JP4430063B2 - Ｗｆｄｃ１の変異を検出する先天性眼疾患の検査方法 - Google Patents
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Description
本発明は、哺乳動物の遺伝子疾患のひとつである先天性眼疾患の検査方法に関し、具体的にはＷＦＤＣ１の遺伝子又はタンパク質の変異を検出する検査方法に関する。さらには、これらの検査方法に使用するプライマーやプライマーセット、並びにこれらを含む検査用試薬、検査用キットに関する。
近年、ヒトのほか、家畜などにおいても、遺伝的疾患が大きな問題としてクローズアップされている。遺伝的疾患は、例えば畜産業の発展にとって無視できない問題となっている。常染色体単一劣性の遺伝子様式をとる遺伝子疾患の解決のための最も有効な方法は、疾患原因遺伝子とその変異を同定し、キャリアー個体を検出するための遺伝子診断方法を確立することである。常染色体劣性の遺伝子に支配される遺伝性疾患では、見かけ上正常のキャリアー同士の交配により発症個体が出現するため、キャリアー個体を効率よく検出し、集団より除去することが疾患の発症防止のために極めて重要となる。一般には常染色体劣性の遺伝子がホモとなって発症個体が現れたときには、その集団の中にはかなりの数のキャリアー個体が蔓延していると考えられる。例えばウシなどの家畜の場合に、特に人工授精等により多数の個体が単一の種雄牛に由来し、且つ近交係数が比較的高くなるような交配様式がとられる傾向のある和牛などの場合、その影響は深刻である（非特許文献１）。
能力の高い揃ったものを作りだすために、家畜、ペット、競走馬などは血統を重視することが多い。例えば、現在、登録が行われている家畜は乳用牛、肉用牛、豚などが挙げられる。また、ヒトであっても先天性眼疾患を患う場合があり、このような場合も、遺伝的な解析ができていれば、先天性眼疾患の発症に関し、対策を行うことができる。
哺乳動物の眼球の発生は非常に複雑な過程であり、これまでＰＡＸ６やＣＨＸ１０等の遺伝子が眼球の発生に重要な役割を果たしていることが明らかにされている。つまり、これらの遺伝子のいずれかが異常をきたすと先天性眼疾患を患う。しかしながら、これらの遺伝子が正常であっても、先天性眼疾患を患う場合がある。先天性眼疾患の原因は、上記に示す遺伝子の他にも遺伝的な原因があるものと考えられる。
先天性眼疾患を予防する手段の１つとして、その疾患の原因である遺伝子のキャリアーを交配に用いることを避けていくという方法が考えられる。そのためには現存する先天性眼疾患の診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを早急に見つけ出す必要がある。上記、ＰＡＸ６やＣＨＸ１０等の遺伝子以外に先天性眼疾患に関連する遺伝子を見出すことができれば、より確実に先天性眼疾患を予防することができる。
上記以外の遺伝子で、先天性眼疾患に関連する遺伝子を解析を行った報告がある（非特許文献２）。ここでは、ウシに関し、祖父(grandsir)１、父(sires)３、母(dams)９及びそれらの子について、眼球疾患の表現型及び該疾患に伴う遺伝子について、染色体マッピングを行い、先天性眼疾患に関連する染色体の領域を確認したことが報告されている。しかし、具体的な遺伝子やその変異の状況については同定するに至っていない。
臨床獣医 Vol.20, No.2 (2002) Mammalian Genome. 2005 Sep;16(9):731-737
臨床獣医 Vol.20, No.2 (2002) Mammalian Genome. 2005 Sep;16(9):731-737
本発明は、哺乳動物の先天性眼疾患の原因物質（遺伝子又はタンパク質）を特定し、該遺伝子又はタンパク質を利用して先天性眼疾患を検査できる検査方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、かかる検査方法に利用する試薬及び先天性眼疾患検査用キットを提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、ＷＦＤＣ１の遺伝子やタンパク質の変異が先天性眼疾患の原因の一つとなることを見出し、該ＷＦＤＣ１の遺伝子又はタンパク質の変異を検出することにより、キャリアーも検出しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下よりなる。
１．哺乳動物におけるＷＦＤＣ１の変異を検出することを特徴とする先天性眼疾患の検査方法。
２．ＷＦＤＣ１の変異が、ＷＦＤＣ１をコードする遺伝子の変異又はＷＦＤＣ１タンパク質の変異を検出することによる前項１に記載の検査方法。
３．以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、前項１又は２に記載の検査方法：
工程ａ）哺乳動物の核酸試料を得る工程；
工程ｂ）工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程；
工程ｃ）工程ｂ）で得た増幅された核酸断片を用いてＷＦＤＣ１の変異の存在を調べる工程。
４．ＷＦＤＣ１の検査方法が、電気泳動法、核酸チップ法、免疫学的手法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）検出法の何れかより選択される方法を用いることによる前項１〜３の何れか１に記載の検査方法。
５．前項４に記載の検査方法における増幅された核酸断片を得るために使用されるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうるオリゴヌクレオチド。
６．哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子が、家畜、ペット、競争用動物、実験動物となりうる哺乳動物及びヒトから選択されるいずれかのＷＦＤＣ１遺伝子である前項５に記載のオリゴヌクレオチド。
７．前項５又は６に記載のオリゴヌクレオチドであって、以下の１）〜３）より選択されるいずれかのオリゴヌクレオチド：
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうるオリゴヌクレオチド；
２）配列表の配列番号４又は５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
３）上記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
８．前項５〜７のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットであり、該少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうることを特徴とする一組のプライマーセット。
９．前項５〜７のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患の検査用試薬。
１０．前項８に記載の一組のプライマーセットを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患検査用キット。
１．哺乳動物におけるＷＦＤＣ１の変異を検出することを特徴とする先天性眼疾患の検査方法。
２．ＷＦＤＣ１の変異が、ＷＦＤＣ１をコードする遺伝子の変異又はＷＦＤＣ１タンパク質の変異を検出することによる前項１に記載の検査方法。
３．以下の工程ａ）〜ｃ）を含む、前項１又は２に記載の検査方法：
工程ａ）哺乳動物の核酸試料を得る工程；
工程ｂ）工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程；
工程ｃ）工程ｂ）で得た増幅された核酸断片を用いてＷＦＤＣ１の変異の存在を調べる工程。
４．ＷＦＤＣ１の検査方法が、電気泳動法、核酸チップ法、免疫学的手法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）検出法の何れかより選択される方法を用いることによる前項１〜３の何れか１に記載の検査方法。
５．前項４に記載の検査方法における増幅された核酸断片を得るために使用されるプライマー機能を有するオリゴヌクレオチドであって、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうるオリゴヌクレオチド。
６．哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子が、家畜、ペット、競争用動物、実験動物となりうる哺乳動物及びヒトから選択されるいずれかのＷＦＤＣ１遺伝子である前項５に記載のオリゴヌクレオチド。
７．前項５又は６に記載のオリゴヌクレオチドであって、以下の１）〜３）より選択されるいずれかのオリゴヌクレオチド：
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうるオリゴヌクレオチド；
２）配列表の配列番号４又は５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；
３）上記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
８．前項５〜７のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドから選択される、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットであり、該少なくとも２種のオリゴヌクレオチドが、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうることを特徴とする一組のプライマーセット。
９．前項５〜７のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患の検査用試薬。
１０．前項８に記載の一組のプライマーセットを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患検査用キット。
本発明の検査方法により、ＷＦＤＣ１の遺伝子やタンパク質の変異が原因となりうる先天性眼疾患に関し、キャリアーを検出することができるのみならず、発生個体の早期診断が可能となる。これにより、より確実に先天性眼疾患の発生を未然に予防することができる。
ＷＦＤＣ１の変異に関連する先天性眼疾患は劣性である場合が多く、ＷＦＤＣ１遺伝子の変異をホモタイプで有するときにのみ先天性眼疾患を表現し、一方の遺伝子のみが変異型であるキャリアーの場合には先天性眼疾患を表現しない場合が多い。しかし、キャリアーとキャリアーが交配することにより、誕生してくる子は、ホモタイプの遺伝子を有する場合もあり、先天性眼疾患を表現する場合が生じうる。キャリアーを調べるのみならず、発生個体の早期診断が可能となり、より確実に先天性眼疾患の発生を未然に防ぐことができる。
本発明における哺乳動物におけるＷＦＤＣ１の遺伝子やタンパク質の変異を検出することによる先天性眼疾患の検査方法について、以下説明する。本発明において先天性眼疾患とは、文字の如く先天性の眼疾患をいう。
本発明において、ＷＦＤＣ１とはWAP four disulfide core domain 1をいい、別名Prostates stromal protein ps20（ＰＳ２０）ともいわれている。ＷＦＤＣ１遺伝子は、前立腺癌由来の細胞で強く発現している遺伝子として同定され、報告されており、これまでは主として前立腺癌を中心とする癌の発生に関与する可能性のある遺伝子として注目されていた。しかしながら、先天性眼疾患とＷＦＤＣ１との関係は、本発明において初めて見出された。
本発明において、哺乳動物とは特に限定されないが、例えばヒトの他、家畜、ペット、競争用動物、実験動物となりうる哺乳動物が挙げられる。例えば家畜やペットの場合には、遺伝子検査によりキャリアーを検出し、キャリアー同士の交配を回避することで、ＷＦＤＣ１遺伝子の変異に基づく先天性眼疾患を防ぐことができる。また、実験動物の場合には、ＷＦＤＣ１遺伝子が変異したトランスジェニック動物、ノックアウト動物や薬剤誘発突然変異動物等により、例えばマウスやラットなどの動物に代表されるような先天性眼疾患モデルを樹立することができる。さらに、ヒトにおいても、遺伝子疾患を排除するために遺伝子検査を行うことも考えられる。
本発明のＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列は、上記に例示された各哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子の配列であれば良く、特に限定されないが、検査の目的対象物により適宜選択することができる。具体的には、ヒトの他、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジなどの家畜類、マウス、ラット、サル類などの実験動物など、目的に応じて対象動物を選択することができ、それらのＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列を基に、変異を検出することができる。より具体的には、ウシのＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列として、例えばGenBank Accession No. NW_929284で表すことができ、ｍＲＮＡの配列は、GenBank Accession No. XM_581642で表すことができる。
本発明において、ＷＦＤＣ１の変異とは特に限定されないが、例えばＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列における特定のヌクレオチドが変異したり、ＷＦＤＣ１タンパク質におけるアミノ酸が変異することが考えられる。例えば、遺伝子の特定の位置のヌクレオチドの変異により、タンパク質の機能に何らかの影響が及ぶ場合や、タンパク質そのものが発現しない場合も考えられる。さらには、タンパク質が発現するものの、その量が不十分である場合もある。
したがって、本発明におけるＷＦＤＣ１の変異の位置は特に限定されないが、例えばＷＦＤＣ１タンパク質合成に影響し、十分にタンパク質が発現し得ない場合も考えられる。具体的には、ＷＦＤＣ１タンパク質をコードする遺伝子に関し、上流部位での１又は複数個のヌクレオチドの置換、欠失、付加している場合も考えられるし、上流以外の部位での１又は複数個のヌクレオチドが、挿入あるいは欠損等している場合も考えられる。これらの変異により、ＷＦＤＣ１遺伝子そのものが機能しなくなる場合も考えられる。具体的にはｍＲＮＡへの転写阻害又は翻訳阻害等によるタンパク質合成能の低下や、フレームシフトやタンパク質合成の終了等への影響が考えられる。また、フレームシフトや、タンパク質合成の終了によらずとも、特定のヌクレオチドの変異により、特定のアミノ酸が変異することによっても、先天性眼疾患に影響する可能性は否定できない。さらには、タンパク質が発現するものの、その量が不十分である場合もある。
先天性眼疾患に関連する具体的な変異として、配列表の配列番号１に示すＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソンの領域（配列番号２）において、正常ＷＦＤＣ１遺伝子ではシトシンが６つ連続している位置（配列番号２で示す配列の第６７〜７２番目）で、先天性眼疾患を表現する個体のＷＦＤＣ１遺伝子では、シトシンが７つ連続するような変異を挙げることができる（図２参照）。具体的にはヌクレオチド（シトシン）がひとつ挿入されることで、タンパク質合成の際に、フレームシフトが生じ、正常タンパク質とは全く構造の異なるタンパク質が合成されるような場合が考えられる（図３参照）。
本発明に関し、遺伝子を基に検査する場合の検査方法は、具体的には以下の工程ａ）〜ｃ）を含む方法により行われる。以下の工程ａ）〜ｃ）の間、あるいは前後に適宜更なる工程を加えても良い。
工程ａ）哺乳動物の核酸試料を得る工程；
工程ｂ）工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程；
工程ｃ）工程ｂ）で得た増幅された核酸断片を用いてＷＦＤＣ１の変異の存在を調べる工程。
工程ｂ）工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程；
工程ｃ）工程ｂ）で得た増幅された核酸断片を用いてＷＦＤＣ１の変異の存在を調べる工程。
工程ａ）について
本発明において、核酸試料とは、例えばゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡを含む試料をいう。このような核酸を含む試料は、哺乳動物のいずれの部位からも採取することができ、例えば血液、血漿、血清、組織、体液（唾液、汗、鼻汁、精液、リンパ液等）等から採取することができる。核酸試料は、自体公知の一般的な方法により、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行）に記載の方法により行うことができる。
本発明において、核酸試料とは、例えばゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡを含む試料をいう。このような核酸を含む試料は、哺乳動物のいずれの部位からも採取することができ、例えば血液、血漿、血清、組織、体液（唾液、汗、鼻汁、精液、リンパ液等）等から採取することができる。核酸試料は、自体公知の一般的な方法により、例えば、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー社、１９８９年発行）に記載の方法により行うことができる。
工程ｂ）について
本発明の検査方法において、工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、増幅した核酸断片を用いることができる。遺伝子増幅反応の方法としては、自体公知の方法を用いることができ、遺伝子の解析に必要な領域を増幅できれば特に限定されないが、例えばＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法（特開平２−５８６４号公報、特開平７−２０３９９９号公報）や鎖置換増幅法（特公平７−１１４７１８号公報、特開平７−８８２４２号公報）、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）法のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもＰＣＲ法が好ましく用いられる。
本発明の検査方法において、工程ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、増幅した核酸断片を用いることができる。遺伝子増幅反応の方法としては、自体公知の方法を用いることができ、遺伝子の解析に必要な領域を増幅できれば特に限定されないが、例えばＰＣＲ法、ＲＮＡポリメラーゼを利用した核酸増幅法（特開平２−５８６４号公報、特開平７−２０３９９９号公報）や鎖置換増幅法（特公平７−１１４７１８号公報、特開平７−８８２４２号公報）、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）法のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもＰＣＲ法が好ましく用いられる。
工程ｂ）において、ＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を上記方法により増幅し、増幅した核酸断片を得る。このような核酸断片を得るために、遺伝子の変異部位を挟む領域を増幅しうるプライマーを用いることが必要である。本発明において、変異の位置は特に限定されない。
使用可能なプライマーは、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子の配列を増幅しうるプライマーであれば良く、特に限定されないが、検査の目的対象物により適宜選択することができる。具体的には、ヒトの他、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、ヒツジなどの家畜類、マウス、ラット、サル類などの実験動物など、目的に応じて対象動物を選択することができ、それらのＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列を基に、変異を検出することができる。
より具体的には、ウシのＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列（配列番号１）に示す塩基配列のうち、例えば第２エクソンの領域（配列番号２）の変異を検出する場合には、配列表の配列番号３に示す第２エクソンを含む領域の塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。また、その相補鎖もプライマーとして用いることができる。具体的には、配列表の配列番号４又は５に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることができる。さらには、これらのオリゴヌクレオチドの相補鎖もプライマーとして用いることができる。
遺伝子の増幅方法により、使用するプライマーの組み合わせ方法は適宜選択することができるが、例えばＰＣＲ法による場合は、具体的にはフォワードプライマー及びリバースプライマーを一組のプライマーセットとして用いることができる。例えば、配列表の配列番号１の塩基配列から選択され、より好適には配列番号３の塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子における先天性眼疾患に関連する変異の部位を含む領域を増幅しうるオリゴヌクレオチドを一組のプライマーセットを用いることができ、より具体的には、配列表の配列番号４及び５に示す塩基配列のオリゴヌクレオチドを一組のプライマーセットとして用いることができる。さらには、上記に示す各オリゴヌクレオチドの相補鎖からなるオリゴヌクレオチドを一組のプライマーセットとすることもできる。
工程ｃ）について
工程ｃ）では、工程ｂ）で得られた核酸断片について解析し、変異の存在を調べる。変異の存在の検出方法としては特に限定されず、自体公知の検査方法に適用することができる。例えばＷＦＤＣ１の検査方法として、電気泳動法、核酸チップ法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）検出法等を例示することができる。さらには得られた核酸断片を基に遺伝子操作により発現させ、発現物質の同定や定量を行うことによっても解析することができる。発現物質の同定はウエスタンブロッティング法などにより、定量はＥＬＩＳＡ法などにより、免疫学的手法により行うことができる。
工程ｃ）では、工程ｂ）で得られた核酸断片について解析し、変異の存在を調べる。変異の存在の検出方法としては特に限定されず、自体公知の検査方法に適用することができる。例えばＷＦＤＣ１の検査方法として、電気泳動法、核酸チップ法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）検出法等を例示することができる。さらには得られた核酸断片を基に遺伝子操作により発現させ、発現物質の同定や定量を行うことによっても解析することができる。発現物質の同定はウエスタンブロッティング法などにより、定量はＥＬＩＳＡ法などにより、免疫学的手法により行うことができる。
例えば、電気泳動法では、得られた増幅断片を直接電気泳動に付し、泳動の度合いから変異を検出することができる。核酸チップ法では、自体公知の手法により解析することができる。具体的には、変異部位を含む適当なＤＮＡ断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法による。例えば基材上に固定したＤＮＡプローブと上記核酸断片を反応させ、ハイブリダイズした核酸を、蛍光、発光やラジオアイソトープなどで標識した物質と反応させることにより検出することにより変異を解析することができる。免疫学的手法としては、増幅核酸を基に発現したタンパク質や、被検対象動物のタンパク質試料を抗ＷＦＤＣ１抗体や、抗変異型ＷＦＤＣ１抗体と反応させる方法、例えばウエスタンブロッティング方法等によることができる。さらに制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を検出して調べる方法も用いられる。
その他の方法として、特定の部位に変異がある場合には制限酵素に反応するよう特定の塩基配列を組み込むことで、該当する制限酵素を作用させたときに得られる核酸断片の大きさを電気泳動により分析し、解析することができる。例えば配列表の配列番号１に示すＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソンの領域（配列番号２）において、変異部位の近辺に、変異が生じたときに制限酵素BglIの認識配列が得られるように、特定の塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み込む。該当箇所を含む領域を、例えば配列表の配列番号６及び７に記載のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法などの核酸増幅方法により増幅して核酸断片を得、制限酵素BglIを作用させた後の断片を電気泳動することにより、解析を行うことができる（図５参照）。
本工程に使用されるその他の解析方法として、単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）を調べる方法を使用することもできる。該方法は、一本鎖ＤＮＡが分子内の相互作用により形成する塩基配列に依存した高次構造の違いを、電気泳動での移動速度の差として調べる方法である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2766-2770 (1989)）。工程ｂ）で得られる核酸断片を、例えば電気泳動に付し、その移動速度を正常個体由来の核酸断片のものと比較することにより、変異の有無を検出することができる。ＲＦＬＰ法、ＳＳＣＰ法以外の検出法としては、例えばＤＤＧＥ法のような公知の変異検出方法を使用することができる。
本発明のＷＦＤＣ１の検査方法により、先天性眼疾患を表現している個体のみならず、キャリアーについても検査し検出することができる。従って、本発明でいう先天性眼疾患とは遺伝子的に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、またキャリアーを含めて広義に解釈するものとする。特に症状を発現している場合には、先天性眼疾患を表現している場合、又は表現型をいうこととする。
遺伝子の解析に寄らず、ＷＦＤＣ１タンパク質の変異を直接検査することもできる。この場合は、例えば血液、血漿、血清、組織、体液（唾液、汗、鼻汁、精液、リンパ液等）等を採取し、ＷＦＤＣ１タンパク質の存在を、例えばＥＬＩＳＡ法などの免疫学的手法により確認することで、検査することができる。
検査用試薬について
本発明の検査用試薬とは、具体的には上記核酸試料に含まれる遺伝子の所望の領域を増幅しうるプライマー、遺伝子増幅に必要な緩衝液、反応試薬、制限酵素、検出試薬（例えば電気泳動用試薬、プローブ等）等から選択されるいずれかいう。特に、本発明において特異的な核酸増幅用プライマーを本発明の試薬として挙げることができる。
本発明の検査用試薬とは、具体的には上記核酸試料に含まれる遺伝子の所望の領域を増幅しうるプライマー、遺伝子増幅に必要な緩衝液、反応試薬、制限酵素、検出試薬（例えば電気泳動用試薬、プローブ等）等から選択されるいずれかいう。特に、本発明において特異的な核酸増幅用プライマーを本発明の試薬として挙げることができる。
先天性眼疾患検査用キットについて
本発明の先天性眼疾患検査用キットには、具体的には上記核酸試料に含まれる遺伝子の所望の領域を増幅しうる一組のプライマーセットを含み、さらに核酸増幅に必要な緩衝液、反応試薬、制限酵素、検出試薬（例えば電気泳動用試薬、プローブ等）等から選択されるいずれか１種又は複数を含ませることができる。また、検査のための装置をキットに含めても何ら差し支えない。
本発明の先天性眼疾患検査用キットには、具体的には上記核酸試料に含まれる遺伝子の所望の領域を増幅しうる一組のプライマーセットを含み、さらに核酸増幅に必要な緩衝液、反応試薬、制限酵素、検出試薬（例えば電気泳動用試薬、プローブ等）等から選択されるいずれか１種又は複数を含ませることができる。また、検査のための装置をキットに含めても何ら差し支えない。
以下に、本発明を完成するに至った経緯についても説明し、その後実施例を示して具体的に説明する。
先天性眼疾患に関連する遺伝子を解析するために、非特許文献１の方法に従い、約２０個体の発症個体を含む家系のウシから核酸試料を得、染色体の連鎖解析を行った。核酸試料は、末梢血及び血清からフェノール／クロロホルム抽出により得た。
ウシの全染色体を網羅する２４０のマイクロサテライトマーカーを用いて連鎖解析を行ったところ、第１８染色体上のＢＭＳ１３２２とＢＭＳ１４に強い連鎖が認められた。したがって先天性眼疾患の原因遺伝子は第１８染色体の近位部に存在することが明らかとなった。さらにこの周辺の新たなマイクロサテライトマーカーを多数開発し、ホモ接合体マッピング法により、候補領域を狭め、最終的に約１．１Ｍｂ領域に特定することができた（以上非特許文献２、図１参照）。
上記により特定された領域に存在する遺伝子各々について解析し、先天性眼疾患とＷＦＣＤ１遺伝子との関係を本発明者らは初めて見出した。以下に、実施例によりその内容を詳述する。
以下に実施例を示して説明するが、本実施例は発明の内容をより理解するためのものであって、本発明は本実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
（実施例１）変異型ＷＦＤＣ１遺伝子の確認
１）ＰＣＲによる増幅
末梢血及び血清からフェノール／クロロホルム抽出により得たウシの核酸試料を、第２エクソンを含む領域（配列番号３）の一部を増幅しうるよう、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ法により核酸を増幅した。
フォワードプライマー 5'-GTAGGCGGAGGAGGTAGGC （配列番号４）
リバースプライマー 5'-GTAGGCGCAGCCGTTGTAG （配列番号５）
１）ＰＣＲによる増幅
末梢血及び血清からフェノール／クロロホルム抽出により得たウシの核酸試料を、第２エクソンを含む領域（配列番号３）の一部を増幅しうるよう、以下のフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ法により核酸を増幅した。
フォワードプライマー 5'-GTAGGCGGAGGAGGTAGGC （配列番号４）
リバースプライマー 5'-GTAGGCGCAGCCGTTGTAG （配列番号５）
ＰＣＲ法は以下の試薬を用いた。正常ウシ、先天性眼疾患ウシ、及びその母ウシのゲノミックＤＮＡを鋳型とした。
鋳型ＤＮＡ(10ng) １μ１
２×ＧＣ緩衝液 I (TAKARA) ５μｌ
ｄＮＴＰｓ １μ１
プライマー(各20μM) 各０．２５μｌ
Ｔａｑ ０．０５Ｕ
Ｈ２Ｏ 全量 １００μｌ
鋳型ＤＮＡ(10ng) １μ１
２×ＧＣ緩衝液 I (TAKARA) ５μｌ
ｄＮＴＰｓ １μ１
プライマー(各20μM) 各０．２５μｌ
Ｔａｑ ０．０５Ｕ
Ｈ２Ｏ 全量 １００μｌ
ＰＣＲは、９４℃で５分おいた後、９４℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で４５秒を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間おき、４℃で保存し、行った。
２）クローニングによる塩基配列の解析
上記１）より得た増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応液より回収し、該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングし、その塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
上記１）より得た増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応液より回収し、該増幅ＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングし、その塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
その結果、ＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソンの領域（配列番号２）に１塩基の挿入が確認された。即ち正常個体では、配列番号２の第６７〜７２番目におけるＣが６回繰りかえしている配列が、発症個体では７回のＣの繰り返しになっていた（図２参照）。この１塩基の挿入の結果、変異型ＷＦＤＣ１遺伝子からＷＦＤＣ１タンパク質を合成する際にフレームシフトを引き起こし、６７番目のアミノ酸残基以降のアミノ酸配列は正常のもの（野生型（配列番号１０））とは全く異なり、１２６番目に早期の終止コドンが出現していることが確認された（図３参照（配列番号１１））。したがって、変異型ＷＦＤＣ１遺伝子から産生されるＷＦＤＣ１タンパク質は、正常ＷＦＤＣ１タンパク質の機能を完全に喪失しているものと考えられた。
（実施例２）直接電気泳動法による検査方法
実施例１のＰＣＲ法により得た増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応液より回収し、該ＤＮＡ断片を直接電気泳動に付した。その結果を図４に示した。正常ウシの場合と、キャリアー又は眼疾患表現型(Affected)のウシの場合では、異なる位置にバンドが認められた。
実施例１のＰＣＲ法により得た増幅ＤＮＡ断片をＰＣＲ反応液より回収し、該ＤＮＡ断片を直接電気泳動に付した。その結果を図４に示した。正常ウシの場合と、キャリアー又は眼疾患表現型(Affected)のウシの場合では、異なる位置にバンドが認められた。
上記結果から、直接電気泳動法により、正常ウシ、キャリアー又は眼疾患表現型(Affected)の遺伝子を検査しうることが確認された。
（実験例３）制限酵素認識配列の挿入による検査方法
ＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソンの領域において、ミスマッチプライマーを用いて変異部位の近辺に、変異の場合に制限酵素BglI の認識配列（5'-GCCNNNNNGGC：配列番号８）が得られるように特定の塩基配列(GCCCCC：配列番号９）からなるポリヌクレオチドを組み込んだ。該当箇所を含む領域を、配列表の配列番号７及び８に記載のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による核酸増幅方法により増幅して核酸断片を得た。得られた増幅産物を、制限酵素BglIを作用させた後に電気泳動することにより、解析を行った（図５参照）。理論的には、変異が認められる場合には制限酵素で切断され、正常な場合には、制限酵素では切断されなかった（図６参照）。
ＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソンの領域において、ミスマッチプライマーを用いて変異部位の近辺に、変異の場合に制限酵素BglI の認識配列（5'-GCCNNNNNGGC：配列番号８）が得られるように特定の塩基配列(GCCCCC：配列番号９）からなるポリヌクレオチドを組み込んだ。該当箇所を含む領域を、配列表の配列番号７及び８に記載のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法による核酸増幅方法により増幅して核酸断片を得た。得られた増幅産物を、制限酵素BglIを作用させた後に電気泳動することにより、解析を行った（図５参照）。理論的には、変異が認められる場合には制限酵素で切断され、正常な場合には、制限酵素では切断されなかった（図６参照）。
フォワードプライマー 5'-GTAGGCGGAGGAGGTAGGC （配列番号６）
リバースプライマー 5'-GCGTGCAGCCTG GCAGGCGCCGG （配列番号７）
リバースプライマー 5'-GCGTGCAGCCTG GCAGGCGCCGG （配列番号７）
実施例の核酸試料について確認したところ、図７に示すように、正常ウシの場合は９８ｂｐでバンドを認め、眼疾患表現型では７６ｂｐでバンドを認め、ほぼ理論どおりの結果を得ることができた。また、キャリアーでは２本のバンドが認められ、変異型ＷＦＤＣ１遺伝子を有するキャリアーについても確認することができた。
上記結果から、ミスマッチプライマーを用いた制限酵素認識配列の挿入法により、正常ウシ、キャリアー又は眼疾患表現型(Affected)の遺伝子を検査しうることが確認された。
以上説明したように、本発明の検査方法によると、ＷＦＤＣ１の遺伝子やタンパク質の変異が原因となりうる先天性眼疾患に関し、キャリアーを検出することができるのみならず、発生個体の早期診断が可能となる。これにより、より確実に先天性眼疾患の発生を未然に予防することができる。
ＷＦＤＣ１の変異に関連する先天性眼疾患は劣性である場合が多く、ＷＦＤＣ１遺伝子の変異をホモタイプで有するときにのみ先天性眼疾患を表現し、一方の遺伝子のみが変異型であるキャリアーの場合には先天性眼疾患を表現しない場合が多い。しかし、キャリアーとキャリアーが交配することにより、誕生してくる子は、ホモタイプの遺伝子を有する場合もあり、先天性眼疾患を表現する場合が生じうる。キャリアーを調べるのみならず、発生個体の早期診断が可能となり、より確実に先天性眼疾患の発生を未然に防ぐことができる。
さらには、ＷＦＤＣ１遺伝子が変異したトランスジェニック動物、ノックアウト動物や薬剤誘発突然変異動物等により、例えばマウスやラットなどの動物に代表されるような先天性眼疾患モデルを樹立することができる。
Claims (9)
- 哺乳動物におけるＷＦＤＣ１をコードする遺伝子の第２エクソン領域（配列番号２）の第６７−７２番目におけるＣ（シトシン）の数の変異を検出することを特徴とする先天性眼疾患の検査方法。
- 以下の工程ａ）及びｂ）を含む、請求項１に記載の検査方法：
工程ａ）哺乳動物から得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付し、当該哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程；
工程ｂ）工程ａ）で得た増幅された核酸断片を用いてＷＦＤＣ１の変異の存在を調べる工程。 - ＷＦＤＣ１の検査方法が、電気泳動法、核酸チップ法、免疫学的手法、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）検出法の何れかより選択される方法を用いることによる請求項１又は２に記載の検査方法。
- 請求項３に記載の検査方法における増幅された核酸断片を得るために使用されるプライマーであって、哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子の塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソン領域（配列番号２）の第６７−７２番目におけるＣ（シトシン）の数の変異の部位を含む領域を増幅しうるプライマー。
- 哺乳動物のＷＦＤＣ１遺伝子が、家畜、ペット、競争用動物、実験動物となりうる哺乳動物及びヒトから選択されるいずれかのＷＦＤＣ１遺伝子である請求項４に記載のプライマー。
- 請求項４又は５に記載のプライマーであって、以下の１）〜３）より選択されるいずれかのプライマー：
１）配列表の配列番号１に示す塩基配列から選択される１５〜３５個のヌクレオチドからなり、ＷＦＤＣ１遺伝子の第２エクソン領域（配列番号２）の第６７−７２番目におけるＣ（シトシン）の数の変異の部位を含む領域を増幅しうるプライマー；
２）配列表の配列番号３又は４に示す塩基配列を含むプライマー；
３）上記１）又は２）に記載のプライマーの相補鎖。 - 請求項４〜６のいずれか１に記載のプライマーから選択される、少なくとも２種のプライマーからなるプライマーセットであり、該少なくとも２種のプライマーが、ＷＦＤＣ１遺伝子における第２エクソン領域（配列番号２）の第６７−７２番目におけるＣ（シトシン）の数の変異の部位を含む領域を増幅しうることを特徴とする一組のプライマーセット。
- 請求項４〜７のいずれか１に記載のプライマーを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患の検査用試薬。
- 請求項７に記載の一組のプライマーセットを含む、ＷＦＤＣ１の変異を検出することによる先天性眼疾患検査用キット。
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