞外节膜盘的吞噬及稳定性至关重要，约占5-9.5％的ADRP病例。RP1基因，表达在视网膜光感受器细胞，作为一种微管蛋白相关蛋白，维持光感受细胞正常功能，约占5-10％的ADRP病例。XLRP患者约占RP患者总数的10-15％，通常男性患者临床表型较为严重，并伴有精子发育异常、听力受损等纤毛发育异常所致病症。目前被明确研究的基因有：视网膜色素变性基因2(RP2，约占XLRP的10-15％)、视网膜色素变性GTP酶调节因子(RPGR，约占XLRP的70％)和口-面-指综合症蛋白1基因(OFD1)。
基因诊断有助于患者眼科病理诊断、遗传咨询和产前诊断等。大部分视网膜色素变性患儿在儿童期和青少年期发病，病情不断加重直至致盲，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者遗传学病因的确诊，为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。视网膜色素变性多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性；X-连锁隐性遗传的视网膜色素变性的家系中，患者(表)兄弟母亲有50％的发病可能性，患者(表)姐妹通常没有典型视网膜色素变性临床症，但多数突变携带者在儿童期即表现为高度近视。对尚无症状的幼年(表)兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。
目前仅通过临床症状、生化及病理检测，不能锁定是哪一个或者几个基因异常所致。早期基因诊断利用连锁分析的方法，锁定致病基因在基因组上的位置，但是该方法需要一个大的患者家系。鉴于RP致病基因众多，并具有高度遗传异质性，一代测序技术通量太低，耗时耗力，无法满足众多基因的测序和多样本的检测。
第二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)是对传统测序技术的一次革命性的技术更新，具有高通量、快速、准确、低成本的优点，可以实现对多个样本、多个基因、多个外显子的同时检测。其中，Life Tech.公司的Ion torrent PGM测序平台是半导体芯片测序的代表，其原理是在高密度分布的芯片微孔中固定DNA模板链，随后依次掺入核苷酸ACGT，当有配对的碱基掺入时，DNA聚合酶完成延伸反应，释放出H+离子，导致微孔pH值的变化，通过半导体感知并转换成数字信号。与其他测序技术相比，ion torrent PGM测序系统更简单、更快速、并且由于其检测设备无需光学检测和扫描系统，并且使用天然核苷酸和聚合酶、无需标记荧光染料的配套试剂。由于Ion torrent PGM结合扩增子测序技术具有通量选择灵活、测序周期短、运行成本低的特点，非常适合于临床单遗传病的基因诊断。基因诊断敏感性高，可在症状出现之前或未形成不可逆病理改变之前做出早期诊断，临床医生可以根据患者家系基因型判断临床转归和预后，早期干预。
因此，本领域仍然需寻求一种新的检测视网膜色素变性致病基因突变的方法，提高诊断准确率，简化操作流程，提高时效性。
发明内容
本发明的发明人在临床中发现，家族性视网膜色素变性致病基因中存在13个高频突变基因，对这些基因进行检测具有较大的辅助诊断价值。13个高频突变基因包括：RHO、PRPF31、PRPH2、RP1、PRPF3、IMPDH1、CRX、FSCN2、RP2、RPGR、OFD1。
本发明的目的是提供一组同时检测13个高频突变的ADRP和XLRP致病基因的全部外显子的检测引物。以及提供同时检测13个高频突变的ADRP和XLRP致病基因全部外显子的试剂盒。
为了实现上述目的，根据本发明的第一方面，本发明提供一种检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物，该扩增引物包括两个引物池，分别为引物池1和引物池2，
所述引物池1包括序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示的核苷酸序列，所述引物池2包括序列表SEQ ID NO：201至SEQ ID NO：400所示的核苷酸序列。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种用于多重PCR特异性扩增检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的试剂盒，该试剂盒包括：
上述的扩增引物；
用于所述扩增引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序的试剂。
所述用于所述扩增引物进行多重PCR反应的试剂优选为高保真性、低扩增偏好性的DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和dNTPs。其中，所述高保真性、低扩增偏好性的DNA聚合酶优选为Ion AmpiseqTM HiFi Mix。所述用于所述扩增引物进行多重PCR反应的试剂可直接商购获得。
根据本发明，所述用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序的试剂可以为本领域常规的各种用于高通测序的试剂，优选为用于Ion PGM高通量测序的试剂，该试剂可通过商购获得。
其中，所述用于从样品中提取基因组DNA的试剂可以本领域常规的各种用于提取基因组DNA的试剂或商品化试剂盒。
优选地，本发明所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂。该试剂可以为本领域常规的各种基因组DNA提取试剂，可商购获得。
根据本发明的第三方面，本发明还提供上述检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物和/或所述试剂盒作为家族性视网膜色素变性致病基因突变检测试剂的应用。
检测时，引物池1和引物池2各自独立进行扩增，以避免引物对之间的相互干扰。每个引物池中各引物浓度可以为100-1000nM。
本发明的扩增引物和试剂盒可用于检测家族性视网膜色素变性致病基因突变，具体方法包括以下步骤：
(1)取受检者样本，如外周血、组织器官，提取基因组DNA；
(2)从Ion torrent高通量测序平台自动合成所述覆盖全部13个致病基因的扩增引物，如上表分为引物池1和引物池2，以上述基因组DNA为模板，在适于扩增目的DNA片段的条件下，采用多重PCR技术对13个基因进行靶向扩增；
(3)对步骤(2)得到的多重PCR扩增产物进行酶切，消化引物序列；
(4)对步骤(3)得到的酶切产物加标签序列(Barcode接头)。优选8个碱基的核苷酸序列，如Ion Xpress 33-48 kit。所述标签只是为了区别每个样品，以便用于同时检测多个样品，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签；
(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；
(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行进一步纯化、去除大片段DNA，选择保留文库扩增片段，并进行精确的浓度测定，即完成待测样本目标区域文库扩增；
(8)对步骤(7)所得到的文库进行等量混合，经过乳液PCR扩增反应(One touch)后，将待测序目的片段进一步扩增并连接于ISP珠子，得到反应液；
(9)对步骤(8)得到的ISP珠子连接的扩增产物富集、纯化；
(10)将步骤(9)得到的产物负载加入芯片，上Ion PGM测序仪进行测序；
(11)将步骤(10)得到的测序信息进行生物信息学比对处理，排斥多态性变异获取每个样本视网膜色素致病基因的突变；
(12)对步骤(11)得到的突变位点进行PCR-Sanger测序法验证。
本发明中采用基于Ion PGM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的家族性视网膜色素变性相关13个致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度在200×的前提下，检测样本量可以多达到30个，大大降低了扩增反应的成本。整个检测流程(从提取DNA、文库构建、测序反应和数据分析判读)能够在两天之内完成，提高了时效性，尤其适合于临床诊断服务。同时，该检测区域具有覆盖度广的优点，整体覆盖度达到97.98％。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。高通量测序检测到的点突变、微小缺失/重复，经过Sanger测序法验证；对高通量测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％。
本发明涉及的DNA扩增引物和试剂盒具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，对家族性视网膜色素变性具有很好的辅助诊断价值。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1显示一个样本的常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)致病基因各个扩增子的测序深度，所有基因外显子的覆盖率为100％。
图2显示一个样本的X-连锁隐性遗传视网膜色素变性(XLRP)致病基因各个扩增子的测序深度，除RPGR第15外显子部分区域因高AG高度重复不能完全覆盖外，其余所有基因外显子的覆盖率为100％。
图3①-图3⑥为6个基因突变检测为阳性的样本的IGV视图(上)和Sanger测序验证结果(下)。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。
所用到的试剂：
Ion Ampliseq Library kit 2.0，Ion PGM Template OT2 200 kit v3，Ion PGMSequencing 200 kit v2，Ion xpress Barcorde Adaptor33-48 kit，Ion 316 chip kitv2 BC。
1、提取待检测的样本全基因组DNA
使用OMEGA“基因组DNA抽提试剂盒”提取外周血DNA。提取的DNA总体积约为100μl，浓度在20-100ng/μl；A260/280在1.8-2.0之间。采用2.0荧光定量仪对基因组DNA进行准确定量。
2、PCR扩增基因组DNA的目标区域
每个引物组(引物池1和引物池2)扩增反应需要的DNA量为10ng(共2个引物组)。每个引物池中引物的浓度为400nM。
扩增程序：
3、消化引物序列
PCR扩增结束，离心，将每个样本的引物池1管和引物池2管的反应液合并为一管，然后加入2μl FuPa Reagent，总体系达到22μl，涡旋混匀。
反应条件：50℃，10min；55℃，15min，60℃，20min；4℃保持
4、Barcode连接至扩增产物并纯化
反应条件：22℃，30min；72℃,15min；4℃保持
产物使用XP试剂1.5×样本体积(45μl)纯化，70％乙醇洗涤2次。DNA片段被吸附在AMPure磁珠上。
5、文库扩增、纯化和测定
扩增程序：
PCR扩增产物需经过两次纯化，分别去除基因组DNA和PCR反应中的各类离子、引物、酶。纯化步骤按照Ion Ampliseq Library Preparation操作手册进行。纯化产物，经Qubit2.0 Fluorometer定量，即制备成片段大小200bp左右的文库。大于0.1ng/μl的文库可以进入后续乳液PCR反应。
6、乳液PCR反应(采用Ion PGM Template OT2 200 Kit V3)：
将构建好的文库，按照分子量和浓度等比例混合，配制成2pg/μL的文库混合液，上述反应体系加入One Touch 2中进行乳液PCR反应，制备Template-Positive OT2 200 IonSphere Particles。
7、高通量测序(采用Ion Sequencing 200 Kit V2)：
乳液PCR反应完成后，连接有测序模板的Ion Sphere Particles，经过One touchES富集、纯化。加入测序引物，退火处理，模板与引物结合，然后加入DNA聚合酶，室温孵育5min后，将反应液点入Ion torrent 316 V2芯片，上Ion PGM测序仪进行测序。
结果分析
Torrent suite对原始的测序数据提取、清除接头序列、滤过质量差的读常；结果与人类基因组参考序列hg19进行序列比对、及SNVs和Indel提取，测序数据经过Coverageanalysis和Variant caller分析，得到碱基序列和突变位点信息(Vcf、Bam、Bai文件)；经过Ion Reporter在线软件注释后，得到PKD1基因突变信息。针对得到的突变位点，采用PCR-Sanger测序法进行验证。图1和图2分别为一个样本的ADRP和XLRP致病基因各个扩增子的测序深度Ion torrent PGM测序的覆盖度和深度，平均覆盖深度达到1200*，除RPGR第15外显子部分区域因高AG高度重复不能完全覆盖外，以高通量测序平均深度100×为例，其余所有基因外显子的覆盖率为100％。
利用本发明所提供的方法，对8名患有家族遗传史的家族性视网膜色素变性患者进行了基因检测，发现了6个致病基因突变。图3①-⑥为6个基因突变检测为阳性的样本的IGV视图(上)和Sanger测序验证结果(下)。图①为PRPF31基因c.1150G>T(p.Glu384*)杂合突变的IGV视图和验证结果；图②为FSCN2基因基因c.72delG(p.Leu24Leufs*121)杂合突变的IGV视图和验证结果；图③为RP2基因c.570_571insGAAGATGCTGT(p.Pro190Profs*52)杂合突变的IGV视图和验证结果；图④为RP1基因c.1126C>T(p.Arg376*)杂合突变的IGV视图和验证结果；图⑤为RHO基因c.403C>T(p.Arg135Trp)杂合突变的IGV视图和验证结果；图⑥为RP1基因c.4737dupA(p.Leu1579Leufs*9)杂合突变的IGV视图和验证结果。高通量测序筛出的基因突变结果与Sanger测序的结果是一致的，说明本发明的方法是可行的、可靠的。
受屏幕分辨率和附图尺寸所限，图1、图2、图3①-图3⑥中部分字体显示不清，但并不影响本领域技术人员对本发明技术方案和技术效果的理解。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 一种检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物、试剂盒及应用
<130> A1700019
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<400> 34
gctgaaatag gagctcggag ac 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cccgtggata gcttggaatt ca 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tggttcgggt tgctttctca 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gggattcagt caagaccatc gc 22
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gagtgggagg aagcaccttc 20
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ggtagggatt tagatactca caccca 26
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
atctgagctt gggcttaggg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ggtgctgagc aagagaggtt 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgtgtacacc tgcgtgtgta g 21
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
agctgaacgc ctccaagc 18
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
cctctgtgat gtccagggag a 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cctgcaacat catgctgctc 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
agctcctgag tgctaccgt 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ctaaggcacg tggatactcg g 21
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
catgaccccc atgcctacc 19
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gctgacggag atccggaag 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gctctaagca gcggagaca 19
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
caagtcgggc agtgggc 17
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gggaggtacc tggagtggg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gctctgatgg gtcacagttg g 21
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gaacccgatc ctagcccttc 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
aatggcacag aaggccctaa c 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
agccacctag gaccatgaag a 21
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
caccctcctt aggcagtgg 19
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ccggagcttc ttcccttctg 20
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
caccatcccc atgattatca tctttttct 29
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
agcagatcag gaaagcgatg ac 22
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
cgtctgccta gcaggttcc 19
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gtagcagagg cctcatcgtc 20
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ttcttggagt gcactatttc tcagtg 26
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
accaccaggt gaccattaca att 23
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gggttcaagc ccagactgat 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tgccctgctg agctactaca 20
<210> 67
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
gagcctcagt gtccccaata tattc 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
gaagtactac cgggacacag ac 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ggcttccatc tggcatactt gg 22
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
ctctggctca tgaactggtt ctc 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
gagaacccgt agtgcaaatc tgt 23
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
cttctcagct ctctgttctc tccta 25
<210> 73
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tctcagcact caccgaagga 20
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
cccgtttttg cccttaagag gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tagtgcctcc agcccacta 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
ttgactcttc tctgccttgt gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
caggagccat accatcacct ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ggttcatcca ctcaggctct c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ggcctgcctg aggttattcg 20
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
aatgttcctg gccccacag 19
<210> 81
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gagggtcctc tctacaccca 20
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gcagaagttt gaacagggct tc 22
<210> 83
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
tacctcccat cagctgatgt agaa 24
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
actctttacg tgggctgtgc 20
<210> 85
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
ttccttcccg tgcccag 17
<210> 86
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gcagcatggc ggactac 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
cacctaaccc ttcgcacagt 20
<210> 88
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gtacagcgcc cgactgc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ccatgtattc gctatggtgc tgt 23
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
acttaaagga gcgagggttg ac 22
<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
acggcgagtc ctacctatgt 20
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tgtcaggtgc tgtagaaatg cc 22
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
attttcctgg gatccctgct g 21
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
agctccagag ctcaggatca 20
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
ttgctgcctc ttcctttgga tatt 24
<210> 96
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
tgagaatcat tcttttctaa ggccaagt 28
<210> 97
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
aaatggacaa ctactgtcag taaaactgg 29
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
gcattctccc aactagcaga act 23
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
gaaatctgtg attggcagtg tgac 24
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
cacttattgc acttgactta agcagac 27
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
tattggacaa caaaactggt atcaagaact 30
<210> 102
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
ctggcaacag atgacaaaat cttctttt 28
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gtgcaagatt cagatagtcc ccttaaa 27
<210> 104
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
taggtgctcc taagcttatt ttatttagtg atc 33
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
aatctcaagc agaagtggca tct 23
<210> 106
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
tgttctgcaa ccaactctgt atataatttt ga 32
<210> 107
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gaatgatccc catacaaatt ctggaaaaat aag 33
<210> 108
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
tgactgtgac aaagtacagt gttcat 26
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
tagaggctgc cattcaagta gatc 24
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
ttccctttag gtttagcacc aagag 25
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gacttgaaag ctgctgttgc c 21
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
agccttattt acagtgcaca tctca 25
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
tgtgttttct gataaggctt gtgc 24
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
attactgaca ttttgatgtg acaccaatg 29
<210> 115
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
aattgttcac taaggaagtt tcaggatga 29
<210> 116
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
ttttactagc ctctacctct tcttggat 28
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
aaggagacca atgaaggaga aactaag 27
<210> 118
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
cagtttttct attgcccttt taacaaatcc t 31
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
catttggctc ttctgaacag gtatct 26
<210> 120
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
gatgacatcc ttagcaaatg attttctttc a 31
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
cagaactcga ggaactgact caac 24
<210> 122
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
agactttgtt accagcagaa ataaaggaa 29
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
gtatgctctt tgtggtcaac attgc 25
<210> 124
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
aactgatcaa atatatcacc aatggcatta tca 33
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
gaatttcttg cacacatcat tgttagttgt 30
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
tgctaatatt taaggaggtc tcaacttgg 29
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
aaaggaagct cgcgtgtttg 20
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
caagacttta tttccgcccg aga 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
gtggctgatg tgttgagtca aga 23
<210> 130
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
cattttcaag agactgtaat gtttcaggat ac 32
<210> 131
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
gcagcctcgg tccatttca 19
<210> 132
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
agcacttagc tatcatacag cactttac 28
<210> 133
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
atgcaggatc tattacaact cattaaaatc aac 33
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
ggaaaaagta catagaaaac tgttgctgtt 30
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
gtcttacgca cctgacgatg t 21
<210> 136
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
ggttaagact ttagaagaca aacaaaaaca tca 33
<210> 137
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
aaggagttaa ccatgttcca gaatgatt 28
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
cttggcccca gtccctattg 20
<210> 139
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
cagattgaaa caaaagaaat ttatgctcaa agg 33
<210> 140
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
tgtaccttct aggtgatatc ccctttac 28
<210> 141
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
ttttcctaaa tttgttagct cagctatggt a 31
<210> 142
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
aagttacaga ctactttgtc agtttttgtt atg 33
<210> 143
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
aggtctgaca tactggccat aaatattaaa tg 32
<210> 144
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
aacaggatga cttaggataa attatgtatg act 33
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
tagagtctgt caaagcccag tct 23
<210> 146
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
cgaattacta aaacacgcaa gtcagaag 28
<210> 147
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
aagagaactt ttccttttga agcaagc 27
<210> 148
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
tgatcattac attttcacag acaccaga 28
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
caatccaaag cagtctgtga tcg 23
<210> 150
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
tgacccttgc cttagtattg gc 22
<210> 151
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
ttgctggaag ccttcaaaaa cattac 26
<210> 152
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
catttcactt tcgaggcttc tttttg 26
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
gagctcttta gaaaccacgt tggta 25
<210> 154
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
aacaagtgaa ggctgacaga gc 22
<210> 155
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
cactgccctt ctttgtcttg gt 22
<210> 156
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
atgaaataat tcacagagca cacgga 26
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
ttagtcctct ggcatacagg ct 22
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
gtcttgctcc tgctggatga t 21
<210> 159
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
gcatacccta tagtttattt tgatgtgctt g 31
<210> 160
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
atgaaagtgt gtagggaaaa caggtac 27
<210> 161
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
tcctgatata aattgtaaac tagggcagaa ac 32
<210> 162
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
ttgagttttg tctgatgata gggaaacat 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tctggtctcc tatggatttt atctctgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
agtacatgtg gtgccccata aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
gcttgttatg aggatcatgt gacagta 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcagacttaa gttttctaga acagcacaaa 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggccataat cgggtcacat ttaa 24
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<213> 人工序列
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agaagagaat gaaaggcagg atgg 24
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<213> 人工序列
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gttccttctc tccctctcct gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ctcactgtct atttcttctg cttctgatt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cagacacaca tcatgagcct ga 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agacgctttc atgcatataa gagtatagg 29
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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catacgtgct gatagagtcc tctg 24
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<213> 人工序列
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ctcatttgtg tttgaagcca atgttga 27
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accatagaga gtgtggaaag atcaataga 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgatcccta atattctcaa tgactttggg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tttccccaga ggcacttaac c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caacatagaa gtgggagata acatgatga 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctggctacc ttttaaaacc ttttctc 27
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<213> 人工序列
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cctcagttct caaagtcagg ca 22
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<213> 人工序列
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ccagttctga aaacctctgg tttg 24
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<213> 人工序列
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tatttgcaga ttcgggtgct gt 22
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<213> 人工序列
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gttctccccc atcctgttct tc 22
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aggattaaag acataaactt gccactctt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agagttctcc gttgctctct ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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ttgcttcaac taccacatta atgtctga 28
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cttcttcgga ggcaccgag 19
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<213> 人工序列
<400> 222
caggtagcgg ctgtcaca 18
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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acccacctac accctgagt 19
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<211> 19
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<213> 人工序列
<400> 225
tcctgctgtc ctgaggaga 19
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<213> 人工序列
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gtccagctct tggtggagat g 21
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<213> 人工序列
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gtctacgacg tcttccacct g 21
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<213> 人工序列
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acggaactcg aagacgaagt c 21
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<213> 人工序列
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tctcaccaat aagtgtcctc atcc 24
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<213> 人工序列
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gggactgtag gaatctgaga tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctccgcttt ctgctcttcc 20
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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cacctcttgt cctcttacca tcttacta 28
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gggattaggc tggagctaca c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acatccggga ctccacatac t 21
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<213> 人工序列
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agggccatcg aggaatcca 19
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<213> 人工序列
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gcactgaggt agacgagaag c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgttacctct gtctgtctgt ctca 24
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<213> 人工序列
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cgccttggta ggacagtgc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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agtccaccat ccgcgac 17
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tatgaacacc cccaatctcc ca 22
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<213> 人工序列
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cacccgtcgc attggaga 18
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<213> 人工序列
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ctcaactaca tcctgctcaa cctag 25
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<211> 25
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<213> 人工序列
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ttggataaca ttgacaggac aggag 25
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<213> 人工序列
<400> 257
tttccaggga gggaatgtga ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 259
aaggaggtca cccgcatg 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gggaagtagc ttgtccttgg c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catgctcacc accatctgct 20
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<213> 人工序列
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aattaaggag cctatgtgac ttcgttc 27
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<213> 人工序列
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catccagcga cgtctgtagg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcaggtgtgt tgagcactga g 21
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<213> 人工序列
<400> 265
cgtgacgaca cccatgga 18
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<213> 人工序列
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catctccagc tgtctgtttc cc 22
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<213> 人工序列
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agtgggactc gacatgggta 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
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cctccaagtg acagcaagga 20
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<213> 人工序列
<400> 272
caacacggct gccaggata 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 19
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<213> 人工序列
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tgggctggag gcactaatc 19
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<211> 19
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<213> 人工序列
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cactcgctca cctcctgac 19
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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gctgaaccac tcatccatct cc 22
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<213> 人工序列
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tcatttcacc cctgcattcc tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tcaactagct ccctggtacc tt 22
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<213> 人工序列
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ccaccctcct cagtgaggta 20
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<211> 21
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<213> 人工序列
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gaggagccag tgggaaaatg a 21
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<213> 人工序列
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ccggctctga ccacactt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cccattccca agaaaagtct ctcc 24
<210> 284
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 284
tctgctcctc taggcttttc tgta 24
<210> 285
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 285
cctctcagat ctcagtgcat gg 22
<210> 286
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 286
aacaggtcgt aaaaaccttc cctaaaa 27
<210> 287
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 287
cacctctcgg gctcgtag 18
<210> 288
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 288
tcctcgggac tcgaccg 17
<210> 289
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 289
agtttctaca agagcggaga cc 22
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 290
gtctacaggc tgcaccttcc 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 291
cttctgagca ggagggtcac 20
<210> 292
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 292
cggagcacac acactcacat a 21
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 293
actctggtct cttttaggtt ccca 24
<210> 294
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 294
tgccgtcctt gaggcaaa 18
<210> 295
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 295
aatgattgct acttagacta ttcttttgtt cct 33
<210> 296
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 296
ctggaaaact catctcactc ttttcatca 29
<210> 297
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 297
ggagataaac attcaaatga cagatcaagt g 31
<210> 298
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 298
tccaatcatt ttctcttgaa cctcagtt 28
<210> 299
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 299
gatcaaatgg aggagtcatc attagaaaga a 31
<210> 300
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 300
aggactgaac ctatcattgg tgttac 26
<210> 301
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 301
gaatttgctc agtgtggttt aacaaaac 28
<210> 302
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 302
cacttttctg gaggtcttcc tcac 24
<210> 303
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 303
attccaaggt tcaaggactt ttaacca 27
<210> 304
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 304
tttgaaacta aactcttctt tgccattcc 29
<210> 305
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 305
aaacctgatt ttcctgaggc tattgc 26
<210> 306
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 306
ccggcaattt tagttatgtg cttattactt t 31
<210> 307
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 307
caggttggat ctctgaatga tgcttat 27
<210> 308
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 308
gactggtaag aggtcttttg gagttt 26
<210> 309
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 309
cattctgcaa tatgtaattc atccactaat ctc 33
<210> 310
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 310
agtccaaagt ggcttgtagt tga 23
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 311
ctgaagtctg tgttttggaa gtgac 25
<210> 312
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 312
gcaagctccc tcataggtat gg 22
<210> 313
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 313
agaaagatct aaatattttg acagaccctg aat 33
<210> 314
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 314
gtccgtggtt cttccatatc aaagg 25
<210> 315
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 315
gtggtaaatg gaggagagca agc 23
<210> 316
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 316
acttccagtt tccatagttt tcaccat 27
<210> 317
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 317
agtggcgaac ttacccaaga g 21
<210> 318
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 318
cctcctggaa ttcctgcaac a 21
<210> 319
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 319
catagaggaa ggagtactga ttgacaaag 29
<210> 320
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 320
ccatgaggca tgttaaagta attgcatt 28
<210> 321
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 321
tagtcatcag tcagaaagag tatgcac 27
<210> 322
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 322
tcttcctcat tcatgggttg gataataac 29
<210> 323
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 323
agggaagaga acaataaagc aagtatgag 29
<210> 324
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 324
ccgctgaggt cttgtgtatt tga 23
<210> 325
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 325
ttgaaatgct tggtcaagct tgc 23
<210> 326
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 326
acatgtgctt catctcatgg gaaa 24
<210> 327
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 327
ctgatgatgg cgcaggtaga 20
<210> 328
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 328
cgatccttaa acgtctggta tagcttt 27
<210> 329
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 329
aacttctggc catggatcta gaac 24
<210> 330
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 330
agaggcgcct attaagaggg a 21
<210> 331
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 331
aacagtgtaa gaaagagctt gaaatttgc 29
<210> 332
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 332
aagccatctt accagtgatt tgtagag 27
<210> 333
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 333
ttgtaaaaac agtgactgag cagtg 25
<210> 334
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 334
aggagcaatc acacaatatg gtaaatca 28
<210> 335
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 335
ttggacagag cattaatgtt aaacctagat 30
<210> 336
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 336
cgagagcttc agattttgct tgac 24
<210> 337
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 337
agaatacgca aaaagtatac cttgagtcg 29
<210> 338
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 338
tctgcttctc ttcctcttag caaatc 26
<210> 339
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 339
ttcctttggg aatctgctat tgaca 25
<210> 340
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 340
agtttatatg ctgagaagga gggaac 26
<210> 341
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 341
ttacaagttg tcatgtttag caccct 26
<210> 342
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 342
atagaaaaga cccaacttgg gaagc 25
<210> 343
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 343
agttctgccc caactgtagg 20
<210> 344
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 344
accttttcat tcagcatatg gttttgttt 29
<210> 345
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 345
tttttacctt cttaggccta gctcag 26
<210> 346
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 346
actagtgtga cttgtgccaa gttt 24
<210> 347
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 347
ggttatcgtt accatggctt caga 24
<210> 348
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 348
gcaccacatt gccatttatt aatccat 27
<210> 349
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 349
gggtagttcc cctgattctg ac 22
<210> 350
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 350
tctgtcctct ccaaaaatat gtctttcc 28
<210> 351
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 351
cagacgcctc tcttccacac 20
<210> 352
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 352
gcaataataa aatgcaggaa accaacag 28
<210> 353
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 353
aaaaggcttt ttgtcacctt gtactc 26
<210> 354
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 354
accaatggat acgtttcacc aaaacta 27
<210> 355
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 355
actggtcctg cattcatttg aataatct 28
<210> 356
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 356
aaaggtgtac aatggagcaa cca 23
<210> 357
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 357
tctgctcaca gtgaaaatcc tttagag 27
<210> 358
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 358
actcaaggtt ccatttgaac tttgga 26
<210> 359
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 359
ggacacgctg caatctagtg a 21
<210> 360
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 360
tgctatcttc ataatgttct caattccttc c 31
<210> 361
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 361
acattacaat acacttggtg actgtgaa 28
<210> 362
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 362
gtcccctcaa taaatcaaaa gattgtcaag 30
<210> 363
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 363
agagagttaa attatgtgga ttgccatatg aa 32
<210> 364
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 364
agagtttcac tgagagcatc agg 23
<210> 365
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 365
tttctcccag gatctcagga tttaag 26
<210> 366
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 366
tttaacaaga aaatcttact cttctctgat ggt 33
<210> 367
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 367
ctctttccct tctccctcct tc 22
<210> 368
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 368
cagaacactg gcaagatgag ga 22
<210> 369
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 369
ccttgccttc actcacctct g 21
<210> 370
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 370
aaacccataa tatccaaatc catggca 27
<210> 371
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 371
gctggctgcg tcatgaaaat 20
<210> 372
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 372
ggcagtattt aaagtagata agttgtcctt gt 32
<210> 373
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 373
ccttttgttt ctgaactggt gataatttta atga 34
<210> 374
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 374
agagcggatt ctattactat ctgaactgt 29
<210> 375
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 375
cttaggagca ctgatggtgc tt 22
<210> 376
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 376
aattcagtct ttccacgatg ttctga 26
<210> 377
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 377
tctgaattaa ctctaaaagt ttgttagcac tca 33
<210> 378
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 378
ctgccgtata gcagtttaac ctca 24
<210> 379
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 379
tgtctgacat ttggctttta ggaaac 26
<210> 380
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 380
tggtcgccac ggaaaattag g 21
<210> 381
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 381
agtaaacatg gaattccatt tttctcagc 29
<210> 382
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 382
ctgggtcttg gcacttttct tttt 24
<210> 383
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 383
cagggaacag aacagtggac tc 22
<210> 384
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 384
ttgacggtaa gaccagcttt ttgt 24
<210> 385
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 385
gaaaggaatg tgtcccagac tgaa 24
<210> 386
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 386
tacactgacc tgtctcataa aaaggg 26
<210> 387
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 387
caagcaaatg tcagaaaata aagaactaaa agc 33
<210> 388
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 388
gtgacctcat cttacattat gtgaaaaatg c 31
<210> 389
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 389
taccgggatt attttcagca aatttacttt tc 32
<210> 390
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 390
atggagtctg aggaataaga aagactga 28
<210> 391
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 391
aactcaccgg gcatcagc 18
<210> 392
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 392
cgccttgcat tcccaagc 18
<210> 393
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 393
caatttgtcc tgttcatttt gttactgtgt 30
<210> 394
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 394
gtcttgaatg agaaactgtt gtcctg 26
<210> 395
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 395
gtgcgagatt gtagaaagct gga 23
<210> 396
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 396
gtaggtatag gaacatagtc ctgaacca 28
<210> 397
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 397
tcagtgtgct gttgttgcat tttatac 27
<210> 398
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 398
gaaaatatcc acaaaagtat accaatcatc cag 33
<210> 399
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 399
agcttggaac tttgttctgt gga 23
<210> 400
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 400
atcaaattct atattcacaa gttgggaaag g 31
Claims (6)
1.一种检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物，其特征在于，该扩增引物包括两个引物池，分别为引物池1和引物池2；
所述引物池1包括序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示的核苷酸序列，所述引物池2包括序列表SEQ ID NO：201至SEQ ID NO：400所示的核苷酸序列。
2.一种用于多重PCR特异性扩增检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
权利要求1所述的扩增引物；
用于所述扩增引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述用于所述扩增引物进行多重PCR反应的试剂为高保真性、低扩增偏好性的DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和dNTPs。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述高保真性、低扩增偏好性的DNA聚合酶为Ion AmpiseqTM HiFi Mix。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于从样品中提取基因组DNA的试剂。
6.权利要求1所述的检测家族性视网膜色素变性致病基因突变的扩增引物和/或权利要求2-5中任意一项所述的试剂盒作为家族性视网膜色素变性致病基因突变检测试剂的应用。
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