KR101890810B1 - 피코액적 디지탈 pcr을 이용한 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단 방법 및 그를 위한 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피코액적 디지탈 PCR을 이용한 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단 방법 및 그를 위한 키트에 관한 것이다. 일 양상에 따른 방법 및 키트에 의하면, 태아와 산모에게 가해지는 위험성은 전혀 없으면서도, 임신 초기에 태아의 상염색체 열성 질환을 비침습적으로 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 피코액적 디지탈 PCR을 이용한 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단 방법 및 그를 위한 키트에 관한 것이다.
유전성 질환은 산전 진단을 통해 임신 중 진단이 가능하다. 이를 통해 출생 전이나 후에 적절한 시기에 필수적인 치료를 시행할 수 있어 유전성 질환의 치료 및 재활에 있어 산전 진단의 역할은 중요하다. 하지만 현재 주로 시행되고 있는 침습적인 산전 진단 방법인 임신 융모 검사와 양수 천자 검사는 약 1%의 유산 위험성을 가지고 있으며 임신 10주가 넘어야 가능하다. 따라서 치명적인 일부 질환에 대해서만 산전 진단이 시행되고 있는 실정이다. 이에 산모의 혈장 DNA를 이용하여 임신 7주부터 차세대 시퀀싱과 칩-기반 디지털을 이용한 비침습적인 산전 진단이 최근에 개발되었다. 그러나, 가장 유병율이 높은 상염색체 열성 질환의 경우, 차세대 시퀀싱의 경우 매우 복잡한 haplotype 복원과정이 필요하고, 경우에 따라서는 3대에 걸친 혈액이 필요하다는 문제점이 있다. 한편 디지탈 PCR을 이용한 산전 진단의 경우 디지탈 PCR 정확도가 진단을 좌우하게 된다. 디지탈 PCR의 기본 전제는 하나의 partition에는 하나의 target copy가 포함되거나 target copy가 존재하지 않는다는 것이다. 이 전제를 바탕으로 target copy의 수를 정확히 측정하는 것이 디지탈 PCR의 핵심이다. 기존의 칩-기반 디지탈 PCR의 경우, 디지탈 PCR에 이용하는 partition이 800개 이하여서 하나의 partition에 두 개 이상의 target copy가 포함될 수 있었다. 이에 통계적 방법으로 이를 극복하게 되는데, 이는 디지탈 PCR의 정확도를 떨어뜨릴 수밖에 없다.
이에 본 발명자들은 이론적으로 임신 10주 이내에 진단이 필수적인 유전성 질환에 대해 임신 초기에 나타나는 산모의 혈장 DNA에 태아의 세포 유리 순환 DNA를 사용하여 피코액적 디지탈 PCR을 수행하여 산모에서 비침습적으로 상염색체 열성 질환을 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 산모로부터 혈장 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 혈장 DNA에 대해 피코액적 디지탈 PCR(picodroplet digital PCR)을 수행하여 태아가 부계 및 모계의 상염색체 열성질환 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 태아의 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단에 관한 정보를 제공하기 위한 산모의 혈장 DNA 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 (1) 혈장 DNA 중 상염색체 열성 질환의 단일염기다형성(SNP)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브, (2) 혈장 DNA 중 정상(wild type)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브 및 (3) 상기 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는, 피코액적 디지탈 PCR에 의한 상염색체 열성 질환의 비침습적 산전 진단에 사용하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
일 양상은 상염색체 열성 질환을 비침습적으로 산전 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 산모로부터 혈장 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 혈장 DNA에 대해 피코액적 디지탈 PCR(picodroplet digital PCR)을 수행하여 태아가 부계 및 모계의 상염색체 열성질환 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 태아의 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단에 관한 정보를 제공하기 위한 산모의 혈장 DNA 분석하는 방법을 포함할 수 있다.
다른 양상은 상염색체 열성 질환을 비침습적으로 산전 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 (1) 혈장 DNA 중 상염색체 열성 질환의 단일염기다형성(SNP)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브, (2) 혈장 DNA 중 정상(wild type)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브 및 (3) 상기 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는, 피코액적 디지탈 PCR에 의한 상염색체 열성 질환의 비침습적 산전 진단에 사용하기 위한 키트일 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "디지털 PCR (digital PCR)"은 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet) 내의 1개의 유전자 카피를 PCR 증폭한 결과에 대해 단일 분자 계수법을 적용하여 DNA 시료를 정확하게 절대 정량할 수 있는 기술을 의미할 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "상염색체 열성질환(autosomal-recessive Mendelian disorders, AR-MDs)"이란, 상염색체상의 유전자에 의해 나타나는 열성 질환을 총칭하는 용어로서 사용되며, 구체적으로, 사람의 22쌍의 상염색체중의 어느 곳에 좌위를 차지하는 유전자의 이상에 의한 질환 중 대립유전자의 양쪽이 이상한 개체(aa)에서 발병하지만, Aa 또는 AA 개체에서는 증상이 나타나지 않는 질환을 의미할 수 있다. Aa개체(보인자)에서는 체내의 모든 세포에서 해당효소의 활성이 정상의 50%이지만, 통상은 활성에 융통성이 있기 때문에 기질 축적 등 생명활동에는 문제가 생기지 않은 것으로 이해된다. 상기 상염색체 열성 질환은 감각신경성청력손실(sensorineural hearling loss), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 백색증(albinism), 색소성건피증(xeroderma pigmentosum), 윌슨병(Wilson's disease), 후를러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 전형적 혈색소 침착증(Haemochromatosis type 1), 및 기텔만 증후군(Gitelman syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 방법은 자동화 또는 반자동화된 방법일 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 첫 번째 아이가 상염색체 열성 질환으로 진단된 경우, 두 번째 아이가 상염색체 열성 질환을 갖는지 여부를 비침습적으로 확인하는 것일 수 있다.
상기 산모로부터 혈장 DNA를 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기에서 분리된 혈장 DNA는 게놈 DNA일 수 있으며, 예를 들면, 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA일 수 있다. 상기 분리하는 단계에 있어서, 혈장 DNA는 산모의 시료로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 시료는 체액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료이며, 더욱 상세하게는 말초혈일 수 있다. 상기 산모는 산모의 체액 등에서 태아 DNA가 나타나는 시기의 산모일 수 있으며, 예를 들면, 임신 6주 이후, 7주 이후, 8주 이후, 또는 9주 이후 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계는, 양성 대조군 및 음성 대조군을 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출하는 단계는 혈장 DNA 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하는 단계; 상기 혈장 DNA 중 부계 원인 돌연변이가 나타나는 경우, 태아는 부계 원인 돌연변이를 갖고 있다고 판정하고, 부계 원인 돌연변이가 나타나지 않는 경우, 태아는 상염색체 열성질환을 가지고 있지 않다고 판정하는 단계; 및 상기 혈장 DNA 중 모계 원인 돌연변이의 비율 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%에 근거하여 태아가 모계 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 검출하는 단계는, 양성 대조군 및 음성 대조군을 사용하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출하는 단계는, 상기 혈장 DNA 중 부계 및 모계 돌연변이의 비율을 결정하는 단계; 상기 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%를 결정하는 단계; 상기 결정된 태아 DNA의 존재%에 기반하여 태아의 DNA에 원인 돌연변이가 있을 때를 가정한 양성 대조군 시료 및 태아의 DNA에 원인 돌연변이가 없을 때를 가정한 음성 대조군을 제조하여 양성 대조군 시료 및 음성 대조군 시료 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하는 단계; 및 상기 결정된 양성 및 음성 대조군 시료의 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 상기 결정된 혈장 DNA 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율과 비교하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 부계 원인 돌연변이에 대한 양성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 첫 번째 아이로부터 분리된 gDNA 또는 아버지로부터 분리된 gDNA를 포함하고, 상기 부계 원인 돌연변이에 대한 음성 대조군 시료는 부계 원인 돌연변이가 없는 사람으로부터 분리된 혈장 DNA를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 모계 원인 돌연변이에 대한 양성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 첫 번째 아이로부터 분리된 gDNA를 포함하고, 상기 모계 원인 돌연변이에 대한 음성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 모계 원인 돌연변이가 없는 사람으로부터 분리된 gDNA를 포함하는 것일 수 있다.
상기 산모의 원인 돌연변이와 아버지의 원인 돌연변이가 동일한 동형접합체(homozygote)인 경우, 상기 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%를 결정하는 단계는 혈장 DNA 중 아버지에게는 존재하나 산모에게는 존재하지 않는 임의의 원인 돌연변이, 예를 들면, 단일염기다형성(SNP)을 이용하여 결정하는 것일 수 있다.
상기 비교하는 단계는 판별분석(discriminant analysis)을 수행하여 태아가 부계 원인 돌연변이를 갖는지 여부, 및 모계 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 상기 비교하는 단계는 이외에도 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 비교 분석할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 피코액적 디지탈 PCR의 수행 산모의 혈장 DNA 중 부계 원인 돌연변이(예를 들면, 태아 DNA의 존재%) 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하거나, 양성 대조군 시료 및 음성 대조군 시료 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하는데 사용되는 것일 수 있다. 상기 피코액적 디지탈 PCR은 상기 (1) 혈장 DNA, (2) 상염색체 열성 질환의 단일염기다형성(SNP)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브, (3) 정상(wild type)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브 및 (4) 상기 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 제조하는 단계; 상기 PCR 반응 혼합물을 액적에 유화(emulsify)시키는 단계; 및 상기 액적을 웰에 넣고 PCR 반응을 수행하고 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 분리된 혈장 DNA는 PCR 반응을 위하여 프라이머/프로브 세트 및 PCR 반응을 위한 버퍼 등의 혼합물의 PCR 프리믹스들과 혼합된다. 프라이머 세트는 대상이 되는 게놈 DNA 유전자의 변이 (돌연변이)를 특이적으로 증폭할 수 있다. PCR 프리믹스는 PCR 반응을 위한 DNA 중합효소 (예를 들면, Tag polymerase), PCR 반응의 정량적 검출을 위한 염료 (예를 들면, 형광 염료), PCR 반응에 적합한 버퍼, dNTP 등을 포함할 수 있다.
상기 PCR 반응 혼합물을 액적에 유화시키는 단계는 PCR 반응 전에 각각의 PCR 반응 용액을 다수의 작은 방울로 쪼개어 나누는 과정으로, 이와 같은 미분화 과정을 통해서 각각의 작은 방울이 이후의 PCR 반응이 수행되기 때문에 각각의 작은 방울에서의 타겟 DNA의 증폭 여부에 따라 양성 또는 음성으로 구분할 수 있다. 상기 액적은 2 내지 10 pl(plicolter), 2 내지 8 pl, 4 내지 8 pl 또는 4 내지 6 pl의 부피를 갖는 것일 수 있다. 상기 미분화는 PCR 반응 및 반응 여부의 측정의 편의상 10,000 내지 25,000개로 미분화될 수 있다.
상기 PCR 반응은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 일반적으로 프라이머/프로브 간 교차결합이 이루어지지 않는 조건에서 수행될 수 있다. PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ?처 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며, 예를 들면, 각 미분화된 작은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으면, 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 액적 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative 액적의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다. 이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에 있어서 전술한 바와 같은 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX 및 TET 등과 같은 형광 모이어티 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, TAMRA, ECLIPSE, BHQ (BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등) 등과 같은 형광 모이어티로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "원인 돌연변이"라는 용어는 분석대상이 되는 시료 내의 유전자들 중 유전자형 분석에 유용한 변이가 존재하는 유전자로서, 예를 들어 유전자 감식이나 개체 식별에 사용되는 마커 유전자, 특정 질환의 진단에 사용되는 마커 유전자, 염색체 수 이상 내지는 유전자 수 이상을 나타내는 유전자, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 유전자, STR (short tandem repeat)을 갖는 유전자 또는 단일염기다형성을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 원인 돌연변이는 단일염기다형성일 수 있다. 상기 단일염기다형성은 SLC26A4 c.1529T>A (p.V510D), SLC26A4 c.2168A>G (p.H723R), GJB2 c.508_511dupAACG (p.A171EfsX40), GJB2 c.257C>G (p.T86R), GJB2 c.299_300delAT (p.H100Rfs*14), GJB2 c.123G>A (p.G45E), 및 GJB2 c.235delC로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 그에 제한되는 것은 아니며, 상염색체 열성 질환에 알려진 모든 단일염기다형성을 포함할 수 있다.
상기 단일염기다형성을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이고, 상기 정상(wild type)을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 혈장 DNA 예를 들면, 원인 돌연변이를 갖는 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 2의 조합, 서열번호 5 및 6의 조합, 서열번호 9 및 10의 조합, 서열번호 13 및 14의 조합, 서열번호 17 및 18의 조합, 서열번호 21 및 22의 조합, 및 서열번호 25 및 26의 조합을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 방법 및 키트에 의하면, 태아와 산모에게 가해지는 위험성은 전혀 없으면서도, 임신 초기에 태아의 상염색체 열성 질환을 비침습적으로 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 비침습적 산전 진단 방법에 적용된 가족의 가계도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 비침습적 산전 진단 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 일 구체예에 따른 비침습적 산전 진단 방법을 나타낸 흐름도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
.
피코액적
디지털
PCR
(
picodroplet
digital
PCR
)을 이용한 상염색체 열성질환 산전 진단
본 발명의 산전 진단 과정은 크게 하기의 3단계로 진행하였다.
1단계(Phase 1)는 산모의 혈장 속에 존재하는 태아의 DNA, cffDNA의 비율을 구하는 단계이다. 이는 산모의 DNA에는 존재하지 않고 태아 DNA에만 존재하는 서열을 측정하여 구할 수 있다. 태아 DNA에만 존재하는 서열로는 산모에게는 없으나 아버지에게는 존재하는 돌연변이를 이용할 수 있다. 산모의 혈장에 존재하는 DNA에서 아버지 돌연변이의 존재 비율을 구하여 산모 혈장에 존재하는 태아 DNA의 비율을 구할 수 있다. 만약 산모의 돌연변이와 아버지의 돌연변이가 동일한 homozygote (동형접합체)의 경우에는 아버지 돌연변이로 태아 DNA 비율을 구할 수 없고, 아버지에게는 존재하나 산모에게는 존재하지 않는 SNP를 이용하여 태아 DNA의 비율을 구한다.
2단계(Phase 2)는 아버지 돌연변이를 태아가 가지고 있는지 진단하는 단계이다. 1단계에서 구한 태아 DNA 비율을 바탕으로 양성 대조군과 음성 대조군을 제작한다. 양성 대조군은 태아 DNA에 아버지 돌연변이가 있는 경우로, 산모의 genomic DNA에 태아 DNA의 비율만큼 아버지 돌연변이 genomic DNA를 혼합하여 제작한다. 음성 대조군은 태아 DNA에 아버지 돌연변이가 없는 경우로, 아버지 돌연변이가 없는 사람의 혈장 DNA로 제작한다. 그 후 양성 대조군과 음성 대조군에서 해당 돌연변이 DNA의 비율을 측정한다. 그리고 산모의 혈장에서 해당 돌연변이 DNA의 비율을 측정한다. 양성 대조군, 음성 대조군, 산모의 혈장에 해당하는 샘플 여러 개에서 돌연변이 DNA의 비율을 측정한 후 산모 혈장에서의 아버지 돌연변이 DNA의 비율이 양성 대조군 혹은 음성 대조군에 해당할 sum of the log-likelihood 값을 각각 구한다. 그리고 이 값들을 비교하는 discriminant analysis를 시행하여 태아 DNA에 아버지 돌연변이가 있는지 없는지 진단한다.
3단계(Phase 3)는 산모 즉, 어머니 돌연변이를 태아가 가지고 있는지 진단하는 단계이다. 1단계에서 구한 태아 DNA 비율을 바탕으로 양성 대조군과 음성 대조군을 제작한다. 양성 대조군은 태아 DNA에 어머니 돌연변이가 있는 경우로, 산모의 genomic DNA에 태아 DNA의 비율만큼 어머니 돌연변이 DNA를 혼합하여 제작한다. 음성 대조군은 태아 DNA에 어머니 돌연변이가 없는 경우로, 산모의 genomic DNA에 태아 DNA의 비율만큼 어머니 돌연변이가 없는 DNA를 혼합하여 제작한다. 그 후 양성 대조군과 음성 대조군에서 해당 돌연변이 DNA의 비율을 측정한다. 그리고 산모의 혈장에서 해당 돌연변이 DNA의 비율을 측정한다. 양성 대조군, 음성 대조군, 산모의 혈장에 해당하는 샘플 여러 개에서 돌연변이 DNA의 비율을 측정한 후, 산모 혈장에서의 어머니 돌연변이 DNA의 비율이 양성 대조군 혹은 음성 대조군에 해당할 sum of the log-likelihood 값을 각각 구한다. 그리고 이 값들을 비교하는 discriminant analysis를 시행하여 태아 DNA에 아버지 돌연변이가 있는지 없는지 진단한다. 만약 산모의 돌연변이와 아버지의 돌연변이가 동일한 homozygote (동형접합체)의 경우에는 상기한 바와 같이 아버지에게는 존재하나 산모에게는 존재하지 않는 SNP를 이용하여 태아 DNA의 비율을 구한다. 그 후 태아 DNA 비율을 바탕으로 양성 대조군과 음성 대조군을 제작한다. 양성 대조군은 태아 DNA에 돌연변이가 homozygote 형태로 있는 경우로, 산모의 genomic DNA에 태아 DNA의 비율만큼 돌연변이가 homozygote 형태로 있는 DNA를 혼합하여 제작한다. 음성 대조군은 태아 DNA에 돌연변이가 heterozygote 형태로 있는 경우로 산모의 genomic DNA에 태아 DNA의 비율만큼 돌연변이가 heterozygote 형태로 있는 DNA를 혼합하여 제작한다. 그 후 양성 대조군과 음성 대조군에서 해당 돌연변이 DNA의 비율을 측정합니다. 그리고 산모의 혈장에서 돌연변이 DNA의 비율을 측정한다. 양성 대조군, 음성 대조군, 산모의 혈장에 해당하는 샘플 여러 개에서 돌연변이 DNA의 비율을 측정한 후, 상기 한 바와 같이 discriminant analysis를 시행하여 태아 DNA에 돌연변이가 있는지 없는지 진단한다.
상기 과정은 도 2에 상세하게 나타내었다.
모든 과정은 서울대학교병원(IRBY-H-0905-041-281) 및 분당서울대학교병원(IRB-B-1007-105-402 및 IRB-B-1508-312-304)의 IRB(Institutional reveiw boards)의 승인을 받아 진행하였다. 모든 피실험자로부터 사전동의서를 받았고, 도 2에 나타낸 바와 같이 첫 번째 아이가 감각신경성청력손실(sensorineural healring loss)을 갖는 세 가족을 실험에 포함시켰고, 각 가족의 첫 번째 아이의 원인 유전자는 다음과 같다; 제1 가족: SLC26A4 c.1529T>A (p.V510D) / c.2168A>G (p.H723R), 제2 가족: GJB2 c.508_511dupAACG (p.A171EfsX40) / c.257C>G (p.T86R), 제3 가족: GJB2 c.299_300delAT (p.H100Rfs*14) / c.123G>A (p.G45E), 제4 가족: GJB2 c.235delC homozygote. 원인 돌연변이는 아버지, 어머니 및 첫 번째 아이의 gDNA(genomic DNA)를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)하여 최종 컨펌하여 확인하였다. 원인 돌연변이 중 하나는 어머니로부터 물려받은 것이고, 다른 하나는 아버지로부터 물려받은 것이다.
1. 혈장 DNA 추출 과정 및
gDNA(genomic DNA)의
제조
혈액 시료를 임신 초기(first trimester) 또는 임신 중기(second trimester)의 산모로부터 수집하였다. 혈장 DNA는 MACHEREY-NAGEL, Nucleospin plasma xs kit(Germany)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 "high sensitivity procedure"를 사용하여 추출하였다.
또한, 양성 대조군 및 음성 대조군을 제작하기 위해 부모, 및 첫 번째 아이의 혈액 시료를 수집하여 gDNA(genomic DNA)를 추출하였다. Covaris S220(Covaris, MA, USA)를 사용하여 gDNA의 단편을 제조하여 혈장 DNA와 대응되게 하였다. 150 염기쌍 길이의 단편 크기는 Bioanalyzer High Sensitivity DNA Chips(Agilent Technologies, CA, USA)를 사용하여 컨펌하였고, DNA 농도는 피코그린의 형광 어세이(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 결정하였다.
2.
피코액적
디지탈
PCR
(
Picodroplet
digital
PCR
)의 수행
피코액적 디지탈 PCR을 수행하기 위해 RainDropTM Digital PCR System(RainDance Technologies In.c, Billerica, MA, USA)를 사용하였다.
구체적으로, 예비-중합효소 연쇄 반응 환경 하에서, PCR 반응 혼합물을 1.25 μl Drop Stabilizer (RainDance Technologies), 12.5 μl TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies), DNase/RNase-free sterile water, 및 주형 DNA(혈장 DNA 최소 2 ng 또는 30 ng of gDNA 단편)와 함께, 하기 표 1의 프라이머 및 프로브와 혼합하였고, 총 반응 부피는 25 μl이었다.
| 이름 | 서열(5' to 3') | 서열번호 | Conc. Used for RainDrop(μM) |
Anneal Temp. (℃) |
| c.299_300delAT-F | GCTCCTAGTGGCCATGCA | 서열번호 1 | 0.9 | 58 |
| c.299_300delAT -R | TCACTCTTTATCTCCCCCTTGATGA | 서열번호 2 | 0.9 | |
| c.299_300delAT-WT Probe | VIC-CTCTTCTTCTCATGTCTCC-NFQ | 서열번호 3 | 0.2 | |
| c.299_300delAT-MT Probe | FAM-CCTCTTCTTCTCGTCTCC-NFQ | 서열번호 4 | 0.2 | |
| c.123G>A-F | TCGTTGTGGCTGCAAAGGA | 서열번호 5 | 0.9 | 58 |
| c.123G>A -R | CAGGGTGTTGCAGACAAAGTC | 서열번호 6 | 0.9 | |
| c.123G>A-WT Probe | VIC-CCTGCTCATCTCCCCACAC-NFQ | 서열번호 7 | 0.2 | |
| c.123G>A-MT Probe | FAM-CCTGCTCATCTTCCCACAC-NFQ | 서열번호 8 | 0.2 | |
| c.1529T>A-F | GCTGGCCTTATATTTGGACTGTTGA | 서열번호 9 | 0.9 | 62 |
| c.1529T>A -R | GGAAATCTGGGTTTTACGTTACTCACA | 서열번호 10 | 0.9 | |
| c.1529T>A-WT Probe | VIC-TGAACTCTCAGGACCACAG-NFQ | 서열번호 11 | 0.2 | |
| c.1529T>A-MT Probe | FAM-TGAACTCTCAGGTCCACAG-NFQ | 서열번호 12 | 0.2 | |
| c.2168A>G-F | CGGGTTCTTTGACGACAACATTAG | 서열번호 13 | 0.35 | 58 |
| c.2168A>G-R | CCCTCTTGAGATTTCACTTGGTTCT | 서열번호 14 | 0.35 | |
| c.2168A>G-WT Probe | VIC-TGACGGTCCATGATGCT-NFQ | 서열번호 15 | 0.2 | |
| c.2168A>G-MT Probe | FAM-TGACGGTCTGTGATGCT-NFQ | 서열번호 16 | 0.2 | |
| c235delC-F | CCATCTCCCACATCCGGC | 서열번호 17 | 0.35 | 60 |
| c235delC-R | CACGTGCATGGCCACTAG | 서열번호 18 | 0.35 | |
| c235deC-WT Probe | VIC-AGCTGCAGGGCCCAT-NFQ | 서열번호 19 | 0.2 | |
| c235delC-MT probe | FAM-ATCAGCTGCAGGCCCAT-NFQ | 서열번호 20 | 0.2 | |
| c.T366C-F | Commercial product (Thermo Fisher Scientific Inc. Assay ID: C_25592461_10 rs number: rs3802720) |
- | 0.9 | 60 |
| c.T366C-R | - | 0.9 | ||
| c.T366C-WT Probe | - | 0.2 | ||
| c.T366C-MT probe | - | 0.2 | ||
| c.508_511dupAACG-F | TCATGTACGACGGCTTCTCC | 서열번호 21 | 0.35 | 62 |
| c.508_511dupAACG-R | GGACACAAAGCAGTCCACAG | 서열번호 22 | 0.35 | |
| c.508_511dupAACG-WT probe | VIC_GAAGTGCAACGCCTGGCCTTG_NFQ | 서열번호 23 | 0.2 | |
| c.508_511dupAACG-MT probe | 6-FAM_GAAGTGCAACGAACGCCTG_NFQ | 서열번호 24 | 0.2 | |
| c.257C>G-F | GGCCCTGCAGCTGATCTT | 서열번호 25 | 0.35 | 58 |
| c.257C>G-R | CGTGCATGGCCACTAGGA | 서열번호 26 | 0.35 | |
| c.257C>G-WT probe | VIC_CGCTGGCGTGGACA_NFQ | 서열번호 27 | 0.2 | |
| c.257C>G-MT probe | 6-FAM_ CGCTGGCCTGGACA_NFQ | 서열번호 28 | 0.2 |
이후에, 상기 제조된 PCR 반응 혼합물을 RainDrop® Source instrument((RainDance Technologies In.c, Billerica, MA, USA)에 적재하였고, 제조사의 지시에 따라 PCR 반응 혼합물을 유화(emulsify)시켰다. 25 μl의 PCR 반응 혼합물을 5 pl 액적 부피로 유화 시켰고, 단일 분자의 DNA를 약 5백만개의 액적에 분배하였다. 유화 후에, PCR 반응 혼합물을 C1000의 웰에 두고 하기 표 2에 제시된 제조사의 지시에 따라 증폭하였다. 이후에 시료를 RainDrop® Sense instrument((RainDance Technologies In.c, Billerica, MA, USA)에 적재하였고, 각 액적의 형광 강도를 488 nm 레이저를 사용하여 프로브에 부착되어 있는 두 개의 형광인자 (FAM 및 VIC)에 대하여 동시에 검출하였다. 모든 시료를 평가한 후에, 클러스터 플랏(cluster plots)으로부터의 데이타를 RainDrop Analyst data analysis 소프트웨어를 사용하여 제조사의 지시에 따라 보정(spectrally-compensate)하고, 분석하였다.
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 폴리머라아제 활성 | 95 ℃ | 10 분 | 1 |
| 변성 | 95 ℃ | 15 초 | 45 |
| 어닐링 & 연장 | Depending on target | 1 분 | 45 |
| 인큐베이션 | 98 ℃ | 10 분 | 1 |
| 최종 보관 | 12 ℃ | Hold |
3. 비침습적 산전 진단을 이용한 태아 유전자형 예측
첫 번째 가족의 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 첫 번째 가족에 있어서, 아버지는 SLC26A4 c.1529T>A (p.V510D) carrier이었고, 산모는 SLC26A4 c.2168A>G (p.H723R) carrier이었고, 첫 번째 아이는 SLC26A4 c.1529T>A (p.V510D) / c.2168A>G (p.H723R) compound heterozygote이었다. 산모 혈장 DNA 중 아버지 돌연변이의 평균 비율은 0.0319이었다. 따라서 산모 혈장 DNA 중 태아 DNA의 비율은 6.4%((64 x 2)/(1845 + 64) + (60 x 2)/(1921 + 60))/2)이었다. 상기 값에 기반하여 태아의 DNA에 부계 원인 돌연변이가 있을 때를 가정한 양성 대조군 시료 및 태아의 DNA에 부계 원인 돌연변이가 없을 때를 가정한 음성 대조군을 제조하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군의 아버지 돌연변이의 비율은 각각 0.0267 및 0.0015이었다. 이후에, 태아는 판별 분석에 의해 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 아버지 돌연변이를 갖는 것으로 진단되었다. 산모 혈장 DNA, 양성 대조군 및 음성 대조군 중 산모 돌연변이의 평균 비율은 각각 0.4557, 0.4939, 및 0.4685 이었다. 이후에 태아는 판별 분석에 의해 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 어머니 돌연변이를 갖지 않는 것으로 나타났다.
이후에, 상기한 바와 같이, 아버지, 어머니 및 첫 번째 아이의 gDNA(genomic DNA)를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)하여 일 구체예에 따른 산전 진단 방법의 진단이 정확한지 최종 컨펌하였다.
두 번째 가족의 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 첫 번째 가족에 있어서, 아버지는 GJB2 c.508_511dupAACG (p.A171EfsX40) carrier이었고, 산모는 GJB2 c.257C>G (p.T86R) carrier이었고, 첫 번째 아이는 GJB2 c.508_511dupAACG (p.A171EfsX40) / c.257C>G (p.T86R) compound heterozygote이었다. 산모 혈장 DNA 중 아버지 돌연변이의 평균 비율은 0.0426이었다. 따라서 산모 혈장 DNA 중 태아 DNA의 비율은 8.5% ((41 2) / (899 + 41) + (35 2) / (820 + 35)) / 2)이었다. 상기 값에 기반하여 태아의 DNA에 부계 원인 돌연변이가 있을 때를 가정한 양성 대조군 시료 및 태아의 DNA에 부계 원인 돌연변이가 없을 때를 가정한 음성 대조군을 제조하였다. 양성 대조군 및 음성 대조군의 아버지 돌연변이의 비율은 각각 0.0490 및 0.0000이었다. 이후에, 태아는 판별 분석에 의해 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 아버지 돌연변이를 갖는 것으로 진단되었다. 산모 혈장 DNA, 양성 대조군 및 음성 대조군 중 산모 돌연변이의 평균 비율은 각각 0.4662, 0.5070 및 0.4655 이었다. 이후에 태아는 판별 분석에 의해 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 어머니 돌연변이를 갖지 않는 것으로 나타났다.
이후에, 상기한 바와 같이, 아버지, 어머니 및 첫 번째 아이의 gDNA(genomic DNA)를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)하여 일 구체예에 따른 산전 진단 방법의 진단이 정확한지 최종 컨펌하였다.
따라서, 일 구체예에 따른 비침습적 산전 진단 방법은 말초혈을 이용하기 때문에 태아와 산모에게 가해지는 위험성은 전혀 없으면서도, 임신 초기에 태아의 상염색체 열성 질환을 비침습적으로 정확하게 진단할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다.
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disease using picodrolet digital PCR and kit therefor
<130> PN115140
<160> 28
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.299_300delAT-F
<400> 1
gctcctagtg gccatgca 18
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.299_300delAT -R
<400> 2
tcactcttta tctccccctt gatga 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.299_300delAT-WT Probe
<400> 3
ctcttcttct catgtctcc 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.299_300delAT-MT Probe
<400> 4
cctcttcttc tcgtctcc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.123G>A-Forward primer
<400> 5
tcgttgtggc tgcaaagga 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.123G>A -Reverse primer
<400> 6
cagggtgttg cagacaaagt c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.123G>A-WT Probe
<400> 7
cctgctcatc tccccacac 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.123G>A-MT Probe
<400> 8
cctgctcatc ttcccacac 19
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.1529T>A-Forward primer
<400> 9
gctggcctta tatttggact gttga 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.1529T>A -Reverse primer
<400> 10
ggaaatctgg gttttacgtt actcaca 27
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.1529T>A-WT Probe
<400> 11
tgaactctca ggaccacag 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.1529T>A-MT Probe
<400> 12
tgaactctca ggtccacag 19
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.2168A>G-Forward primer
<400> 13
cgggttcttt gacgacaaca ttag 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.2168A>G-Reverse primer
<400> 14
ccctcttgag atttcacttg gttct 25
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.2168A>G-WT Probe
<400> 15
tgacggtcca tgatgct 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.2168A>G-MT Probe
<400> 16
tgacggtctg tgatgct 17
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c235delC-Forward primer
<400> 17
ccatctccca catccggc 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c235delC-Reverse primer
<400> 18
cacgtgcatg gccactag 18
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c235deC-WT Probe
<400> 19
agctgcaggg cccat 15
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c235delC-MT probe
<400> 20
atcagctgca ggcccat 17
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.508_511dupAACG-Forward primer
<400> 21
tcatgtacga cggcttctcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.508_511dupAACG-Reverse primer
<400> 22
ggacacaaag cagtccacag 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.508_511dupAACG-WT probe
<400> 23
gaagtgcaac gcctggcctt g 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.508_511dupAACG-MT probe
<400> 24
gaagtgcaac gaacgcctg 19
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.257C>G-Forward primer
<400> 25
ggccctgcag ctgatctt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.257C>G-Reverse primer
<400> 26
cgtgcatggc cactagga 18
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.257C>G-WT probe
<400> 27
cgctggcgtg gaca 14
<210> 28
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> c.257C>G-MT probe
<400> 28
cgctggcctg gaca 14
Claims (14)
- 산모로부터 혈장 DNA를 분리하는 단계; 및
상기 혈장 DNA에 대해 피코액적 디지탈 PCR(picodroplet digital PCR)을 수행하여 태아가 부계 및 모계의 상염색체 열성질환 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 검출하는 단계는,
상기 혈장 DNA 중 부계 및 모계 돌연변이의 비율을 결정하는 단계;
상기 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%를 결정하는 단계;
상기 결정된 태아 DNA의 존재%에 기반하여 태아의 DNA에 부계 원인 및 모계 원인 돌연변이가 있을 때를 가정한 양성대조군 시료 및 태아의 DNA에 부계 원인 및 모계 원인 돌연변이가 없을 때를 가정한 음성 대조군을 제조하여 양성 대조군 및 음성 대조군 시료 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하는 단계로서, 상기 부계 원인 돌연변이에 대한 양성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 첫 번째 분만한, 원인 돌연변이를 가진 아이로부터 분리된 gDNA 또는 아버지로부터 분리된 gDNA를 포함하고,
상기 부계 원인 돌연변이에 대한 음성 대조군 시료는 부계 원인 돌연변이가 없는 임의의 사람으로부터 분리된 혈장 DNA를 포함하고,
상기 모계 원인 돌연변이에 대한 양성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 첫 번째 분만한, 원인 돌연변이를 가진 아이로부터 분리된 gDNA를 포함하고,
상기 모계 원인 돌연변이에 대한 음성 대조군 시료는 산모의 gDNA(genomic DNA) 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%만큼 모계 원인 돌연변이가 없는 임의의 사람으로부터 분리된 gDNA를 포함하는 것인 단계; 및
상기 결정된 양성 및 음성 대조군 시료의 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 상기 결정된 혈장 DNA 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율과 비교하는 단계를 포함하는 태아의 상염색체 열성질환의 비침습적 산전 진단에 관한 정보를 제공하기 위한 산모의 혈장 DNA 분석하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 검출하는 단계는,
혈장 DNA 중 부계 및 모계 원인 돌연변이의 비율을 결정하는 단계;
상기 혈장 DNA 중 부계 원인 돌연변이가 나타나는 경우, 태아는 부계 원인 돌연변이를 갖고 있다고 판정하고, 부계 원인 돌연변이가 나타나지 않는 경우, 태아는 상염색체 열성질환을 가지고 있지 않다고 판정하는 단계; 및
상기 혈장 DNA 중 모계 원인 돌연변이의 비율 및 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%에 근거하여 태아가 모계 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 비교하는 단계는 판별분석(discriminant analysis)을 수행하여 태아가 부계 원인 돌연변이를 갖는지 여부, 및 모계 원인 돌연변이를 갖는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 산모의 원인 돌연변이와 아버지의 원인 돌연변이가 동일한 동형접합체(homozygote)인 경우, 상기 혈장 DNA 중 태아 DNA의 존재%를 결정하는 단계는 혈장 DNA 중 아버지에게는 존재하나 산모에게는 존재하지 않는 임의의 단일염기다형성(SNP)을 이용하여 결정하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 피코액적 디지탈 PCR의 수행은,
상기 (1) 혈장 DNA, (2) 상염색체 열성 질환의 단일염기다형성(SNP)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브, (3) 정상(wild type)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 프로브 및 (4) 상기 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 제조하는 단계;
상기 PCR 반응 혼합물을 액적에 유화(emulsify)시키는 단계; 및
상기 액적을 웰에 넣고 PCR 반응을 수행하고 형광을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 청구항 7에 있어서, 상기 액적은 2 내지 10 pl(picoliter)의 부피를 갖는 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 단일염기다형성을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24, 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이고, 상기 정상(wild type)을 검출하기 위한 프로브는 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 원인 돌연변이는 단일염기다형성인 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 단일염기다형성은 SLC26A4 c.1529T>A (p.V510D), SLC26A4 c.2168A>G (p.H723R), GJB2 c.508_511dupAACG (p.A171EfsX40), GJB2 c.257C>G (p.T86R), GJB2 c.299_300delAT (p.H100Rfs*14), GJB2 c.123G>A (p.G45E), 및 GJB2 c.235delC로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상염색체 열성 질환은 감각신경성청력손실(sensorineural hearling loss), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 겸상적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 백색증(albinism), 색소성건피증(xeroderma pigmentosum), 윌슨병(Wilson's disease), 후를러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie syndrome), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 전형적 혈색소 침착증(Haemochromatosis type 1), 및 기텔만 증후군(Gitelman syndrome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- (1) 혈장 DNA 중 상염색체 열성 질환의 단일염기다형성(SNP)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 서열번호 4, 8, 12, 16, 20, 24 및 28로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브, (2) 혈장 DNA 중 정상(wild type)을 검출하기 위한, 형광모이어티가 부착된 서열번호 3, 7, 11, 15, 19, 23 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브 및 (3) 상기 혈장 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는, 피코액적 디지탈 PCR에 의한 상염색체 열성 질환의 비침습적 산전 진단에 사용하기 위한 키트.
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Non-Patent Citations (2)
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