WO2020230739A1 - Ｈｌａクラスｉアレル欠失血球の検出方法 - Google Patents

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裕希 水牧
眞二 中尾
晃平 細川
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裕希 水牧
眞二 中尾
晃平 細川
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting HLA class I allele-deficient blood cells and a kit for that purpose.
  • Bone marrow failure is a condition in which all blood cells decrease due to a decrease in bone marrow function. Idiopathic bone marrow failure caused by qualitative and quantitative abnormalities of hematopoietic stem cells is sometimes collectively referred to as "bone marrow failure syndrome". In recent years, the number of patients with bone marrow failure syndrome has been increasing with the aging of the population. The category of bone marrow failure includes aplastic anemia (AA), myelodysplastic syndrome (MDS), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), etc., but they overlap each other and have no boundaries. Since it is clear, it is important to perform treatment according to the pathological condition.
  • AA plastic anemia
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • PNH paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
  • Aplastic anemia presents with various symptoms such as palpitation and shortness of breath associated with anemia, susceptibility to leukopenia, purpura due to thrombocytopenia, and bleeding tendency due to a decrease in hematopoietic stem cells.
  • the onset of regenerative anemia includes direct damage to hematopoietic stem cells by cytotoxic T cells (CTL) and suppression of hematopoiesis by immunological mechanisms such as excess of T cell hormones that suppress hematopoietic stem cells. It is believed to be involved in many cases. On the other hand, in some cases, it develops due to abnormalities of hematopoietic stem cells themselves, but an effective method for differentiating these causes has not been established.
  • CTL cytotoxic T cells
  • PNH-type blood cells are blood cells lacking the GPI-anchored membrane protein characteristic of PNH.
  • Hematopoietic stem cells lacking the GPI-anchored membrane protein become normal stem cells in an environment where high concentrations of this cytokine are present in the bone marrow because they are less sensitive to "inflammatory cytokines that keep hematopoietic stem cells in a quiescent state.” They are more likely to be activated in comparison and they produce GPI-anchored membrane protein-deficient blood cells. This is considered to be the reason why PNH type blood cells are easily detected in bone marrow failure due to immune pathology. However, PNH-type blood cells cannot be accurately detected at all institutions, and even if PNH-type blood cells are negative, the immune pathology cannot be ruled out. Therefore, immunopathological markers other than PNH-type blood cells are required.
  • HLA human leukocyte antigen
  • Hematopoietic stem cells with mutations in various genes are present in the bone marrow of healthy subjects, but they do not contribute to hematopoiesis because they are usually in a quiescent state. However, when a CTL attack on hematopoietic stem cells occurs, the stem cells that contribute to hematopoiesis decrease, while the sleeping stem cells are mobilized for hematopoiesis to supplement it. If any of these "raised" stem cells are hematopoietic stem cells that lack a specific HLA class I allele due to a genetic abnormality in HLA, they survive the attack of CTL because they are not recognized by T cell receptors. Produces HLA-deficient blood cells. HLA-deficient leukocytes can be detected by flow cytometry (FCM) using a specific antibody against the HLA molecule.
  • FCM flow cytometry
  • Mechanisms for deleting this HLA class I allele include loss of the HLA gene haplotype due to heterozygosity loss (6pLOH) of the short arm of chromosome 6 in which the HLA gene group is present, and somatic mutation of the HLA class I allele. Can be mentioned.
  • 6pLOH heterozygosity loss
  • the remaining chromosomes make up for the deletion to maintain the balance of the chromosomes. Form.
  • the result is 6pLOH. Due to this phenomenon, leukocytes having only one HLA are detected in about 13% of all aplastic anemias (Non-Patent Document 1).
  • This 6pLOH has been conventionally investigated by a method called SNP array analysis that can quantify the copy number of a specific gene region.
  • Another method for detecting the presence of 6pLOH is to quantify the imbalance between two allelic amounts by droplet digital PCR (ddPCR) (Non-Patent Document 2).
  • ddPCR droplet digital PCR
  • the gene amount is 1: 1 when each allele is amplified by PCR under normal conditions, but in patients with 6pLOH, only one is amplified, so the amplified gene amount is not 1: 1. This is to detect the existence of 6pLOH.
  • HLA-LL HLA class I allele-deficient blood cells
  • the existing detection method has the following problems. (1) In order to detect HLA-LL by ddPCR method or FCM, it is necessary to carry out expensive HLA typing in advance. (2) Since HLA typing usually takes more than one week, it takes 1-3 months to clarify the presence or absence of HLA-LL, including the subsequent assay. (3) The types of HLA antigens that can be detected with monoclonal antibodies are limited, and the detection of 6pLOH blood cells by the ddPCR method is not applicable to all cases.
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting HLA-LL quickly, with high sensitivity, and at low cost without performing HLA typing, thereby dramatically improving the medical care for bone marrow failure. ..
  • the present inventors detailed the HLA class I gene of patients with 6 pLOH using a next-generation sequencer in order to search for genetic abnormalities common to HLA-LL-positive patients. Analyzed. As a result, in 12 of the 22 analyzed cases, 1-3 types of loss-of-function mutations (median 1 type) were detected per case. Surprisingly, most of the loss-of-function mutations detected were concentrated at specific locations in the exon 1 region of the HLA-A or HLA-B gene, regardless of the type of HLA class I allele.
  • HLA-B * 40 : 02 This common mutation was previously found in the analysis of the HLA class I allele (HLA-B * 40 : 02), which is most frequently carried by patients with aplastic anemia (Non-Patent Documents 2 and 3), but is optional. It was not recognized at all that it was a common mutation among HLA class I alleles.
  • the present inventors consider that if this common mutation can be detected easily and with high sensitivity, the presence or absence of HLA-LL can be rapidly evaluated without performing HLA typing in advance, and ddPCR, which is a next-generation PCR method, is used. Focused on the law. Since the HLA gene is the most polymorphic gene among all genes, it was extremely difficult to prepare primers and probes that amplify only a specific region, but the present inventors conducted trial and error. As a result, we succeeded in designing a primer-probe set that detects this mutation with high sensitivity.
  • the common mutation was detected in 101 of 353 patients with aplastic anemia (about 29%).
  • the immune pathology can be detected in about 4/5 cases.
  • a common mutation was detected in 34 (31%) of the 108 PNH blood cell negative cases. Therefore, it was clarified that using this method, immune pathology can be detected even in cases where pathological diagnosis is difficult by PNH type blood cell test.
  • the present invention is as follows.
  • HLA class including the step of detecting a loss-of-function mutation in the 19th nucleotide of the coding sequence of the HLA-A and / or HLA-B gene in DNA derived from blood collected from a subject whose HLA type is unknown.
  • Method for detecting I allele-deficient blood cells [2] The method according to [1], wherein the loss-of-function mutation is a nonsense mutation. [3] The method according to [1] or [2], wherein a loss-of-function mutation is detected using a digital PCR method. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the subject is a patient with or suspected of having bone marrow failure syndrome.
  • [5] The method according to [4], wherein bone marrow failure is caused by a disease selected from the group consisting of aplastic anemia, myelodysplastic syndrome and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], which is used in combination with the detection of PNH type blood cells.
  • [7] A kit for detecting HLA class I allele-deficient blood cells in a subject whose HLA type is unknown.
  • a primer set that can amplify a partial nucleotide sequence of an HLA-A and / or HLA-B gene, including the 19th nucleotide of the coding sequence.
  • kits comprising a probe capable of specifically hybridizing to an amplified PCR product in which the 19th nucleotide is mutated to cause a loss-of-function mutation.
  • the primer set capable of amplifying the partial nucleotide sequence of the HLA-A gene is a forward primer having a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NOs: 2 to 5. Containing each of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by and one or more reverse primers consisting of substantially the same sequence, and / or (a2) a partial nucleotide sequence of the HLA-B gene.
  • the primer set that can be amplified includes one or more forward primers having substantially the same sequence as each of the one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 8, and SEQ ID NOs: 9 to 9.
  • the probe of (b1) has substantially the same sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • the probe of (b2) has substantially the same sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the kit according to [8] or [9] which comprises the same sequence.
  • HLA-LL can be detected easily and highly sensitively without performing HLA typing, so that immunization of bone marrow failure is extremely quick and inexpensive as compared with the conventional method requiring HLA typing.
  • the pathological condition can be diagnosed.
  • the left shows the test result of the detection sensitivity using the dilution series, and the right shows the detection result in 24 healthy subjects (all cases are less than 0.07%).
  • the upper part shows HLA-LL positive cases, and the lower part shows HLA-LL negative cases.
  • the present invention provides a method for detecting HLA class I allele-deficient blood cells (HLA-LL) in a subject whose HLA type is unknown (hereinafter, also referred to as "detection method of the present invention”).
  • HLA-LL HLA class I allele-deficient blood cells
  • An allele refers to an individual gene located at the same locus on a pair of homologous chromosomes.
  • HLA class I allele-deficient blood cells lack one or more HLA class I (eg, HLA-A, HLA-B, HLA-C) alleles by 6pLOH or are specific It means a leukocyte that does not express the HLA class I molecule encoded by the allele on the surface due to a loss-of-function mutation of the HLA class I allele.
  • the detection method of the present invention is a loss-of-function type in the 19th nucleotide (hereinafter, also referred to as “target nucleotide”) of the coding sequence of the HLA-A and / or HLA-B gene in the blood-derived DNA collected from the subject. Includes the step of detecting a mutation.
  • target nucleotide 19th nucleotide
  • the "subject" to be measured is a patient with bone marrow failure syndrome or a person suspected of having bone marrow failure syndrome.
  • Bone marrow failure is a condition in which all blood cells are reduced due to a decrease in bone marrow function
  • bone marrow failure syndrome is a general term for idiopathic bone marrow failure caused by qualitative and quantitative abnormalities of hematopoietic stem cells.
  • the categories of bone marrow failure syndrome include aplastic anemia (AA), myelodysplastic syndrome (MDS), paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), large granulolymphocyte hyperplasia (LGL), and pure red cell aplasia (Pure red cell aplasia). PRCA), etc. are included.
  • the main subject in the detection method of the present invention is a patient with or suspected of having aplastic anemia, myelodysplastic syndrome or paroxysmal nocturnal hemoglobinuria whose immune pathology may be involved in the development of bone marrow failure. Is a person.
  • the biggest feature of the detection method of the present invention is that the presence or absence of HLA-LL in a subject can be quickly detected without performing HLA typing. Therefore, the subject in the detection method of the present invention does not need to know the HLA type.
  • genomic DNA extracted from peripheral blood containing leukocytes examples include genomic DNA extracted from peripheral blood containing leukocytes.
  • genomic DNA can be isolated from blood collected from a subject by normal blood collection by a phenol extraction method or the like.
  • a commercially available genomic DNA extraction kit or device such as QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit may be used.
  • the loss-of-function mutation to be detected in the detection method of the present invention is a loss-of-function mutation in cytosine (c.19C), which is the 19th nucleotide of the coding sequence of the HLA-A and / or HLA-B gene.
  • the nucleotide is located within exon 1 of the HLA-A and HLA-B genes and is the first nucleotide of the 7th codon (CGA).
  • Examples of the loss-of-function mutation include nonsense mutations and frameshift mutations.
  • the nonsense mutation detected in the present invention is a mutation (c.19C> T) that produces a stop codon (TGA) by substituting thymine at position 19 cytosine.
  • a frameshift mutation includes a deletion or insertion of 1 or 2 nucleotides at the position of the 19th nucleotide, and is preferably a frameshift mutation due to a deletion or deletion of the 19th cytosine (c.19delC). More preferably, the loss-of-function mutation to be detected in the detection method of the present invention is a nonsense mutation due to the substitution of cytosine at position 19 with thymine (c.19C> T).
  • the presence or absence of a loss-of-function mutation in a gene can be determined by any polymorphism analysis method known in the art.
  • a method using a PCR method can be mentioned.
  • Methods using the PCR method include amplification of the nucleic acid of interest by the PCR method and detection of mutations in the amplification product by fluorescence or luminescence, PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) method, and PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism: single-strand conformation polymorphism) method (Orita, M. et al., Proc. Natl. Acad.
  • PCR -SSO specific sequence oligonucleotide
  • ASO allele specific oligonucleotide hybridization method
  • TaqMan registered trademark, Roche Molecular Systems
  • digital PCR method eg, droplet digital PCR (ddPCR) method, micropore distribution type digital PCR method, etc.
  • cycling probe method Invader (registered trademark, Third Wave Technologies) method (Lyamichev V et al., Nat Biotechnol, 17,292 (1999)), and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) method (Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256 (1985), Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794 (1988), International Publication No. 99/28500, JP 2004- 121232, etc.), methods using DNA chips or microarrays (Wang DG et al., Science 280, 1077 (1998), etc.), Southern blot hybridization methods, dot hybridization methods (Southern, E., J. Mol . Biol. 98, 503-517 (1975)) and so on.
  • Invader registered trademark, Third Wave Technologies
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the method using the PCR method is preferable from the viewpoint of simplicity and sensitivity.
  • digital PCR which is a next-generation PCR that can perform absolute quantification without worrying about amplification efficiency, has high accuracy, high sensitivity, and excellent processing performance, especially ddPCR, is particularly popular. preferable.
  • the detection method of the present invention can be carried out, for example, as follows. (1) A step of contacting a DNA sample with a probe set that specifically hybridizes with a target nucleotide (2) A step of amplifying a region containing the target nucleotide by PCR (3) A step of including the PCR product amplified in the step (2). Step of measuring fluorescence intensity of solution (4) Step of detecting loss-of-function mutation in target nucleotide based on the measurement result of (3) above
  • Step of contacting the probe set with the DNA sample (a) Probe set
  • the probe set that specifically hybridizes with the target nucleotide used in the step (1) includes the HLA-A and / or HLA-B gene. Oligonucleotides consisting of a contiguous nucleotide sequence of about 5 to about 30 bases, preferably about 7 to about 20 bases, that hybridize to a partial nucleotide sequence containing the target nucleotide are used.
  • the probe set consists of two types of probes whose target nucleotide portion is a normal type (cytosine) and a mutant type (thymine when the loss-of-function mutation is a nonsense mutation).
  • the probe set is an oligonucleotide of substantially the same sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 (CCCCGAACC) for the HLA-A and HLA-B genes. (Normal type) and an oligonucleotide (variant type) having a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the oligonucleotide having substantially the same sequence as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a probe for detecting a nonsense mutation in the target nucleotide of the HLA-A and HLA-B genes.
  • SEQ ID NO: 12 corresponds to the 16th to 24th nucleotide sequences of the coding sequences of both the HLA-A and HLA-B genes, and in most alleles, the sequences are completely matched between the two genes. , Both HLA-A and HLA-B can be measured with one probe set.
  • substantially identical sequence means not only a sequence that is completely identical, but also a partial nucleotide sequence containing a target nucleotide of the HLA-A and / or HLA-B gene, which is hybridized under the conditions of a PCR reaction.
  • the probe set used in the present invention is an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 (normal type) and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 (variant type). ..
  • a labeling substance can be bound to each probe.
  • the labeling substance include fluorescent dyes and the like.
  • Various fluorescent dyes are commercially available, for example, 6-FAM (fluorescein), HEX, TE, Quasar 670, Quasar 570, Quasar 705, Pulsar 650, TET, HEX, VIC, JOE, CAL Fluor Orange.
  • an HLA fragment having a normal target nucleotide has a normal probe, and an HLA having a target nucleotide (c.19C> T in the case of a nonsense mutation) that causes a loss-of-function mutation.
  • an HLA having a target nucleotide c.19C> T in the case of a nonsense mutation
  • two types of fluorescence derived from the fluorescent dye of each probe are detected.
  • each probe is further bound with a quencher capable of quenching the fluorescence from the fluorescent substance.
  • the quencher is not particularly limited as long as it can quench the fluorescence from the fluorescent dye, and may be a fluorescent dye or a non-fluorescent dye, but a non-fluorescent dye is preferable from the viewpoint of detection accuracy. There can be.
  • Specific quenchers include, for example, 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), Eclipse Dark Quencher, Iowa black FQ (IBFQ), minor groove binder (MGB), non- Fluorescent quencher (NFQ) and the like.
  • Examples of the constituent unit of the probe include ribonucleotides and deoxyribonucleotides.
  • the nucleotide residue contains sugars, bases and phosphoric acid as components.
  • Ribonucleotides have a ribose residue as a sugar and bases adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and uracil (U) (which can also be replaced with thymine (T)).
  • Deoxyribonucleotide residues have deoxyribose residues as sugars and bases such as adenine (dA), guanine (dG), cytosine (dC) and thymine (dT) (which can also be replaced with uracil (dU)).
  • nucleotides may be modified (modified nucleotide residues may be referred to as "modified nucleotide residues") or unmodified (unmodified nucleotide residues are referred to as "unmodified nucleotides”. Residues).
  • modified nucleotide residues can improve nuclease resistance and thus stability.
  • the position and proportion of the modified nucleotide residue in the probe are not particularly limited. In addition, it may contain a linker region composed of an unmodified nucleotide residue or a molecule different from the modified nucleotide residue.
  • the modified nucleotide residue may be modified by, for example, any of the components of the unmodified nucleotide residue.
  • “modification” includes, for example, substitution, addition and / or deletion of the component, substitution, addition and / or deletion of an atom and / or functional group in the component.
  • the modified nucleotide residue include naturally occurring nucleotide residues, artificially modified nucleotide residues, and the like.
  • the naturally occurring modified nucleotide residue for example, Limbach et al. (Limbach et al., 1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: 2183 to 2196) can be referred to.
  • examples of the modified nucleotide residue include residues that are substitutes for nucleotides.
  • Modification of the nucleotide residue includes, for example, modification of a sugar-phosphate skeleton (the skeleton also includes a base) (hereinafter, sugar phosphate skeleton).
  • sugar phosphate skeleton when the sugar is ribose, for example, a ribose residue can be modified.
  • the ribose residue can, for example, modify the 2'-carbon, and specifically, for example, the hydroxyl group bonded to the 2'-carbon can be modified with a methyl group, or the hydroxyl group can be replaced with a halogen such as hydrogen or fluoro. ..
  • nucleic acid in which the hydroxyl group bonded to the 2'carbon of the sugar is modified with a methyl group as described above may be referred to as a 2'-O-methyl modified nucleic acid.
  • nucleic acid includes nucleic acid monomers such as nucleotides.
  • the sugar phosphate skeleton may be replaced, for example, with a non-ribose phosphate skeleton having non-ribose residues (including non-deoxyribose residues) and / or non-phosphate. Is also included in the modification of the sugar phosphate skeleton.
  • examples of the non-ribose phosphate skeleton include uncharged substances of the sugar phosphate skeleton.
  • Substitutes for the nucleotides substituted with the non-ribos phosphate skeleton include, for example, morpholino, cyclobutyl, pyrrolidine and the like.
  • Other examples of the alternative include artificial nucleic acids.
  • PNA peptide nucleic acid
  • BNA crosslinked artificial nucleic acid
  • BNA Bridged Nucleic Acid
  • BNA Locked Nucleic Acid
  • ENA 2'-O, 4'-C-Ethylene Crosslinked Nucleic Acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • EDA 2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid
  • the method of contacting the probe set with the DNA sample is not particularly limited, but it can be performed, for example, by adding the probe set and DNA in the same solution.
  • the above solution usually contains a PCR primer set and a DNA polymerase.
  • the PCR primer set consists of a forward primer and a reverse primer of about 15 to about 30 bases capable of specifically amplifying a partial nucleotide sequence containing a target nucleotide of the HLA-A gene and the HLA-B gene.
  • the HLA gene shows the highest degree of polymorphism among the functional genes, so that the region containing the target nucleotide can be amplified for any HLA type. Based on the sequence information of HLA-A and HLA-B genes of multiple individuals, it is possible to select the region with the lowest polymorphism in the region sandwiching the target nucleotide and design multiple types of primers as needed. desirable.
  • nucleotide constituting the primer set the same nucleotide as the probe set can be used, or the nucleotide constituting the probe may be modified in the same manner.
  • the primer set includes a forward primer having a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the HLA-A gene.
  • a forward primer having a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the HLA-A gene.
  • examples thereof include a primer set containing each of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by 5 to 5 and one or more reverse primers having substantially the same sequence.
  • one or more forward primers having substantially the same sequence as each of the one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 8 and one or more forward primers.
  • substantially identical sequence means that not only the completely identical sequence but also "each target sequence of HLA-A and / or HLA-B gene can be hybridized under the condition of PCR reaction".
  • a condition it means that in the nucleotide sequence represented by each of the above SEQ ID NOs, 1 or 2 nucleotides, preferably 1 nucleotide is substituted, deleted, inserted or added.
  • the primer set used in the present invention is represented by SEQ ID NOs: 2 to 5 and a forward primer consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and / or 14 for the HLA-A gene.
  • a primer set comprising one or more reverse primers consisting of each of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences. Further, for the HLA-B gene, one or more forward primers consisting of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 8 and SEQ ID NOs: 9 to 11 are shown. A primer set comprising one or more reverse primers consisting of each of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences to be obtained.
  • the DNA polymerase is not particularly limited as long as it is a DNA polymerase usually used in the PCR method.
  • the method of amplifying the region containing the target nucleotide by PCR is not particularly limited, but it is preferably amplified by the digital PCR method.
  • Digital PCR is performed, for example, by the following procedure. A reaction solution containing a probe set, a DNA sample, a PCR primer set and a DNA polymerase is set in a digital PCR device.
  • the mixing ratio of each reaction solution component can be appropriately selected and optimized within a range known per se. For example, the mixing ratio shown in Examples described later may be used, but it can be appropriately changed depending on the primer set, probe set, and the like to be used.
  • the amount of DNA sample is preferably 50 to 200 ng, preferably 80 to 150 ng per reaction solution.
  • the digital PCR apparatus distributes the reaction solution to a large number of reaction wells, thousands to tens of thousands, provided on the chip.
  • the reaction well is, for example, a minute well having an opening size of several tens of ⁇ m or a nanoliter-sized droplet.
  • some reaction wells on the chip preferably contain about one copy of the HLA-A or HLA-B allele, and the other reaction wells do not contain the allele.
  • the reaction mix is distributed to the reaction wells.
  • PCR When PCR is performed in a reaction mix distributed to multiple reaction wells, a region of the allele is amplified in the reaction well where the desired HLA allele is present, due to the nuclease activity of DNA polymerase.
  • the probe bound to the target region is cleaved, the fluorescent dye dissociates, and fluorescence is emitted.
  • the fluorescence intensity in the step (3) can be measured, for example, by using a fluorescence reader known per se.
  • the fluorescence intensity can be measured by, for example, measuring the number of reaction wells in which fluorescence is detected by a reader of a digital PCR device.
  • the plurality of fluorescence intensities can be measured at once by detecting the fluorescence derived from each fluorescence.
  • Step (4) Step of detecting loss-of-function mutation in target nucleotide
  • the loss-of-function mutation in the target nucleotide of the HLA-A and / or HLA-B gene Can be detected. That is, from the above measurement results, the number of copies of normal DNA and the number of copies of mutant DNA are obtained for each gene, and the number of copies of mutant DNA is divided by the sum of the number of copies of normal DNA and the number of copies of mutant DNA. , The allergen frequency of mutation can be calculated.
  • the subject can be determined to be HLA-LL positive.
  • the cutoff value for example, a PCR reaction is carried out in the same manner as above using DNA derived from blood collected from a certain number or more of healthy subjects, and the allergen frequency (false positive rate) of mutation is calculated. It can be appropriately determined by a value sufficiently higher than the obtained median or mean value (for example, + 3SD) and higher than the detection limit of the PCR reaction.
  • the cutoff value depends on the amount of DNA used for measurement, but when the amount of DNA is 100 ng per reaction solution as in the examples described later, the false positive rate in healthy subjects is 0 to 0.042% (median 0.009%). Therefore, the cutoff value was set to 0.07% together with the result of the sensitivity test.
  • HLA-LL positive When HLA-LL positive is determined by the detection method of the present invention, it can be determined that the subject is likely to develop bone marrow failure due to damage to hematopoietic stem cells by an immunological mechanism. Therefore, it can be predicted that immunosuppressive therapy, such as administration of anti-thymocyte immunoglobulin (ATG) and / or cyclosporine (CsA), will be effective for the subject. From the above viewpoint, the present invention also implements the detection method of the present invention, and as a result, administers immunosuppressive therapy, for example, ATG and / or CsA, to a subject determined to be HLA-LL positive. Provided are methods for diagnosing and treating immune pathologies in bone marrow failure, including the above.
  • immunosuppressive therapy such as administration of anti-thymocyte immunoglobulin (ATG) and / or cyclosporine (CsA)
  • the detection method of the present invention can be used in combination with the PNH type blood cell test.
  • PNH-type blood cells cannot be accurately detected at all facilities, and even if PNH-type blood cells are negative, the immune pathology cannot always be ruled out. Therefore, it is particularly desirable to carry out the detection method of the present invention for a subject who is negative in the PNH type blood cell test.
  • the detection method of the present invention is determined to be HLA-LL positive, it is considered that bone marrow failure is caused by damage to hematopoietic stem cells by an immunological mechanism even if PNH type blood cells are negative. Therefore, immunosuppressive therapy can be predicted to be effective in these cases.
  • the PNH type blood cell test can be performed, for example, by the method described in Sugimori et al., Blood, 107: 1308-1314 (2006), JP2012-122954A, and the like, but is not limited thereto.
  • Kit of the present invention also provides a kit for detecting HLA class I allele-deficient blood cells in a subject whose HLA type is unknown (hereinafter, also referred to as “kit of the present invention”).
  • the kit is suitable for carrying out the above-mentioned detection method of the present invention, and includes the following primer set (a) and the following probe sets (b1) and (b2) as a configuration.
  • a probe that can specifically hybridize to a mutated one that causes a type mutation
  • the loss-of-function mutation at the 19th nucleotide of the coding sequence of the HLA-A and / or HLA-B gene is a nonsense mutation or frameshift mutation, more preferably a nonsense mutation.
  • the primer set of (a) is capable of amplifying the region containing the 19th nucleotide of the HLA-A and / or HLA-B gene from DNA derived from a subject having an arbitrary HLA type. .. Since the HLA gene exhibits the highest degree of polymorphism among functional genes, in order to be able to amplify the region containing the target nucleotide for any HLA type, the primer sequence should be placed in the region with the lowest possible polymorphism. It is desirable to set.
  • the primer set capable of amplifying the partial nucleotide sequence of the HLA-A gene is represented by a forward primer having a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • Each of one or more nucleotide sequences selected from the above nucleotide sequences contains one or more reverse primers consisting of substantially the same sequence, and / or (a2) a partial nucleotide sequence of the HLA-B gene can be amplified.
  • the primer set is represented by SEQ ID NOs: 9 to 11 and one or more forward primers having a sequence substantially the same as that of each of the one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 8.
  • examples thereof include one containing one or more reverse primers consisting of substantially the same sequence as each of one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences to be prepared.
  • substantially the same sequence is synonymous with the case of "(b) PCR primer set" in the detection method of the present invention.
  • the primer set of (a) is (A1)
  • the primer set capable of amplifying the partial nucleotide sequence of the HLA-A gene is a forward primer consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and / or 14, and the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • a primer set comprising one or more reverse primers consisting of each of one or more nucleotide sequences selected from and / or capable of amplifying a partial nucleotide sequence of the (a2) HLA-B gene is available in SEQ ID NOs: 6-8.
  • It consists of one or more forward primers consisting of each of one or more nucleotide sequences selected from the represented nucleotide sequences, and one or more nucleotide sequences selected from the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 9 to 11. It contains one or more reverse primers.
  • the primer set of (a) is (A1)
  • the primer set capable of amplifying the partial nucleotide sequence of the HLA-A gene includes a forward primer consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 14 (preferably SEQ ID NO: 14) and SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • Primer sets containing four reverse primers consisting of each of the nucleotide sequences represented by and / or capable of amplifying a partial nucleotide sequence of (a2) HLA-B gene are represented by SEQ ID NOs: 6-8.
  • the probe of (b1) has a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the probe (b2) has a sequence substantially the same as the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • "from substantially the same sequence” is synonymous with the case of "(a) probe set" in the detection method of the present invention.
  • the probe set is The probe of (b1) is composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • the probe of (b2) is composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • the kit of the present invention comprises PCR in the detection method of the present invention.
  • reagents used in the reaction such as DNA extraction reagents, DNA polymerase, dNTPs, reaction buffers, nucleic acids containing target regions that are positive controls for PCR, and containers, instruments, instructions, and the like. Can be done.
  • the above-mentioned primer set or probe set may be included in the kit as a probe set and / or a primer set in which each primer or each probe is stored in a coexisting state so as not to adversely affect the reaction. it can.
  • HLA-LL HLA class I allele-deficient blood cell
  • Example 1 Detection of HLA-LL using a common mutation of HLA class I gene as an index by ddPCR method Therefore, 303 patients with aplastic anemia and healthy subjects were used by ddPCR method to detect this common mutation with high sensitivity.
  • the allelic frequency of the common mutation (nonsense mutation (c.19C> T)) identified in Reference Example 1 was measured for DNA samples extracted from whole blood collected from 24 subjects.
  • one type of FW primer (SEQ ID NO: 1) and four types of RV primers (SEQ ID NOs: 2 to 5) were designed for HLA-A.
  • FW primers SEQ ID NOs: 6 to 8
  • RV primers SEQ ID NOs: 9 to 11
  • the FW and RV primers were mixed so that the final concentration was 500 nM.
  • One probe was designed for each of the mutant sequence (SEQ ID NO: 13) and the normal sequence (SEQ ID NO: 12), and in order to increase the sensitivity, a probe in which LNA (Locked Nucleic Acids) was incorporated into a normal Taqman probe was designed. .. Each probe was adjusted to a final concentration of 250 nM.
  • the normal probe was labeled with HEX and the mutant probe was labeled with FAM. Iowa black FQ (IDT) was used as a quencher on the 3'end side of the probe sequence.
  • Each reagent was mixed at the ratio shown in Table 3, the reaction solution was set up, and the reaction solution was set in the reaction solution QX200 Droplet Generator (Bio-Rad) to prepare a Droplet.
  • the PCR reaction was performed using a thermal cycler under the conditions shown in Table 4, and after the PCR was completed, the measurement was performed with the QX200 Droplet reader (Bio-Rad) and analyzed with Quantasoft software (Bio-Rad). An example of the result is shown in FIG. 2 (A).
  • the mutation allele frequency was calculated by dividing the copy number of the mutant DNA of Mt by the copy number of the normal DNA of Wt plus the copy number of the mutant DNA.
  • Figure 3 shows an example of the actual measurement results.
  • the above cases were positive, and the allelic frequency of common mutations was calculated to be 1.28%.
  • the case below was a negative case and was judged negative because the allele frequency was 0.01%, which was less than the cutoff value.
  • 99 of 303 cases 99 of 303 cases (32.7%) were positive, and the median mutation clone size was 0.60% (range, 0.074-23.1%). ..
  • Example 2 Detection of HLA-LL using a common mutation of HLA class I gene as an index by ddPCR method
  • the allele frequency of the common mutation (nonsense mutation (c.19C> T)) was measured in the same manner as in Example 1.
  • FW primer SEQ ID NO: 14
  • four types of RV primer SEQ ID NOs: 2 to 5 were designed.
  • FW primers SEQ ID NOs: 6 to 8
  • RV primers SEQ ID NOs: 9 to 11
  • the FW and RV primers were mixed so that the final concentration was 500 nM.
  • One probe was designed for each of the mutant sequence (SEQ ID NO: 13) and the normal sequence (SEQ ID NO: 12), and in order to increase the sensitivity, a probe in which LNA (Locked Nucleic Acids) was incorporated into a normal Taqman probe was designed. .. Each probe was adjusted to a final concentration of 250 nM.
  • the normal probe was labeled with HEX and the mutant probe was labeled with FAM. Iowa black FQ (IDT) was used as a quencher on the 3'end side of the probe sequence.
  • Each reagent was mixed at the ratio shown in Table 6, the reaction solution was set up, and the reaction solution was set in the reaction solution QX200 Droplet Generator (Bio-Rad) to prepare a Droplet.
  • the PCR reaction was carried out using a thermal cycler under the conditions shown in Table 7, and after the PCR was completed, the measurement was performed with the QX200 Droplet reader (Bio-Rad) and analyzed with Quantasoft software (Bio-Rad).
  • the mutation allele frequency was calculated by dividing the copy number of the mutant DNA of Mt by the copy number of the normal DNA of Wt and the copy number of the mutant DNA, as in Example 1.
  • the cutoff value was also set to 0.07% as in Example 1.
  • FIG. 5 shows a comparison of the measurement results of Example 1 and Example 2 for the same case.
  • the upper part is the measurement result of Example 1
  • the lower part is the measurement result of Example 2.
  • Figure 6 shows the results of combining the PNH type blood cell test and the common nonsense mutation test using ddPCR. Similar to Example 1, the immune pathology could be detected in about 4/5 cases. In addition, a common nonsense mutation was detected in 34 of 108 cases (31.5%) who were "PNH type blood cell negative".
  • an assay system capable of finding a mutation at a specific site of the HLA-A and / or HLA-B gene common to HLA-LL-positive patients regardless of the HLA class I allele and detecting the common mutation with high sensitivity.
  • HLA typing since HLA typing is not required, the presence or absence of HLA-LL can be clarified within one day at a low cost of about 2000 yen per case.
  • an immune condition is involved in bone marrow failure syndrome such as aplastic anemia and myelodysplastic syndrome, which is extremely useful in the treatment of bone marrow failure syndrome. is there.

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Abstract

本発明は、HLAタイピングを行うことなしに、迅速かつ安価にHLA-LLを検出する方法を提供し、以て骨髄不全の診療を向上させることを目的とする。　本発明は、HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAを対象として、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法を提供することにより、上記課題を解決する。

Description

ＨＬＡクラスＩアレル欠失血球の検出方法
　本発明は、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法及びそのためのキットに関する。
　骨髄不全とは、骨髄機能の低下によってすべての血球の減少を来たす状態である。造血幹細胞の質的・量的異常によって起こる特発性の骨髄不全を総称して「骨髄不全症候群」ということがある。骨髄不全症候群は、近年、人口の高齢化に伴い患者数は増加傾向にある。骨髄不全の範疇には、再生不良性貧血（AA）、骨髄異形成症候群（MDS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）等が含まれるが、それらは互いにオーバーラップしており、境界が不明確であるため、治療に際しては病態に即した治療を行うことが重要である。
　再生不良性貧血は、造血幹細胞が減少することにより、貧血に伴う動悸、息切れや、白血球減少による易感染性、血小板減少による紫斑、出血傾向など種々の症状を呈する。再生不良性貧血の発症には、細胞傷害性T細胞（CTL）による造血幹細胞の直接的な傷害や、造血幹細胞を抑制するT細胞ホルモンの過剰、などの免疫学的機序による造血抑制が、多くの症例で関与していると考えられている。一方、一部の症例では、造血幹細胞自身の異常が原因となって発症するが、これらの成因を鑑別する有効な方法は確立されていない。
　再生不良性貧血や骨髄異形成症候群の診療においては、それらの発症に免疫病態が関与しているかどうかを判断することがもっとも重要である。というのも、これらの疾患に免疫病態が関与している場合、免疫抑制療法の奏効率が高く、毒性の強い別の治療が不用意に行われることを回避できるからである。免疫病態の関与を判断する最も簡便な方法として、フローサイトメトリーを用いた発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）形質の血球の検査がある。PNH型血球は、PNHに特徴的なGPIアンカー型膜タンパクを欠失した血球である。GPIアンカー型膜タンパクを欠失した造血幹細胞は、「造血幹細胞を静止期の状態に留める炎症性サイトカイン」に対する感受性が低下するために、このサイトカインが骨髄に高濃度に存在する環境では正常幹細胞に比べて活性化されやすくなり、それらがGPIアンカー型膜タンパク欠失血球を産生する。これが、免疫病態による骨髄不全でPNH型血球が検出されやすい理由と考えられている。
　しかし、PNH型血球は全ての施設で正確に検出できる訳ではなく、また、PNH型血球が陰性であっても免疫病態を否定できる訳ではない。このためPNH型血球以外の免疫病態マーカーが求められている。
　再生不良性貧血が、CTLによる造血幹細胞の攻撃によって起こることを示す最も直接的な証拠は、末梢血中のヒト白血球型抗原（HLA）クラスＩアレル欠失血球の存在である。CTLが標的細胞を攻撃するのは、標的細胞のHLAクラスＩ分子が提示する自己抗原ペプチドを、CTLが有するT細胞レセプターが認識するためである。ウイルス感染や環境毒への曝露等をきっかけとして、「造血幹細胞が高発現している自己抗原」に対するTリンパ球の「免疫寛容」が破綻し、その結果、造血幹細胞に対するCTLが誘導されると考えられる。健常者の骨髄には、様々な遺伝子に変異を起こした造血幹細胞が存在しているが、それらは通常静止期の状態にあるため、造血に寄与することはない。しかし、造血幹細胞に対するCTLの攻撃が起こると、造血に寄与している幹細胞が減少する一方、それを補うために眠っていた幹細胞が造血に動員される。この「起こされた」幹細胞の中に、HLAの遺伝子異常により特定のHLAクラスＩアレルを欠失した造血幹細胞があれば、それらはT細胞レセプターによって認識されないため、CTLの攻撃を免れて生き残り、HLAを欠失した血球を産生する。
　HLAを欠失した白血球は、該HLA分子に対する特異的な抗体を用いてフローサイトメトリー（FCM）により検出することができる。
　このHLAクラスＩアレルを欠失するメカニズムには、HLA遺伝子群が存在する第6染色体短腕のヘテロ接合体消失（6pLOH）によるHLA遺伝子ハプロタイプの喪失や、HLAクラスＩアレルの体細胞変異などが挙げられる。HLA遺伝子をコードしている第6染色体短腕（6p）の片方が細胞分裂の際に欠失すると、染色体のバランスを保つために、残存する染色体が欠失部分を補うように2倍体を形成する。その結果生じるのが6pLOHである。この現象によって、一方のHLAだけを持つようになった白血球が、再生不良性貧血全体の約13％で検出される（非特許文献１）。この6pLOHは、特定の遺伝子領域の遺伝子コピー数を定量できるSNPアレイ解析という方法で従来から調べられてきた。
　6pLOHの存在を検出する別の方法として、2つの対立遺伝子量のアンバランスを、droplet digital PCR（ddPCR）によって定量する方法が挙げられる（非特許文献２）。この方法は、正常であれば各対立遺伝子をPCRで増幅すると遺伝子量は1:1であるところが、6pLOHがある患者では、片方のみしか増幅されないため、増幅された遺伝子量が1:1とならないことを利用して、6pLOHの存在を検出するというものである。
　一方、HLAクラスＩ遺伝子の体細胞変異は、次世代シーケンサーを用いて、HLAクラスＩ遺伝子領域を詳細に調べることによって明らかとなった（非特許文献２、３）。
　以上のように、HLAクラスＩアレル欠失血球（以下、「HLA-LL」と略記する場合がある。）の存在を明らかにすることは、骨髄不全の病態を診断し、病態に即した適切な治療を行う上で非常に重要である。しかし、既存の検出方法には以下のような問題点がある。
（１）ddPCR法やFCMでHLA-LLを検出するためには、あらかじめ高額なHLAタイピングを実施する必要があること。
（２）HLAタイピングには通常1週間以上の時間がかかるため、その後のアッセイを含めると、HLA-LLの有無が明らかになるまでに1-3か月の時間を要すること。
（３）モノクローナル抗体で検出できるHLA抗原の種類は限られており、ddPCR法による6pLOH血球の検出もすべての例に適応できる訳ではないこと。
（４）次世代シーケンサーによるHLAアレルの体細胞変異の検出は、高額の費用と時間がかかるため、実用的ではないこと。
（５）これらすべての方法は、HLA-LLの検出感度が1％以上であるため、それより割合の低いHLA-LLは検出できないこと。
Katagiri et al., Blood, 118: 6601-6609(2011) Zaimoku et al., Blood, 129: 2908-2916(2017) Babushok et al., Blood Adv, 1:1900-1910(2017)
　従って、本発明の目的は、HLAタイピングを行うことなしに、迅速、高感度、かつ安価にHLA-LLを検出する方法を提供し、以て骨髄不全の診療を飛躍的に向上させることである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、HLA-LL陽性患者に共通する遺伝子異常がないかを検索するため、6pLOHを有する患者のHLAクラスＩ遺伝子を次世代シーケンサーを用いて詳細に解析した。その結果、解析した22例中12例において、1症例当たり1-3種類（中央値1種類）の機能喪失型変異を検出した。驚くべきことに、検出した機能喪失型変異のほとんどが、HLAクラスＩアレルの種類に関係なく、HLA-A又はHLA-B遺伝子のエクソン1領域における特定の箇所に集中していた。この共通変異は、再生不良性貧血患者による保有頻度が最も高いHLAクラスＩアレル（HLA-B*40:02）の解析において以前に見出されていたが（非特許文献２、３）、任意のHLAクラスＩアレル間で共通する変異であることは全く認識されていなかった。
　本発明者らは、この共通変異を簡便かつ高感度で検出することができれば、事前にHLAタイピングを行うことなくHLA-LLの有無を迅速に評価し得ると考え、次世代PCR法であるddPCR法に着目した。HLA遺伝子は全遺伝子の中で最も多型性の高い遺伝子であるため、特定の領域のみを増幅させるプライマーとプローブを作製することは極めて困難であったが、本発明者らは、試行錯誤の結果、高感度にこの変異を検出するプライマー-プローブセットの設計に成功した。このプライマー-プローブセットを用いて、末梢血由来のDNAを鋳型としてddPCR法を実施したところ、再生不良性貧血353例中101例（約29%）で当該共通変異が検出された。また、この方法を従来のPNH型血球検査と組み合わせれば、約4/5の症例で免疫病態を検出できることが明らかになった。特筆すべきことに、PNH型血球陰性108例の中にも34例（31％）で共通変異が検出された。したがって本方法を用いれば、PNH型血球検査では病態診断が困難な症例であっても免疫病態を検出できることが明らかになった。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法。
〔２〕機能喪失型変異がナンセンス変異である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕デジタルPCR法を用いて機能喪失型変異を検出する、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕被験者が骨髄不全症候群患者又はその疑いのある者である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕骨髄不全が、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群及び発作性夜間ヘモグロビン尿症からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、〔４〕に記載の方法。
〔６〕PNH型血球の検出と組み合わせて用いられる、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球検出のためのキットであって、
（ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット、
（ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、並びに
（ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
を含む、キット。
〔８〕機能喪失型変異がナンセンス変異である、〔７〕に記載のキット。
〔９〕（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含む
〔７〕又は〔８〕に記載のキット。
〔１０〕前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなり、前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなる、［８］又は［９］に記載のキット。
　本発明によれば、HLAタイピングを行うことなしに、簡便かつ高感度にHLA-LLを検出することができるので、HLAタイピングが必要な従来法と比べて、きわめて迅速かつ安価に骨髄不全の免疫病態を診断することができる。
HLA-LL陽性患者22例について、次世代シーケンサーを用いてHLAクラスＩ遺伝子の変異の有無を解析した結果を示す図である。左の円グラフは、22例中12例で6pLOHに加えて機能喪失型変異が見出されたことを示す。右図は、HLA-A及びHLA-B遺伝子のどの位置にどのような種類の変異が起こっているかを模式的に示す。 （Ａ）ddPCR法を用いた本発明の検出方法の結果の一例を示す図である。（Ｂ）本発明の検出方法におけるカットオフ値の決定の様子を示す。左は希釈系列を用いた検出感度の検定結果を示し、右は健常者24名における検出結果（全例が0.07％未満）を示す。 ddPCR法を用いた本発明の検出方法の実際の検査結果（実施例１）を示す図である。上がHLA-LL陽性例、下がHLA-LL陰性例を示す。 再生不良性貧血患者303例（実施例１）におけるPNH型血球の有無及び本発明の共通変異の有無の内訳を示す図である。 同一症例における実施例１（上）と実施例２（下）の検査結果の比較を示す図である。プライマーとPCR試薬の種類を変更することにより増幅効率が向上し、ddPCRの反応時間を短縮することができ、分離能も顕著に改善した。 再生不良性貧血患者353例（実施例２）におけるPNH型血球の有無及び本発明の共通変異の有無の内訳を示す図である。
［Ｉ］本発明の検出方法
　本発明は、HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）を検出する方法（以下、「本発明の検出方法」ともいう。）を提供する。
　アレルとは、一対の相同染色体の同じ遺伝子座に存在する個々の遺伝子を指す。「HLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）」は、6pLOHにより1個以上のHLAクラスＩ（例、HLA-A、HLA-B、HLA-C）対立遺伝子を欠失するか、特定のHLAクラスＩアレルの機能喪失型変異によって、当該対立遺伝子にコードされるHLAクラスＩ分子を表面上に発現しない白血球を意味する。
　本発明の検出方法は、被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチド（以下、「標的ヌクレオチド」ともいう。）における機能喪失型変異を検出する工程を含む。
　本発明の検出方法において、測定対象となる「被験者」は、骨髄不全症候群患者又はその疑いのある者である。骨髄不全とは、骨髄機能の低下によってすべての血球の減少を来たす状態であり、「骨髄不全症候群」とは、造血幹細胞の質的・量的異常によって起こる特発性の骨髄不全の総称である。骨髄不全症候群の範疇には、再生不良性貧血（AA）、骨髄異形成症候群（MDS）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、大顆粒リンパ球増多症（LGL）、赤芽球癆（PRCA）、等が含まれる。本発明の検出方法における主な被験者は、骨髄不全の発症に免疫病態が関与している可能性がある再生不良性貧血、骨髄異形成症候群もしくは発作性夜間ヘモグロビン尿症患者、又はその疑いのある者である。
　本発明の検出方法は、HLAタイピングを行うことなしに、被験者におけるHLA-LLの有無を迅速に検出できることに最大の特徴がある。従って、本発明の検出方法における被験者は、HLAタイプが既知である必要はない。
　本発明の検出方法に用いる被験者由来のサンプルとしては、白血球を含む末梢血から抽出したゲノムDNAが挙げられる。例えば、通常の採血により被験者から採取した血液からフェノール抽出法などによりゲノムDNAを単離することができる。その際、例えば、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kitなどの市販のゲノムDNA抽出キットや装置を用いてもよい。
　本発明の検出方法において検出対象となる機能喪失型変異は、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドであるシトシン（c.19C）における機能喪失型変異である。当該ヌクレオチドは、HLA-A及びHLA-B遺伝子のエクソン1内に位置し、7番目のコドン（CGA）の第１ヌクレオチドにあたる。機能喪失型変異としては、例えば、ナンセンス変異、フレームシフト変異などが挙げられる。本発明において検出するナンセンス変異は、19番目のシトシンがチミンに置換することにより終止コドン（TGA）を生じる変異（c.19C>T）である。一方、フレームシフト変異としては、19番目のヌクレオチドの位置における1もしくは2ヌクレオチドの欠失又は挿入が挙げられるが、好ましくは19番目のシトシンの欠失（c.19delC）によるフレームシフト変異である。より好ましくは、本発明の検出方法における検出対象となる機能喪失型変異は、19番目のシトシンがチミンに置換すること（c.19C>T）によるナンセンス変異である。
　一般に遺伝子における機能喪失型変異の有無は、当分野で公知の任意の多型解析方法によって行うことができる。例えば、PCR法を用いた方法が挙げられる。PCR法を用いた方法としては、対象の核酸をPCR法により増幅し、増幅産物の変異を蛍光又は発光によって検出する方法、PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アレル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、TaqMan（登録商標、Roche Molecular Systems社）-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin.Microbiol.,34,2933(1996))に代表されるリアルタイムPCR法、デジタルPCR法（例：droplet digital PCR（ddPCR）法、微細孔分配式デジタルPCR法等）などが挙げられる。
　その他の方法として、サイクリングプローブ法、Invader（登録商標、Third Wave Technologies社）法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を利用した方法（Heller, Academic Press Inc, pp. 245-256(1985)、Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790-8794(1988)、国際公開第99/28500号公報、特開2004-121232号公報など）、DNAチップ又はマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）などがある。
　微量な変異DNAを検出するためには、簡便性や感度の点からPCR法を用いた方法が好ましい。また、従来のリアルタイムPCRとは異なり、増幅効率を気にしなくてよく、絶対定量が可能で、高精度・高感度で処理性能にも優れた次世代PCRであるデジタルPCR、就中ddPCRが特に好ましい。
　PCR法を用いる場合、本発明の検出方法は、例えば、以下のようにして行うことができる。
（１）標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
（３）工程（２）で増幅したPCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
（４）前記（３）の測定結果に基づき、標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程
（１）プローブセットとDNAサンプルとを接触させる工程
（ａ）プローブセット
　工程（１）に用いる標的ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブセットとしては、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の、標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列とハイブリダイズする約5～約30塩基、好ましくは約7～約20塩基の連続したヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。該プローブセットは、標的ヌクレオチド部分が正常型（シトシン）と変異型（機能喪失型変異がナンセンス変異の場合、チミン）である2種類のプローブからなる。
　本発明の好ましい一実施態様においては、該プローブセットは、HLA-AおよびHLA-B遺伝子に対して、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列（CCCCGAACC）と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチド（正常型）と、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチド（変異型）である。ここで配列番号１３で表されるヌクレオチド配列（CCCTGAACC）と実質的に同一の配列からなるオリゴヌクレオチドは、HLA-A及びHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドにおけるナンセンス変異を検出するためのプローブである。配列番号１２で表される配列は、HLA-A及びHLA-B両遺伝子のコード配列の16～24番目のヌクレオチド配列に相当し、大半のアレルで、両遺伝子間で配列が完全に一致するので、一種類のプローブセットでHLA-A及びHLA-Bの両方を測定することができる。
　ここで「実質的に同一の配列」とは、完全に同一な配列だけでなく、「HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列にPCR反応の条件下でハイブリダイズし得ることを条件として、上記の各配列番号で表されるヌクレオチド配列において、標的ヌクレオチドに対応するヌクレオチドを除く1もしくは2ヌクレオチド、好ましくは1ヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている配列」をも包含することを意味する。好ましくは、本発明に用いられるプローブセットは、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（正常型）と、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド（変異型）である。
　各プローブには標識物質を結合させることができる。該標識物質は、例えば、蛍光色素等が挙げられる。かかる蛍光色素は、種々のものが市販されており、例えば、6-FAM（フルオレセイン）、HEX、TE、Quasar 670、Quasar 570、Quasar 705、Pulsar 650、TET、HEX、VIC、JOE、CAL Fluor Orenge、CAL Fluor Gold、CAL Fluor Red、Texas Red、Cy、Cy5などが挙げられる。正常型プローブに結合される蛍光色素と、変異型プローブに結合される蛍光色素とは、異なるものであることが好ましい。この構成をとることにより、正常な標的ヌクレオチド（c.19C）を有するHLA断片には正常型プローブが、機能喪失型変異を生じる標的ヌクレオチド（ナンセンス変異の場合、c.19C>T）を有するHLA断片には変異型プローブがそれぞれハイブリダイズすることで、各プローブの蛍光色素に由来する2種類の蛍光が検出される。
　各プローブは、さらに蛍光物質からの蛍光を消光できるクエンチャーが結合されていることが好ましい。クエンチャーとしては、蛍光色素からの蛍光を消光できるものであれば特に制限されず、蛍光色素であっても非蛍光色素であってもよいが、検出の精度の観点から非蛍光色素が好ましい場合があり得る。具体的なクエンチャーとしては、例えば、6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、Eclipse Dark Quencher、Iowa black FQ（IBFQ）、minor groove binder（MGB）、非蛍光クエンチャー（NFQ）などが挙げられる。
　プローブの構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。前記ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。リボヌクレオチドは、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びウラシル（U）（チミン（T）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（dA）、グアニン（dG）、シトシン（dC）及びチミン（dT）（ウラシル（dU）に置き換えることもできる）を有する。
　これらのヌクレオチドは、修飾されていても（修飾されたヌクレオチド残基を「修飾ヌクレオチド残基」と称することがある）、非修飾であってもよい（非修飾のヌクレオチド残基を「非修飾ヌクレオチド残基」と称することがある）。修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性が向上し、その結果安定性が向上し得る。修飾ヌクレオチド残基を有する場合、プローブ中の修飾ヌクレオチド残基の存在位置及び割合は特に限定されない。また、非修飾ヌクレオチド残基や修飾ヌクレオチド残基とは異なる分子で構成されるリンカー領域を含んでいてもよい。
　前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」には、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失が挙げられる。前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等が挙げられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら（Limbach et al., 1994, Summary:the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res．22:2183～2196）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、ヌクレオチドの代替物の残基が挙げられる。
　前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、糖－リン酸骨格（該骨格には、塩基も含まれる）（以下、糖リン酸骨格）の修飾が挙げられる。前記糖リン酸骨格において、糖がリボースの場合、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾、あるいは該水酸基を水素又はフルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。以下では、前記のように糖の2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾した核酸を2'－O－メチル修飾核酸と称することがある。また、本発明において、「核酸」にはヌクレオチドなどの核酸モノマーが包含される。
　前記糖リン酸骨格は、例えば、非リボース残基（非デオキシリボース残基も包含されるものとする）及び／又は非リン酸を有する非リボースリン酸骨格に置換してもよく、このような置換も糖リン酸骨格の修飾に包含される。前記非リボースリン酸骨格は、例えば、前記糖リン酸骨格の非荷電体が挙げられる。前記非リボースリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等が挙げられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸が挙げられる。具体例として、例えば、PNA（ペプチド核酸）、架橋構造型人工核酸（BNA：Bridged Nucleic Acid）などが挙げられる。BNAとしては、例えば、ロックト人工核酸（LNA：Locked Nucleic Acid）、2’-O,4’-C-エチレン架橋核酸（ENA：2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acid）などが挙げられるが、好ましくはLNAである。
　前記工程（１）において、該プローブセットと、DNAサンプルとを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、同一溶液中にプローブセットとDNAとを加えることで行うことができる。
　また、上記溶液中には、通常PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼが含まれる。
（ｂ）PCRプライマーセット
　該PCRプライマーセットは、HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドを含む部分ヌクレオチド配列を特異的に増幅し得る、約15～約30塩基のフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるセットであれば特に制限はないが、HLA遺伝子は機能的遺伝子の中では最も高度な多型性を示すので、任意のHLAタイプについて標的ヌクレオチドを含む領域を増幅し得るようにするためには、多個体のHLA-A及びHLA-B遺伝子の配列情報を元に、標的ヌクレオチドを挟む領域で最も多型性の低い領域を選択し、必要に応じて、複数種のプライマーを設計することが望ましい。
　当該プライマーセットを構成するヌクレオチドとしては、前記プローブセットと同様のものを用いることができ、また、前記プローブを構成するヌクレオチドと同様の修飾を施されたものであってもよい。
　本発明の好ましい一実施態様においては、該プライマーセットとして、HLA-A遺伝子に対しては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットを挙げることができる。また、HLA-B遺伝子に対しては、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットを挙げることができる。
　ここで「実質的に同一の配列」とは、完全に同一な配列だけでなく、「HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の各標的配列にPCR反応の条件下でハイブリダイズし得ることを条件として、上記の各配列番号で表されるヌクレオチド配列において、1もしくは2ヌクレオチド、好ましくは1ヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加された配列」をも包含することを意味する。好ましくは、本発明に用いられるプライマーセットは、HLA-A遺伝子に対しては、配列番号１及び／又は１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットである。また、HLA-B遺伝子に対しては、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むプライマーセットである。
（ｃ）DNAポリメラーゼ
　上記DNAポリメラーゼは、通常PCR法に用いられるDNAポリメラーゼであれば特に限定されない。
（２）標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する工程
　前記工程（２）において、標的ヌクレオチドを含む領域をPCRにより増幅する方法は特に限定されないが、デジタルPCR法により増幅することが好ましい。デジタルPCRは、例えば、次の手順により行われる。デジタルPCR装置に、プローブセット、DNAサンプル、PCRプライマーセット及びDNAポリメラーゼを含む反応溶液をセットする。ここで各反応液成分の混合比率は、自体公知の範囲で適宜選択し、最適化することができる。例えば、後述の実施例に示される混合比率とすることが挙げられるが、使用するプライマーセットやプローブセット等に応じて適宜変更することができる。但し、骨髄不全症候群患者では、全血であっても十分量のDNAを得られない可能性があるので、DNAサンプル量は反応溶液あたり50～200ng、好ましくは80～150ngとすることが好ましい。
　デジタルPCR装置により、反応溶液はチップに設けられた数千から数万という多数の反応ウェルに分配される。反応ウェルは、例えば、開口の大きさが数十μｍである微小なウェルやナノリットルサイズのドロップレットである。反応ミックスをチップに添加すると、チップ上の一部の反応ウェルにはHLA-A又はHLA-Bアレルが好ましくは１コピー程度含まれ、その他の反応ウェルには該アレルが含まれない状態となるよう、反応ミックスが反応ウェルに分配される。複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内でPCRを実施すると、目的のHLAアレルが存在する反応ウェルでは、該アレルの一部の領域が増幅され、その際に、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により、標的領域に結合したプローブが切断され蛍光色素が乖離し、蛍光を発する。
（３）PCR産物を含む溶液の蛍光強度を測定する工程
　前記工程（３）における蛍光強度を測定は、例えば、自体公知の蛍光リーダーを用いて行うことができる。前記PCRをデジタルPCRで行った場合には、例えば、デジタルPCR装置のリーダーにより、蛍光が検出された反応ウェルの数を計測することで、蛍光強度が測定できる。蛍光色素が異なる複数のプローブを用いた場合には、各蛍光に由来する蛍光を検出することで、複数の蛍光強度を一度に測定することができる。
（４）標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程
　前記工程（４）において、前記工程（３）の測定結果に基づき、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の標的ヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出することができる。即ち、前記測定結果から、各遺伝子について、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数を求め、変異DNAのコピー数を、正常DNAのコピー数と変異DNAのコピー数の和で除すことにより、変異のアレル頻度を算出することができる。
　得られた変異のアレル頻度がカットオフ値よりも高い場合、被験者はHLA-LL陽性であると判定することができる。ここでカットオフ値は、例えば、一定数以上の健常者から採取した血液由来のDNAを鋳型として、上記と同様にしてPCR反応を実施し、変異のアレル頻度（偽陽性率）を算出して得られる中央値又は平均値よりも十分に高く（例えば、+3SD）、かつPCR反応の検出限界よりも高い数値で適宜決定することができる。カットオフ値は、測定に用いるDNA量に依存するが、後述の実施例のようにDNA量を反応溶液あたり100ngとした場合、健常者における偽陽性率は0～0.042%（中央値0.009％）であり、感度検定の結果と合わせてカットオフ値を0.07%と設定した。
　本発明の検出方法によって、HLA-LL陽性と判定された場合、被験者は、免疫学的機序による造血幹細胞の傷害により骨髄不全を発症している可能性が高いと判断することができる。従って、該被験者には、免疫抑制療法、例えば抗胸腺細胞免疫グロブリン（ATG）及び／又はシクロスポリン（CsA）の投与が有効であると予測することができる。
　以上の観点から、本発明はまた、本発明の検出方法を実施すること、その結果、HLA-LL陽性と判定された被験者に対して、免疫抑制療法、例えばATG及び／又はCsAの投与を行うことを含む、骨髄不全における免疫病態の診断及び治療方法を提供する。
　本発明の検出方法をPNH型血球検査と組み合わせて用いることができる。上述のように、PNH型血球は全ての施設で正確に検出できる訳ではなく、また、PNH型血球が陰性であっても免疫病態を必ずしも否定できない。従って、特に、PNH型血球検査で陰性であった被験者に対して、本発明の検出方法を実施することが望ましい。本発明の検出方法において、HLA-LL陽性と判定された場合、PNH型血球陰性であっても、免疫学的機序による造血幹細胞の傷害により骨髄不全を発症していると考えられる。従って、これらの例では免疫抑制療法が有効であると予測することができる。PNH型血球検査は、例えば、Sugimori et al., Blood, 107: 1308-1314 (2006)、特開2012-122954号公報に記載の方法等により実施することができるが、それらに限定されない。
［ＩＩ］本発明のキット
　本発明はまた、HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球の検出のためのキット（以下、「本発明のキット」ともいう。）を提供する。当該キットは、上記の本発明の検出方法を実施するのに適したキットであり、下記（ａ）のプライマーセットと下記（ｂ１）及び（ｂ２）のプローブセットとを構成として含む。
（ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット
（ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
（ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
　好ましい実施態様において、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異はナンセンス変異又はフレームシフト変異であり、より好ましくはナンセンス変異である。
　前記（ａ）のプライマーセットは、任意のHLAタイプを有する被験者由来のDNAから、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の該19番目のヌクレオチドを含む領域を増幅し得るものであることが望ましい。HLA遺伝子は機能的遺伝子の中では最も高度な多型性を示すので、任意のHLAタイプについて標的ヌクレオチドを含む領域を増幅し得るようにするためには、できるだけ多型性の低い領域にプライマー配列を設定することが望ましい。
　好ましい一実施態様においては、前記（ａ）のプライマーセットとして、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含むものが挙げられる。
　ここで「実質的に同一の配列」とは前記本発明の検出方法における「（ｂ）PCRプライマーセット」の場合と同義である。
　より好ましくは、前記（ａ）のプライマーセットは、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１及び／又は１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれからなる１以上のリバースプライマーとを含むものである。
　特に好ましくは、前記（ａ）のプライマーセットは、
（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１又は１４（好ましくは、配列番号１４）で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる4種のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
（ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる3種のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列のそれぞれからなる3種のリバースプライマーとを含むものである。
　（ａ１）において、配列番号１４で表されるヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーを用いると、他のPCR試薬の種類によっても異なるが、増幅効率がより向上し、分離能を改善させ得る。
　また、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異がナンセンス変異の場合、好ましくは、
　前記（ｂ１）のプローブは、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるものであり、
　前記（ｂ２）のプローブは、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるものである。
　ここで「実質的に同一の配列から」とは前記本発明の検出方法における「（ａ）プローブセット」の場合と同義である。
　より好ましくは、該プローブセットは、
　前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、
　前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列からなるものである。
　本発明のキットは、前記（ａ）のプライマーセットと、上記（ｂ１）の正常型プローブ及び上記（ｂ２）の変異型プローブからなるプローブセットとに加えて、上記の本発明の検出方法におけるPCR反応に使用される試薬類、例えば、DNA抽出用試薬、DNAポリメラーゼ、dNTPs、反応緩衝液、PCRの陽性コントロールとなる標的領域を含む核酸等、さらには、容器、器具、説明書などを含むことができる。また、上記プライマーセット又はプローブセットは、各プライマー又は各プローブを共存状態で保存することにより、反応に悪影響を及ぼさない限り、それらを混合したプローブセット及び／又はプライマーセットとして、キットに含めることができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１　HLAクラスＩアレル欠失血球（HLA-LL）陽性患者に共通する遺伝子異常の同定
　HLAクラスＩアレル欠失血球陽性患者22例について、HLAクラスＩ遺伝子を次世代シーケンサー（機種：Miseq; illumina社）を用いて解析した。その結果、22例中12例に、1症例当たり1-3種類（中央値1種類）の機能喪失型変異が検出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに興味深いことに、検出した機能喪失型変異のほとんどがHLAクラスＩアレルに関係なく、HLA-A及びHLA-B遺伝子のエクソン1中のコード配列の19番目のヌクレオチド(c.19C)に集中していることが明らかとなった（図１）。従って、この共通変異は、HLAをタイピングすることなくHLA-LLの有無を評価するための有用なマーカーとなり得ることが示唆された。
実施例１　ddPCR法によるHLAクラスＩ遺伝子の共通変異を指標にしたHLA-LLの検出
　そこで、この共通変異を高感度で検出するためddPCR法を用いて、再生不良性貧血患者303例と健常者24名から採取した全血より抽出したDNAサンプルについて、参考例１で同定された共通変異（ナンセンス変異（c.19C>T））のアレル頻度を測定した。
　すべてのHLAクラスＩ遺伝子の多型をカバーするため、HLA-Aに対して、FW primer 1種類（配列番号１）、RV primer 4種類（配列番号２～５）を設計した。また、HLA-Bに対しては、FW primer 3種類（配列番号６～８）、RV primer 3種類（配列番号９～１１）を設計した。FW及びRV primerは、それぞれ最終濃度が500 nMになるように混合した。Probeは変異配列（配列番号１３）と正常配列（配列番号１２）にそれぞれ1種類ずつ設計し、より感度を高めるために、通常のTaqman probeにLNA (Locked Nucleic Acids) を組み入れたprobeを設計した。それぞれのprobeが最終濃度250 nMとなるよう調整した。正常型プローブはHEXで、変異型プローブはFAMで標識した。クエンチャーとしてprobeの配列の3’末端側にIowa black FQ (IDT) を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表３に示す比率でそれぞれの試薬を混合し、反応液をセットアップし、該反応液QX200 Droplet Generator（Bio-Rad社）にセットしてDropletを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Droplet作製後、表４に示す条件でサーマルサイクラーを用いてPCR反応を行い、PCR終了後、QX200 Droplet reader（Bio-Rad社）で測定し、Quantasoft software（Bio-Rad社）で解析した。結果の一例を図２（Ａ）に示す。変異のアレル頻度の計算は、Mtの変異DNAのコピー数を、Wtの正常DNAのコピー数と変異DNAコピー数を足したもので割ることで計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　再生不良性貧血患者は、全血であっても十分量のDNAを得られない可能性があるため、本プロトコールで使用するDNA量は100 ngという少量に設定した。健常者24名の共通変異のアレル頻度の中央値は0.009 %であったことから、希釈系列によって決定した感度の結果と合わせて、カットオフ値を0.07%と設定した（図２（Ｂ））。
　図３に実際の測定結果の例を示した。上の症例は陽性例で、共通変異のアレル頻度は1.28%と算出された。下の症例は陰性例で、アレル頻度は0.01%とカットオフ値未満のため、陰性と判定された。303例についてこのddPCR法を用いて共通変異を検出したところ、303例中99例（32.7%）が陽性であり、変異クローンサイズの中央値は0.60% (range, 0.074-23.1%)であった。
　PNH型血球検査と、ddPCRを用いた共通ナンセンス変異検査を組み合わせることにより、図４に示すように、約4/5の症例で免疫病態を検出することができるようになった。特に重要な所見は、ddPCRを用いた本アッセイにより、これまでは病態診断が困難であった「PNH型血球陰性」の92例中30例（32.6%）に共通ナンセンス変異が検出されることである。
実施例２　 ddPCR法によるHLAクラスＩ遺伝子の共通変異を指標にしたHLA-LLの検出（２）
　実施例１で調べた303例を含む再生不良性貧血患者353例と健常者24名から採取した全血より抽出したDNAサンプルについて、一部のプライマー、試薬、及びPCR条件を変えた以外は実施例１と同様にして、共通変異（ナンセンス変異（c.19C>T））のアレル頻度を測定した。
　HLA-Aに対して、FW primer 1種類（配列番号１４）、RV primer 4種類（配列番号２～５）を設計した。また、HLA-Bに対しては、FW primer 3種類（配列番号６～８）、RV primer 3種類（配列番号９～１１）を設計した。FW及びRV primerは、それぞれ最終濃度が500 nMになるように混合した。Probeは変異配列（配列番号１３）と正常配列（配列番号１２）にそれぞれ1種類ずつ設計し、より感度を高めるために、通常のTaqman probeにLNA (Locked Nucleic Acids) を組み入れたprobeを設計した。それぞれのprobeが最終濃度250 nMとなるよう調整した。正常型プローブはHEXで、変異型プローブはFAMで標識した。クエンチャーとしてprobeの配列の3’末端側にIowa black FQ (IDT) を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表６に示す比率でそれぞれの試薬を混合し、反応液をセットアップし、該反応液QX200 Droplet Generator（Bio-Rad社）にセットしてDropletを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Droplet作製後、表７に示す条件でサーマルサイクラーを用いてPCR反応を行い、PCR終了後、QX200 Droplet reader（Bio-Rad社）で測定し、Quantasoft software（Bio-Rad社）で解析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　変異のアレル頻度の計算は、実施例１と同様に、Mtの変異DNAのコピー数を、Wtの正常DNAのコピー数と変異DNAコピー数を足したもので割ることで計算した。カットオフ値も実施例１と同様に0.07%に設定した。
　図５に、同一症例についての実施例１と実施例２の測定結果の比較を示した。上は実施例１の測定結果であり、下は実施例２の測定結果である。フォーワードプライマー及びPCR試薬を変更することにより、実施例１の場合よりも増幅効率が向上し、ddPCRの反応時間を1時間以上短縮することができ、分離能（特にWtのドット）も顕著に改善した。再生不良性貧血患者353例についてこのddPCR法を用いて共通変異を検出したところ、353例中101例（28.6%）が陽性であり、変異クローンサイズの中央値は0.42% (range, 0.071-23.1%)であった。
　PNH型血球検査と、ddPCRを用いた共通ナンセンス変異検査とを組み合わせた結果を図６に示す。実施例１と同様に、約4/5の症例で免疫病態を検出することができ。また、「PNH型血球陰性」の108例中34例（31.5%）に共通ナンセンス変異が検出された。
　本発明において、HLAクラスＩアレルに関係なく、HLA-LL陽性患者に共通するHLA-A及び／又はHLA-B遺伝子の特定部位の変異を見出し、該共通変異を高感度に検出し得るアッセイ系を確立した。本法によれば、HLAタイピングが不要であるため、1症例あたり2000円程度の安価で、1日以内にHLA-LLの有無を明らかにすることができる。その結果、再生不良性貧血や骨髄異形成症候群をはじめとする骨髄不全症候群において免疫病態が関与しているか否かを迅速かつ簡便に鑑別することができることから、骨髄不全症候群の診療にきわめて有用である。
　本出願は日本で出願された特許出願である特願２０１９－０９０２１９（出願日：２０１９年５月１０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (10)

  1. 　HLAタイプが未知の被験者から採取した血液由来のDNAにおける、HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドにおける機能喪失型変異を検出する工程を含む、HLAクラスＩアレル欠失血球の検出方法。
  2. 　機能喪失型変異がナンセンス変異である、請求項１に記載の方法。
  3. 　デジタルPCR法を用いて機能喪失型変異を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　被験者が骨髄不全症候群患者又はその疑いのある者である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　骨髄不全が、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群及び発作性夜間ヘモグロビン尿症からなる群より選択される疾患によって引き起こされる、請求項４に記載の方法。
  6. 　PNH型血球の検出と組み合わせて用いられる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　HLAタイプが未知の被験者におけるHLAクラスＩアレル欠失血球検出のためのキットであって、
    （ａ）HLA-A及び／又はHLA-B遺伝子のコード配列の19番目のヌクレオチドを含む、該遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセット、
    （ｂ１）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが正常なものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ、並びに
    （ｂ２）上記（ａ）のプライマーセットにより増幅されるPCR産物のうち、該19番目のヌクレオチドが機能喪失型変異を生じさせるように変異したものに特異的にハイブリダイズし得るプローブ
    を含む、キット。
  8. 　機能喪失型変異がナンセンス変異である、請求項７に記載のキット。
  9. 　（ａ１）HLA-A遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなるフォーワードプライマーと、配列番号２～５で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含み、並びに／あるいは
    （ａ２）HLA-B遺伝子の部分ヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーセットが、配列番号６～８で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のフォーワードプライマーと、配列番号９～１１で表されるヌクレオチド配列から選択される１以上のヌクレオチド配列のそれぞれと実質的に同一の配列からなる１以上のリバースプライマーとを含む請求項７又は８に記載のキット。
  10. 　前記（ｂ１）のプローブが、配列番号１２で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなり、前記（ｂ２）のプローブが、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列と実質的に同一の配列からなる、請求項８又は９に記載のキット。
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