CN115927593A - 一种检测低比例嵌合变异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测低比例嵌合变异的方法，包括以下步骤：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。本发明还公开了一种检测低比例嵌合变异的反应体系及其在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。本发明方法具有富集放大突变序列的作用，能检测低至0.1％的嵌合变异，灵敏度大为提高，在临床诊断嵌合变异的病例中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种检测低比例嵌合变异的方法。
背景技术
嵌合现象是指从单一受精卵发育而成的同一个体细胞有不同的遗传组成的现象，嵌合现象既可发生在染色体层面，也可发生在基因水平，而且其分布有多种模式，包括全身分布，局限在某个组织的分布。嵌合变异可存在于体细胞和/或生殖细胞，当嵌合变异仅发生在生殖细胞时，父母一般无症状，但会产生具有疾病状态的子代。这给临床生殖遗传的诊断增加了难度和挑战。因为，如果嵌合变异存在于父亲的精子或母亲的卵子中，经过血液检测根本无法发现基因突变的异常，只有对生殖细胞进行基因检测，才能找到致病的嵌合变异。然而，生殖细胞数量少，嵌合变异的比例又极低，要检测出生殖细胞中的嵌合变异对于基因检测技术要求非常高。
目前，对嵌合疾病的常用检测技术手段有细胞遗传学分析、微阵列芯片技术、二代测序技术等，但这些检测技术对嵌合变异的检测灵敏度还不够高，尤其是对低比例的嵌合变异就更难捕捉检测到。
发明内容
本发明要解决目前用于低比例嵌合变异的检测方法灵敏度不高的技术问题，提供一种检测低比例嵌合变异的方法，该方法能检测低至0.1％的嵌合变异，灵敏度大为提高。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种检测低比例嵌合变异的方法，包括以下步骤：
针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；
将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。
在针对低比例嵌合变异的SNP位点设计引物和抑制探针之前，还可包括步骤：
对微量细胞进行基因组核酸扩增；
对所述扩增产物进行全基因组建库；
用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；
将杂交捕获的文库进行深度测序，以捕捉到低比例基因嵌合变异。
所述微量细胞包括一个或若干个细胞。
所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测低比例嵌合变异的的反应体系，所述反应体系包括：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
所述检测体系还包括聚合酶和基因组DNA，所述检测体系为PCR扩增反应体系。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测低比例嵌合变异的试剂盒，包含针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
在本发明的另一方面，还提供了上述反应体系在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备胚胎植入前单基因遗传病诊断产品中的应用。
本发明检测低比例嵌合变异的方法，具有富集放大突变序列的作用，灵敏度高、特异性强，在临床诊断嵌合变异的病例中具有很好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的部分SNP位点经BDA扩增后LOD检测结果图；
图2是本发明实施例2两例精液样本呈现嵌合可能性的具体信息图；
图3是本发明实施例2利用BDA技术对精子嵌合变异的验证结果图。
具体实施方式
实施例1证明抑制探针置换扩增(Blocker Displacement Amplification，BDA)技术在不同位点中和不同比例浓度范围内的普适性
1候选标准品样本的筛选(生物信息学分析)
1.1筛选合适的标准品来源样本：对14例志愿者样本(编号缩写LJF,YHX,YYX,CLL,GX,ZW,BW,TR,LSS,WJP,LRQ,XX,CMM,DBH)进行WES(人类全外显子捕获测序)测序并分析外显子区域的SNP的分型。
实验结果：分析这14例测序数据中外显子区域的SNP分型并进行比较，最后筛选出一对配对样本(LJF，CMM)用于后续的标准品制备。这组配对样本中找到320个SNP位点可以用于后续的BDA设计，这320个SNP位点在LJF样本中均为和基因组REF基因型相同的纯合SNP分型，在CMM样本中均为和基因组ALT基因型相同的纯合SNP分型。320个SNP位点可见表1。
表1 320个SNP位点
1.2分析内控样本WES数据中的外显子区域SNP位点信息，从中找出1000个杂合的SNP位点。
实验结果：分析内控样本LJF的WES数据中外显子区域的SNP分型信息，共找到1247个AF＝0.4-0.6的杂合SNP位点。1247个SNP位点可见表2。
表2 1247个杂合SNP位点
2.标准品的制备
2.1标准品样本DNA的提取
根据WES数据的分析结果，选取LJF和CMM配对样本用于后续标准品的制备，其中LJF作为野生型DNA样本，CMM作为突变型DNA样本。采集LJF和CMM的外周血各10mL用于基因组DNA的提取，血液基因组DNA提取的方法包括如下步骤：
1)取200μL血液样本到2.0mL的离心管中，若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足至200μL，再进行下一步实验。
2)加入200μL Buffer GB和20μL Proteinase K溶液至上述样品中，充分振荡混匀。
3)56℃孵育10min，期间颠倒混匀数次，溶液中应无团块，若有需要可延长裂解时间至溶液无团块为止。
4)室温放置2-5min后加入350μL Buffer BD，充分颠倒混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
5)将所有液体转移到CG2离心柱中(离心柱放入收集管中)，12000rpm(～12400×g)离心30sec，弃废液和收集管，将离心柱套入一个新的收集管。
6)加入500μL Buffer GDB，12000rpm(～12400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。
7)加入600μL Buffer PWB，12000rpm(～12400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。
8)重复上一步骤。
9)12000rpm(～12400×g)离心2min，弃收集管，将离心柱转入一个新的1.5mL离心管中，开盖室温放置约5min，彻底风干吸附膜上残余的缓冲液。
10)向离心柱的吸附膜中央悬空加入30μL NFW，室温放置2min后，12000rpm(～12400×g)离心2min，将洗脱液收集到离心管中。
11)重复上一步骤，离心结束弃柱。
12)琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用NanoDrop和Qubit分别测定DNA纯度与浓度。
2.2标准品样本DNA的定量和稀释
用Qubit分别对提取完的LJF基因组DNA和CMM基因组DNA进行浓度测定，并用DNA稀释液稀释至10ng/μL。
2.3不同浓度梯度标准品的制备
2.3.1取10ng/μL的LJF基因组DNA 900μL和10ng/μL的CMM基因组DNA 100μL进行混合，涡旋混匀，制备得到10ng/μL，AF＝10％的标准品DNA。
2.3.2取10ng/μL的AF＝10％的标准品DNA 900μL和10ng/μL的CMM基因组DNA 100μL进行混合，涡旋混匀，制备得到10ng/μL，AF＝1％的标准品DNA。
2.3.3取10ng/μL的AF＝1％的标准品DNA 500μL和10ng/μL的CMM基因组DNA 500μL进行混合，涡旋混匀，制备得到10ng/μL，AF＝0.5％的标准品DNA。
2.3.4取10ng/μL的AF＝0.5％的标准品DNA 500μL和10ng/μL的CMM基因组DNA 500μL进行混合，涡旋混匀，制备得到10ng/μL，AF＝0.25％的标准品DNA。
2.3.5取10ng/μL的AF＝0.25％的标准品DNA 500μL和10ng/μL的CMM基因组DNA500μL进行混合，涡旋混匀，制备得到10ng/μL，AF＝0.125％的标准品DNA。
3.研究抑制探针置换扩增(BDA)技术在不同SNP位点中的LOD(Limit ofdetection,检测限)
3.1订购杂交捕获探针
从纳昂达(南京)生物科技有限公司订购杂交捕获探针：捕获探针靶向包括以上标准品制备过程提及的320个纯合SNP位点和1247个杂合SNP位点，探针包信息见下述表3。
表3探针所覆盖的基因组位置信息
3.2 BDA-sanger技术对标准品样本中SNP的检测
3.2.1从320个纯合SNP位点中随机选择了117个SNP位点进行BDA设计：每个SNP设计1对引物和1种Blocker，351条oligo见下表4和表5。BDA引物和Blocker由阅尔基因公司的NGSure软件自动化设计。
表4针对117个SNP位点设计的BDA引物
表5针对117个SNP位点设计的BDA的Blocker(抑制探针)
3.2.2测试这117对BDA设计的效果：用117对BDA引物和Blocker对10ng/μL的AF＝1％的标准品DNA进行扩增，每对BDA引物和Blocker使用3个blocker浓度梯度(引物：blocker＝1:3,1:10,1:30)。将BDA扩增产物进行Sanger测序，判断待测SNP位点在Sanger中的AF。3个blocker浓度梯度的sanger结果中任意1个sanger结果中待测SNP位点的AF≥20％，则认为BDA富集成功。反之，则BDA富集失败。BDA PCR体系和扩增程序如下：聚合酶(Thermo Fisher PowerUp SYBR Green Master Mix)；引物浓度：正向引物400nM(1x)，反向引物400nM(1x)，BDA抑制探针(Blocker):1.2uM(1:3)、4uM(1:10)、12uM(1：30)；30uL反应体系加30ng基因组DNA，当处理等位基因频率很低的样本时，需要增加加入DNA的总量，以确保至少有20个等位基因分子的拷贝；扩增程序包括步骤0：95℃3min，步骤1：95℃30s，步骤2：60℃1min，步骤3：重复步骤1到步骤2，40次，步骤4：4℃。结果：117对BDA设计中91对BDA富集成功，成功率为77.78％。
3.2.3对第一次BDA设计未成功的SNP位点进行第二次BDA设计并测试，再对第二次BDA设计未成功的SNP位点进行第三次BDA设计并测试，以此类推，针对单个SNP位点最多进行五次BDA设计和测试。若五次BDA设计均未成功，则停止设计，判断此位点设计失败。结果如下：12个SNP位点在第二次BDA设计时富集成功，成功率为10.26％；9个SNP位点在第三次BDA设计时富集成功，成功率为7.69％；3个SNP位点在第四次BDA设计时富集成功，成功率为2.56％；1个SNP位点在第五次BDA设计时富集成功，成功率为0.85％；1个SNP位点尝试了五次BDA设计均未富集成功，失败率为0.85％。
综上，117个SNP位点进行BDA设计的成功率如下表6所示：
表6不同引物对BDA设计成功率
| 引物对数 | 位点数量 | 比例 | 成功比例 |
| 1 | 91 | 77.78％ | 77.78％ |
| 2 | 12 | 10.26％ | 88.03％ |
| 3 | 9 | 7.69％ | 95.72％ |
| 4 | 3 | 2.56％ | 98.29％ |
| 5 | 1 | 0.85％ | 99.14％ |
结论：针对单个SNP进行3对BDA引物设计可以提高成功率至95％以上。
3.3研究不同SNP位点的LOD
3.3.1针对以上BDA设计成功的116个SNP位点，用设计成功的BDA引物和Blocker以及对应的Blocker浓度针对不同浓度的标准品(AF＝1％，0.5％，0.25％，0.125％)进行BDA扩增，将BDA扩增产物进行Sanger测序，判断待测SNP位点在Sanger中的AF。每个浓度的标准品进行4个重复测试。每个浓度梯度的标准品的4个重复的sanger结果中待测SNP位点的AF全部≥20％，则认为该位点的BDA反应的LOD可达此浓度。
3.3.2结果：116个BDA设计成功的SNP位点中，有88个位点的LOD为0.125％，比例为75.86％；有14个位点的LOD为0.25％，比例为12.07％；有5个位点的LOD为0.50％，比例为4.31％；有9个位点的LOD为1％，比例为7.76％。117个SNP位点的BDA的LOD如表7所示，图1所示为部分SNP位点BDA扩增的LOD检测结果图，表8为117个SNP位点进行BDA设计的统计结果。
表7 117个SNP位点的BDA的LOD
表8 117个SNP位点进行BDA设计的统计结果
实施例2利用BDA技术对精子嵌合案例的验证
两例精液样本，临床结果发现在Chr1:149927731delA和Chr9:2039663C>G位置发生突变，呈现嵌合可能性，具体信息如图2所示。
针对该两例精液样本2.88％和2.5％的嵌合变异比例，利用BDA技术进行验证，其结果如图3所示。
由图3可知，利用BDA技术可灵敏地检测低比例的嵌合变异情况。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种检测低比例嵌合变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：
针对低比例嵌合变异的SNP位点设计至少一对引物和一条抑制探针，用于进行抑制探针置换扩增反应，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠；
将抑制探针置换扩增产物进行测序，得到低比例嵌合变异的检测结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在针对低比例嵌合变异的SNP位点设计引物和抑制探针之前，还可包括步骤：
对微量细胞进行基因组核酸扩增；
对所述扩增产物进行全基因组建库；
用杂交捕获探针对构建的文库进行杂交和靶向捕获；
将杂交捕获的文库进行深度测序，以捕捉到低比例基因嵌合变异。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量细胞包括一个或若干个细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对微量细胞进行基因组核酸扩增包括：采用MDA方法对微量细胞进行基因组核酸扩增。
5.一种检测低比例嵌合变异的的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
6.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括聚合酶和基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系为PCR扩增反应体系。
8.一种检测低比例嵌合变异的试剂盒，其特征在于，包含针对低比例嵌合变异的SNP位点设计的至少一对引物和一条抑制探针，所述抑制探针的寡核苷酸链与SNP位点对应的野生型DNA序列碱基互补结合，该抑制探针在野生型DNA序列上的互补结合位置，与所述引物在该野生型DNA序列上的互补结合位置部分重叠。
9.权利要求5-7任一项所述反应体系在制备植入前胚胎遗传学检测产品中的应用。
10.权利要求8所述试剂盒在制备胚胎植入前单基因遗传病诊断产品中的应用。
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| CN111683958A (zh) * | 2018-02-20 | 2020-09-18 | 威廉马歇莱思大学 | 使用多重抑制探针置换扩增进行等位基因富集的系统和方法 |
| WO2021222798A1 (en) * | 2020-05-01 | 2021-11-04 | William Marsh Rice University | Quantitative blocker displacement amplification (qbda) sequencing for calibration-free and multiplexed variant allele frequency quantitation |
| CN114774553A (zh) * | 2022-06-01 | 2022-07-22 | 上海君远生物科技有限公司 | 一种利用高通量测序技术检测多基因位点突变的方法 |
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2022
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