KR101825497B1

KR101825497B1 - 단일염기다형성을 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측용 키트 및 이를 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측 방법

Info

Publication number: KR101825497B1
Application number: KR1020160106130A
Authority: KR
Inventors: 황춘홍; 변유정
Original assignee: (주)다우진유전자연구소
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2016-08-22
Publication date: 2018-02-05

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 DNA 유래의 16개 단일염기다형성(SNP)을 선발하여, 16개의 SBE 프라이머를 개발 및 조합하여 동시에 증폭될 수 있도록 multiplex SNP extension assay를 수행할 수 있는 말의 모계혈통 확인 및 운동능력의 예측이 가능한 키트를 제작하고, 이를 이용하여, 말의 모계혈통 및 운동능력을 예측할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 발굴한 16 SNPs을 이용하여 개발된 DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A와 -B를 이용할 경우, 말의 모계혈통 확인 및 운동능력의 예측이 가능하게 되며, 궁극적으로 우수 경주마 생산 및 관리의 체계적 확립이 가능하게 된다.

Description

단일염기다형성을 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측용 키트 및 이를 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측 방법 {Kits for Detecting Equine Maternal lineage and Predicting Athletic Ability with Single Nucleotide Polymorphism and Method for Detection of Equine Maternal lineage and Prediction of Athletic Ability thereby}

본 발명은 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측용 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 미토콘드리아 DNA 유래의 16개 단일염기다형성(SNP)을 선발하여 말의 모계혈통 확인 및 운동능력의 예측이 가능한 키트를 제작하고, 이를 이용하여, 말의 모계혈통 및 운동능력을 예측할 수 있는 방법에 관한 것이다.

단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 여러 가지 DNA 마커 중 하나로서, 하나의 염색체 내 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기서열들 중 하나의 염기서열에서 나타나는 일반적인 돌연변이를 지칭한다.

인간의 지놈(genome)에서 가장 많이 발견되는 DNA 서열 변이 (sequence variation)인 SNP는 유전자의 기능을 변화시키며, 인간은 약 3백만 개의 SNP이 존재하는데, 약 500~1000 염기 당 1개의 빈도로 나타나는 것이다. SNP로 인하여 인간은 피부 및 머리카락 색깔, 성장률 등 외형적인 표현형과 질병감수성 같은 유전적 특성이 각 개인별로 각각 다르게 나타나게 된다.

인간뿐만 아니라 동물에 있어서도, SNP는 많이 연구되고 있는데, DNA 단일 염기서열변이 (Single nucleotide polymorphism, SNP)와 표현형 (phenotype, 유전자의 작용과 환경에 의해 외부로 나타나는 성질을 뜻함)의 관련성을 찾는 것이 핵심적이다. 한우의 경우, SNP와 개체의 육량 및 지방 축적도 등과의 연관 관계가 다수 보고된 바 있고, 말의 경우도, HSDB (Horse Single Nucleotide Polymorphism and Expression Database)에서는 약 340만개 이상의 SNPs를 보고하였으며, 최근 개체 내 SNP를 발굴하고, 이를 통해 형질 관련성에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

말은 인간에게 중요한 가축 중 하나로, 전 세계에서 널리 사육되고 있다. 옛날에는 인간의 식량을 위한 사냥의 대상이었으나, 그 후 군마(軍馬)나 밭갈이에 이용되었고, 최근에는 주로 경주용으로 많이 이용되고 있다.

정부의 말산업육성법 시행과 FTA 이후 축산업의 대체산업으로 말 산업에 대해 정부 및 지자체의 관심이 집중되고 있다. 경주마에 대해 자연교배만을 허용하는 국제기준에 따라, 국내에서의 경주마 생산은 지금까지 주로 더러브렛종 유래로 이루어져 왔으며, FTA 이후 축산업의 대체산업으로 말 산업이 대두되고 있다.

경주마로 알려진 더러브레드(Thoroughbred) 종은 17세기 말에서 18세기 초 사이에 중동과 북 아프리카로부터 영국으로 수입되어 만들어진 품종으로써, 체질과 체형이 모두 뛰어나고, 우수한 골격근 및 높은 유산소 능력을 가지고 있다.

오랫동안 소수의 수말에 대해서만 강력한 경주능력을 갖는 말을 선발해왔음에도 불구하고, 더러브레드의 경주능력에 대한 유전적 잠재력은 여전히 아주 높다. 하지만, 지난 몇십 년 동안 유전적 개량의 노력은 둔화되어 새로운 개량 기술에 대한 필요성이 제기되고 있는 실정이다.

더러브렛종의 탁월한 유전적 영향력을 이용하기 위해서는 우수한 암수 마의 선대에 대한 지식이 필요하며, 경주마 생산자는 우수한 혈통들의 유전자 요소들을 강화시키고 개량하여, 최상급의 스피드 또는 스태미나에 필수적인 유전자형을 유전할 수 있는 우수한 씨수말과 씨암말에 대한 지식을 확보하는 것이 필요하다. 이러한 지식을 바탕으로 유전자 정보를 확인하여 어떤 자마가 부모마로부터 가장 우수한 유전자를 물려받았는지 알 수 있어야 한다. 이를 위해서는 우수한 씨수말과 우승마를 배출한 모계혈통을 가진 씨암말의 과학적인 선택기준이 필요한 것이다.

최근 분자유전학적 기술의 발달로 유전적 마커 (marker)를 이용하여 표현형 (양적·질적 형질)에 미치는 영향을 탐구하자고 하는 노력이 많이 이루어지고 있는데, SNP를 이용하여 우수한 표현형을 보이는 경주마의 인위선발이 가능할 것이다. 경주마에 있어서, 경기력이 좌우되는 운동수행능력이 표현형으로써 특히 중요한데, 운동수행능력과 관련이 있는 SNP를 찾아낸다면 경주능력 관련유전자형을 밝힐 수 있을 것이다. 다만, 현재까지 미토콘드리아 DNA 분석을 통하여, 우수한 경주마 생산을 위한 씨암말의 모계혈통정립이 가능하고 운동능력과 연관성 있는 SNP marker 개발을 통해, 경주마의 우수한 모계혈통 정립과 운동능력의 연관성을 예측할 수 있는 제품의 개발이 전무한 상태이다. 더러브렛종 말의 혈통 등록은 초봄에 집중되어 단시일 내에 많은 검사를 수행해야 하므로, 신속하고 정확하며 경제적인 방법으로, 단순하고 시간이 절약될 수 있는 marker가 좋을 것으로 알려져 있다.

근래에 들어 국내 말 생산 산업의 괄목한 만한 성장으로 인해, 생산 및 사육농가의 증가, 경주마의 생산두수 증가, 인기 있는 씨수말과의 교배 집중화, 혈통과 유전형질이 뛰어난 외국산 씨수말 및 씨암말의 구입 등 경마의 국제화에 따른 말의 국제간 이동 증가, 목장 내 생산마의 친자감정을 둘러싼 분쟁 등 종래에 비해서 말의 개체식별이나 친자감정의 중요성이 대두됨에 따라 신속하고 정확하며 경제적인 감정방법을 요구하고 있다.

SNP 마커는 기존의 분자마커들에 비해 보다 조밀하고 안정된 유전자 지도를 만들 수 있으며, 탐색에서 분석에 이르는 전 과정을 고속으로 자동화시킬 수 있는 장점이 있기 때문에 유전적 특이성 및 계통분류에서 가장 유용한 마커로 활용되고 있다. 또한, 우수한 씨수말과 교배 집중화와 혈통 및 유전형질이 뛰어난 외국산 씨수말과 씨암말의 구입이 증가함에 따라, 우수한 경주마 생산과 생산기술의 중요성이 대두되고 있기 때문에, 단시일 내에 대량분석이 가능하고, 경제적이며, 검사방법이 단순하고, 신속한 분석이 가능한 SNP 마커는 널리 활용될 수 있을 것이다.

한편, 기존의 우수한 경주마생산을 위한 씨암말의 선택기준은 출산한 자마의 우수한 경주성적을 근거로 추정하는 간접적 사후적인 방법으로 시행되어 왔다. 우수한 경주마의 지속적인 생산을 위해서는 유전적으로 뛰어난 모계 혈통 확립이 매우 중요하지만 아직까지 경주마의 모계혈통 확립과 운동능력을 예측하는 표준화된 검사방법 및 상용화된 제품이 없어 모계혈통 확인과 운동능력 예측이 어려운 실정이다.

현재 경주마의 경주 능력에 관한 연구결과 경주능력의 유전력은 약 30%정도이고 유전력 이외에도 수없이 많은 환경적 요인들이 상호 작용한다고 알려져 있다. 유전적 요인은 세대를 거쳐 전달되어 누적되지만, 환경적 요인은 해당 말의 사망과 동시에 종료된다. 따라서, 우수 경주마의 생산을 위해서는 유전적으로 뛰어난 모계혈통 확립이 매우 중요한 것이다.

그런데, 모계혈통을 분석할 수 있는 미토콘드리아 DNA에 관한 연구는 현재 매우 저조하며, 관련 제품이 상용화되지 않아 관련 제품의 개발이 절실하다. 다만, 최근 들어 모계로 유전되는 미토콘드리아 DNA가 운동능력과 관련성이 있다는 연구결과가 발표됨에 따라, 모계혈통 분석을 위한 검사방법 및 기술개발의 수요가 증가하고 있다.

미토콘드리아 DNA (mtDNA)는 약 16 kb 크기의 원형 DNA로서, 세포질 속에 존재하는데, 모계를 통해서 유전되는 특징이 있다. 일반적인 미토콘드리아 DNA 연구는 집단 내에서 높은 변이율을 보이는 약 1.1kb 길이의 조절영역 염기서열을 분석대상으로 하여 말의 품종 간 유전적 다형성 분석 연구가 수행되고 있다. 하지만, 미토콘드리아의 DNA 분석을 통해 경주마의 우수한 모계혈통의 정립과 운동능력의 연관성을 예측할 수 있는 마커의 개발은 전무한 상태이다.

미토콘드리아는 세포호흡과 관련하여 에너지 공급에 매우 중요한 ATP를 생성하고, 근육세포에 많이 존재하기 때문에, 경주마의 스피드와 지구력은 미토콘드리아 DNA와 연관성이 매우 높을 것으로 예측된다. 따라서, 모계 유전되는 미토콘드리아 DNA의 연구 및 모계혈연확인과 운동능력 예측이 가능한 SNP의 발굴은 우수한 경주마 생산을 위해 매우 필요하고 중요하다.

대한민국 특허공개번호 제10-2016-0065233호 (공개일자 2016.06.09)에는, "말 유전자 타이핑용 프라이머 세트"가 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2015-0078620호 (공개일자 2015.07.08)에는, "경주능력 관련 SNPs로 구축된 회귀모형을 이용한 경주마 유전체 육종가의 예측방법 및 이를 이용한 우수한 경주마 선발방법"이 기재되어 있다.

말의 개체식별과 친자감별을 위해 genomic DNA상의 MS marker를 사용한 DNA 분석키트를 외국회사에서 제조, 판매, 상용화하여 말의 혈통등록에 활용하고 있다. 또한, 말의 모계 혈통분석을 위한 미토콘드리아 DNA 분석은 Sanger sequencing 염기서열 분석방법에 의해 SNP를 확인하는 방법으로 수행되고 있다. 하지만, 분석방법의 번거로움과 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 존재한다.

현재 경주마의 우수한 모계혈통의 정립과 운동능력의 연관성을 예측할 수 있는 마커의 개발이 전무한 상태이므로, 미토콘드리아 DNA 분석을 통해 우수한 경주마 생산을 위한 씨암말의 모계혈통정립 및 운동능력과 연관성을 보여줄 수 있는 SNP 마커의 개발이 필요하다.

기존의 미토콘드리아 DNA의 SNP분석에는 Sanger sequencing 염기서열분석 방법이 주로 사용되었으나, 이 분석법은 주의가 요구되는 기술로 분석에 많은 시간과 비용이 소요되며, 분석방법에 번거로움이 있어, 동시에 대량의 시료 분석에 어려움이 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명에서는 대량의 경주마 시료를 다수의 SNP를 동시에 신속 정확하게 분석 가능하도록 single base extention (SBE) 방법을 이용하여 모계혈연관계 확인 및 운동능력 예측이 가능한 SNP 다중증폭 SBE 프라이머의 조합기술을 개발하고자 하였다.

즉, 본 발명에서는, 말의 집단으로부터 mtDNA control region 염기서열을 조사하여 말의 mtDNA 데이터베이스를 구축하고, 유전통계학적인 방법을 이용하여 말의 모계집단 구조, 소집단 분화, 동질성 여부를 분석하며, mtDNA 하플로그룹 기반 염기서열 분석 및 통계학적 검증을 통해 표준화된 실험기법을 제시함으로써 말의 모계기원을 이해하고 말의 운동능력평가에 필요한 생물학적 데이터베이스 및 분석 키트를 개발하고자 하였다.

결국, 본 발명에서는 경주마의 미토콘드리아 DNA 분석을 통하여, 우수한 모계혈통의 정립과 운동능력과의 연관성을 예측할 수 있는 16개의 SNP 마커로 구성된 다중증폭 SBE(Single base extention) 프라이머의 조합기술의 개발을 통해 모계혈연관계 또는 운동능력 예측 키트를 개발하여 표준화된 과학적인 분석방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 이용하여, 미토콘드리아 DNA에 대해 PCR을 수행한 후, PCR 산물을 분석하여, 말 미토콘드리아 DNA의 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드 중 선택되는 어느 하나 이상의 단일염기다형성을 분석함으로써 말 형질을 분석할 수 있다. 말 형질의 예로는 경주용 말의 경우, 잘 달리는 말과 잘 못 달리는 말의 형질 및 모계혈연관계를 본 발명의 단일염기다형성으로 분석(분류)할 수 있는 것이다.

한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석용 진단키트를 제공한다. 상기 본 발명의 말 형질 분석용 진단키트는, 일 예로 PCR(polymerase chain reaction) 키트일 수 있다. 본 발명의 진단키트는 서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 포함하는 프라이머 세트를 차별성 있는 구성으로 포함하고 있는 것으로, 본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트 외에 PCR을 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 각종 시약, 각종 버퍼 및 각종 효소를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명은 말 미토콘드리아 DNA의 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계 (a); 및, 상기 증폭산물에서, 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드 중 선택되는 어느 하나 이상의 단일염기다형성을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석 방법을 제공한다. 본 발명의 말 형질 분석 방법은 상기의 단계 (a) 및 (b) 외에, 필요하다면, 단일염기다형성 분석에 사용되는 공지의 기술을 추가로 덧붙여 사용할 수 있다.

한편, 상기 말 형질 분석 방법은, 바람직하게, 상기 단계 (b) 후, 개체별 유전자형에 따른 표현형을 분석하는 단계 (c);를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 단계를 통해 표현형과 유전자형을 연관시킬 수 있어, 우수한 표현형 (형질)을 갖는 말 개체를 유전자 차원에 분석이 가능하다.

한편, 상기 말 형질 분석 방법은, 더욱 바람직하게 상기 단계 (c) 후, 개체별 유전자형에 따른 표현형을 분석하고, 잘 달리는 말과 잘 못 달리는 말의 유전자형을 구분해 내는 단계 (d);를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 예로, 경주용 말의 경우 단계 (d)를 수행함으로써, 잘 달리는 말과 잘 못 달리는 말을 유전자형으로 미리 구별할 수 있어, 경주마의 체계적인 교배 및 육종에 효과적으로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은, 말 미토콘드리아 DNA의 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계 (a); 상기 증폭산물에서, 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드 중 선택되는 어느 하나 이상의 단일염기다형성을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계 (b); 및, 상기 유전자형 결정 후, 각 개체별 유전자형이 동일한 개체들을 모계혈연관계가 성립하는 것으로 판정하는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 모계혈연관계 분석 방법을 제공한다. 본 발명의 말 모계 관계 분석 방법은 상기의 단계 (a) 및 (b) 외에, 필요하다면, 단일염기다형성 분석에 사용되는 공지의 기술을 추가로 덧붙여 사용할 수 있다.

본 발명에서 발굴한 미토콘드리아 DNA의 SNP를 이용할 경우, 말의 모계혈통 확인 및 운동능력의 예측이 가능하게 되며, 궁극적으로 우수 경주마 생산 및 관리의 체계적 확립이 가능하게 된다.

또한, 본 발명의 방법을 사용할 경우, 분석시간이 단축되고, 민감도가 증가하며, 한 번의 분석으로 16개의 유전자 마커 분석이 가능한 장점이 있다. 또한, 우수마 맞춤형으로 우수 종마의 전 생애주기 관리가 가능한 장점이 있다.

말 산업분야는 최근 말 산업 육성법이 국회를 통과하는 등 산업적 성장가치가 매우 크고 비약적 발전이 기대되는 사업분야이다. 여러 지자체에서도 말 생산이나 승마의 보급 등 지역경제 활성화를 위한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 따라서, 향후 마사회는 물론 지역 단위의 말 산업 등에 적극 적용하여 모계혈통확인 및 운동 능력 예측에 의한 육종체계의 발전 및 말에 관한 여러 연구 분야에 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 개발된 키트를 사용하여 1) 우수 경주마 생산 수율 향상, 2) 경주마의 전 주기의 사전적 관리 가능 및 시스템관리 효율성 증대, 3) 수입대체효과, 4) 수출증대효과, 5) 정부 말산업 육성 5개년 종합계획 정책의 부합, 6) 양질의 가축관리 기술에 접목, 7) 과학적이고 표준화된 검사방법을 제시, 8) 우수한 씨암말의 생산 및 질적 향상 등 말산업 발전에 크게 기여할 것으로 예상된다.

한편, 한국마사회는 씨수말과 씨암말을 한 해 150~200마리를 수입하고, 경주마 생산촉진을 위한 농가의 교배 지원체계 구축 및 지원을 위해 2009년 이후 우수 씨수말을 해외에서 마리당 약 30억 원 이상의 고가로 수입하여 총 168억 원 이상의 비용을 소요하고 있는 실정이다. 그런데, 본 발명을 이용할 경우, 우수한 모계혈통과 운동능력을 가진 말들의 검증이 가능하게 되어, 해당 씨암말을 확인할 수 있으므로, 씨암말의 수입비용을 절반 이상 대체할 수 있게 되는 효과가 발휘된다.

도 1은 본 발명에 따른 SNPs을 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법에서 추출된 DNA로부터 말의 모계혈통 분석범위가 가능한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 SNPs을 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법에서 하플로그룹(haplogroups), 즉 8개의 하플로그룹을 나타낸 도면이다.
도 3은 SNPs을 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법에서 말의 모계혈통확인 및 운동 능력 예측 가능한 16 SNPs 선별한 좌위 위치를 나타낸다.
도 4는 SNPs을 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법에서 8개 하플로그룹을 구분하고 운동능력 예측 가능한 16 SNPs에 대한 SBE (Single Base Extension) 프라이머 설계를 한 후 16개 각각의 SNP genotyping를 수행하여 genetic analyzer 분석을 통해 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 16 SNPs에 대한 16개의 SBE 프라이머를 조합하여 한번에 동시에 증폭될 수 있도록 multiplex SNP extension assay를 수행하여 genetic analyzer 분석을 통해 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 SNPs를 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 방법에서 8개 하플로그룹을 구분하고 운동능력 예측 가능한 16 SNPs에 대한 mtSNP extension assay를 수행한 결과이며 genetic analyzer 분석을 통해 모계혈연관계를 검증한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명에 따른 16 SNPs을 통한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법에서 SNP genotyping 산물로 genetic analyzer 분석을 통해 운동능력예측 검증한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 말의 시료로부터 DNA를 추출하고, 말의 모계혈통 분석 범위가 가능한 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 구역의 프라이머를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하고, 상기 PCR의 산물로 SNP 지노타이핑(genotyping)을 수행하며, SNP 지노타이핑(genotyping) 산물로 유전자 분석기(genetic analyzer)를 통해 유전자 분석을 수행함을 특징으로 한다.

특히, 본 발명은 경주마의 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 분석을 통해, 경주마의 모계혈통분석 및 운동능력 예측 가능한 SNPs를 발굴하여 새로운 형태의 말의 모계혈연 관계 확인 및 운동 능력 예측 가능한 키트를 제조하고, 이를 이용하여 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력을 예측할 수 있는 것이다.

미토콘드리아 DNA는 세포호흡과 관련하여 에너지 공급에 매우 중요한 ATP를 생성하는데, 특히 근육세포에 많이 존재하기 때문에 경주마의 스피드와 지구력은 세포호흡과 에너지원 생성에 관여하는 미토콘드리아 DNA와 연관성이 매우 높을 것으로 예측된다. 따라서, 우수한 우승마들은 모계로부터 우수한 유전형질을 물려받을 가능성이 높기 때문에, 우수한 경주마 생산을 위한 모계 유전되는 미토콘드리아 DNA 연구는 매우 중요하고 필요하다.

말의 모계혈통 정립을 위해서는 모계로 유전되는 특징을 가진 세포소기관인 미토콘드리아 DNA의 분석이 필요하며, 미토콘드리아 DNA (mtDNA)는 약 16 kb 크기의 원형 DNA로 세포질 속에 존재하는 모계를 통해서 유전되는 특징이 있다. 미토콘드리아 DNA는 높은 변이율을 보이는 약 1.1 kb 길이의 조절영역 (control region) 염기서열과 ATP 생성과 세포호흡 등에 관련된 유전자들을 포함하고 있는 코딩영역 (coding region)의 염기서열이 있다.

미토콘드리아 DNA는 핵 DNA보다 약 10배 정도의 높은 변이율이 나타나 종 간 또는 종 내 혈연관계를 측정할 수 있으며, 유전 질환과의 연관성을 분석하는 분자 마커 개발에 널리 활용될 수 있기 때문에 독창성이 매우 크다.

본 발명의 'SNPs을 이용한 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 진단 방법'은 먼저 모계혈통 및 운동능력 관련 SNP 마커 선별과정 및 모계혈연관계 및 운동능력 예측 키트(일명: DOW mtQuickFinder Equine Kit) 제작과정이 선행된다.

한편, 모계혈통 및 운동능력 관련 SNP 마커 선별과정은 모계혈통 및 운동능력 관련 유전자의 염기서열 분석 과정 (SNPs 확인)과, 하플로그룹(haplogroup) 분석 및 SNP 마커선정 과정(16 SNPs)을 포함한다.

또한, 본 발명의 소위 'DOW mtQuickFinder Equine Kit' 제작과정은 PCR 과정, Single-Base Extension 과정, Capilliary Electrophoresis 및 GeneScan Software data 분석 과정, DOW mtQuickFinder Equine Kit 조건 확립 과정, 및 DOW mtQuickFinder Equine Kit 검증과정을 포함한다.

이하, 본 발명에 따른 SNPs을 이용하여 말의 모계혈통 확인 및 운동 능력 예측 가능한 16개 SNP DOW mtQuickFinder Equine Kit의 제조 방법에서, 먼저 미토콘드리아 DNA 조절영역(control region)에서 염기서열 분석을 통한 SNP를 개발하는 과정을 설명하고자 한다.

운동능력이 뛰어난 경주마와 운동능력이 떨어지는 경주마 그룹에서 mtDNA 조절영역의 변이율이 높은 부분을 선택하여 시퀀싱 (sequencing)한 후, multiple sequence alignment를 할 수 있는 프로그램을 사용하여 염기서열 분석을 하여 데이터베이스 (database)를 구축하고 염기서열 변이 SNP를 선발한다.

(1) DNA 추출

말의 털 또는 혈액으로부터 DNA를 추출한다.

(2) PCR 수행

<프라이머(Primer) 디자인>

미토콘드리아 DNA control region (D-loop)의 1,192bp 중에서 hypervariable region이 포함된 nt 15,351과 nt 30 사이의 미토콘드리아 DNA의 조절영역 (control region)을 선택하여 프라이머 (primer)를 디자인하였다.

정방향 프라이머 (horse-DL-F1): 5'-TCA ATC CTC TAC TTC TCC CT-3'

역방향 프라이머 (horse-DL-R1): 5'-GCG GAT ACT TGC ATG TGT A-3'

-1X Taq PCR 버퍼 (Tris-HCL, KCl), MgCl₂, 프라이머 (F1과 R1), dNTP, Taq DNA polymerase, 95℃에서 5분간 디네이쳐레이션(denaturation) 시킨 후, 95℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분씩 총 35 사이클의 조건에서 PCR을 수행하였다.

(3) DNA 시퀀싱 (sequencing)

PCR 산물의 nt 15,351과 nt 30 사이를 시퀀싱하여 대부분의 변이율을 보이는 부위를 분석하였다.

(4) 멀티플 시퀀스 얼라인먼트 (Multiple Sequence Alignment)

말의 mtDNA 시퀀스 (GenBank Accession Number, X79547.1)를 참조로 하여, 말에 대한 염기서열을 멀티플 시퀀스 얼라인먼트를 할 수 있는 프로그램을 사용하여 분석을 하였다. 염기서열 분석을 통하여 얼라인먼트를 수행하여 mtDNA SNP (mtSNPs)를 관찰하였다.

(5) DOW mtQuickFinder Equine Kit 개발 (mtSNPs extension assay)

SBE (Single Base Extension) 방법을 활용하여 DOW mtQuickFinder Equine Kit를 구성하였다.

모계 혈통분석 및 운동능력을 예측할 수 있는 16개의 SNP 마커를 선정한 후, SNPs 확인이 가능한 SBE (Single Base Extension) 프라이머 세트 (SBE system-I과 SBE system-II), 즉 'DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A'와 'mtQuickFinder Equine primer mix-B'를 개발한 것이다. 본 발명에서 개발한 프라이머 세트는 16개 SNPs를 동시에 효과적으로 증폭할 수 있는 특징이 있다.

DOW mtQuickFinder Equine Primer-A (SBE primer Set-I)
서열번호	primer 명	sequence (5'->3')
1	QFE-1	gattcttcccctaaaagacaacaatt
2	QFE-2	tttcttgatttcttcccctaaaagacaacaattt
3	QFE-3	accctcatttgctatttcagtatcagattatacccccac
4	QFE-4	caatttaccctcatttgctatttcagtaacagattat
5	QFE-5	tttaccctcatgtgctatgtcagtaacagattatacccccac
6	QFE-6	catgcaatatcttatgaaacgcctatgtacg
7	QFE-7	aatggcctatgtacgtcgaccattaaattgtc
8	QFE-8	aatggcctatgtacgtcgaccattaaattgtct

DOW mtQuickFinder Equine Primer-B (SBE primer Set-I)
서열번호	primer 명	sequence (5'->3')
9	QFE-9	catgtacataatatcatttatcttacata
10	QFE-10	gcaatccccatccaagtcaaatcatttccagt
11	QFE-11	gcaatccccatccaagtcaaatcatttccagtcaacac
12	QFE-12	ccccatccaagtcaaatcatttccagtcaacacgcatatcac
13	QFE-13	ccccacccaagtcaaatcatttccagtcaacacgcatatcacag
14	QFE-14	cccaactaccagtcccaatcctcgctccgggcccatc
15	QFE-15	cccaactaccagtcccaatcctcgctccgggcccatccaaa
16	QFE-16	cccaatcctcgctccgggcccatccaaacgtgggggtttctacaa

PCR로부터 얻어진 각각의 PCR 증폭 산물을 정제하기 위하여 효소처리를 하여 불활성화시켰다. 정제된 증폭 산물에 SBE 프라이머 세트 (SBE system-I과 SBE system-II), 즉 'DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A'와 'mtQuickFinder Equine primer mix-B'를 사용하여 SNP genotyping를 수행한 후, 형광이 표지된 증폭산물을 유전적 분석기(genetic analyzer)에 전기영동하였다. 반응산물은 모세관 전기영동을 수행한 후, 특정한 소프트웨어, 즉 GeneMapper Software를 통해 데이터를 분석하였다.

(6) DOW mtQuickFinder Equine Kit 조건 개발 (mtSNPs extension assay 조건)

분석에 필요한 시약은 SNPs를 확인할 수 있는 DOW mtQuickFinder Equine reacation mix (형광 표지된 ddNTPs, buffer)와 SBE 프라이머 세트 (SBE system-I과 SBE system-II), 즉 DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A와 mtQuickFinder Equine primer mix-B 등으로 구성한 후 반응조건을 최적화하였다.

기존의 SNP분석을 위한 시퀀싱 분석방법에서는 10ng 이상의 시료에서 염기 서열 분석이 가능하였으나, 본 발명에 따른 DOW mtQuickFinder Equine Kit를 사용한 유전자 분석에서는 2ng 이상의 시료에도 분석이 가능하도록 반응 조건을 최적화하였다.

SNP 마커별로 증폭되는 정도에 있어서 차이가 발생할 경우, SNP 유전자형 판독이 정확하지 않을 수 있기 때문에, 피크 높이(Peak Height)의 범위가 100~4000 RFU 증폭범위 이내에 있도록 하여 안정적인 유전자형 판독 여부를 확인할 수 있도록 최적화하였다.

또한, 모계혈통 및 운동능력을 예측할 수 있는 16개 SNPs에 대한 SBE 프라이머 조합의 DOW mtQuickFinder Equine Kit 조건을 확립하고 각 SNP 마커 식별이 가능하도록 개발하였다.

(7) 유전자형 판독의 정확성 확인

경주마 분석을 한 후 DOW mtQuickFinder Equine Kit를 통하여 분석된 SNP 유전자형 결과 데이터와 Sanger sequencing 염기서열분석 방법을 이용한 미토콘드리아 DNA 조절영역(control region) 및 유전자 염기서열 분석에서 나타난 SNP가 동일한지 확인하기 위해서, 시료에서 전체 SNP 마커에 대해 정확한 유전자형 판독이 가능한지 여부를 분석하였다. 분석결과 동일한 SNP 유전자형 결과를 얻었다.

먼저, 도 1에 도시된 바와 같이, 추출된 미토콘드리아 DNA로부터 말의 모계혈통 분석범위가 가능한 프라이머 (horse-DL-F1과 horse-DL-R1)를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 구체적으로는, horse-DL-F1(정방향 프라이머 이름), 5'-TCA ATC CTC TAC TTC TCC CT -3'의 시퀀스를 가지며, 길이는 20mer이다. 또한, 다른 역방향 프라이머 이름은 horse-DL-R1이고, 5'-GCG GAT ACT TGC ATG TGT A-3'의 시퀀스를 가지며, 길이는 19 mer이었다. PCR 산물(product)의 크기는 1.6 Kb이었다.

PCR 조성은 Genomic DNA, 1 uL, Primer, F1 (5 pmole) 1 ul, Primer, R1 (5 pmole) 1 ul, dNTP (2.5.mM) 1.6 ul, 10 x buffer 2 ul, Taq 0.2 ul, DW 11.7 ul, total vol. 20 ul이었다.

위와 같은 PCR 조성을 가지고, 다음과 같은 조건, 즉 온도, 시간 및 사이클 (cycle)은 95℃ 5min (1 cycle, 즉 1회 반복), 그리고, 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 72℃ 7min은 35 cycle (즉 35회 반복), 마지막으로 72℃ 7min 1cycle (1회)의 조건으로 수행하였다.

PCR 수행 후, 도 1의 하단에 표시된 바와 같은 밴드의 PCR 증폭된 화면이 표시되었다. 말시료 SH-1~SH-30은 동일한 증폭 결과 (증폭 산물 크기가 1.6 kb)가 나타났다.

상기 과정은 PCR 증폭 과정인데, DOW mtQuickFinder Equine Kit를 만들기 위한 과정의 첫 번째 단계로서, 이후 DNA 시퀀싱 및 하플로그룹을 만드는 과정을 위한 전단계로서도 필요한 과정이다. 또한, 이 과정은 본 발명의 키트를 이용한 말들 간의 모계혈연관계 및 운동능력 예측을 확인하기 위한 과정에서도 수행될 수 있다.

이후, 미토콘드리아 DNA로부터 증폭된 PCR 산물을 이용하여 시퀀싱을 수행하고, 멀티플 시퀀스 얼라인먼트 (Multiple Sequence Alignment)를 수행할 수 있는 프로그램을 사용하여 분석하여, 기본적인 미토콘드리아 DNA의 하플로그룹 (Haplogroups)을 하플로타입 페이징 알고리즘 소프트웨어를 이용하여 8개의 haplogoup을 생성하였다 (도 2 참조).

도 2 및 도 3을 참조하면, 각각 생성된 8개의 하플로그룹을 구분 지을 수 있는 16개 SNP를 선정하여 SBE system-I과 SBE system-II으로 나눴으며, SBE (Single Base Extension)방법을 활용하여 각각 16개의 SBE primer를 선별하여 개발하였다 (표 1 및 표 2에 기재된 프라이머). 즉, 말의 모계혈통확인 및 운동 능력 예측 가능한 16 SNPs을 선별한 것이다.

본 발명에서는 133두의 말의 DNA 시퀀스를 분석하여 하플로그룹의 결과를 도출하였다. 구체적으로, DNA 추출 -> PCR 수행 (Primer 디자인 -> PCR 조건) (도 1 참조) -> DNA 시퀀싱 (sequencing) -> 멀티플 시퀀스 얼라인먼트 (multiple sequence alignment) -> 하플로그룹 (haplogoup) (도 2 참조)을 수행하여 16개의 SNPs를 결과적으로 선별하였다.

본 발명에서는 16개의 SNPs에 대한 것을 2개로 나누어 프라이머 세트 (SBE system-I과 SBE system-II 즉, DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A와 mtQuickFinder Equine primer mix-B)로 표시하였고, (도 3 참조), 각각의 SNPs는 rs15494, rs15496, rs15526, rs15534, rs15538, rs15585, rs15602, rs15603, rs15649, rs15703, rs15709, rs15718, rs15720, rs15806, rs15810, rs15827로 16개를 포함하고 있다. 16개의 SNPs로 나누다 보니 8개의 하플로그룹에서 일부 서브-하플로그룹이 나왔다. 크게 8개의 하플로그룹으로 나눌 수 있었다 (도 2).

본 발명의 도 2에서 총 8개의 하플로 그룹을 타원형으로 표시하였다. C7b 서브 하플로그룹에서 Hap4와 Hap23은 하플로타입을 의미하며, 각각의 하플로그룹에 여러 개의 하플로타입이 포함되어져 있다.

16개의 SNP는 각각 QFE-1_15494, QFE-2_15496, QFE-3_15526, QFE-4_15534, QFE-5_15538, QFE-6_15585, QFE-7_15602, 및 QFE-8_15603으로 이루어진 SBE system-I (즉 DOW mtQuickFinder Equine primer mix-A)과, QFE-9_15649, QFE-10_15703, QFE-11_15709, QFE-12_15718, QFE-13_15720, QFE-14_15806, QFE-15_15810, 및 QFE-16_15827로 이루어진 SBE system-II (즉 DOW mtQuickFinder Equine primer mix-B)를 포함한다.

이에 관한 하플로그룹은 C1~C8까지 8개 그룹으로 나뉘어져 있고, 서브 하플로그룹도 포함하고 있다. 예를 들면, C7은 C7a, C7b의 서브 하플로그룹을 포함하고 있는 것이다.

만약, 샘플 DNA 시료가 QFE-13에 반응하여 15720G를 나타내면, 하플로그룹 C1에 속하는 것으로 확인된다. 또한, 샘플 DNA 시료가 QFE-1, 2, 4, 6, 7, 8, 9에 반응하여 15494C, 15496G, 15534T, 15585A, 15602T, 15603C, 15649G를 나타내면 하플로그룹 C7b에 속하는 것으로 확인되는 것이다.

본 발명에서는 16개의 SNPs에 대한 Single base extension (SBE) 프라이머를 설계 개발하여 16개 각각의 SBE 프라이머에 대해서 SNP genotyping 산물로 genetic analyzer 분석을 통해 모계혈연관계 및 경주운동능력 예측이 가능한 SNP에 대한 각각의 피크들을 관찰하였다 (도 4 참조).

또한, 본 발명에서는 16개의 SBE 프라이머를 조합하여 한 번에 즉 동시에 증폭될 수 있도록 multiplex SNP extension assay조건을 수립하여 genetic analyzer 분석을 통해 16개의 SNPs를 동시에 관찰할 수 있도록 개발하였다. 각각의 피크는 'nucleotide code' 즉 A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine)와 C (Cytosine) 4가지로 나타나며 각각의 피크 색깔 (peak color)는 녹색, 빨간색, 파란색과 검은색으로 나타난다. 이를 통해 모계혈연관계 검증이 가능한 하플로그룹 분석이 가능하다 (도 5 참조).

한편, 도 6을 참조하면, 본 발명에 따른 DOW mtQuickFinder Equine Kit를 사용하여 얻은 SNP genotyping 산물로 genetic analyzer 분석을 통해, 모계관계 및 경주운동능력 예측할 수 있다. 즉, 도 6은 본 발명에 따른 SNP genotyping 산물로 genetic analyzer 분석을 통해 모계혈연관계를 검증한 결과화면이다. 예를 들면 자마 (FOAL)-5와 모마 (DAM)-6 분석결과 16개의 피크가 서로 일치하므로 결과적으로 자마-5와 모마-6은 모계혈연관계가 성립하게 되며, 특히 피크를 분석하게 되면 C7b의 하플로그룹에 속한다는 것을 알 수 있다. 또한 자마 (FOAL)-1와 모마 (DAM)-2 분석결과 16개의 피크 중에서 QFE-6, -7, -13, -14, -16 SNP 5개가 일치하지 않으므로 결과적으로 자마-1와 모마-2는 모계혈연관계가 성립하지 않으며, 특히 피크를 분석하게 되면 자마-1은 C1, 모마-2는 C5의 하플로그룹에 속한다는 것을 알 수 있는 것이다 (도 6 참조).

도 7을 참조하면, 본 발명에서는 말의 모계혈통관계 및 경주 운동 능력 예측 가능한 16 SNPs 선별과정을 통해 하플로그룹을 나누었으며, 하플로그룹을 통해 경주운동능력을 예측할 수 있다. 즉, 8개의 하플로그룹 내에 속하는 말들을 대상으로 잘 달리는 말과 못 달리는 말로 구분하여 빈도수(Frequency)를 조사하였다. 편의상 BH (Bad Horse)는 못 달리는 말, GH (Good Horse)는 잘 달리는 말을 나타내었다. 이와 같이 하여 결과를 살펴보면, 예를 들면, C7 하플로그룹은 GH가 21.7%, BH가 6.6%로 잘 달리는 말과 못 달리는 말의 경주운동능력, 즉 잘 달릴 확률이 약 3.3배 높은 것으로 예측되는 것이다.

본 발명을 요약 설명하자면, 말들 간의 모계관계 및 운동능력을 확인하기 위하여, 말들의 시료로부터 DNA를 추출하고, 말들 간의 모계혈통 분석 범위가 가능한 프라이머를 이용하여 PCR 수행하고, 상기 PCR의 산물로 16개의 SBE 프라이머를 조합하여 동시에 증폭될 수 있도록 multiplex SNP extension assay를 수행하며, SNP genotyping 산물로 genetic analyzer 분석을 수행하고, 분석 후 말의 모계혈통 확인 및 운동능력 예측을 진단하게 되는 것이다 (분석 결과의 예시는 도 6, 7 참조).

본 발명에 따르면 최초로 미토콘드리아 DNA 분석을 통한 말의 모계혈통분석 및 운동능력예측 가능한 제품으로 우수 씨암말의 혈통관리가 가능하게 된다. 또한, 본 발명은 씨암말 선택의 기준으로 정할 수 있는 표준화된 검사 방법을 제시하고 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 우수 씨암말에 의한 우수 경주마 생산을 통해 말 산업의 고부가 가치 창출이 가능하게 된다.

이상에서 설명된 본 발명 말의 모계혈통분석 및 운동능력예측의 실시예는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

<110> Dowgene <120> Kits for Detecting Equine Maternal lineage and Predicting Athletic Ability with Single Nucleotide Polymorphism and Method for Detection of Equine Maternal lineage and Prediction of Athletic Ability thereby <130> YP-16-0163 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gattcttccc ctaaaagaca acaatt 26 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tttcttgatt tcttccccta aaagacaaca attt 34 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 accctcattt gctatttcag tatcagatta tacccccac 39 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caatttaccc tcatttgcta tttcagtaac agattat 37 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tttaccctca tgtgctatgt cagtaacaga ttataccccc ac 42 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 catgcaatat cttatgaaac gcctatgtac g 31 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aatggcctat gtacgtcgac cattaaattg tc 32 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aatggcctat gtacgtcgac cattaaattg tct 33 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catgtacata atatcattta tcttacata 29 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gcaatcccca tccaagtcaa atcatttcca gt 32 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gcaatcccca tccaagtcaa atcatttcca gtcaacac 38 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccccatccaa gtcaaatcat ttccagtcaa cacgcatatc ac 42 <210> 13 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccccacccaa gtcaaatcat ttccagtcaa cacgcatatc acag 44 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cccaactacc agtcccaatc ctcgctccgg gcccatc 37 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cccaactacc agtcccaatc ctcgctccgg gcccatccaa a 41 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccaatcctc gctccgggcc catccaaacg tgggggtttc tacaa 45

Claims

서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석용 프라이머 세트.
서열번호 1 내지 16의 핵산서열을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석용 진단키트.
제2항에 있어서,
상기 진단키트는,
PCR (polymerase chain reation) 키트인 것을 특징으로 하는 말 형질 분석용 진단키트.
말 미토콘드리아 DNA (GenBank Accession Number X79547.1)의 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계 (a); 및,
상기 증폭산물에서, 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드의 단일염기다형성을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계 (b);를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석 방법.
제4항에 있어서,
상기 단계 (b) 후,
개체별 유전자형에 따른 표현형을 분석하는 단계 (c);를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석 방법.
제5항에 있어서,
상기 단계 (c) 후,
개체별 유전자형에 따른 표현형을 분석하고, 잘 달리는 말과 잘 못 달리는 말의 유전자형을 구분해 내는 단계 (d);를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 말 형질 분석 방법.
말 미토콘드리아 DNA (GenBank Accession Number X79547.1)의 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드를 포함하도록 PCR 증폭하여 증폭산물을 회수하는 단계 (a);
상기 증폭산물에서, 15494, 15496, 15526, 15534, 15538, 15585, 15602, 15603, 15649, 15703, 15709, 15718, 15720, 15806, 15810 및 15827번째 뉴클레오타이드의 단일염기다형성을 분석하여 개체별 유전자형을 결정하는 단계 (b); 및,
상기 유전자형 결정 후, 각 개체별 유전자형이 동일한 개체들을 모계혈연관계가 성립하는 것으로 판정하는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 말 모계혈연관계 분석 방법.