JP6435139B2 - 染色体キメラの検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウシの染色体キメラの検出方法に関する。

ウシの畜産農家は、ウシ個体の遺伝的特徴を一頭ごとに確認する場合がある。これは、ウシ個体の形質、肉質、遺伝子疾患や疾患のキャリア、品種、親子関係等を明確にすることで、そのウシの価値を見定め、価値を高めることを目的としている。また、それによって、経済損失を防ぐことができる。

ウシ個体の遺伝的特徴の確認には、ＤＮＡ多型を用いた検査が用いられている。ＤＮＡ多型を用いた検査方法には、マイクロサテライト多型を用いるものと一塩基多型（ＳＮＰ）を用いるものの２通りがある。マイクロサテライトは、ゲノム上に存在する複数のヌクレオチドを一単位とする繰り返し配列である。この繰り返し配列の繰り返し回数に個体差がある場合、これをマイクロサテライト多型という。マイクロサテライト多型は３万から１０万塩基対に１箇所存在している。一塩基多型（ＳＮＰ）とは、ＤＮＡを構成するヌクレオチド配列の１箇所の塩基が異なる塩基に変化（置換）している現象およびその箇所をいう。ＳＮＰはゲノム上に最も多く存在しているＤＮＡ多型である。

マイクロサテライトは、繰り返し配列とその近傍領域をＰＣＲ増幅し、その配列長を確認することで、解析できる。また、一つのマイクロサテライトから得られる情報量が多いため、複数のマイクロサテライトを解析することで詳細な検査を行うことを可能としている。しかしながら、マイクロサテライトは突然変異率が比較的高く、短い世代で新たな変異が発生する頻度が高い。また、マイクロサテライトの解析は熟練度を要するという欠点がある。一方、ＳＮＰ解析の場合は、一つのＳＮＰから得られる情報量は少ないものの、マルチプレックスＰＣＲを行い、複数のＳＮＰを同時に解析することで、詳細な検査を行うことが可能になる。また、突然変異率が低いためＤＮＡマーカーとして安定している。さらに、対立遺伝子が２個であるので解析も容易であり、ＳＮＰに起因する遺伝性疾患等を判定することができ、親子鑑定にも用いることができる。

畜産業において、ウシの疾患の発生は畜産農家の経済的損失につながる重大な問題である。そのような疾患の一つとして、フリーマーチン（ｆｒｅｅｍａｒｔｉｎ）が挙げられる。フリーマーチンは、ウシの異性多胎において、胎児として発達していく際に、胎盤中で２個の胎子の絨毛膜が融合し、お互いの血管が吻合することで、雄胎子の血液が雌胎子の中に混ざる（すなわち、血液キメラとなる）ことにより、発生する。フリーマーチンの雌胎子では生殖器の分化に異常をきたし、結果、生まれた雌個体は不妊となる。ウシの異性多胎では、雌の９０％以上がフリーマーチンとなるとされている。フリーマーチンの個体は、雄と雌の両方のＤＮＡを保持しており、性染色体はＸＸ／ＸＹのキメラ状態となっている。

キメラとは、同一個体内に異なる遺伝情報を有する細胞が混在している状態である。ウシは多胎である場合、親ウシの子宮内で、一方の胎子の血液細胞が他方の胎子の中に混ざり、その血液細胞が骨髄に定着することで、他方の胎子が染色体キメラになるという現象が発生することがある。

通常、ウシの生体の遺伝的特徴の確認において、遺伝子検査のサンプルとしては、毛根が一般的に用いられている。これは、血液サンプルの採取のように、獣医師の立ち会いを必要としないからである。しかし、毛根のサンプルの採取は、例えば数十から数百本の毛を引き抜いて採取するなど、採取箇所を傷つけることとなり、ウシへストレスを与えるとともに、感染症を引き起こす危険性が考えられる。

さらに、染色体キメラの個体であっても、全ての細胞が染色体キメラとなってはおらず、例えば、毛根由来の細胞は染色体キメラとなっていない。このため、様々な染色体キメラの確認を行うためには、別個血液サンプルを採取し、検出を行う必要があった。これは獣医師の立ち会いを必要とし、畜産農家にとって負担の大きい、煩雑なものである。このため、染色体キメラを簡便に検出する方法を確立することが望まれている。

特開平１１−２４３９６６号公報 国際公開第２００９／０５４３６７号

Ｆｕｊｉｓｈｉｒｏら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、４３：８８３ページ−８９１ページ， １９９５年 ＥＮＮＩＳら、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ、６７、１１１ページ−１１２ページ、１９９９年

本発明の解決課題は、従来法に比べより簡便かつ低コストで実施できる、フリーマーチンなどのウシの染色体キメラの検査方法を提供することである。また、かかる検査方法を実施するためのキットを提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、鼻腔内から採取した検体を用いて、染色体キメラを簡便に検査できることを見出し、本発明を完成させた。これまで、染色体キメラの確認を行うには血液サンプル由来の核酸の利用が最適であるとされてきたが、今回、鼻腔内細胞由来の核酸の利用でも、同じ精度で染色体キメラの確認が実施できることが確認できた。

すなわち、本発明は、以下を提供するものである：
（１）ウシの染色体キメラを検出する方法であって、
（ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および
（ｂ）採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する工程
を含む、方法；
（２）塩基配列に基づいて遺伝子変異を判定する工程をさらに含む、（１）に記載の方法；
（３）遺伝子変異が遺伝子多型である、（２）に記載の方法；
（４）遺伝子多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、（３）に記載の方法；
（５）ウシのフリーマーチンを検出する方法であって、
（ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および
（ｂ）採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する工程
を含む、方法；
（６）塩基配列に基づいて性染色体上の遺伝子変異を判定する工程をさらに含む、（５）に記載の方法；
（７）遺伝子変異が遺伝子多型である、（６）に記載の方法；
（８）遺伝子多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、（７）に記載の方法；および
（９）（１）〜（８）のいずれか一つに記載の方法を実施するためのキットであって、塩基配列を解析するための試薬を含む、キット。

本発明によれば、鼻腔内から採取した検体から得られたＤＮＡを用いることで、ウシのキメラを検出する方法が提供できる。これは、血液サンプルを用いる従来の検査法に比べ、簡便かつ低コストに実施することができる。また、通常の遺伝子検査においても、毛根サンプルを用いないことで、ウシへの負荷や感染症の危険性を減らすことができる。

図１はＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法で測定したサンプル１および２のタイピングパターンを示す。サンプル１は、３頭のフリーマーチン個体（ＦＭ１、ＦＭ２およびＦＭ３）の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプルで実施した。サンプル２は、正常個体の２頭の雌（雌１、雌２）、および正常個体の２頭の雄（雄１、雄２）の鼻腔内細胞のサンプルで実施した。 図２は、サンプル３および４の電気泳動像である。サンプル３は、３頭のフリーマーチン個体（ＦＭ１、ＦＭ２およびＦＭ３）の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプルで実施した。サンプル４は、正常個体の１頭の雌（雌１）、２頭の雄（雄１、雄２）の鼻腔内細胞のサンプルで実施した。レーン１：ＦＭ１：鼻腔内、レーン２：ＦＭ１：血液、レーン３：ＦＭ１：毛根、レーン４：ＦＭ２：鼻腔内、レーン５：ＦＭ２：血液、レーン６：ＦＭ２：毛根、レーン７：ＦＭ３：鼻腔内、レーン８：ＦＭ３：血液、レーン９：ＦＭ３：毛根、レーン１０：雌１、レーン１１：雄１、レーン１２：雄２ 図３はＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法で測定したサンプル５およびサンプル６のタイピングパターンを示す。サンプル５は、１頭の染色体キメラの個体（ＭＵ１）の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプル（合計３サンプル）を用いて実施した。サンプル６は、１４頭の正常個体（正常１、正常２、正常３、正常４、正常５、正常６、正常７、正常８、正常９、正常１０、正常１１、正常１２、正常１３、正常１４）の鼻腔内細胞のサンプル（合計１４サンプル）を用いて実施した。

１つの態様において、本発明は、ウシの染色体キメラを検出する方法であって、（ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および（ｂ）採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する工程を含む、方法に関する。

本明細書において、「染色体キメラ」とは、同一個体内に異なる遺伝情報を有する細胞が混在している状態、およびそのような状態にある個体を指す。ウシの場合、多胎妊娠した母ウシの子宮内で、胎子は互いに血液を共有するため、一方の血液幹細胞が他方へ移動することが可能となる。移動した血液幹細胞が移動先の胎子の骨髄に定着した結果、持続的に血液細胞を供給することにより、胎子が染色体キメラになる。この現象は、同性多胎あるいは異性多胎に関わらず起こり得る。

染色体キメラは様々な疾患の原因となり得る。また、親子鑑定を含む遺伝学的な特徴を検査する際にも妨げとなる。染色体キメラに起因する不良形質には、例えば、ウシの雌個体のキメラが不妊となるフリーマーチンが挙げられる。

本明細書において、「ウシ」とは、Ｂｏｓ属の動物を指す。例えば、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ種（家畜牛）、Ｂｏｓ ｊａｖａｎｉｃｕｓ種（バンテン）、Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ種（コブウシ）、Ｂｏｓ ｆｒｏｎｔａｌｉｓ （ガヤールもしくはマイタン）などが含まれる。家畜牛には、乳牛および肉牛が含まれる。乳牛には、ホルスタイン種、ガンジー種、ジャージー種、エアシャー種、ブラウンスイス種、ロングホーン種などが挙げられる。肉牛には、アバディーン・アンガス種、シャロレー種、ショートホーン種、デボン種、ヘレフォード種、シンメンタール種、韓牛、見島牛、見蘭牛、和牛、ならびにそれらの交雑種などが挙げられる。和牛には、黒毛和種、褐色和種、無角和種および日本短角種、ならびにそれらの交雑種が含まれる。

本明細書において、「検体」とは、例えば、鼻腔拭い液などの鼻（例えば鼻粘膜）からの採取物、または口腔拭い液などの口（例えば口腔粘膜）からの採取物である。好ましい実施形態では、本発明において用いられる検体は、鼻腔内（例えば鼻粘膜）から採取される。より好ましい実施形態では、本発明において用いられる検体は、鼻腔拭い液である。さらに好ましい実施形態では、本発明において用いられる検体は、鼻腔内細胞を含む鼻腔拭い液である。

鼻腔または口腔内からの検体の採取は、例えば、当業者に知られている適切な検体採取器具および方法を用いて行うことができる。例えば、綿棒を鼻腔または口腔内に挿入し、鼻粘膜壁または口腔粘膜壁を軽く擦ることにより、検体を採取することができる。採取した検体は、溶解液、バッファーまたは希釈液などを用いて、本発明で用いるために適した状態へと調製されてもよい。

本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する場合、採取した検体をそのまま用いて、塩基配列を解析してもよい。あるいは、検体から核酸を抽出し、抽出した核酸を用いて、塩基配列を解析してもよい。あるいは、検体から核酸を抽出し、抽出した核酸をさらに精製し、精製した核酸を用いて、塩基配列を解析してもよい。採取した検体からの核酸の抽出には、フェノール抽出、エタノール沈殿などの当技術分野において周知の方法を用いることができる。あるいは、市販の核酸抽出キットを用いてもよい。抽出した核酸の精製には、当技術分野において周知の方法を用いることができる。あるいは、市販の核酸精製キットを用いてもよい。

本発明では、染色体キメラを検出するために、採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する。塩基配列の解析は、当技術分野で一般に用いられるＤＮＡシークエンシング技術を用いて行うことができる。例えば、「サンガー法」（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５）または「マクサム・ギルバート法」（Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）により行うことができる。この場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの配列特異的増幅と組み合わせたシークエンシング技術を用いてもよい（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６）。

対象の動物が染色体キメラであるか否かは、例えば、その動物の核酸における遺伝子変異を確認することで判定することができる。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、塩基配列に基づいて遺伝子変異を判定する工程をさらに含む。例えば、塩基配列上のある特定のＳＮＰに着目した場合、染色体キメラでない個体であれば、一方のＳＮＰ型のみの解析結果が得られる。しかしながら、染色体キメラの個体であれば、一方のＳＮＰ型と他方のＳＮＰ型が混ざった解析結果が得られる。遺伝子変異は、例えば、塩基の挿入、欠失もしくは置換、マイクロサテライト多型および一塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝子多型、インデル（微小インデルを含む）、遺伝子変換多型、メチル化差異などを含む。「インデル」とは、Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／Ｄｅｌｅｔｉｏｎの略称であり、数ヌクレオチド長の挿入および欠失の組み合わせである。遺伝子変換とは、ある配列が別の配列に変化した多型をいう。これらの遺伝子変異は、例えば、シークエンサー等を用いて直接塩基配列を決定するダイレクトシークエンス法を用いて確認することができる。あるいは、例えば、遺伝子変異の部位を含む特定の配列を増幅するようにＰＣＲを行い、増幅の有無あるいは増幅断片の大きさを確認することによって、遺伝子変異の有無を確認することもできる（ＰＣＲアッセイ）。

本発明の好ましい実施形態では、判定される遺伝子変異は遺伝子多型である。遺伝子多型は、当技術分野において周知の方法によって判定することができる。さらに好ましい実施形態では、かかる遺伝子多型は一塩基多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰは、当技術分野において周知の方法によって判定することができる。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡチップもしくはＤＮＡマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＤＨＰＬＣ（Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法、ミニシーケンシング法、パイロシーケンシング法^登録商標、ＥＭＤ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）アッセイ、ＴａｑＭａｎ^登録商標法、シングルヌクレオチドプライマーエクステンション法、インベーダー^登録商標法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、シークエンサー等を用いて直接塩基配列を決定するダイレクトシークエンス法、ＡＳＰ（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ）−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型性）を利用するＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ^商標法、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）、モレキュラー・ビーコン法、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＡＲＭＳ法（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、ＡＳＯ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）、ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標法（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００５ Ｎｏｖ １５；３４６（２）：２８１−８を参照のこと）およびＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００７ Ｍａｙ １；３６４（１）：７８−８５を参照のこと）からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって判定される。上記方法には、それらを改変した方法も包含される。本発明の好ましい実施形態では、ＳＮＰはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標法もしくはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法またはそれらの改変方法によって判定される。より好ましい実施形態では、ＳＮＰはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法またはその改変方法によって判定される。

ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法は、解析対象となるＳＮＰごとにコモンプローブとクエリプローブを用いて、一度に複数箇所のＳＮＰについて遺伝子型を決定することができるマルチプレックスＳＮＰタイピング法である。コモンプローブは、ＳＮＰ位置と隣接して下流に存在する３’側のプローブである。クエリプローブは、ＳＮＰをその３’末端に含む、上流に存在する５’側のプローブである。クエリプローブはアレルに対応した２種類をＳＮＰごとに用意する。クエリプローブの３’末端に対応するＳＮＰの遺伝子型に応じて、それと相補的な塩基を持つクエリプローブだけが、３’側に隣接して存在するコモンプローブと結合することができる。検出のために各クエリプローブの５’末端には、アレルに対応して２種類のクエリタグが連結されている。クエリタグは、検出のための蛍光標識などを結合するために用いられる。またコモンプローブの３’末端にはＳＮＰごとに異なるコモンタグが連結されている。検出は、コモンタグと相補的な塩基配列を有するオリゴＤＮＡを固定したＤＮＡチップを用いて行う。検体の遺伝子型に応じて、クエリプローブとコモンプローブの結合により生成された産物は、ＤＮＡチップ上のコモンタグと相補的な塩基配列を有するオリゴＤＮＡにコモンタグを介して結合し、ＤＮＡチップ上に捕捉される。アレルごとのクエリタグに対応して、２種類の蛍光標識を導入することで、各ＳＮＰの遺伝子型を決定することができる。また、検出は他のＳＮＰと同時にマルチプレックスで行ってもよい。

他の態様において、本発明は、ウシのフリーマーチンを検出する方法であって、（ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および（ｂ）採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する工程を含む、方法に関する。

「フリーマーチン」とは、ウシの異性多胎において雄胎子の血液が雌胎子に混ざることに起因する不良形質であると考えられている。フリーマーチンの雌個体はＹ染色体を有し、ＸＸ／ＸＹのキメラ状態となっている。したがって、雌のウシ個体の性染色体を検査した結果、Ｘ染色体およびＹ染色体の両方が存在する場合には、そのウシ個体はフリーマーチンであると判定できる。

本発明では、フリーマーチンを検出するために、採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する。塩基配列の解析は、上述した当技術分野で一般に用いられるＤＮＡシークエンシング技術を用いて行うことができる。

対象の動物がフリーマーチンであるか否かは、例えば、その動物の核酸における性染色体上の遺伝子変異を確認することで判定することができる。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、塩基配列に基づいて性染色体上の遺伝子変異を判定する工程をさらに含む。この場合、遺伝子変異は、例えば、塩基の挿入、欠失もしくは置換、マイクロサテライト多型および一塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝子多型、インデル（微小インデルを含む）、遺伝子変換多型、メチル化差異などを含む。これらの遺伝子変異は、上述したダイレクトシークエンス法やＰＣＲアッセイを用いて確認することができる。

本発明の好ましい実施形態では、判定される遺伝子変異は遺伝子多型である。遺伝子多型は、当技術分野において周知の方法によって判定することができる。さらに好ましい実施形態では、かかる遺伝子多型は一塩基多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰは、上述した当技術分野において周知の方法およびそれらを改変した方法によって判定することができる。好ましい実施形態では、ＳＮＰはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標法もしくはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法またはそれらの改変方法によって判定される。より好ましい実施形態では、ＳＮＰはＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法またはその改変方法によって判定される。

あるいは、Ｘ染色体に特異的な配列および／またはＹ染色体に特異的な配列をそれぞれ検出することにより、塩基配列を解析してもよい。例えば、Ｙ染色体に特異的な配列を増幅するプライマーセットを用いたＰＣＲアッセイにより、雌ウシ個体におけるＹ染色体の存在または非存在を検出してもよい。あるいは、Ｘ染色体およびＹ染色体について、それぞれ異なる長さの断片を増幅するプライマーセットを用いて、雌ウシ個体におけるＹ染色体の存在または非存在を検出してもよい。Ｙ染色体の存在が検出された雌ウシ個体は、ＸＸ／ＸＹの染色体キメラ、すなわちフリーマーチンであると判定される。

別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットに関する。かかるキットは、塩基配列を解析するための試薬を含む。通常は、かかる試薬は適切な容器に入れて提供される。かかるキットは、綿棒などの検体採取器具、本発明の方法の実施を簡便にするための適当な試薬、例えば希釈液、反応希釈液、バッファー、洗浄試薬、検体溶解試薬、核酸抽出試薬、核酸精製試薬、核酸溶解試薬などを含んでもよい。さらに、プライマー、プローブなどの適当な核酸試薬を含んでもよい。またさらに、本発明の方法の実施に必要な説明書などの資材を含んでもよい。

以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

染色体キメラの検出１（フリーマーチン）
ウシの性染色体キメラであるフリーマーチンの検出を、鼻腔内から採取した検体から抽出したＤＮＡを用いて実施した。陽性対照として、染色体キメラの検出が可能である血液サンプルを用いた。また、陰性対照として毛根サンプルを用いた。フリーマーチンは、雌ウシ個体中のＹ染色体の存在／非存在を確認することで判定することができる。Ｙ染色体の存在が確認された雌ウシ個体は、ＸＸ／ＸＹのキメラ、すなわちフリーマーチンと判定できる。

１．ＤＮＡ抽出
１−１．血液サンプル
ウシ個体から採取した全血６ｍＬを１５ｍＬ容量の遠沈菅に入れ、２０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。得られたバフィーコート（白血球層）の内０．２ｍＬを１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。マイクロチューブに０．５ｍＬのザルコシル溶液（０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）を加え、３７℃で一晩反応を行った。このマイクロチューブに０．７ｍＬのＴＥ飽和フェノールを加え、５分間反転混合した。その後、４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を新しい１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。このマイクロチューブに０．７ｍＬのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、５分間反転混合した。その後、４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を新しい１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。このマイクロチューブに０．１ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）と１ｍＬの９９．５％エタノールを加え、５分間反転混合した。その後、１２０００ｒｐｍにて５分間遠心した。全ての上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを加えた。直ぐに１２０００ｒｐｍにて５分間遠心した。全ての上清を捨て、室温にて５分間乾燥させて、ＤＮＡを得た。その後、０．１ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））バッファーを加えて得られたＤＮＡを溶解した。

１−２．毛根サンプル
ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を使用した。ウシ個体から毛３０本を採取した。毛根部を１ｃｍ切り取り、１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。このマイクロチューブに３００μＬのバッファーＡＴＬ、２０μＬのプロテイナーゼＫ、２０μＬの１Ｍ ＤＴＴを加え、ボルテックスにて１０秒間攪拌した。５６℃で１時間反応させた。この間、１０分毎にボルテックスにて１０秒間攪拌した。このマイクロチューブに３００μＬのバッファーＡＬを添加後、ボルテックスで１０秒間攪拌した。７０℃で１０分間反応させた。この間、３分毎にボルテックスにて１０秒間攪拌した。このマイクロチューブに１５０μＬの９９．５％エタノールを添加し、１５秒間ボルテックスで静かに攪拌した。スピンダウンにより、１．５ｍＬ容量のマイクロチューブの蓋の内側に付着したサンプルを回収し、ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ（２ｍＬ コレクションチューブ中）に注入した。８０００ｒｐｍで１分間遠心した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬのコレクションチューブにセットし、ろ液を含むコレクションチューブを破棄した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを開き、５００μＬのバッファーＡＷ１を添加した。蓋を閉めて８０００ｒｐｍで１分間遠心した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬのコレクションチューブにセットし、ろ液を含むコレクションチューブを破棄した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを開き、７００μｌのバッファーＡＷ２を添加した。蓋を閉めて８０００ｒｐｍで１分間遠心した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬのコレクションチューブにセットし、ろ液を含むコレクションチューブを破棄した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを開き、７００μＬの９９．５％エタノールを添加した。蓋を閉め８０００ ｒｐｍで１分間遠心した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍＬのコレクションチューブにセットし、ろ液を含むコレクションチューブを破棄した。１２０００ｒｐｍで３分間遠心してメンブレンを完全に乾燥させた。新しい１．５ｍＬ容量のマイクロチューブにＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎをセットし、ろ液を含むコレクションチューブを破棄した。ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｏｌｕｍｎの蓋を開き、室温にて１０分間インキュベートした。５０μＬのバッファーＡＴＥをメンブレンの中央にアプライした。蓋を閉めて、室温で１分間インキュベートした。その後、１２０００ｒｐｍにて１分間遠心し、ＤＮＡ溶液を得た。

１−３．鼻腔内サンプル
ウシ個体の鼻腔内を綿棒で擦った。擦った綿棒を１．０ｍＬのザルコシル溶液（０．５％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２００μｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）に加え、５０℃で２時間反応を行った。得られた溶液０．５ｍＬを１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに加えた。このマイクロチューブに０．７ｍＬのＴＥ飽和フェノールを加え、５分間反転混合した。その後、４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を新しい１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。このマイクロチューブに０．７ｍＬのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、５分間反転混合した。その後、４０００ｒｐｍにて５分間遠心した。上清を新しい１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに回収した。このマイクロチューブに５０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と０．５ｍｌの９９．５％エタノールを加え、５分間反転混合した。その後、１２０００ｒｐｍにて５分間遠心した。全ての上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを加えた。直ぐに１２０００ｒｐｍにて５分間遠心した。全ての上清を捨て、室温にて５分間乾燥させて、ＤＮＡを得た。その後、１００μＬのＴＥ（１０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））バッファーを加えて得られたＤＮＡを溶解した。

２．Ｘ染色体およびＹ染色体の検出
２−１．ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法
ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法を用いて性染色体特異的なＳＮＰを検出することにより、Ｘ染色体およびＹ染色体を検出した。

ＰＣＲ
標的とするＳＮＰの周辺配列を増幅するため、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を使用して、ＰＣＲを行った。用いたプライマーの配列は以下の表の通りである。

以下の表の通り、反応液を作製した。

１４μＬの反応液Ｉに、血液サンプル、毛根サンプルまたは鼻腔内サンプルから抽出したＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ加えた。全量２０μＬとなるように超純水を加えた。

熱サイクル反応を以下の条件にて行った。

ライゲーション
上述のＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、クエリプローブとコモンプローブを結合させるため、ライゲーションを行った。クエリプローブとコモンプローブの配列は以下の表の通りである。クエリプローブ１はＸ染色体を検出する。クエリプローブ２はＹ染色体を検出する。

まず、ライゲーションを行うために、コモンプローブの５’末端のリン酸化を行った。以下の表の通り、反応液を作製した。

反応を以下の条件にて行った。

続いて、クエリプローブとコモンプローブのライゲーションを行った。以下の表の通り、反応液を作製した。

さらに、１４．５μＬの上記反応液ＩＩＩに、ＰＣＲの増幅産物０．５μＬを加えた。

以下の条件にて熱反応を行った。

ラベリング
上述のライゲーションにより結合した配列を蛍光標識するために、ラベリングを行った。蛍光標識に使用する配列は以下の表の通りである。フォワードプライマー１は５’末端をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^登録商標 ６４７で、フォワードプライマー２は５’末端をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^登録商標 ５５５で標識した。

以下の表の通り、反応液を作製した。

さらに、６μＬの上記反応液ＩＶに、ライゲーション産物６μＬを加えた。

以下の条件にて熱反応を行った。

検出
コモンタグアレイによる検出を行った。以下の表の通り、反応液を作製した。

さらに、７．５μＬの上記反応液Ｖに、ラベリング産物６．３μＬを加えた。その後、９０℃で、１分間、熱変性を行った。熱変性した反応液８μＬを、３７℃に温めておいたコモンタグアレイ（クラボウ製）上のブロックに添加し、３７℃で、３０分間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、アレイをフォルダーにセットした。次いで、洗浄液（１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）中で５回上下に振とうした。さらに室温で３分間浸漬した。続いて、純水中でアレイを５回振とうした。さらに室温にて１分間浸漬した。最後に、２０００ｒｐｍ、１分間の遠心により、アレイを乾燥させた。マイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＰｉｘ４２００Ａ）を用いてアレイの蛍光検出を行った。タイピングパターン解析においてＸ染色体の検出を縦軸にプロットされる様にプローブを設計し、Ｙ染色体の検出を横軸にプロットされる様にプローブを設計した。それゆえ、正常の雌個体はＸＸであるため縦軸上にプロットされ、雄個体はＸＹであるため縦軸と横軸の中間にプロットされる。

結果
ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法による結果を以下に示す。サンプル１は、３頭のフリーマーチン個体（ＦＭ１、ＦＭ２およびＦＭ３）の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプル（合計９サンプル）で実施した。サンプル２は、正常個体の２頭の雌（雌１、雌２）、および正常個体の２頭の雄（雄１、雄２）の鼻腔内細胞のサンプル（合計４サンプル）で実施した。ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法で測定したサンプル１および２の蛍光値を以下の表および図１に示す。

上述のＹ染色体の検出および実際のフリーマーチン個体の判定結果との整合性を、以下の表に示す。

上述の通り、鼻腔内サンプルから抽出したＤＮＡを用いてＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法により、フリーマーチン個体中のＹ染色体を検出することができた。これより、血液サンプルと同様に、鼻腔内サンプルを用いて染色体キメラの検出が可能であることが示された。なお、陰性対照として用いた毛根サンプルでは、フリーマーチン個体においてＹ染色体を検出することができなかった。

２−２．ＰＣＲアッセイ
ＰＣＲアッセイによって性染色体特異的な配列を増幅することにより、Ｘ染色体およびＹ染色体を検出した。

ＰＣＲ反応
Ｘ染色体およびＹ染色体由来配列の増幅を確認するため、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を使用して、ＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列は以下の表の通りである。

以下の表の通り、反応液を作製した。

さらに、１４μＬの反応液ＶＩにゲノムＤＮＡ１００ｎｇを加えた。全量２０μＬとなるように超純水を加えた。

以下の条件にて熱サイクル反応を行った。

Ｘ染色体からは５２４ｂｐ、Ｙ染色体からは４６１ｂｐのＤＮＡが増幅される。

電気泳動
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＡｇｉｌｅｎｔ^登録商標 ＤＮＡ ７５００キットを用いて電気泳動を行った。操作方法は付属の説明書に従った。電気泳動には上記のＰＣＲ産物２０μＬ中の１μＬを使用した。

結果
ＰＣＲアッセイによる結果を以下に示す。サンプル３は、３頭のフリーマーチン個体（ＦＭ１、ＦＭ２およびＦＭ３）の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプル（合計９サンプル）で実施した。サンプル４は、正常個体の１頭の雌（雌１）、２頭の雄（雄１、雄２）の鼻腔内細胞のサンプル（合計３サンプル）で実施した。サンプル３および４の電気泳動像を図２に示す。

上述のＹ染色体の検出および実際のフリーマーチン個体の判定結果との整合性を、以下の表に示す。

上述の通り、鼻腔内サンプルから抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲアッセイにより、フリーマーチン個体中のＹ染色体を検出することができた。これより、血液サンプルと同様に、鼻腔内サンプルを用いて染色体キメラの検出が可能であることが示された。なお、陰性対照として用いた毛根サンプルでは、フリーマーチン個体においてＹ染色体を検出することができなかった。

染色体キメラの検出２
同一の染色体キメラ個体において、血液サンプル、毛根サンプル、鼻腔内サンプル由来のＤＮＡを用いて比較実験を行った。染色体キメラの検出が可能である血液サンプルを陽性対照、検出ができない毛根サンプルを陰性対照として確認した。染色体キメラは、常染色体上のＳＮＰ検出において、他方（双子のもう一方）の対立するＳＮＰが検出される場合に判定できる。さらに、正常個体から鼻腔内サンプル由来のＤＮＡを用いた検出の結果を示した。

１．ＤＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出は、実施例１と同様の方法で行った。

２．常染色体のＳＮＰの検出
検出は、ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法を用いて行った。手順は実施例１の２−１と同様である。但し、ＰＣＲプライマー、プローブ、およびラベリング用ＰＣＲのプライマーは以下の表の通りである。タイピングパターン解析においてクエリプローブ４の検出を横軸にプロットされる様にプローブを設計し、クエリプローブ３の検出を縦軸にプロットされる様にプローブを設計した。クエリプローブ４のみで検出されるホモ個体は横軸上にプロットされ、クエリプローブ３のみで検出されるホモ個体は縦軸上にプロットされ、クエリプローブ４とクエリプローブ３で検出されるヘテロ個体は横軸と縦軸の中間にプロットされる。また、検出するＳＮＰのｒｓ番号はｒｓ４１６４２２８３である。変異が無いときの塩基はＣであり野生型であり、変異が起こっているときの塩基はＴでありｒｓ４１６４２２８３（Ｃ＞Ｔ）である。配列は以下の表の通りである。野生型をクエリプローブ３で検出し、ｒｓ４１６４２２８３（Ｃ＞Ｔ）をクエリプローブ４で検出する。なお、今回ｒｓ４１６４２２８３のＳＮＰを用いたが、染色体キメラを検出するために用いられるＳＮＰはこれに限定されるものではない。

結果
染色体キメラ個体の鼻腔内細胞、血液、毛根のサンプルのＤＮＡのアッセイ
ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法による結果を以下に示す。サンプル５は、１頭の染色体キメラの個体（ＭＵ１）の鼻腔内細胞、血液、および毛根のサンプル（合計３サンプル）で実施した。サンプル６は、１４頭の正常個体（正常１、正常２、正常３、正常４、正常５、正常６、正常７、正常８、正常９、正常１０、正常１１、正常１２、正常１３、正常１４）の鼻腔内細胞のサンプル（合計１４サンプル）で実施した。ＤｉｇｉＴａｇ^登録商標２法で測定したサンプル５および６の蛍光値を以下の表および図３に示す。

上述の常染色体上で対立するＳＮＰの検出および染色体キメラ個体の判定結果を、以下の表に示す。「他方の常染色体上で対立するＳＮＰ」とは、双子のもう一方が持つ対立ＳＮＰである。

上記の表に示されるサンプル５および６の蛍光値ならびに図３より、陰性対照として用いた毛根サンプルと陽性対照として用いた血液サンプルとを比較すると、対立遺伝子の検出に差異を示す結果が得られ、当該個体（ＭＵ１）がキメラであることを確認した。鼻腔内サンプルでも、陽性対照の血液サンプルと同様に、陰性対照の毛根サンプルとの差異が確認でき、ＭＵ１が染色体キメラであることが確認できた。また、正常個体の結果から、上記のプライマーおよびプローブを用いることで、対象の個体がホモ個体またはヘテロ個体のいずれであるのかを判定できることが確認できた。

結論として、毛根サンプルでは、フリーマーチンや染色体キメラを検出できない。これは、染色体キメラの個体であっても、毛根由来の細胞は、染色体キメラの状態になっていないという事実と一致する。採材が容易な鼻腔内粘膜細胞のキメラ状態についてはこれまで不明であったが、検討の結果、鼻腔内粘膜も血液と同程度にキメラになっていることを明らかにした。

本発明によれば、鼻腔内から採取した検体を用いる、ウシの染色体キメラを検出する方法の提供が可能になる。また、鼻腔内から採取した検体を用いる、ウシのフリーマーチンを検出する方法の提供が可能になる。鼻腔内から採取した検体を用いることで、従来の検査法に比べ、簡便かつ低コストに染色体キメラを検出することができる。また、ウシへの負荷や感染症の危険性を減らすことができる。したがって、本発明は、ウシの畜産業における染色体キメラに起因するウシの不良形質の判定において利用可能である。

配列番号１：フォワードプライマーＡ
配列番号２：リバースプライマーＡ
配列番号３：クエリプローブ１
配列番号４：クエリプローブ２
配列番号５：コモンプローブ１
配列番号６：フォワードプライマー１
配列番号７：フォワードプライマー２
配列番号８：リバースプライマー１
配列番号９：フォワードプライマーＢ
配列番号１０：リバースプライマーＢ
配列番号１１：フォワードプライマーＣ
配列番号１２：リバースプライマーＣ
配列番号１３：クエリプローブ３
配列番号１４：クエリプローブ４
配列番号１５：コモンプローブ２
配列番号１６：フォワードプライマー３
配列番号１７：フォワードプライマー４
配列番号１８：リバースプライマー２
配列番号１９：ｒｓ４１６４２２８３ 野生型
配列番号２０：ｒｓ４１６４２２８３ （Ｃ＞Ｔ）

Claims (7)

1. 多胎のウシの染色体キメラを検出する方法であって、
   （ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および
   （ｂ）採取した検体中の塩基配列を解析する工程
   を含む、方法。
2. 塩基配列に基づいて遺伝子多型を判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 遺伝子多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項２に記載の方法。
4. 多胎のウシのフリーマーチンを検出する方法であって、
   （ａ）鼻腔内から検体を採取する工程；および
   （ｂ）採取した検体中の核酸の塩基配列を解析する工程
   を含む、方法。
5. 塩基配列に基づいて性染色体上の遺伝子多型を判定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 遺伝子多型が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項５に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、染色体上の一塩基多型を検出するためのプライマーを含む、キット。

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