JP6830094B2 - 染色体異常を検出するための核酸及び方法 - Google Patents

染色体異常を検出するための核酸及び方法 Download PDF

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発明の詳細な説明
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年７月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／１９８，６５４号の利益を主張するものであり、その全体は本明細書に参照として組み込まれる。
［技術分野］
本発明は、検出を必要とする対象における、とりわけ、異数性及び染色体異常を検出するためのシステム及び方法に関する。
［背景技術］
主な染色体異常は、生産数のほぼ１４０分の１で検出されており、満期に達しない胎児、または、死産になる胎児において、はるかに高い比率で検出されている。Ｈｓｕ（１９９８）「Ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ．」（Ｉｎ：Ｍｉｌｕｎｓｋｙ Ａ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｅｔｕｓ．４ ｅｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．１７９−１８０；Ｓｔａｅｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５））、「Ｓｈｏｕｌｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｂｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｆｏｒ ａｌｌ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｌ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ？」（Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ ２５：５６７−５７３．）。最も一般的な異数性は２１トリソミー（ダウン症候群）であり、現時点における生産数の７３０分の１で発生している（Ｈｓｕ；Ｓｔａｅｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）。２１トリソミーより一般的ではないが、１８トリソミー（エドワーズ症候群）及び１３トリソミー（パトー症候群）はそれぞれ、生産数の５，５００分の１、生産数の１７，２００分の１で発生している（Ｈｓｕ．）。多種多様な先天性欠損症、発育不全症、及び、知的障害は、染色体の異数性を有する小児に見られるが、これらは、家族及び社会に、生涯にわたる課題を提示している（Ｊｏｎｅｓ（２００６）「Ｓｍｉｔｈ’ｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｌｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓａｕｎｄｅｒｓ．））。胎児異数性リスクの大きさを示すことが可能である様々な出生前検査法があり、例えば、羊水穿刺または絨毛採取などの侵襲的な診断検査法が挙げられる。これらは現時点におけるゴールドスタンダードとなっているが、無視できないほどの胎児の死亡リスクを伴う（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ（２００７） ＡＣＯＧ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．８８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７．「Ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ．」Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １１０：１４５９−１４６７．）。それゆえ、胎児異数性に関する、より信頼性が高く非侵襲的な検査法が長きにわたり求められている。これらのうち最も有望な検査法は、母体血漿中に存在する胎児ＤＮＡを検出することに基づいている。母体血漿から作製したライブラリに対して超並列シークエンシングを行うことにより、２１番染色体の異常を確実に検出可能であることが示されてきた（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００８）「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｍａｔｅｒｎａｌ ｐｌａｓｍａ．」（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：２０４５８−２０４６３；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００８））、及び、「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｆｅｔａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ ｂｙ ｓｈｏｔｇｕｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ．」 （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：１６２６６−１６２７１．） ）。
現在の異数性スクリーニング法、例えば、超並列ショットガンシークエンシングなどは、多くの時間を要するか、費用が多くかかるか、または、広範囲にわたるバイオインフォマティクス解析を必要とする。
それゆえ、経済性に優れかつ効率的な、高感度及び高特異性を有する検査法の開発が求められている。
［発明の概要］
本開示における一部の実施形態は以下のとおりである。
１．胎児における異数性を検出するための方法であって、
ａ）母体血液試料から単離した核酸試料を得ることと、
ｂ）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の１つまたは複数の集団を用いることにより、工程ａ）で得た前記核酸試料中における複数の目的の標的配列を捕捉して、複数のレプリコンを作製することと、
前記ＭＩＰ集団内の前記ＭＩＰのそれぞれは、以下の構成要素、
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含み、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、同一であり、前記複数の目的の標的配列内におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的であり、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有標的分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）工程ｂ）で得た前記レプリコンから増幅した複数のＭＩＰアンプリコンをシークエンスすることと、
ｄ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第１のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第１のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｅ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第２のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第２のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｆ）工程ｄ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第１のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｇ）少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｆ）で決定した前記部位捕捉基準の第１のサブセットを同定することと、
ｈ）工程ｅ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第２のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｉ）前記少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｈ）で決定した前記部位捕捉基準の第２のサブセットを同定することと、
ｊ）工程ｇ）で同定した部位捕捉基準の前記第１のサブセットから求めた第１の指標を、工程ｉ）で同定した部位捕捉基準の前記第２のサブセットから求めた第２の指標で正規化して、検査比率を得ることと、
ｋ）前記検査比率を、正倍数性または異数性を示すことが既知である参照対象から単離した参照核酸試料に基づいて計算した、複数の参照比率と比較することと、
ｌ）工程ｋ）の前記比較に基づいて、異数性が前記胎児において検出されるかどうかを判定することと、
を含む、前記方法。
２．前記核酸試料はＤＮＡまたはＲＮＡである、実施形態１に記載の方法。
３．前記核酸試料はゲノムＤＮＡである、実施形態２に記載の方法。
４．前記血液試料は、全血試料、血漿試料、または、血清試料である、実施形態１から実施形態３のいずれか１つに記載の方法。
５．前記血液試料は血漿試料である、実施形態４に記載の方法。
６．前記第１の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対である、実施形態１から実施形態５のいずれか１つに記載の方法。
７．前記第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対である、実施形態１から実施形態６のいずれか１つに記載の方法。
８．前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態１から実施形態７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態１から実施形態８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記第１の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態１から実施形態９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態１から実施形態１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記固有分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態１から実施形態１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記固有分子タグのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態１から実施形態１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記ポリヌクレオチドリンカーは、前記対象における任意のゲノム領域に対して実質的に相補的ではない、実施形態１から実施形態１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記ポリヌクレオチドリンカーは、１４〜３０塩基対の長さを有する、実施形態１から実施形態１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記ポリヌクレオチドリンカーは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態１から実施形態１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記ポリヌクレオチドリンカーは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態１から実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも１種の増幅用プライマーを含む、実施形態１から実施形態１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記ポリヌクレオチドリンカーは、増幅用フォワードプライマー及び増幅用リバースプライマーを含む、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記増幅用フォワードプライマーの前記配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧ−３´（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１９に記載の方法。
２１．前記増幅用リバースプライマーの前記配列は、５´−ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：２）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１９に記載の方法。
２２．前記ポリヌクレオチドリンカーは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１から実施形態２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記第１の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３´（配列番号：４）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１から実施形態２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記第２の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：５）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１から実施形態２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記ＭＩＰは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、（Ｎ１−６）は前記第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は前記第２の固有分子タグを表す、実施形態１から実施形態２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記ＭＩＰは、ＭＩＰ ００１〜ＭＩＰ ００８（配列番号：７〜１４）のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１から実施形態２４のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記ＭＩＰ集団は、１０ｆＭ〜１００ｎＭの濃度を有する、実施形態１から実施形態２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記ＭＩＰレプリコンのそれぞれは、一本鎖環状核酸分子である、実施形態１から実施形態２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記部位捕捉基準は、部位捕捉性能指標（ＳＣＥ）である、実施形態１から実施形態２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記部位捕捉基準は、部位捕捉密度指標（ＳＣＣ）である、実施形態１から実施形態２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．工程ｂ）で提供した前記ＭＩＰレプリコンのそれぞれは、
ｉ）前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームをそれぞれ、前記核酸試料中の対応する前記第１及び第２の領域にハイブリダイズすることと、前記第１及び第２の領域は目的の標的配列に隣接し、
ｉｉ）前記ハイブリダイゼーション後、ライゲーション／伸長用混合液を用いて、前記２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし、一本鎖環状核酸分子を作製することと、
により作製される、実施形態１から実施形態３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記ＭＩＰレプリコンのそれぞれは、一本鎖環状核酸分子である、実施形態１から実施形態３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．ｃ）の前記シークエンシング工程は、次世代シークエンシング法を含む、実施形態１から実施形態３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記次世代シークエンシング法は、超並列シークエンシング法、または、超並列ショートリードシークエンシング法を含む、実施形態３３に記載の方法。
３５．実施形態１から実施形態３４のいずれか１つに記載の方法であって、前記方法は、ｃ）の前記シークエンシング工程の前に、シークエンシング用の前記ＭＩＰレプリコンを増幅するためのＰＣＲ反応を含む、前記方法。
３６．前記ＰＣＲ反応はインデックスＰＣＲ反応である、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記インデックスＰＣＲ反応は、以下の構成要素、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記ＭＩＰアンプリコンのそれぞれに導入する、実施形態３６に記載の方法。
３８．前記バーコード化ＭＩＰアンプリコンは、以下の構成要素、第１のシークエンシングアダプター−第１のシークエンシングプライマー−前記第１の固有標的分子タグ−前記第１の標的ポリヌクレオチドアーム−捕捉核酸−前記第２の標的ポリヌクレオチドアーム−前記第２の固有標的分子タグ−固有試料バーコード−第２のシークエンシングプライマー−第２のシークエンシングアダプター、を配列内に含む、実施形態３７に記載の方法。
３９．前記第１の複数の目的の標的配列は、単一染色体上に存在する、実施形態１から実施形態３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記第２の複数の目的の標的配列は、複数の染色体上に存在する、実施形態１から実施形態３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．工程ｆ）で決定した前記部位捕捉基準は、工程ｄ）で測定した捕捉現象の数であり、工程ｈ）で決定した前記部位捕捉基準は、工程ｅ）で測定した捕捉現象の数である、実施形態１から実施形態４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．特定の部位における複数の部位捕捉基準の変動係数を計算することを更に含み、前記複数の部位捕捉基準中のそれぞれの部位捕捉基準は、異なる対象由来の核酸試料から求められ、工程ｇ）及び工程ｈ）で用いた前記少なくとも１つの判定基準は、前記特定の部位における前記変動係数が閾値未満であるという必要条件を含む、実施形態１から実施形態４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．工程ｊ）で求めた前記第１の指標は、部位捕捉基準の前記第１のサブセットの合計であり、目的の染色体に対応し、工程ｊ）で求めた前記第２の指標は、部位捕捉基準の前記第２のサブセットの合計であり、前記目的の染色体以外の染色体に対応する、実施形態１から実施形態４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．工程ｌ）で行った前記判定は、統計的検定を行い、工程ｊ）で得た前記検査比率が前記複数の参照比率とは統計的に異なるかどうかを判定することを含む、実施形態１から実施形態４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記第１のアンプリコン集団は、目的の染色体に対応する、実施形態１から実施形態４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．前記第２のアンプリコン集団は、前記目的の染色体以外の染色体に対応する、実施形態４５に記載の方法。
４７．前記検査比率及び前記参照比率は、染色体比率である、実施形態１から実施形態４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．前記染色体比率は、目的の染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１）と、全ての染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１＋Ｓ２）との比率により定義される、実施形態４７に記載の方法。
４９．前記ＭＩＰレプリコンのサイズは、８０〜９０塩基対である、実施形態１から実施形態４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記シークエンシング工程は、６〜８百万リードの読み取り深度を有する、実施形態１から実施形態４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記目的の標的配列は、Ａｌｕ因子内に位置する、実施形態１から実施形態５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記目的の標的配列は、Ａｌｕ因子のライトアーム内に位置する、実施形態５１に記載の方法。
５３．前記異数性は常染色体異数性であり、工程ｄ）及び工程ｅ）で測定した捕捉現象の数は、性染色体由来の任意の捕捉現象を除外する、実施形態１から実施形態５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記異数性は性染色体異数性であり、工程ｄ）及び工程ｅ）で測定した捕捉現象の数は、少なくとも１つの性染色体由来の捕捉現象を含む、実施形態１から実施形態５２のいずれか１つに記載の方法。
５５．胎児における異数性を検出するための方法であって、
ａ）母体血液試料由来のゲノムＤＮＡ試料を得ることと、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡ試料を、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルへと加えることと、前記マルチウェルプレートのそれぞれのウェルはプローブ混合液を含み、前記プローブ混合液は分子反転プローブ（ＭＩＰ）集団及び緩衝液を含み、
前記ＭＩＰ集団内のそれぞれのＭＩＰは、以下の構成要素、
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含み、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、同一であり、複数の目的の標的配列内におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的であり、
前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有標的分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）前記ＭＩＰの前記プローブ混合液を含む前記ゲノムＤＮＡ試料をインキュベートして、前記複数の目的の標的配列を捕捉することと、
ｄ）伸長／ライゲーション用混合液を、前記ＭＩＰ及び前記複数の目的の標的配列を含むｃ）の前記試料へと加えて、複数のＭＩＰアンプリコンを作製することと、前記伸長／ライゲーション用混合液は、ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、リガーゼ、及び、緩衝液を含み、
ｅ）エキソヌクレアーゼ混合液を、前記標的及び対照ＭＩＰアンプリコンへと加えて、過剰プローブまたは過剰ゲノムＤＮＡを除去することと、
ｆ）インデックスＰＣＲ用混合液をｅ）の前記試料へと加えて、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記複数のアンプリコンへと加えることと、
ｇ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有標的分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第１の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第１の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｈ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有標的分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第２の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第２の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
ｉ）工程ｇ）で測定した第１のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、部位捕捉基準を計算し、工程ｈ）で測定した第２のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、複数の対照プローブ捕捉基準を計算することと、
ｊ）少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準を有する前記ＭＩＰアンプリコンの前記集団における部位捕捉基準のサブセットを同定することと、
ｋ）前記部位捕捉基準を、前記少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準の前記サブセットから計算した係数で正規化して、検査正規化部位捕捉基準を得ることと、
ｌ）工程ｂ）〜工程ｈ）における同一の標的部位及び対照部位、標的集団、対照集団のサブセットを用いて、前記検査正規化部位捕捉基準を、既知の遺伝子型を示す参照対象から得た参照ゲノムＤＮＡ試料に基づいて計算した複数の参照正規化部位捕捉基準と比較することと、
ｍ）工程ｌ）の前記比較、及び、参照対象の前記既知の遺伝子型に基づいて、異数性が前記胎児において検出されるかどうかを判定することと、
を含む、前記方法。
５６．前記血液試料は、全血試料、血漿試料、または、血清試料である、実施形態５５に記載の方法。
５７．前記血液試料は血漿試料である、実施形態５６に記載の方法。
５８．前記第１の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対である、実施形態５５から実施形態５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．前記第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対である、実施形態５５から実施形態５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態５５から実施形態５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態５５から実施形態６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．前記第１の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態５５から実施形態６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．前記第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態５５から実施形態６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．前記固有分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態５５から実施形態６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．前記固有分子タグのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態５５から実施形態６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記ポリヌクレオチドリンカーは、前記対象における任意のゲノム領域に対して実質的に相補的ではない、実施形態５５から実施形態６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記ポリヌクレオチドリンカーは、２０〜１，０００塩基対の長さを有する、実施形態５５から実施形態６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記ポリヌクレオチドリンカーは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態５５から実施形態６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．前記ポリヌクレオチドリンカーは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態５５から実施形態６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも１種の増幅用プライマーを含む、実施形態５５から実施形態６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．前記ポリヌクレオチドリンカーは、増幅用フォワードプライマー及び増幅用リバースプライマーを含む、実施形態７０に記載の方法。
７２．前記増幅用フォワードプライマーの前記配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧ−３´（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む、実施形態７１に記載の方法。
７３．前記増幅用リバースプライマーの前記配列は、５´−ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：２）のヌクレオチド配列を含む、実施形態７２に記載の方法。
７４．前記ポリヌクレオチドリンカーは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）のヌクレオチド配列を含む、実施形態５５から実施形態７３のいずれか１つに記載の方法。
７５．前記第１の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３´（配列番号：４）のヌクレオチド配列を含む、実施形態５５から実施形態７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．前記第２の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：５）のヌクレオチド配列を含む、実施形態５５から実施形態７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．前記ＭＩＰは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、（Ｎ１−６）は前記第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は前記第２の固有分子タグを表す、実施形態５５から実施形態７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．前記ＭＩＰ集団は、１０ｆＭ〜１００ｎＭの濃度を有する、実施形態５５から実施形態７７のいずれか１つに記載の方法。
７９．前記ＭＩＰレプリコンのサイズは、８０〜９０塩基対である、実施形態５５から実施形態７８のいずれか１つに記載の方法。
８０．前記シークエンシング工程は、６〜８百万リードの読み取り深度を有する、実施形態５５から実施形態７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．対象内の異数性を検出するのに用いる分子反転プローブ（ＭＩＰ）を、複数の候補ＭＩＰから選択するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記複数の候補ＭＩＰの核酸配列を受信することと、
ｂ）前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれの対応するＭＩＰについて、
ｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチのない固有部位の第１の数（Ａ）を計算することと、
ｉｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記目的の染色体上におけるミスマッチが１つある固有部位の第２の数（Ｃ）を計算することと、
ｉｉｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチのない固有部位の第３の数（Ｅ）を計算することと、
ｉｖ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記ゲノムの全体にわたるミスマッチが１つある固有部位の第４の数（Ｇ）を計算することと、
ｖ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記ゲノムの全体にわたるミスマッチのない非固有部位の第５の数（Ｆ）を計算することと、
ｖｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記ゲノムの全体にわたるミスマッチが１つある非固有部位の第６の数（Ｈ）を計算することと、
ｖｉｉ）前記第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、及び、第６の数の少なくとも一部に基づいて、前記対応するＭＩＰの性能測定基準を計算することと、
ｃ）工程ｂ）ｖｉｉ）で前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれのＭＩＰについて計算した前記性能測定基準の少なくとも一部に基づいて、ＭＩＰを選択することと、
を含む、前記方法。
８２．固有部位は、前記対応するＭＩＰにより１回だけ捕捉される部位に相当する、実施形態８１に記載の方法。
８３．非固有部位は、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される部位に相当する、実施形態８１から実施形態８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．前記非固有部位は、同一染色体上で、異なる染色体上で、または、その両方において、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される、実施形態８３に記載の方法。
８５．前記ゲノムは、全ての常染色体、Ｘ染色体、及び、Ｙ染色体を含む、実施形態８１から実施形態８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第５の数（Ｆ）との第１の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態８５のいずれか１つに記載の方法。
８７．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第３の数（Ｅ）との第２の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第２の数（Ｃ）との第３の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）及び前記第２の数（Ｃ）の第１の合計と、前記第３の、第４の、第５の、及び、第６の数（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の第２の合計との第４の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態８８のいずれか１つに記載の方法。
９０．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）及び前記第２の数（Ｃ）の第１の加重和と、前記第３の、第４の、第５の、及び、第６の数（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の第２の加重和との第５の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．前記第１の加重和と前記第２の加重和との前記第５の比率（Ｐ１）は、
Figure 0006830094
 で表される、実施形態８１から実施形態９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．前記第１の加重和と前記第２の加重和との前記第５の比率（Ｐ）は、
Figure 0006830094
 で表される、実施形態８１から実施形態９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．工程ｃ）で前記ＭＩＰを選択することは、前記性能測定基準を既定閾値と比較することを含む、実施形態８１から実施形態９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．工程ｃ）で選択した前記ＭＩＰは、６超の第５の比率（Ｐ）を有する、実施形態９３に記載の方法。
９５．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第２の数（Ｃ）との第３の加重和が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量の加重和よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．前記第３の加重和は、
Figure 0006830094
 で表される、実施形態８１から実施形態９５に記載の方法。
９７．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第５の比率（Ｐ１）と前記第３の加重和（Ｐ２）の積が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量積よりも大きくなるように選択される、実施形態８１から実施形態９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．前記性能測定基準は、前記目的の染色体由来の有効リード総数に基づいて計算される、実施形態８１から実施形態９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、ミスマッチが１つの部位（Ｋ１）の平均捕捉係数と、ミスマッチが０の部位（Ｋ０）の平均捕捉係数との比率（Ｋｅ）、
Figure 0006830094
 に基づいて選択され、式中、前記比率（Ｋｅ）は実験により概算する、実施形態８１から実施形態９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、
Figure 0006830094
 として定義される、総分子タグカウント（ＴＭＴＣ）に基づいて選択される、実施形態８１から実施形態９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．対象内の異数性を検出するのに用いる分子反転プローブ（ＭＩＰ）を、複数の候補ＭＩＰから選択するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記複数の候補ＭＩＰの核酸配列を受信することと、
ｂ）前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれの対応するＭＩＰについて、
ｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチのない固有部位の第１の数（Ａ）を計算することと、
ｉｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記目的の染色体上におけるミスマッチが１つある固有部位の第２の数（Ｃ）を計算することと、
ｉｉｉ）前記第１及び第２の数の少なくとも一部に基づいて、前記対応するＭＩＰの性能測定基準を計算することと、
ｃ）工程ｂ）ｉｉｉ）で前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれのＭＩＰについて計算した前記性能測定基準の少なくとも一部に基づいて、ＭＩＰを選択することと、
を含む、前記方法。
１０２．固有部位は、前記対応するＭＩＰにより１回だけ捕捉される部位に相当する、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．非固有部位は、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される部位に相当する、実施形態１０１から実施形態１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．前記非固有部位は、同一染色体上で、異なる染色体上で、または、その両方において、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第２の数（Ｃ）との第１の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態１０１から実施形態１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．対象内の異数性を検出するのに用いる分子反転プローブ（ＭＩＰ）を、複数の候補ＭＩＰから選択するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記複数の候補ＭＩＰの核酸配列を受信することと、
ｂ）前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれの対応するＭＩＰについて、
ｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチのない固有部位の第１の数（Ａ）を計算することと、
ｉｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、前記ゲノムの全体にわたるミスマッチのない非固有部位の第２の数（Ｆ）を計算することと、
ｉｉｉ）前記第１及び第２の数の少なくとも一部に基づいて、前記対応するＭＩＰの性能測定基準を計算することと、
ｃ）工程ｂ）ｉｉｉ）で前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれのＭＩＰについて計算した前記性能測定基準の少なくとも一部に基づいて、ＭＩＰを選択することと、
を含む、前記方法。
１０７．固有部位は、前記対応するＭＩＰにより１回だけ捕捉される部位に相当する、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．非固有部位は、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される部位に相当する、実施形態１０６から実施形態１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９．前記非固有部位は、同一染色体上で、異なる染色体上で、または、その両方において、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第２の数（Ｆ）との第１の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態１０６から実施形態１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．前記ゲノムは、全ての常染色体、Ｘ染色体、及び、Ｙ染色体を含む、実施形態１０６から実施形態１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．対象内の異数性を検出するのに用いる分子反転プローブ（ＭＩＰ）を、複数の候補ＭＩＰから選択するための方法であって、前記方法は、
ａ）前記複数の候補ＭＩＰの核酸配列を受信することと、
ｂ）前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれの対応するＭＩＰについて、
ｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチのない固有部位の第１の数（Ａ）を計算することと、
ｉｉ）前記対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチのない固有部位の第２の数（Ｅ）を計算することと、
ｉｉｉ）前記第１及び第２の数の少なくとも一部に基づいて、前記対応するＭＩＰの性能測定基準を計算することと、
ｃ）工程ｂ）ｉｉｉ）で前記複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれのＭＩＰについて計算した前記性能測定基準の少なくとも一部に基づいて、ＭＩＰを選択することと、
を含む、前記方法。
１１３．固有部位は、前記対応するＭＩＰにより１回だけ捕捉される部位に相当する、実施形態１１２に記載の方法。
１１４．非固有部位は、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される部位に相当する、実施形態１１２から実施形態１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前記非固有部位は、同一染色体上で、異なる染色体上で、または、その両方において、前記対応するＭＩＰにより２回以上捕捉される、実施形態１１４に記載の方法。
１１６．工程ｃ）の前記ＭＩＰは、前記第１の数（Ａ）と前記第２の数（Ｅ）との第１の比率が、前記候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される、実施形態１１２から実施形態１１５のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記ゲノムは、全ての常染色体、Ｘ染色体、及び、Ｙ染色体を含む、実施形態１１２から実施形態１１６のいずれか１つに記載の方法。
１１８．５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、前記核酸分子。
１１９．前記第１の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態１１８に記載の核酸。
１２０．前記第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対である、実施形態１１８から実施形態１１９のいずれか１つに記載の核酸。
１２１．前記固有標的分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態１１８から実施形態１２０のいずれか１つに記載の核酸。
１２２．前記固有標的分子タグのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態１１８から実施形態１２１のいずれか１つに記載の核酸。
１２３．５´−Ａ−（Ｎ）ｘ−Ｂ−（Ｎ）ｙ−Ｃ−３´のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ）ｘは第１の固有分子タグを表し、（Ｎ）ｙは第２の固有分子タグを表し、式中、Ｘ及びＹは４〜１５塩基対であり、
式中、Ａは、ｉ）５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ−３´（配列番号：１５）の配列、または、５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ−３´（配列番号：１５）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有し、
式中、Ｃは、ｉ）５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：１６）の配列、または、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：１６）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する、
前記核酸分子。
１２４．５´−Ａ−（Ｎ）ｘ−Ｂ−（Ｎ）ｙ−Ｃ−３´のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ）ｘは第１の固有分子タグを表し、（Ｎ）ｙは第２の固有分子タグを表し、式中、Ｘ及びＹは４〜１５塩基対であり、
式中、Ａは、ｉ）５´−ＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ−３´（配列番号：１７）の配列、または、５´−ＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ−３´（配列番号：１７）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有し、
式中、Ｃは、ｉ）５´−ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣ−３´（配列番号：１８）の配列、または、５´−ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣ−３´（配列番号：１８）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する、
前記核酸分子。
１２５．式中、Ｂは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列、または、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含む、実施形態１２３または実施形態１２４に記載の核酸分子。
１２６．式中、ＡまたはＣは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する、実施形態１２３から実施形態１２５のいずれか１つに記載の核酸分子。
１２７．式中、ＡまたはＣは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、実施形態１２３から実施形態１２６のいずれか１つに記載の核酸分子。
１２８．５´−ＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ１−６）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：１９）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１２９．５´−ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣ−３´（配列番号：２０）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３０．５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：２１）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３１．５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：２２）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３２．５´−ＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡ−３´（配列番号：２３）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３３．５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：２４）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３４．５´−ＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧ−３´（配列番号：２５）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３５．５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：２６）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３６．５´−ＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：２７）のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、
前記核酸分子。
１３７．前記ＭＩＰは、実施形態１２３から実施形態１３６のいずれか１つに記載の核酸分子を含む、実施形態１から実施形態８０のいずれか１つに記載の方法。
［図面の簡単な説明］
［図１］本開示の方法に従い記載されるプロセスのいずれかを実行するコンピュータデバイスにおける、例示的な実施形態を示す図である。
［図２］本開示における一部の方法に従い、プローブを設計及び選択するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。
［図３］本開示における一部の方法に従い、検査対象の異数性状態を予測するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。
［図４］本開示における一部の方法に従い、検査対象の異数性状態を予測するための、より詳細な別の例示的なプロセスを示すフローチャートである。
［図５］本開示における一部の方法に用いる、例示的な分子反転プローブ（ＭＩＰ）の配列を示す図である。ＭＩＰは、以下の構成要素、第１の標的ポリヌクレオチドアーム（「ライゲーションアーム」と記載）、ポリヌクレオチドリンカー（「主鎖」と記載）、及び、第２の標的ポリヌクレオチドアーム（「伸長アーム」と記載）を配列内に含み、またそのリンカーは、第１の固有標的分子タグ（「６Ｎ」と記載）、ＰＣＲ用フォワードプライマー、ＰＣＲ用リバースプライマー、及び、第２の固有標的分子タグ（こちらも「６Ｎ」と記載）を含む。ＭＩＰのそれぞれにおける第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、目的の部位に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である。固有分子タグは、ランダムなポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、「実質的に相補的」とは、両方のアームにおいてミスマッチが０であること、または、一方のアームのみにおいてミスマッチがせいぜい１であることを意味する（例えば、標的ポリヌクレオチドアームが、目的の部位に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域にそれぞれハイブリダイズする場合）。一部の実施形態では、「実質的に相補的」とは、両方のアームにおいてミスマッチの数が少ないこと、例えば、せいぜい１、２、３、３、５、６、７、または、８であることを意味する。
［図６］本開示の方法における、プローブによるハイブリダイゼーション及び伸長／ライゲーションを示す図である。第１の標的ポリヌクレオチドアーム（「ライゲーションアーム」と記載）及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム（「伸長アーム」と記載）を、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズするのに好適な条件下で、ＤＮＡにＭＩＰを添加する。ハイブリダイゼーション後、伸長／ライゲーション条件下で、ポリメラーゼ及びリガーゼを添加してから、ライゲーションアームと伸長アームとの間に固有ギャップ配列を含む目的の標的配列全体にわたりＤＮＡ合成を行うことにより、環状オリゴヌクレオチド（「捕捉済みプローブ」）を作製する。アンプリコン及びｃｓＤＮＡが融解すると、捕捉済みプローブを増幅する準備が整う。
［図７］捕捉済みプローブの増幅及びシークエンシングを示す図である。シークエンシングアダプター及びＰＣＲ用フォワードプライマーまたはＰＣＲ用リバースプライマーを含む核酸分子を環状アンプリコンの主鎖に結合させてから、ＭＩＰにより作製された全ての環状オリゴヌクレオチドをＰＣＲを用いて増幅する。その後、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いてアンプリコンのシークエンスを行ってから、それぞれのアンプリコン内に存在する固有分子タグの数をカウントすることにより、得られたアンプリコンのリード数を測定する。
［図８］２１番染色体トリソミー（ダウン症候群）検査の結果を示す図である。検査した４８点の試料のうち４６点がダウン症候群に対して陰性であった一方、２点の試料がダウン症候群に対して陽性であった。２点の陽性試料を、Ｚ値が６超の上部右側に示す。
［図９］本開示の実施形態における、Ａｌｕ因子へのプローブのハイブリダイゼーションを示す図である。
［図１０］トリソミー１３を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。
［図１１］トリソミー１８を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。
［図１２］トリソミー２１を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。
本開示では、異数性を検出するためのシステム及び方法を提供する。
本明細書に記載の本開示を完全に理解できるように、以下に詳細な説明を記載する。
本明細書において特に明示しない限り、本出願で用いる科学用語及び専門用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載する、細胞及び組織培養技術、分子生物学技術、細胞生物学技術、がん生物学技術、神経生物学技術、神経化学技術、ウイルス学技術、免疫学技術、微生物学技術、遺伝学技術、タンパク質及び核酸化学技術、化学技術、薬理学技術と関連させて用いる専門用語は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである。本明細書に記載する本開示のそれぞれの実施形態は、単独で用いてもよく、または、本開示の１つまたは複数のその他実施形態と組み合わせて用いてもよい。
本開示の方法及び技術は通常、特に指示がない限り、当該技術分野において周知の分子生物学的方法、細胞生物学的方法、生化学的方法、マイクロアレイ及びシークエンシング技術、ならびに、本明細書全体にわたり列挙及び説明する各種概要及びより具体的な言及の記載に従い行われる。例えば、Ｍｏｔｕｌｓｋｙ，「Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ」，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）；Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｔｈ ｅｄ．」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９９）；Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．」，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（２０００）を参照されたい。
本明細書で用いる化学用語は、「Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ」，Ｐａｒｋｅｒ Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃ．Ａ．（１９８５）により例示されるような、当該技術分野における通常の用法に従って用いられる。
上記の全て、ならびに、本出願において参照する任意のその他刊行物、特許及び公開特許出願は明示的に、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書（その具体的な定義を含む）が優先される。
本明細書の全体にわたり、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、またはその変形形態「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、明示した整数（または構成要素）または整数（または構成要素）の群を包含するが、任意のその他の整数（または構成要素）または整数（または構成要素）の群を除外しないことを意味するものと理解されたい。
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指示しない限り、複数形を含む。
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むがこれらに限定されない」を意味するように用いられる。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含むがこれらに限定されない」は、同じ意味で用いられる。
定義
本開示を更に明示するために、本明細書において、以下の用語及び定義を提供する。
本発明で使用する場合、用語「異数性」とは、例えば、半数体染色体数の正確な倍数ではない、染色体数の異常変異に特徴付けられる染色体異常のことを意味する。例えば、ｎが半数体個体の染色体数である場合、正倍数性の個体は、２ｎに等しい数の染色体を有している。ヒトにおける半数体数は２３である。それゆえ、二倍体個体は４６の染色体を有することになる。異数性の個体は、染色体の余分な複製（その染色体のトリソミー）を有する場合があり、または、染色体の複製を欠損（その染色体のモノソミー）している場合がある。異常変異は、それぞれの個々の染色体を基準としている。それゆえ、トリソミー及びモノソミーの両方を有している個体は、４６本の染色体を有するにもかかわらず異数体である。異数性による疾患または状態の例としては、ダウン症候群（２１番染色体のトリソミー）、エドワーズ症候群（１８番染色体のトリソミー）、パトー症候群（１３番染色体のトリソミー）、ターナー症候群（女性におけるＸ染色体のモノソミー）、及び、クラインフェルター症候群（男性におけるＸ染色体の余分な複製）が挙げられるが、これらに限定されない。異数体ではないその他の染色体異常としては、転座（ある染色体のあるセグメントが、別の染色体へと移行していること）、欠失（染色体の一部が失われていること）、及び、他の種類の染色体損傷（例えば、脆弱Ｘ症候群であり、それは異常に壊れやすいＸ染色体により引き起こされる）が挙げられる。
本開示におけるその他の実施形態では、本方法を用いてコピー数多型を検出することができる。本発明で使用する場合、「コピー数多型」とは通常、遺伝的変異または染色体異常の分類または種類のことである。コピー数多型は、欠失（例えば、微小欠失）、重複（例えば、微小重複）、または、挿入（例えば、微小挿入）であり得る。特定の実施形態では、本発明で使用する接頭辞「微小」とは、長さ５塩基対未満の核酸セグメントのことを意味し得る。コピー数多型としては、染色体セグメントにおける、１つまたは複数の欠失（例えば、微小欠失）、重複及び／または挿入（例えば、微小重複、微小挿入）を挙げることができる。特定の実施形態では、重複は挿入を含む。特定の実施形態では、挿入とは重複のことである。特定の実施形態では、挿入は重複のことではない。例えば、ある部位において配列が重複すると、重複が見つかる部位のカウントが増加する。多くの場合、ある部位において配列が重複すると、エレベーションまたはレベルが増加する。特定の実施形態では、第１のエレベーションまたはレベルを構成する部位に存在する重複は、重複が存在しない第２のエレベーションまたはレベルと比較して、エレベーションまたはレベルを増加させる。特定の実施形態では、挿入はある部位のカウントを増加させ、挿入を示す配列は同一部位内の別の位置に存在（すなわち、重複）する。特定の実施形態では、挿入は、ある部位のカウント、すなわち、エレベーションまたはレベルを有意には増加させず、挿入された配列は同一部位内における配列の重複ではない。特定の実施形態では、挿入は検出されないか、または、重複としては示されず、挿入を示す重複配列は同一部位には存在しない。一部の実施形態では、コピー数多型は、胎児のコピー数多型である。多くの場合、胎児のコピー数多型は、胎児のゲノム内におけるコピー数多型である。一部の実施形態では、コピー数多型は、母体及び／または胎児のコピー数多型である。特定の実施形態では、母体及び／または胎児のコピー数多型は、妊娠している女性（例えば、胎児を身籠もっている女性の対象）の、出産した女性の対象の、または、胎児を身籠もることが可能な女性のゲノム内におけるコピー数多型である。コピー数多型は、変異（例えば、重複または欠失）がゲノムの片方の対立遺伝子に存在する、ヘテロ接合性のコピー数多型であり得る。コピー数多型は、変異がゲノムの両方の対立遺伝子に存在する、ホモ接合性のコピー数多型であり得る。一部の実施形態では、コピー数多型は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の、胎児のコピー数多型である。一部の実施形態では、コピー数多型は、ヘテロ接合性またはホモ接合性の、母体及び／または胎児のコピー数多型である。コピー数多型は、母体のゲノム及び胎児のゲノム内に存在する場合があり、母体のゲノム内に存在して胎児のゲノム内には存在しない場合があり、または、胎児のゲノム内に存在して母体のゲノム内には存在しない場合がある。
本発明で使用する場合、用語「対象」及び「患者」とは、任意の動物、例えば、イヌ、ネコ、トリ、家畜類など、特に哺乳類、好ましくはヒトのことを意味する。用語「参照対象」及び「参照患者」とは、既知の遺伝子型（例えば、既知の正倍数性または異数性）を示す、任意の対象または患者のことを意味する。
本発明で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、及び、「核酸分子」は同じ意味で用いられ、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、及び、ヌクレオチドのアナログを用いて作製したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログのことを意味する。核酸分子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、多本鎖ＤＮＡ、相補ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、非コードＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）、または、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。
本発明で使用する場合、用語「試料」とは、体液、細胞、組織、器官、または、生体に通常由来する試料のことを意味し、試料としては、例えば、異数性またはその他染色体異常のスクリーニングを実施する少なくとも１つの核酸配列を含む、核酸または核酸の混合物が挙げられる。一部の実施形態では、試料は、全血試料、血清試料、または、血漿試料などの血液試料である。一部の実施形態では、試料は、ゲノムが変異を起こしていると推測される、少なくとも１つの核酸配列を含む。このような試料としては、痰／唾液、羊水、血液、血液画分、または、細針生検検体（例えば、外科生検、細針生検など）、尿、腹腔液、胸水などが挙げられるが、これらに限定されない。試料は多くの場合、ヒト対象（例えば、患者）から採取するが、アッセイを用いて、任意の哺乳類（イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタなどを含むがこれらに限定されない）に由来する試料から異数性を検出してもよい。生物源から得た試料を直接用いてもよく、または、前処理を施してから試料の特性を調整してもよい。このような前処理としては、例えば、血液から血漿を調製すること、粘性流体を希釈することなどを挙げてもよい。前処理の方法としては更に、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、遠心分離、凍結、凍結乾燥、濃縮、増幅、核酸の断片化、干渉する構成要素の不活性化、試薬の添加、溶解などを挙げてもよいが、これらに限定されない。試料に対してこのような前処理方法を採用する場合、このような前処理方法は通常、目的の核酸（複数可）が検査用試料中に残存するように行われ、好ましくは、未処理の検査用試料（例えば、つまり、このような前処理方法（複数可）を行わない試料）の濃度と釣り合う濃度で行われる。用いる試料の種類にもよるが、追加の処理及び／または精製工程を実施して、適切な純度またはサイズの核酸断片を得てもよい。用いる処理方法としては、超音波処理、噴霧化、ゲル精製、ＰＣＲ精製システム、ヌクレアーゼによる切断、サイズ特異的な捕捉または排除、標的捕捉、またはこれら方法の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。更なる解析を行う前に、任意選択的に、無細胞ＤＮＡを試料から単離してもよい。一部の実施形態では、試料は、本開示のシステム及び方法を用いて正倍数性または異数性の同定を行う対象由来のものであり、それら試料もまた「検査試料」と呼ばれる。
本発明で使用する場合、用語「ＭＩＰ」とは、分子反転プローブ（環状捕捉プローブとしても周知）のことを意味する。本発明で使用する場合、用語「プライマー」または「プローブ」もまた、ＭＩＰを意味していてもよい。分子反転プローブは、２つの標的ポリヌクレオチドアーム、１つまたは複数の固有分子タグ（固有分子識別子としても周知）、及び、ポリヌクレオチドリンカー（例えば、一般的な主鎖リンカー）を有する核酸分子である。例えば、図５を参照のこと。一部の実施形態では、ＭＩＰは、２つ以上の固有分子タグ、例えば、２つの固有分子タグ、３つの固有分子タグ、またはそれ以上を含んでいてもよい。一部の実施形態では、それぞれのＭＩＰ内における固有ポリヌクレオチドアームがＭＩＰの５´末端及び３´末端に位置する一方で、固有分子タグ（複数可）及びポリヌクレオチドリンカーは中央部に位置する。例えば、本開示で用いるＭＩＰは、以下の構成要素、第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含む。一部の実施形態では、ＭＩＰ内におけるポリヌクレオチドリンカー（または主鎖リンカー）は、本開示の方法に用いる全てのＭＩＰにおいて共通である。
ＭＩＰ内において、固有ポリヌクレオチドアームは、ゲノム核酸試料中の目的とする特定の標的配列（または部位）の上流及び下流に直接ハイブリダイズするように設計されている。本発明で使用する場合、用語「目的の標的配列」及び「目的の標的部位」は同じ意味で用いられ、ＭＩＰがそれを捕捉するように設計された、ゲノム核酸分子の一部のことを意味する。一部の実施形態では、固有ポリヌクレオチドアームは、ゲノム核酸試料中における１つまたは複数の目的の配列（または目的の部位）に隣接する上流及び下流に対して相補的である。一部の実施形態では、これら固有ポリヌクレオチドアームは、ゲノム核酸試料中における１つまたは複数の目的の配列（または目的の部位）に対して相補的である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、ライゲーション配列及び伸長配列を含む。ＤＮＡ試料中における複数の目的の配列に対して相補的な、標的ポリヌクレオチドアームを含むＭＩＰは、「再犯者（ｒｅｐｅａｔ ｏｆｆｅｎｄｅｒ）−ＭＩＰ」または「ＲＯ−ＭＩＰ」と呼ばれることもある。例えば、ＲＯ−ＭＩＰは、ＤＮＡ試料（例えば、ヒトゲノムを含む試料）中における、数百の、数千の、数十万の、または、数百万の目的の配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、ＲＯ−ＭＩＰは、例えば、１，０００超の、１０，０００超の、２０，０００超の、３０，０００超の、４０，０００超の、５０，０００超の、６０，０００超の、７０，０００超の、８０，０００超の、９０，０００超の、１００，０００超の、２００，０００超の、３００，０００超の、４００，０００超の、５００，０００超の、６００，０００超の、７００，０００超の、８００，０００超の、９００，０００超の、及び／または、１，０００，０００超の、目的の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＲＯ−ＭＩＰは、例えば、１００，０００超の、１１０，０００超の、１２０，０００超の、１３０，０００超の、１４０，０００超の、１５０，０００超の、１６０，０００超の、１７０，０００超の、１８０，０００超の、１９０，０００超の、及び／もしくは、２００，０００超の、または、１００，０００〜２００，０００の任意の範囲の、目的の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＲＯ−ＭＩＰは、１４０，０００〜１６０，０００の、目的の配列を標的とする。これら目的の配列は、標的ポリヌクレオチドアームがそこにハイブリダイズする反復配列に隣接していてもよい。特定の実施形態では、反復配列は、標的ポリヌクレオチドアームとハイブリダイズする上で、０、１、２、３、４、またはそれ以上のミスマッチを有している。特定の実施形態では、反復配列は、標的ポリヌクレオチドアームとハイブリダイズする上で、０または１のミスマッチを有している。一部の実施形態では、ＲＯ−ＭＩＰは、ゲノム中の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）とは結合しない。
一部の実施形態では、固有分子タグは、ランダムに生成された短いヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、固有分子タグは、ゲノム核酸断片上またはゲノム核酸試料中に位置する、任意の配列または部位とはハイブリダイズしない。特定の実施形態では、固有分子タグは、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に組み込み可能または結合可能な、好適な検出可能標識を有する任意のタグであり、それらタグにより、タグを含む核酸またはタグと結合した核酸の検出及び／または同定が可能となる。一部の実施形態では、タグは、シークエンシング法（例えば、ポリメラーゼによる）を行う最中に、核酸に組み込まれるか、または、核酸と結合する。タグの非限定例としては、核酸タグ、核酸インデックスまたは核酸バーコード、放射能標識（例えば、同位元素）、金属標識、蛍光標識、化学発光標識、リン光標識、蛍光体−消光剤、染料、タンパク質（例えば、酵素、抗体またはその一部、リンカー、結合対の構成要素）など、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、タグ（例えば、核酸インデックスまたは核酸バーコード）は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログにおける、固有の配列、周知の配列、及び／または、識別可能な配列である。一部の実施形態では、タグは、６個またはそれ以上の隣接ヌクレオチドである。様々な異なる励起スペクトル及び発光スペクトルを持つ多数の蛍光体が利用可能である。任意の適切な種類及び／または数の蛍光体をタグとして用いることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載する方法（例えば、核酸検出法及び／またはシークエンシング法）に、１個以上の、２個以上の、３個以上の、４個以上の、５個以上の、６個以上の、７個以上の、８個以上の、９個以上の、１０個以上の、２０個以上の、３０個以上の、５０個以上の、１００個以上の、５００個以上の、１０００個以上の、１０，０００個以上の、または、１００，０００個以上の異なるタグを利用することができる。一部の実施形態では、１種または２種のタグ（例えば、蛍光標識）を、ライブラリ内のそれぞれの核酸と連結させる。一部の実施形態では、染色体に特異的なタグを用いることで、染色体のカウントをより速くまたはより容易にする。タグの検出及び／または定量化は、適切な方法、装置、または、機器を用いて実施可能であり、その非限定例としては、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、照度計、蛍光光度計、分光光度計、適切なジーンチップもしくはマイクロアレイ解析、ウェスタンブロット、質量分析、クロマトグラフィー、細胞蛍光測定分析、蛍光顕微鏡、適切な蛍光画像処理法もしくはデジタル画像処理法、共焦点レーザー走査顕微鏡、レーザー走査サイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィー、手動によるバッチ様式の分離、電界懸濁、適切な核酸シークエンシング法、及び／または、核酸シークエンシング装置など、ならびに、これらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態では、タグは、マイクロアレイ解析と共に用いるのに適している。
核酸（例えば、核酸断片）にＭＩＰを導入して、核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡ）上に位置する標的配列または標的部位の捕捉を行う。一部の実施形態において、例えば、ゲノムＤＮＡが試料中に存在している場合、断片化させることが、分子反転プローブによる標的核酸の捕捉に役立ち得る。本明細書において更に詳細に記載するとおり、目的の標的配列（例えば、遺伝子座）を捕捉した後、標的配列の複製を環に組み込むように、捕捉した標的に対して、酵素によるギャップフィリング工程及びライゲーション工程を更に実施してもよい。ＭＩＰによる核酸断片上の標的配列の捕捉性能は、ハイブリダイゼーション及びギャップフィリングのためのインキュベーション時間を長くすることにより、向上させることができる（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ Ｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ａｐｒ．６：１−２を参照されたい）。
ＭＩＰ技術を用いて、複合混合液中の特定の核酸配列を検出または増幅してもよい。ＭＩＰ技術を用いることによる利点の１つは、その高度な多重化能力であり、それにより、数千ものＭＩＰを含有する単一の反応液中で、数千もの標的配列を捕捉することが可能となる。ＭＩＰ技術の様々な態様については、例えば、Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｔａｇｇｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ」（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（６）：６７３−６７８（２００３））、Ｈａｒｄｅｎｂｏｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｏｖｅｒ １０，０００ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＳＮＰｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｔｕｂｅ ａｓｓａｙ」（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：２６９−２７５（２００５））、Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，「ＤＭＥＴ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６３２：９９−１２４（２０１０））、Ｓｉｓｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｅｒａ：ｔｈｅ ＤＭＥＴ ｐｌａｔｆｏｒｍ」（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１（１）：８９−１０３（２０１０））、Ｄｅｅｋｅｎ，「Ｔｈｅ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＤＭＥＴ ｐｌａｔｆｏｒｍ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１（３）：２６０−２６８（２００９））、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ＦＦＰＥ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ（ＭＩＰ） ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２：８（２００９））、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ」（Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８（１１）：Ｒ２４６（２００７））、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６（１６）：７９１０−７９１９（２００６））、及び、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ａｌｌｅｌｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ（ＭＩＰ）」（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（２１）：ｅ１８３（２００５））に記載されている（それぞれの記載内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。米国特許番号６，８５８，４１２、５，８１７，９２１、６，５５８，９２８、７，３２０，８６０、７，３５１，５２８、５，８６６，３３７、６，０２７，８８９、及び、６，８５２，４８７もまた参照されたい（それぞれの開示内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ＭＩＰ技術は以前より、がんのバイオマーカーの新規同定及び分類を含むその他の研究領域に、うまく応用されている。例えば、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｃｒｅｅｎ− ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍ−ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ ａｎｄ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４（１０）：１６０９−１６１６（２０１１））、Ｇｅｉｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｕｎｋｎｏｗｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ ＵＳＰ６ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ＳＳ１８ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌｉｄ ａｎｅｕｒｙｓｍａｌ ｂｏｎｅ ｃｙｓｔ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０４（４）：１９５−２０２（２０１１））、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＢＲＡＦ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＤＫＮ２Ａ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７０（２）：５１２−５１９（２０１０））、Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ９ｐ２１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ」（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９３（１）：９−１８（２００９））、Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ＢＲＣＡ１ ｌｏｓｓ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ」（ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，８：１７（２００８））、及び、Ｄｅｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ａｎｄ ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＤＭＥＴ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ」（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，１０（３）：１９１−１９９（２００９））を参照されたい（それぞれの記載内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
ＭＩＰ技術はまた、新規薬剤に関連したバイオマーカーの同定に応用されている。例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，「ＣＹＰ４Ｆ２ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔ ａｌｔｅｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｅ」（Ｂｌｏｏｄ，１１１（８）：４１０６−４１１２（２００８））、及び、ＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，「ＣＹＰ４Ｆ２ Ｉｓ ａ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ１ Ｏｘｉｄａｓｅ：Ａｎ Ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｗａｒｆａｒｉｎ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｖ４３３Ｍ Ｖａｒｉａｎｔ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７５：１３３７−１３４６（２００９））を参照されたい（それぞれの記載内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＭＩＰのその他の応用法としては、薬物開発及び安全性研究が挙げられる。例えば、Ｍｅｇａ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ」（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３６０（４）：３５４−３６２（２００９））、Ｄｕｍａｕａｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，８（３）：２９３−３０５（２００７））、及び、Ｄａｌｙ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｒｕｇ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ」（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３（７）：１２２２−１２３０（２００７））を参照されたい（それぞれの記載内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。ＭＩＰ技術の更なる応用としては、遺伝子型及び表現型のデータベース化が挙げられる。例えば、Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅｓ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｉｎ ３ Ｍａｊｏｒ Ｅａｓｔ Ａｓｉａｎ Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ Ｃａｕｃａｓｉａｎｓ ａｎｄ Ａｆｒｉｃａｎｓ」（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５０（８）：９２９−９４０（２０１０））を参照されたい（その記載内容全体は、あらゆる目的において参照として本明細書に組み込まれる）。
本発明で使用する場合、用語「捕捉する」または「捕捉」とは、分子反転プローブと対応する標的部位との間の結合反応またはハイブリダイゼーション反応のことを意味する。
本発明で使用する場合、用語「感度」とは、アッセイ（例えば、方法、検査法）の性能における統計指標のことを意味し、真陽性の数を、真陽性と偽陰性との合計で割ることにより算出される。
本発明で使用する場合、用語「特異度」とは、アッセイ（例えば、方法、検査法）の性能における統計指標のことを意味し、真陰性の数を、真陰性と偽陽性との合計で割ることにより算出される。
本発明で使用する場合、用語「ＭＩＰレプリコン」または「環状レプリコン」とは、捕捉反応（例えば、ＭＩＰとその標的配列との間の結合反応またはハイブリダイゼーション反応）により生成された環状核酸分子のことを意味する。一部の実施形態では、ＭＩＰレプリコンは一本鎖環状核酸分子である。一部の実施形態では、標的ＭＩＰは、標的配列または標的部位を捕捉、または、標的配列または標的部位にハイブリダイズする。捕捉反応またはハイブリダイゼーションの後に、ライゲーション／伸長用混合液を導入して、２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし、一本鎖環状ヌクレオチド分子、すなわち、標的ＭＩＰレプリコンを作製する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＭＩＰレプリコンを増幅させて、二本鎖ヌクレオチド分子である、複数の標的ＭＩＰアンプリコンを作製してもよい。
本発明で使用する場合、用語「アンプリコン」とは、増幅反応により生成された核酸のことを意味する。一部の実施形態では、アンプリコンは一本鎖核酸分子である。一部の実施形態では、アンプリコンは一本鎖環状核酸分子である。一部の実施形態では、アンプリコンは、二本鎖核酸分子である。例えば、ＭＩＰ（例えば、ＲＯ−ＭＩＰ）は、標的配列または標的部位を捕捉、または、標的配列または標的部位にハイブリダイズする。捕捉反応またはハイブリダイゼーションの後に、ライゲーション／伸長用混合液を導入して、２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし、一本鎖環状ヌクレオチド分子、すなわち、ＭＩＰレプリコンを作製する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＭＩＰレプリコンを増幅させて、二本鎖ヌクレオチド分子である、複数のＭＩＰアンプリコンを作製してもよい。第１の複数の目的の標的配列（例えば、異数性を検査する染色体）及び第２の複数の目的の標的配列（例えば、ゲノム全体に分布する標的配列）から、ＭＩＰレプリコン及びＭＩＰアンプリコンを作製することができる。
本発明で使用する場合、用語「シークエンシング」は、広範な意味で用いられ、また、少なくとも核酸の一部における少なくとも一部の連続したヌクレオチドの順番を同定することを可能とする、当該技術分野において周知である任意の技術のことを意味することができ、制限はないが、伸長産物またはベクターインサートの少なくとも一部を含む。シークエンシングは更に、核酸配列におけるヌクレオチド塩基間の違いの検出を可能とする技術のことを意味し得る。例示的なシークエンシング技術としては、以下のものが挙げられる。標的シークエンシング、１分子リアルタイムシークエンシング、電子顕微鏡ベースのシークエンシング、トランジスタを用いたシークエンシング、ダイレクトシークエンシング、ランダムショットガンシークエンシング、サンガージデオキシ末端シークエンシング、標的シークエンシング、エキソンシークエンシング、全ゲノムシークエンシング、ハイブリダイゼーション（例えば、マイクロアレイなどのアレイ）によるシークエンシング、パイロシークエンシング、キャピラリ電気泳動、ゲル電気泳動、二重鎖シークエンシング、サイクルシークエンシング、１塩基伸長シークエンシング、固相シークエンシング、ハイスループットシークエンシング、超並列シグネチャーシークエンシング、エマルションＰＣＲ、低変性温度の同時増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆染色末端によるシークエンシング、ペアエンドシークエンシング、近接末端シークエンシング、エキソヌクレアーゼシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ショートリードシークエンシング、１分子シークエンシング、合成によるシークエンシング、リアルタイムシークエンシング、リバースターミネーターシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、ナノボールシークエンシング、ナノポアシークエンシング、４５４シークエンシング、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒによるシークエンシング、ｍｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨｉＳｅｑ ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨｉＳｅｑ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＭｉｎＩＯＮ（商標）（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リアルタイムＳＭＲＴ（商標）技術（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｒｏｂｅ−Ａｎｃｈｏｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（ｃＰＡＬ（商標））（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ／ＢＧＩ）、ＳＯＬｉＤ（登録商標）シークエンシング、ＭＳ−ＰＥＴシークエンシング、質量分析、及びこれらの組み合わせ。一部の実施形態では、シークエンシングは、装置（限定するわけではないが、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００−Ａｖａｎｔ、３７３０、もしくは、３７３ＯｘＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、または、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ２０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、または、質量分析計）を用いて、シークエンシング産物を検出することを含む。特定の実施形態では、シークエンシングはエマルションＰＣＲを含む。特定の実施形態では、シークエンシングは、ハイスループットシークエンシング技術、限定するわけではないが、例えば、超並列シグネチャーシークエンシング（ＭＰＳＳ）を含む。
本明細書に記載する方法及び装置においては、ＲＯ−ＭＩＰ産物を定量するためにマイクロアレイ技術を代わりに採用してもよい。「マイクロアレイ」または「アレイ」とは、表面を有する固相支持体のことを意味し、その表面は、限定するわけではないが、好ましくは、平坦な表面、または実質的に平坦な表面であり、アレイのそれぞれの部位が、実質的に同一または同一のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの複製を含み、空間的に分けられ、アレイ上のその他構成要素の部位と重なり合わない（つまり、部位が空間的に分離している）ように、核酸を含む部位のアレイを備える。アレイまたはマイクロアレイは更に、ビーズまたはウェルなどの表面を有する、信号を送ることが可能な平坦ではない構造体を含んでいてもよい。アレイ上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、固相支持体と共有結合していてもよく、または、非共有結合していてもよい。通常のマイクロアレイ技術については、例えば、Ｓｃｈｅｎａ，Ｅｄ．，「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００））で考察されている。「アレイ解析」、「アレイによる解析」、または、「マイクロアレイによる解析」とは、例えば、マイクロアレイを用いた１つまたは複数の生体分子の配列解析などの解析のことを意味する。一部の実施形態では、それぞれの試料は、個別に単一のマイクロアレイへとハイブリダイズされる。その他の実施形態では、複数のマイクロアレイを、簡便なハイスループット処理用の単一マルチマイクロアレイプレート上に物理的に接続させることにより、処理のスループットを向上させることができる。特定の実施形態では、とりわけＲＯ−ＭＩＰアッセイの産物を定量するための、カスタムＤＮＡマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）製）を作製することができる。
本明細書に記載する組成物及び方法が出願に適したように脚色または修正可能であること、本明細書に記載する組成物及び方法をその他の適切な用途に採用可能であること、及び、このようなその他の追加及び修正が本発明の範囲から逸脱しないということを、当業者は理解するであろう。
本開示は、以下に続く実験の詳細からより理解されよう。しかしながら、その後に続く実施形態でより完全に説明するように、記載する特定の方法及び結果は本開示を例示するに過ぎないということを、当業者は容易に理解するであろう。
疾患または状態を検出するための方法
現行のシークエンシング法は、有効な変動係数を得るのに数千万ものリードを必要とする面倒なシークエンシングライブラリ調製工程を採用しており、試料中における胎児由来の比率が４％未満に下がる場合、その有効性が失われることがある。非標的「ショットガン」法は、ヒト異数性に関連する染色体における適切な領域のカバレッジを得るのに、本質的に多数のリードを必要とする。標的法は、多数のＰＣＲ用プライマー操作、及び多重化を必要とする。ライブラリ調製において、反復領域のＰＣＲ増幅に１種類のプライマーペアを用いる方法では、生成配列に不明瞭さ（干渉）を生じさせるＰＣＲアーティファクトの悪影響を受ける場合があり、特徴的なマッピングリードの比率、及び、全体効率が低下してしまう。
本開示の実施形態では、異数性を検出するための現行シークエンシング法が抱える課題に対する解決策を提供する。これらの実施形態では、従来のライブラリ調製法を、少数のオリゴヌクレオチドＭＩＰを用いた捕捉方法に置き換えているが、そのＭＩＰは、反復配列にハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドアームを含み、そのアームは、高性能で一般的な主鎖構造に結合したアームである。これらのＭＩＰは、ヒトゲノム全体にわたり固有にアラインした配列に隣接して一体化するように設計されているが、それら配列には、一般的な異数性（例えば、２１、１８、または、１３番染色体のトリソミー）の検出に関連する標的が豊富に存在している。捕捉分子の選択について検討する方法では、定量化を行うために、適切な領域における固有配列を選択する必要性に言及しているが、増幅に好都合な反復配列においては、一部の固有配列の存在に依存することはない。
最適化した捕捉方法において反復配列（すなわち、「再犯者」）を用いることにより、ライブラリ調製中における１分子運動のバーコード化標的作製において、類似配列による干渉がほとんどまたは全くない状態での、標的領域の高密度配置が可能となる。１分子解析により、優れた定量化及び染色体カウントが可能となる。また代わりに、リード数をカウントしてもよい。しかし、１分子解析には偏りがないため、定量化にも影響を及ぼし難い。本明細書に記載の方法では、分子タグをカウントすることにより、オリジナルＤＮＡ試料中に比較的豊富に存在するそれぞれの配列について、より精度の高い状態を把握する。本開示は更に、従来の方法と比較して経済的にメリットのある方法を提供する。詳細には、本方法は、ゲノムワイドなインデックスをなおも検査可能な少量の捕捉用試薬（プライマー）を用いることにより、節約をもたらす。方法は更に、容易に多重化可能なアッセイを用いた、リード数の少ない迅速な解析を提供する。例えば、本方法では、固有分子タグ及び／または固有分子バーコードの複数の層を用いて、特定のプライマー種を同定することができ、またそれに加えて、多重化データを読み解いて個々の試料までシグナルを追跡することができる。更に、本方法を、１００％胎児性試料（受胎産物など）または非胎児性診断用試料中のトリソミーを検出することなど、カバレッジが極端に低い用途に用いることができる。また、試料を混合してもよく（例えば、胎児対母体、または、疾患対非疾患）、または、混合しなくてもよい（例えば、異数性を有すると疑われる小児）。この場合、シグナルが強力であるため、「カバレッジ」または読み取り深度が非常に低い（例えば、２０，０００未満の読み取り深度）場合がある。方法はまた、全ゲノムシークエンシング、全エキソームシークエンシング、及び、超並列ショットガンシークエンシングと比較して、迅速である。
本開示の方法は、遺伝子解析分野に関する。一般に、これらの方法は、遺伝的機能の欠失及び重複を検出及び定量するための迅速かつ経済的な手法として利用可能である。その欠失及び重複は、完全な染色体及び染色体のアームから、微細欠失及び微細重複、極微細欠失及び極微細欠失、更には、一塩基多型、一塩基欠失、及び、一塩基挿入を含む一ヌクレオチド機能までの範囲を含む。特定の実施形態では、本開示の方法を用いて、サブ染色体の遺伝的損傷、例えば、微細欠失を検出することができる。本方法の例示的な応用としては、小児の異数性診断、受胎産物の検査または早期流産リスクの検査、非侵襲的出生前検査（定性的及び定量的両方の遺伝子検査、例えば、メンデル病、挿入／欠失、及び、染色体不均衡の検出など）、着床前遺伝子検査、腫瘍特性解析、細胞遺伝学を含む出生後検査、及び、突然変異原の影響のモニタリングが挙げられる。
本開示が提供する核酸分子（例えば、ＭＩＰ）は更に、同一分子の一部ではない通常のＰＣＲ用プライマーペアと比較して、結合安定性が高いという利点を有している。特定の実施形態では、標的アーム配列の長さは、ＰＣＲ用プライマーの長さと比較して、厳密にはやや短い。それゆえ、ＰＣＲに関して言えば、標的アーム配列の融解温度は非常に低くなる。しかしながら、ＭＩＰ構成において、プライマーは、共同して相互作用を安定させることによりその結合特異性を高める。一方のアームの結合能が高い場合、反対側のアームの結合能が低かったとしても、捕捉性は向上する。ペアの長さを長くすることにより、捕捉における「オン／オフ」のバランスが向上する。その理由としては、ＭＩＰ内において結合能の低いアームが、遊離ＰＣＲプライマーとしてよりも、その標的により近接する場合が多いためである。
本開示が提供する方法には、標的シークエンシングと比較して、いくつかの利点がある。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、捕捉位置における２つの配列因子による同時認識を利用しているが、それら２つのアームの近接性には制限がある。対照的に、通常の標的シークエンシング法では、ポリメラーゼは、単一部位において反応を開始する。通常のシークエンシングを用いて生成したランオン産物は結合不能をもたらすが、更に、第２のプライマーとの内部のまたは「適切でないプライミング」をもたらし得る。本開示の核酸（例えば、ＲＯ−ＭＩＰ）に固有の「デュアル認識」は、ストリンジェンシー（ＭＩＰ構造体内の分子識別子因子による定量化にもたらされる影響）を高める。固有分子タグをＭＩＰ主鎖の片側部位に配置してもよいが、分子識別子を用いる標準的な標的シークエンシングでは、両方のプライマーにランダム配列を用いる。更に、本開示が提供する方法では、標的シークエンシングが必要とする数百または数千もの多重化ＰＣＲ用プライマーと比較して、非常に少ないＲＯ−ＭＩＰでゲノムワイドなカバレッジを得ることが可能であるため、試薬コストの削減が可能となっている。それでもなお、本開示の方法は、標的シークエンシングがショットガン法により示す経済上の利点及び性能上の利点のほとんど（全てではない）を有している。
本開示の方法及び核酸は、上記の遺伝学的方法と比較して、明らかな利点を提供する。例えば、全ゲノムシークエンシング及び超並列ショットガンシークエンシングは通常、大規模で情報を持たないゲノム部位に関するコストの高い解析を必要とするのに対し、本方法では、ゲノムの一部を用いて同様の解析結果を得ることが可能であるため、アッセイコストを抑えて時間を短縮させることができる。その他の手法は、情報を有するゲノム部位の選択的なアッセイに依存している。本開示における特定の態様は一定の類似性を共有しているが、本方法は、反復したプライマー結合部位を同定するための新規の包括的な手法を用いている。その手法は、優れたアッセイ設計パラメータ（配列の曖昧さ、限定するわけではないが、例えば、反復ＬＩＮＥ因子）、より多くの候補プライマー（例えば、可能性のある全てのプライマーを数え上げるため）、臨床に十分有用なほど特異的で高感度なシンプルで低コストなアッセイ、及び、優れた多重化能力を可能とする。
本明細書に記載する方法及び核酸は、反復領域を含むゲノム全体にわたり目的の標的部位を同定するための別の方法（例えば、目的の標的部位（または目的の標的配列）の捕捉にプライマーを用いて染色体異数性を検出する方法）と比較して、明らかな利点を有している。特定の実施形態では、本開示の方法は、目的の標的部位（または目的の標的配列）を捕捉するのにＭＩＰを用いる。特定の実施形態では、本明細書に記載する方法で生成したＭＩＰレプリコン（またはアンプリコン）は、５０〜１２０ｂｐｓ（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、もしくは、１１５ｂｐｓ、または５０〜１２０ｂｐｓの間の任意のサイズ、または、５０〜１２０ｂｐｓの間の任意のサイズ範囲）のサイズを有している。一部の実施形態では、ＭＩＰレプリコン（またはアンプリコン）は、８０〜９０ｂｐｓ、８０〜１００ｂｐｓ、８０〜１１０ｂｐｓ、８０〜１２０ｂｐｓ、７０〜９０ｂｐｓ、７０〜１００ｂｐｓ、７０〜１１０ｂｐｓ、または、７０〜１２０ｂｐｓのサイズを有している。一部の実施形態では、ＭＩＰレプリコン（またはアンプリコン）は、８０〜９０ｂｐｓのサイズを有している。プライマー捕捉法では、本明細書に記載する方法で生成するＭＩＰレプリコン（またはアンプリコン）よりも長いレプリコン（またはアンプリコン）を生成する。血漿試料由来の環状ＤＮＡは多くの場合、断片化される。このようなＤＮＡを鋳型として用いる場合、短いレプリコン（またはアンプリコン）は、長いものと比較して明らかな利点を提供する。その理由としては、短いレプリコン（またはアンプリコン）が、短い断片の捕捉可能性を高めるからである。アンプリコンが長い場合、短い断片が、このような長いアンプリコンの両方の結合部位を有する可能性はほとんどない。更に、周知のプライマー捕捉法における試料あたりの読み取り深度は、本明細書に記載の方法の読み取り深度よりも高い。これが、周知のプライマー捕捉法における１つの欠点である。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、試料あたり２０百万リード未満の、試料あたり１９百万リード未満の、試料あたり１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、または、３百万リード未満の、試料あたり２百万リードを下回らない数の、試料あたり２〜２０百万リードの任意の範囲、または、試料あたり３〜２０百万リードの任意の範囲の、読み取り深度を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、試料あたり６〜８百万リードの、例えば、試料あたり６、７、または、８百万リードの、読み取り深度を提供する。更に、プライマー捕捉法と比較した場合、本明細書に記載の方法は、ゲノムワイドでより多くの目的の部位（または目的の配列）を標的とし、及び／または、プライマー捕捉法よりも目的の染色体（例えば、２１番染色体）上を標的とする。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ゲノム全体にわたる５０ｋ〜２５０ｋの範囲の（または、５０ｋ〜２５０ｋの間の任意の数または範囲の）、結合部位の総数を有する。一部の実施形態では、ゲノム全体にわたる結合部位の総数は、５０ｋ超、６０ｋ超、７０ｋ超、８０ｋ超、９０ｋ超、１００ｋ超、１１０ｋ超、１２０ｋ超、１３０ｋ超、１４０ｋ超、１５０ｋ超、１６０ｋ超、１７０ｋ超、１８０ｋ超、１９０ｋ超、２００ｋ超、２１０ｋ超、２２０ｋ超、２３０ｋ超、または、２４０ｋ超である。一部の実施形態では、ゲノム全体にわたる結合部位の総数は、１２５ｋ〜１７５ｋである。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的の染色体（例えば、２１番染色体）上に、５００〜３０００部位の範囲の（または、５００〜３０００部位の間の任意の数または範囲の）結合部位の総数を有している。一部の実施形態では、目的の染色体上における結合部位の総数は、５００超の、６００超の、７００超の、８００超の、９００超の、１０００超の、１１００超の、１２００超の、１３００超の、１４００超の、１５００超の、１６００超の、１７００超の、１８００超の、１９００超の、２０００超の、２１００超の、２２００超の、２３００超の、２４００超の、２５００超の、２６００超の、２７００超の、２８００超の、２９００超の、または、３０００超の部位である。一部の実施形態では、固有のアライメント率は、３５％超、３６％超、３７％超、３８％超、３９％超、４０％超、４１％超、４２％超、４３％超、４４％超、４５％超、４６％超、４７％超、４８％超、４９％超、もしくは、５０％超、または、それ以上である。本発明で使用する場合、用語「固有のアライメント率」とは、対象ゲノム（例えば、ヒトゲノム）上の１つの染色体位置に固有にアラインする、総シークエンシングリード数の比率のことを意味する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的の標的部位（または目的の標的配列）を捕捉するのに、または、目的の標的部位（または目的の標的配列）と結合するのに、ＭＩＰではないプライマーペアを用いる。一部の実施形態では、ＭＩＰではないプライマーペアは、直線状または環状に調製される。本発明で使用する場合、用語「目的の標的配列」及び「目的の標的部位」は同じ意味で用いられ、プライマーペアがそれを捕捉または結合するように設計された、ゲノム核酸分子の一部のことを意味する。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマーペアは、ゲノム核酸試料中の目的とする特定の標的配列（または部位）の上流及び下流に直接ハイブリダイズするように設計されている。一部の実施形態では、１つまたは複数のプライマーペアは、ゲノム核酸試料中における１つまたは複数の目的の配列（または目的の部位）に対して相補的な配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、検出を必要とする個体または胎児において、異数性を検出するための方法、または、異数性がないことを検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、検出を必要とする個体または胎児において、異数性を検出するための方法、または、異数性がないことを検出するための方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、胎児の異数性を検出するための方法を提供し、以下の内容を含む。
ａ）母体血液試料から単離した核酸試料を得ることと、
ｂ）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の１つまたは複数の集団を用いることにより、工程ａ）で得た核酸試料中における複数の目的の標的配列を捕捉して、複数のレプリコンを作製することと、
ＭＩＰ集団内のＭＩＰのそれぞれは、以下の構成要素、
第１の標的ポリヌクレオチドアーム、及び、第２の標的ポリヌクレオチドアームを、配列内に含み、
ＭＩＰのそれぞれにおける一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、同一であり、第１の複数の目的の標的配列内におけるそれぞれの配列に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的であり、
ｃ）目的の標的配列を増幅することと、
ｄ）目的の標的配列をシークエンスすることと、
ｅ）遺伝子座において、目的の標的配列をインシリコでゲノム配列にマッチさせることと、
ｆ）個々の遺伝子座においてマッチするアンプリコンの数をカウントし、検査染色体上の遺伝子座にマッチするアンプリコンの数を、参照染色体上の遺伝子座にマッチするアンプリコンの数と比較すること。
一部の実施形態では、本開示は、胎児の異数性を検出するための方法を提供し、以下の内容を含む。
ａ）母体血液試料から単離した核酸試料を得ることと、
ｂ）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の１つまたは複数の集団を用いることにより、工程ａ）で得た核酸試料中における複数の目的の標的配列を捕捉して、複数のレプリコンを作製することと、
ＭＩＰ集団内のＭＩＰのそれぞれは、以下の構成要素、
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含み、
ＭＩＰのそれぞれにおける一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、同一であり、複数の目的の標的配列内におけるそれぞれの配列に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的であり、
ＭＩＰのそれぞれにおける第１及び第２の固有標的分子タグの組み合わせは、ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）工程ｂ）で得たレプリコンから増幅した複数のＭＩＰアンプリコンをシークエンスすることと、
ｄ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た複数のアンプリコンにおける第１のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、第１のアンプリコン集団は、目的の標的配列のシークエンスにより同定され、
ｅ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た複数のアンプリコンにおける第２のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、第２のアンプリコン集団は、目的の標的配列のシークエンスにより同定され、
ｆ）工程ｄ）で測定したシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、そこから第１のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｇ）少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｆ）で決定した部位捕捉基準の第１のサブセットを同定することと、
ｈ）工程ｅ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから第２のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
ｉ）少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｈ）で決定した部位捕捉基準の第２のサブセットを同定することと、
ｊ）工程ｇ）で同定した部位捕捉基準の第１のサブセットから求めた第１の指標を、工程ｉ）で同定した部位捕捉基準の第２のサブセットから求めた第２の指標で正規化して、検査比率を得ることと、
ｋ）検査比率を、正倍数性または異数性を示すことが既知である参照対象から単離した参照核酸試料に基づいて計算した、複数の参照比率と比較することと、
ｌ）工程ｋ）の比較に基づいて、異数性が胎児において検出されるかどうかを判定すること。あるいは、この方法を用いて、胎児ではない対象内における異数性を検出することも可能である。特定の実施形態では、異数性の検出に代えて、本開示の方法を用いて、染色体のアーム内における遺伝的機能の欠失及び重複に加えて、微細欠失及び微細重複、極微細欠失及び極微細欠失、及び、一塩基多型、一塩基欠失、及び、一塩基挿入を含む一ヌクレオチド機能を検出及び定量することができる。
特定の実施形態では、本開示の方法を、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸試料、例えば、ゲノムＤＮＡに対して実施することができる。当業者に周知の任意の方法（例えば、遠心分離）を用いて、核酸試料を単離してもよい。当業者は、対象が任意のヒトであり得るということを理解するであろう。正倍数性、異数性、または、疾患もしくは状態が胎児において検出された場合、その対象は妊娠している女性である。
一部の実施形態において、本開示の方法では、１種類のＭＩＰを用いる。別の実施形態では、方法は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または、それ以上の種類のＭＩＰを用いる。例えば、複数種のＭＩＰを用いて、単一試料から異なる疾患または状態（例えば、異数性などの染色体異常）を検出することができる。特定の実施形態では、１種類のＭＩＰを用いて、単一試料から異なる疾患または状態（例えば、異数性などの染色体異常）を検出することができる。
当業者は、標的ポリヌクレオチドアームと核酸試料との間の効率的なハイブリダイゼーションを提供するために、第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さが必要に応じて様々であることを理解するであろう。例えば、第１及び／または第２の標的ポリヌクレオチドアームは、１４〜３０塩基対、例えば、１８〜２１塩基対であってもよい。特定の実施形態では、第１及び／または第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは、３０塩基対、または、１４〜３０塩基対の任意の範囲である。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、４５℃〜８０℃（例えば、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、もしくは、８０℃、または、４５℃〜８０℃の任意の範囲）の融解温度（ＴＭ）、及び／または、３０％〜８０％（例えば、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは、８０％、または、３０％〜８０％の任意の範囲）のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、４５℃〜８０℃（例えば、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、もしくは、８０℃、または、４５℃〜８０℃の任意の範囲）の融解温度（ＴＭ）、及び／または、３０％〜７０％（例えば、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、もしくは、７０％、または、３０％〜７０％の任意の範囲）のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、６０℃〜７０℃のＴＭ、及び／または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、以下、１）１４〜３０のヌクレオチド長、２）４５℃〜８０℃のＴＭ、及び、３）３０％〜７０％のＧＣ含有量、のうち少なくとも１つまたは複数を有する。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、捕捉後の増幅のために、同一の主鎖配列（すなわち、同一のポリヌクレオチドリンカー）を有する。一部の実施形態では、第１の標的ポリヌクレオチドアームの配列は、ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧである。一部の実施形態では、第２の標的ポリヌクレオチドアームの配列は、ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドアームは、例えば、１，０００超の、１０，０００超の、２０，０００超の、３０，０００超の、４０，０００超の、５０，０００超の、６０，０００超の、７０，０００超の、８０，０００超の、９０，０００超の、１００，０００超の、２００，０００超の、３００，０００超の、４００，０００超の、５００，０００超の、６００，０００超の、７００，０００超の、８００，０００超の、９００，０００超の、及び／または、１，０００，０００超の、目的の配列（または目的の部位）を標的とする。一部の実施形態では、目的の標的配列（または目的の部位）は、５０〜１５０ｂｐ（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは、１５０ｂｐ、または、５０〜１５０ｂｐの任意の範囲）のサイズを有する。一部の実施形態では、ＲＯ−ＭＩＰは、ゲノム中の長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）とは結合しない。
特定の実施形態では、本明細書に記載するＭＩＰは、ゲノム中の複数のＡｌｕ因子を捕捉、または、ゲノム中の複数のＡｌｕ因子と結合する。Ａｌｕ因子は、ヒト対象内に存在する最も豊富な転移因子であり、ゲノム全体に分散した１百万超の複製を有している。Ａｌｕ因子は反復配列であり、約３００塩基対の長さを有している（図９を参照されたい）。一部の実施形態では、ＭＩＰは、Ａｌｕ因子のライトアームを捕捉、または、Ａｌｕ因子のライトアームと結合する。一部の実施形態では、ＭＩＰは、Ａｌｕ因子のレフトアームを捕捉、または、Ａｌｕ因子のレフトアームと結合する。一部の実施形態では、ＭＩＰは、Ａｌｕ因子のライトアーム上の、３１ｎｔの挿入領域を捕捉、または、３１ｎｔの挿入領域と結合する（図９を参照のこと）。
固有分子タグは、任意のアンプリコンにおける捕捉現象の数を測定するための方法を提供する。ＭＩＰは、１つまたは複数の固有分子タグ、例えば、１、２、３、４、または、５つの固有分子タグを含んでいてもよい。特定の実施形態では、第１及び／または第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または、１５塩基対である。特定の実施形態では、固有分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度（例えば、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、または、６５℃）、及び／または、３０％〜８０％（例えば、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは、８０％、または、３０％〜８０％の任意の範囲、例えば、３０％〜７０％）のＧＣ含有量を有する。
ポリヌクレオチドリンカーは、２つの標的ポリヌクレオチドアーム間のギャップを埋める。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、第１の固有分子タグと第２の固有分子タグとの間に直に位置している。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、対象における任意のゲノム領域に対して実質的に相補的ではない。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、２０〜１，０００塩基対（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または、４０塩基対）の長さ、及び／または、４５℃〜８０℃（例えば、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、または、６５℃）の融解温度、及び／または、３０％〜８０％（例えば、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、もしくは、８０％、または、３０％〜８０％の任意の範囲、例えば、３０％〜７０％）のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも１種の増幅用プライマー、例えば、増幅用フォワードプライマー及び増幅用リバースプライマーを含む。例えば、増幅用フォワードプライマーの配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧ−３´（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、及び／または、増幅用リバースプライマーの配列は、５´−ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：２）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。したがって、ポリヌクレオチドリンカーのヌクレオチド配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
特定の実施形態では、ＭＩＰは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、また（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す。
特定の実施形態では、本明細書の本開示は、５´−Ａ−（Ｎ）ｘ−Ｂ−（Ｎ）ｙ−Ｃ−３´のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、式中、（Ｎ）ｘは第１の固有分子タグを表し、（Ｎ）ｙは第２の固有分子タグを表し、式中、Ｘ及びＹは４〜１５塩基対であり、式中、Ａは、ｉ）５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ−３´（配列番号：１５）の配列、または、５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ−３´（配列番号：１５）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有し、式中、Ｃは、ｉ）５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：１６）の配列、または、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：１６）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ａは、ｉ）５´−ＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧ−３´（配列番号：１５）の配列に少なくとも９０％、または、９５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｃは、ｉ）５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−３´（配列番号：１６）の配列に少なくとも９０％、または、９５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｂは、ｉ）５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列、または、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列に少なくとも８５％（または９０％もしくは９５％）類似した配列を含む。一部の実施形態では、ＡまたはＣは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する。一部の実施形態では、ＡまたはＣは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する。
特定の実施形態では、本明細書の本開示は、５´−Ａ−（Ｎ）ｘ−Ｂ−（Ｎ）ｙ−Ｃ−３´のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、式中、（Ｎ）ｘは第１の固有分子タグを表し、（Ｎ）ｙは第２の固有分子タグを表し、式中、Ｘ及びＹは４〜１５塩基対であり、式中、Ａは、ｉ）５´−ＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ−３´（配列番号：１７）の配列、または、５´−ＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ−３´（配列番号：１７）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有し、式中、Ｃは、ｉ）５´−ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣ−３´（配列番号：１８）の配列、または、５´−ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣ−３´（配列番号：１８）の配列に少なくとも８５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ａは、ｉ）５´−ＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣ−３´（配列番号：１７）の配列に少なくとも９０％、または、９５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｃは、ｉ）５´−ＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣ−３´（配列番号：１８）の配列に少なくとも９０％、または、９５％類似した配列を含み、ｉｉ）３０塩基対以下の長さを有する。一部の実施形態では、Ｂは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列、または、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）の配列に少なくとも８５％（または９０％もしくは９５％）類似した配列を含む。一部の実施形態では、ＡまたはＣは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する。一部の実施形態では、ＡまたはＣは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する。
一部の実施形態では、記載した方法に用いたＭＩＰは以下のとおりであり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及び、Ｈに対応する数値は、表１及び表２に関連させて記載しており、スコアに対応する数値は、式９に関連させて記載している。
Figure 0006830094
Figure 0006830094
一部の実施形態では、本開示の方法に用いるＭＩＰ集団は、１０ｆＭ〜１００ｎＭの濃度、例えば、０．５ｎＭの濃度を有している。特定の実施形態では、本開示の方法に用いるＭＩＰの濃度は標的にする配列の数と共に変化し、その数は、例えば、反応液中における目的の標的配列の数にゲノム当量の数を掛けることにより算出される（「総標的数」）。特定の実施形態では、ＭＩＰ分子数と総標的数とのおおよその比率は、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または、１：１，０００である。特定の実施形態では、ＭＩＰレプリコン及び／またはＭＩＰアンプリコンのそれぞれは、一本鎖環状核酸分子である。
一部の実施形態では、ｉ）第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームをそれぞれ、核酸試料中の対応する第１及び第２の領域にそれぞれハイブリダイズすること（第１及び第２の領域は目的の標的配列に隣接する）、及び、ｉｉ）ハイブリダイゼーション後、ライゲーション／伸長用混合液を用いて、２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし一本鎖環状核酸分子を作製すること、により、ＭＩＰレプリコンを作製する。特定の実施形態では、例えば、ＰＣＲを用いて、ＭＩＰレプリコンを増幅することにより、ＭＩＰアンプリコンを作製する。
一部の実施形態では、シークエンシング工程は、次世代シークエンシング法、例えば、超並列シークエンシング法またはショートリードシークエンシング法を含む。一部の実施形態では、シークエンシングは、当該技術分野において周知の任意の方法、例えば、標的シークエンシング、１分子リアルタイムシークエンシング、電子顕微鏡ベースのシークエンシング、トランジスタを用いたシークエンシング、ダイレクトシークエンシング、ランダムショットガンシークエンシング、サンガージデオキシ末端シークエンシング、標的シークエンシング、エキソンシークエンシング、全ゲノムシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、パイロシークエンシング、キャピラリ電気泳動、ゲル電気泳動、二重鎖シークエンシング、サイクルシークエンシング、１塩基伸長シークエンシング、固相シークエンシング、ハイスループットシークエンシング、超並列シグネチャーシークエンシング、エマルションＰＣＲ、低変性温度の同時増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、可逆染色末端によるシークエンシング、ペアエンドシークエンシング、近接末端シークエンシング、エキソヌクレアーゼシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ショートリードシークエンシング、１分子シークエンシング、合成によるシークエンシング、リアルタイムシークエンシング、リバースターミネーターシークエンシング、ナノポアシークエンシング、４５４シークエンシング、Ｓｏｌｅｘａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒによるシークエンシング、ＳＯＬｉＤ（登録商標）シークエンシング、ＭＳ−ＰＥＴシークエンシング、質量分析、及びこれらの組み合わせにより行われてもよい。一部の実施形態では、シークエンシングは、装置（限定するわけではないが、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００−Ａｖａｎｔ、３７３０、もしくは、３７３ＯｘＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ、または、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ２０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、または、質量分析計）を用いて、シークエンシング産物を検出することを含む。特定の実施形態では、シークエンシングはエマルションＰＣＲを含む。特定の実施形態では、シークエンシングは、ハイスループットシークエンシング技術、限定するわけではないが、例えば、超並列シグネチャーシークエンシング（ＭＰＳＳ）を含む。
本開示の方法において使用可能なシークエンシング技術としては、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングが挙げられる。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングは、フォールドバックＰＣＲ及びアンカープライマーを用いた固体表面上でのＤＮＡ増幅に基づいている。ゲノムＤＮＡを断片化し、その断片の５´末端及び３´末端にアダプターを付加する。フローセルチャネル表面上に結合させたＤＮＡ断片を、伸長及びブリッジ増幅させる。断片を二本鎖にし、その二本鎖分子を変性させる。複数サイクルの固相増幅に続いて変性を行うことにより、それぞれのフローセルチャネル内に、同一鋳型から複製した約１，０００個の一本鎖ＤＮＡ分子からなる数百万ものクラスターを形成することができる。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び、４色蛍光標識した可逆ターミネーターヌクレオチドを用いて、連続シークエンシングを行う。ヌクレオチドに組み込んだ後、レーザーを用いて蛍光体を励起させてから画像をキャプチャし、第１の塩基の識別を記録する。３´末端及び蛍光体をそれぞれの組み込み塩基から除去し、組み込み、検出、及び、同定からなる工程を繰り返す。この技術に従ったシークエンシング法は、米国特許第７，９６０，１２０号、米国特許第７，８３５，８７１号、米国特許第７，２３２，６５６号、米国特許第７，５９８，０３５号、米国特許第６，９１１，３４５号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第６，８２８，１００号、米国特許第６，３０６，５９７号、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許公開第２０１１／０００９２７８号、米国特許公開第２００７／０１１４３６２号、米国特許公開第２００６／０２９２６１１号、及び、米国特許公開第２００６／００２４６８１号に記載されている（それぞれの開示内容全体は、参照として本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本開示の方法は、シークエンシング（例えば、上記のシークエンシング工程ｄ））前にＰＣＲ反応を行い、シークエンシングのためのＭＩＰアンプリコンを増幅することを含む。このＰＣＲ反応は、インデックスＰＣＲ反応であってもよい。特定の実施形態において、インデックスＰＣＲ反応では、以下の構成要素、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、ＭＩＰアンプリコンのそれぞれに導入する。特定の実施形態では、バーコード化標的ＭＩＰアンプリコンは、以下の構成要素、第１のシークエンシングアダプター−第１のシークエンシングプライマー−第１の固有標的分子タグ−第１の標的ポリヌクレオチドアーム−捕捉核酸−第２の標的ポリヌクレオチドアーム−第２の固有標的分子タグ−固有試料バーコード−第２のシークエンシングプライマー−第２のシークエンシングアダプターを、配列内に含む。
一部の実施形態では、第１の複数の目的の標的配列は、単一染色体上に存在する。一部の実施形態では、第２の複数の目的の標的配列は、複数の染色体上に存在する。単一ＭＩＰ配列を用いてゲノム全体にわたる目的の配列を標的とすることが可能であるため、特定の実施形態では、本開示の方法は、２つ以上の染色体上の異数性を一度に検出可能であるという利点を提供する。例えば、第１の複数の標的配列を２１番染色体上の配列と定義してもよく、第２の複数の標的配列を残りの染色体上の配列と定義してもよい。しかしながら、同一反応を用いて、第１の複数の標的配列を１３番染色体上の配列と定義してもよく、第２の複数の標的配列を残りの染色体上の配列と定義してもよい。それゆえ、同一反応から得たシークエンシングデータを用いて、ダウン症候群（２１トリソミー）及びパトー症候群（１３トリソミー）の両方を検出することができる。同様に、ＭＩＰを設計して、またデータを解析して、異数性、または、他の種類の染色体異常もしくはサブ染色体異常に関連する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の状態を検出することも可能である。
一部の実施形態では、本開示は、胎児の異数性を検出するための方法を提供し、以下の内容を含む。
ａ）母体血液試料由来のゲノムＤＮＡ試料を得ることと、
ｂ）ゲノムＤＮＡ試料を、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルへと加えることと、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルはプローブ混合液を含み、プローブ混合液は分子反転プローブ（ＭＩＰ）集団及び緩衝液を含み、
ＭＩＰ集団内のそれぞれのＭＩＰは、以下の構成要素、
第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含み、
ＭＩＰのそれぞれにおける一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、同一であり、複数の目的の標的配列内におけるそれぞれの配列に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的であり、
ＭＩＰのそれぞれにおける第１及び第２の固有標的分子タグの組み合わせは、ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
ｃ）ＭＩＰのプローブ混合液を含むゲノムＤＮＡ試料をインキュベートして、複数の目的の標的配列を捕捉することと、
ｄ）伸長／ライゲーション用混合液を、ＭＩＰ及び複数の目的の標的配列を含むｃ）の試料へと加えて、複数のＭＩＰアンプリコンを作製することと、伸長／ライゲーション用混合液は、ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、リガーゼ、及び、緩衝液を含み、
ｅ）エキソヌクレアーゼ混合液を、標的及び対照ＭＩＰアンプリコンへと加えて、過剰プローブまたは過剰ゲノムＤＮＡを除去することと、
ｆ）インデックスＰＣＲ用混合液をｅ）の試料へと加えて、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、複数のアンプリコンへと加えることと、
ｇ）超並列シークエンシング法を用いて、固有標的分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第１の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの第１の集団は、目的の標的配列のシークエンスにより同定され、
ｈ）超並列シークエンシング法を用いて、固有標的分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第２の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの第２の集団は、目的の標的配列のシークエンスにより同定され、
ｉ）工程ｇ）で測定した第１のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、部位捕捉基準を計算し、工程ｈ）で測定した第２のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、複数の対照プローブ捕捉基準を計算することと、
ｊ）少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準を有するＭＩＰアンプリコンの集団における部位捕捉基準のサブセットを同定することと、
ｋ）部位捕捉基準を、少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準のサブセットから計算した係数で正規化して、検査正規化部位捕捉基準を得ることと、
ｌ）工程ｂ）〜工程ｈ）における同一の標的部位及び対照部位、標的集団、対照集団のサブセットを用いて、検査正規化部位捕捉基準を、既知の遺伝子型を示す参照対象から得た参照ゲノムＤＮＡ試料に基づいて計算した複数の参照正規化部位捕捉基準と比較することと、
ｍ）工程ｌ）の比較、及び、参照対象の既知の遺伝子型に基づいて、異数性が胎児において検出されるかどうかを判定すること。
一部の実施形態では、本開示は、対象内の異数性を検出するのに用いる分子反転プローブ（ＭＩＰ）を、複数の候補ＭＩＰから選択するための方法を提供し、方法は、以下の内容を含む。
ａ）複数の候補ＭＩＰの核酸配列を受信することと、
ｂ）複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれの対応するＭＩＰについて、
ｉ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチのない固有部位の第１の数（Ａ）を計算することと、
ｉｉ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、目的の染色体上におけるミスマッチが１つある固有部位の第２の数（Ｃ）を計算することと、
ｉｉｉ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチのない固有部位の第３の数（Ｅ）を計算することと、
ｉｖ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチが１つある固有部位の第４の数（Ｇ）を計算することと、
ｖ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチのない非固有部位の第５の数（Ｆ）を計算することと、
ｖｉ）対応するＭＩＰにより捕捉されると予測される、ゲノムの全体にわたるミスマッチが１つある非固有部位の第６の数（Ｈ）を計算することと、
ｖｉｉ）第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、及び、第６の数の少なくとも一部に基づいて、対応するＭＩＰの性能測定基準を計算することと、
ｃ）工程ｂ）ｖｉｉ）で複数の候補ＭＩＰ中のそれぞれのＭＩＰについて計算した性能測定基準の少なくとも一部に基づいて、ＭＩＰを選択すること。
特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）と第５の数（Ｆ）との第１の比率が候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）と第３の数（Ｅ）との第２の比率が候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）と第２の数（Ｃ）との第３の比率が候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）及び第２の数（Ｃ）の第１の合計と、第３の、第４の、第５の、及び、第６の数（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の第２の合計との第４の比率が、候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）及び第２の数（Ｃ）の第１の加重和と、第３の、第４の、第５の、及び、第６の数（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の第２の加重和との第５の比率が、候補ＭＩＰの残りの集合の当量比よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、第１の加重和と第２の加重和との第５の比率（Ｐ１）は、
Figure 0006830094
 で表される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第１の数（Ａ）と第２の数（Ｃ）との第３の加重和が、候補ＭＩＰの残りの集合の当量の加重和よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、第３の加重和は、
Figure 0006830094
 で表される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、第５の比率（Ｐ１）と第３の加重和（Ｐ２）の積が、候補ＭＩＰの残りの集合の当量積よりも大きくなるように選択される。特定の実施形態では、性能測定基準は、目的の染色体由来の有効リード総数に基づいて計算される。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、ミスマッチが１つの部位（Ｋ１）の平均捕捉係数と、ミスマッチが０の部位（Ｋ０）の平均捕捉係数との比率（Ｋｅ）、
Figure 0006830094
 に基づいて選択される。特定の実施形態では、比率（Ｋｅ）は、実験により概算する。特定の実施形態では、工程ｃ）のＭＩＰは、
Figure 0006830094
 として定義される、総分子タグカウント（ＴＭＴＣ）に基づいて選択される。
一部の実施形態では、本開示は更に、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、式中、（Ｎ１−６）は第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は第２の固有分子タグを表す、核酸分子を提供する。特定の実施形態では、第１の固有分子タグの長さは４〜１５塩基対である。特定の実施形態では、第２の固有分子タグの長さは４〜１５塩基対である。特定の実施形態では、固有標的分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する。特定の実施形態では、固有標的分子タグのそれぞれは、３０％〜８０％の、または、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する。本開示は更に、本明細書に記載する核酸分子のいずれかを含む組成物を提供する。
ＭＩＰの同定方法
図１は、本明細書に記載するプロセス（プロセス２００、プロセス３００、及び、プロセス５００を含む）のいずれかを実行するためのコンピュータデバイス１００のブロック図である。本発明で使用する場合、用語「プロセッサ」または「コンピュータデバイス」とは、本明細書に記載のコンピュータ技術の１つまたは複数を実行するように構成された、１つまたは複数のコンピュータ、マイクロプロセッサ、論理回路、サーバ、または、ハードウェア、ファームウェア、及び、ソフトウェアを備えたその他のデバイスのことを意味する。プロセッサ及び処理デバイスは更に、入力、出力、及び、処理中データを格納するための、１つまたは複数のメモリデバイスを含んでいてもよい。コンピュータデバイス１００としては、１つまたは複数の入力デバイス（例えば、キーパッド、タッチスクリーン、トラックボール、音声認識システムなど）、及び／または、１つまたは複数の出力デバイス（例えば、表示装置、スピーカー、触感ディスプレイ、印刷装置など）の任意の適切な組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない、「ユーザインターフェース」を挙げてもよい。コンピュータデバイス１００としては、本明細書に記載のコンピュータ技術の１つまたは複数を実行するように構成された、１つまたは複数のハードウェア、ファームウェア、及び、ソフトウェアの任意の適切な組み合わせを挙げてもよいが、これらに限定されない。本明細書に記載する構成部材のそれぞれは、１つまたは複数のコンピュータデバイス１００上に実装されてもよい。特定の態様では、これらシステムにおける複数の構成部材は、１つのコンピュータデバイス１００内に含まれていてもよい。特定の実施形態では、構成部材及び格納デバイスは、いくつかのコンピュータデバイス１００にわたり実装されていてもよい。
コンピュータデバイス１００は、少なくとも１つの通信インターフェースユニット１０８、入力／出力制御装置１１０、システムメモリ、及び、１つまたは複数のデータ格納デバイスを備える。システムメモリは、少なくとも１つのランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ１０２）、及び、少なくとも１つの読み取り専用メモリ（ＲＯＭ１０４）を含む。これら部材の全ては、コンピュータデバイス１００の演算を円滑化するために、中央演算処理装置（ＣＰＵ１０６）と通信する。コンピュータデバイス１００は、多くの異なる様式で構成されていてもよい。例えば、コンピュータデバイス１００は通常のスタンドアロンコンピュータであってもよく、あるいは、コンピュータデバイス１００の機能は、多数のコンピュータシステム及びコンピュータアーキテクチャにわたり分散していてもよい。図１において、コンピュータデバイス１００は、ネットワークまたはローカルネットワークを介して、その他のサーバまたはシステムと接続している。
コンピュータデバイス１００は分散アーキテクチャで構成されていてもよく、その場合、データベース及びプロセッサは別々のユニットまたは場所に収容される。一部のユニットは、主要な処理機能を実行し、また、最低限の全体制御装置またはプロセッサ、及び、システムメモリを含む。分散アーキテクチャの実施形態では、これらユニットのそれぞれは、通信インターフェースユニット１０８を介して、その他のサーバ、クライアントコンピュータまたはユーザコンピュータ、及び、その他関連装置との主要な通信リンクとして機能する、通信ハブまたは通信ポート（図示せず）と接続していてもよい。通信ハブまたは通信ポートはそれ自体、主に通信ルータとして機能する、最小限の処理能力を有していてもよい。様々な通信プロトコルがシステムの一部であってもよく、それら通信プロトコルとしては、イーサネット（商標）、ＳＡＰ、ＳＡＳ（商標）、ＡＴＰ、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（商標）、ＧＳＭ（商標）、及び、ＴＣＰ／ＩＰが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＰＵ１０６は、ＣＰＵ１０６からのワークロードを転送するためのプロセッサ、例えば、１つまたは複数の通常のマイクロプロセッサ、及び、１つまたは複数の補助的なコプロセッサ（例えば、数値演算コプロセッサ）を含む。ＣＰＵ１０６は、通信インターフェースユニット１０８及び入力／出力制御装置１１０と通信し、それを介して、ＣＰＵ１０６は、その他のデバイス、例えば、その他のサーバ、ユーザ端末、または、デバイスと通信する。通信インターフェースユニット１０８及び入力／出力制御装置１１０は、例えば、その他のプロセッサ、サーバ、または、クライアント端末と同時に通信するための、複数の通信チャネルを含んでいてもよい。
ＣＰＵ１０６は更に、データ格納デバイスと通信する。データ格納デバイスは、磁気メモリ、光学メモリ、または、半導体メモリの適切な組み合わせを含んでいてもよく、例えば、ＲＡＭ１０２、ＲＯＭ１０４、フラッシュドライブ、光ディスク（例えば、コンパクトディスク）、または、ハードディスクもしくはハードドライブを挙げてもよい。ＣＰＵ１０６及びデータ格納デバイスはそれぞれ、例えば、単一コンピュータまたはその他のコンピュータデバイス内に完全に収容されていてもよく、あるいは、ＵＳＢポート、シリアルポートケーブル、同軸ケーブル、イーサネットケーブル、電話線、無線周波数トランシーバー、もしくは、その他の類似無線メディアもしくは有線メディア、または、上記の組み合わせなどの通信メディアにより、互いに接続していてもよい。例えば、ＣＰＵ１０６は、通信インターフェースユニット１０８を介して、データ格納デバイスと接続していてもよい。ＣＰＵ１０６は、１つまたは複数の特定の処理機能を実行するように構成されていてもよい。
データ格納デバイスは、例えば、（ｉ）コンピュータデバイス１００のオペレーティングシステム１１２、（ｉｉ）本明細書に記載するシステム及び方法に従い、とりわけＣＰＵ１０６に関し詳細に記載するプロセスに従い、ＣＰＵ１０６に命令するように構成された、１つまたは複数のアプリケーション１１４（例えば、コンピュータプログラムコードまたはコンピュータプログラムプロダクト）、または、（ｉｉｉ）プログラムが必要とする情報を格納するのに利用可能な情報を格納するように構成された、データベース（複数可）１１６、を格納してもよい。
オペレーティングシステム１１２及びアプリケーション１１４は、例えば、圧縮形式、アンコンパイル形式、及び、暗号化形式で格納されていてもよく、コンピュータプログラムコードを含んでいてもよい。プログラムの命令は、データ格納デバイス以外のコンピュータ可読媒体から、例えば、ＲＯＭ１０４またはＲＡＭ１０２から、プロセッサのメインメモリへと読み込まれてもよい。プログラム内の命令シーケンスを実行することにより、ＣＰＵ１０６に本明細書に記載のプロセス工程を実行させるのだが、本開示のプロセスの実施形態において、ソフトウェア命令の代わりに、または、ソフトウェア命令と組み合わせて、配線回路を用いてもよい。したがって、記載するシステム及び方法は、ハードウェア及びソフトウェアの特定の組み合わせに何ら限定されない。
適切なコンピュータプログラムコードは、本明細書に記載する１つまたは複数の機能を実行するために提供されてもよい。プログラムは更に、オペレーティングシステム１１２、データベース管理システム、及び、入力／出力制御装置１１０を介して、プロセッサに、コンピュータの周辺機器（例えば、ビデオディスプレイ、キーボード、コンピュータマウスなど）とインターフェースさせる「デバイスドライバ」、などのプログラム要素を含んでいてもよい。
本発明で使用する場合、用語「コンピュータ可読媒体」とは、コンピュータデバイス１００のプロセッサ（または、本明細書に記載するデバイスの任意のその他プロセッサ）へと実行のための命令を提供するか、または、命令の提供に関与する、任意の非一過性媒体のことを意味する。このような媒体は多くの形態をとってもよく、例えば、非揮発性媒体及び揮発性媒体が挙げられるが、これらに限定されない。非揮発性媒体としては、例えば、光学ディスク、磁気ディスク、もしくは、光学磁気ディスク、または、集積回路メモリ（フラッシュメモリなど）が挙げられる。揮発性媒体としては、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）が挙げられ、それは通常、メインメモリを構成する。コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意のその他磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、任意のその他光学媒体、パンチカード、紙テープ、せん孔パターンを備えた任意のその他物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ（電気的に消去可能なプログラマブル読み取り専用メモリ）、ＦＬＡＳＨ−ＥＥＰＲＯＭ、任意のその他メモリチップもしくはメモリカートリッジ、または、そこからコンピュータが読み取り可能な任意のその他非一過性媒体が挙げられる。
コンピュータ可読媒体の様々な形態は、実行のための１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを、ＣＰＵ１０６（または、本明細書に記載のデバイスにおける任意のその他プロセッサ）へと伝えることに関与してもよい。例えば、命令は、最初にリモートコンピュータ（図示せず）の磁気ディスク上に伝えられてもよい。リモートコンピュータは、命令をそのダイナミックメモリへとロードすることが可能であり、また、モデムを用いて、イーサネット接続、ケーブル線、または更に、電話線を介して、その命令を送信することも可能である。コンピュータデバイス１００にローカル接続された通信デバイス（例えば、サーバ）は、対応する通信回線上でデータを受信し、そのデータを、プロセッサのシステムバス上に配置することが可能である。システムバスはデータをメインメモリへと伝える（プロセッサは、そのメインメモリから命令を取り出して実行する）。メインメモリが受信した命令を、任意選択的に、プロセッサにより実行される前または後のいずれかにて、メモリ内に格納してもよい。加えて、命令を、通信ポートを介して、電気信号、電磁信号、または、光信号として受信してもよく、それらは、様々な種類の情報を伝える無線通信またはデータストリームの例示的な形態である。
図２は、例示的な実施形態に従い、プローブ（例えば、ＭＩＰ）を設計及び選択するための、プロセス２００のフローチャートである。プロセス２００は、制約条件集合を決定する工程（工程２０２）、制約条件集合を用いてプライマーを同定する工程（工程２０４）、最適化手法を行い、標的染色体上における分子捕捉比率及び有効部位数を最大化させる工程（工程２０６）、及び、最適化手法に基づいてプローブを選択する工程（工程２０８）を含む。
工程２０２では、制約条件集合を決定する。例えば、ＣＰＵ１０６上に実装されたソフトウェアまたはアプリケーション（複数可）を用いて、制約条件集合を決定してもよい。一部の実施形態では、ＣＰＵ１０６上のソフトウェアまたはアプリケーション（複数可）を用いて、更に、プロセス２００の続く工程のいずれか１つまたは複数を実行してもよい。例えば、ＣＰＵ１０６上のソフトウェア及びアプリケーション（複数可）を用い、決定した制約条件に基づいて、任意の参照ゲノム（例えば、ＨＧ１９）内の豊富なプライマーペアを検索してもよく、また、ゲノムファイルの接尾辞配列インデックスを自動的に作成してもよい。
一部の実施形態では、制約条件集合を、代わりにアルゴリズムフラグと呼んでもよい。例えば、制約条件（またはアルゴリズムフラグ）としては、レフトプライマーの長さ、プライマーペアの最低頻度、プライマー間の最大長（例えば、アンプリコンの長さ）、プライマーの総最低頻度及び／または総最高頻度、プライマーあたりの最低ＧＣ含有量（％）、異なるアンプリコンの最低量（％）、ゲノム内におけるプライマーの分布、またはこれらの任意の適切な組み合わせを挙げてもよい。例示的な実施形態では、以下の制約条件を用いてプライマーペアを設計してもよい。
・レフトプライマーの長さ：１８、１９、２０、２１塩基対（ｂｐ）
・プライマーペアの頻度：１００、２５０、５００、２５００、５０００、１００００
・アンプリコンの長さ：５０〜１５０ｂｐ、例えば、８５ｂｐ未満
・プライマーあたりの最低ＧＣ含有量：４０％
・アンプリコンの固有性（目的の標的配列が固有であるパーセント）：８０％超
・ゲノム内におけるプライマーの分布：反復ラン、それぞれのバケットサイズ（ｂｓ）が１〜５０％の範囲、バケットフィル（ｂｆ）が１〜ｂｓ−１（バケットサイズ（ｂｓ）とは、ゲノム長のｂｓ％のことを意味し、それぞれのバケットは全ヒットのｂｆ％を含む必要がある）
工程２０４では、工程２０２で決定した制約条件集合を用いて、プライマー集合を同定する。詳細には、それぞれのプライマー設計において、以下のパラメータの任意の組み合わせを提供してもよい。レフトプライマーの配列（例えば、ゲノムのプラス鎖及びマイナス鎖上におけるそれらの存在数と同様に）、ライトプライマーの配列（例えば、ゲノムのプラス鎖及びマイナス鎖上におけるそれらの存在数と同様に）、固有ペア及び非固有ペアの両方を含むペアの頻度（例えば、制約条件により制限されたアンプリコン長とペアをなすレフトプライマー配列及びライトプライマー配列）、固有に生成されるアンプリコンの頻度及び比率、ならびに、固有ペア由来のアンプリコン配列及び非固有ペア由来のアンプリコン配列。一部の実施形態では、ゲノム上の複数の領域（例えば、数百超、数千超、数万超、数十万超、または、数百万超）において、それぞれのプライマーペアを増幅させることができる。
一部の実施形態では、生成したプライマーペアは、レフトプライマー配列内またはライトプライマー配列内（すなわち、レフトアームまたはライトアーム）のいずれにもミスマッチがないアンプリコン部位を同定または予測し得る。あるいは、別のアンプリコン部位を同定または予測するためには、以下に示すような少数のミスマッチが許容され得る。
レフトアーム内に１つのミスマッチがあり、ライトアーム内に０のミスマッチがある
レフトアーム内に０のミスマッチがあり、ライトアーム内に１つのミスマッチがある
レフトアーム内に１つのミスマッチがあり、ライトアーム内に１つのミスマッチがある
レフトアーム内に２つのミスマッチがあり、ライトアーム内に０のミスマッチがある、または、
レフトアーム内に０のミスマッチがあり、ライトアーム内に２つのミスマッチがある
一部の実施形態では、上記のアンプリコン予測スキームは、予測したアンプリコンのゲノム座標を提供する。しかしながら、一部の実施形態において、ミスマッチのないアンプリコン部位を同定するスキームで、予測したアンプリコンのゲノム座標を更に提供することは、集中的な計算となる場合がある。このような場合、スキームを２つのパートに分けてもよい。第１のパートでは、ミスマッチのないアンプリコン部位を同定するが、同定したアンプリコン部位のゲノム座標は提供しない。第２のパートでは、少数のミスマッチ（例えば、上で列挙したミスマッチの組み合わせ）を含むアンプリコン部位を同定し、また、これらアンプリコン部位のゲノム座標に加え、ミスマッチのないアンプリコン部位のゲノム座標を提供する。スキームを２つのモジュールパートに分けることにより、計算の複雑さが軽減され得る。しかしながら、一般的に、２つのパートを組み合わせ、単一関数を用いて、ミスマッチのないアンプリコン部位、ミスマッチのあるアンプリコン部位、及び、それらのゲノム座標からなるセットを提供可能であることを理解されたい。
一部の実施形態では、工程２０４において同定したアンプリコン部位の１つまたは複数を除去してもよい（例えば、フィルタリング操作）。例えば、レフトプライマーの５´末端及びライトプライマーの３´末端から少なくとも３塩基対（ｂｐ）に存在しないミスマッチがアンプリコン部位にある場合、その部位を除去してもよい。フィルタリング操作を通過したこれらプライマー（以下、「候補プライマー」と呼ぶ）のアンプリコン部位は、参照ゲノム中の複数の領域（例えば、通常、２５００またはそれ以上）を標的とするが、目的の染色体を濃縮させるはずである。更に、一部の実施形態では、候補プライマーのレフトアーム配列及びライトアーム配列の両方は、ＤＮＡ結合安定性の最近傍モデルを用いて計算する場合、６０℃台前半〜６０℃台後半の範囲の融解温度（ＴＭ）を有するはずである（核酸配列に従い、実験的な安定性パラメータを合計する）。例えば、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ ａｎｄ Ｈｉｃｋｓ（２００４）を参照されたい。最後に、候補プライマーは、レフトアームの５´上及びライトアームの３´上３ｂｐｓに存在するミスマッチに対して広い許容範囲を有するはずである。
除去（またはフィルタリング）操作を行った後、それぞれの候補プライマーのパラメータ値セットを生成するために、残ったアンプリコン部位に対して更なる処理を行う。一部の実施形態では、目的の染色体由来のアンプリコン部位の数と、フィルタリング操作を通過したアンプリコン部位の総数との比率を計算する。それぞれの候補プライマーに関する、拡充情報（例えば、計算した比率）、関連するアンプリコン部位情報、及び、任意のその他パラメータ値を、データベース１１６などのデータベース内に保存してもよい。
工程２０６では、最適化手法を行い、最適な予測性能を有するプライマーを同定する。最適化手法は、それぞれの候補プライマーの目的関数を求めることを含む。特に、その他の染色体上の捕捉部位数と比較して、目的の染色体上の捕捉部位の比率を最大化する目的関数を用いることが望ましい場合がある。その上、目的関数は更に、目的の染色体由来部位の数を最大化し得る。一部の実施形態では、候補プライマーは任意選択的に、その予測したアンプリコン部位に高頻度で一塩基多型（ＳＮＰ）を有するプライマーを含んでいてもよい。類似反復配列を標的とする高ランクプライマーの存在により、一部の実施形態では、大きなオーバーラップを有するプライマーの中から、目的の染色体由来部位の比率が最も高い候補プライマーのサブセットのみを同定することができ、残った候補プライマーを将来の使用のため取っておいてもよい。
一部の実施形態では、以下のマトリックスに基づいて、それぞれの候補ＭＩＰの目的関数を設定してもよい。
Figure 0006830094
Figure 0006830094
 上記のプローブマトリックスにおいて、「０のミスマッチ」と記載する行は、両方のアームにおいて完璧にマッチしているＭＩＰのことを示し、「１つのミスマッチ」と記載する行は、そのアームの一方にせいぜい１つのミスマッチを許容するプライマーのことを示す。表１において、「固有」と記載する列は、対応するＭＩＰに１回だけアラインする、目的の染色体上の部位数に相当する（アライメントは、目的の染色体上に存在し、その他の染色体上には存在しない）。表１において、「非固有」と記載する列は、対応するＭＩＰに２回以上アラインする、目的の染色体上の部位数に相当する（アライメントは、目的の染色体上に、複数の染色体上に、またはそれらの両方に複数存在する）。表２において、「固有」と記載する列は、対応するＭＩＰに１回だけアラインする、全染色体（例えば、第１〜第２２染色体、Ｘ染色体、及び、Ｙ染色体の全てを含む）にわたる部位数に相当する。言い換えれば、値Ｅは、複数のＡｉにわたる合計を含み、それは、ｉ番目の染色体上における、ミスマッチがゼロの固有部位の数を示す。同様に、表２において「非固有」と記載する列は、対応するＭＩＰに２回以上アラインする、全染色体にわたる部位数に相当する（例えば、同一染色体上に、複数の染色体上に、またはそれらの両方に複数存在するアライメントを含む）。
直観的ないくつかの目的関数を、これらプローブマトリックスから容易に推論することが可能である。通常、アーム配列にマッチする部位の比率が高い（または、せいぜい少数のミスマッチ、例えば、１つのミスマッチを有する）ＭＩＰを選択することが望ましい場合がある。更に、固有部位の比率が高いＭＩＰを選択することが望ましい場合がある。これは、Ｂ、Ｄ、Ｆ、または、Ｈ（またはこれらの任意の適切な組み合わせ）と比べて、Ａ、Ｃ、Ｅ、または、Ｇ（またはこれらの任意の適切な組み合わせ）に比較的大きな値を有するＭＩＰを選択することにより表してもよい。更に、目的の染色体上にある部位の比率が高いＭＩＰを選択することが望ましい場合がある。これは、Ｅ、Ｆ、Ｇ、または、Ｈ（またはこれらの任意の適切な組み合わせ）と比べて、Ａ、Ｂ、Ｃ、または、Ｄ（またはこれらの任意の適切な組み合わせ）に比較的大きな値を有するＭＩＰを選択することにより表してもよい。
例えば、Ａ／Ｆを最大化または増加する目的関数を用いて、０のミスマッチを許容する候補プライマーにおける不明瞭なリードをより少なく生成することができる。２つ目の例では、Ａ／Ｅを最大化または増加する目的関数を用いて、標的染色体（例えば、２１番染色体）に特異的なリードを生成することができる。３つ目の例では、Ａ／Ｃを最大化または増加する目的関数を用いて、１つのミスマッチを有するプライマーよりも著しく完璧にマッチする部位を有するプライマーを選択することにより、結果として、効率的な捕捉を実現させる。４つ目の例では、Ａを最大化または増加する目的関数とは、多数の部位が目的の染色体に固有にアラインすることを意味する。５つ目の例では、（Ａ＋Ｃ）／（Ｅ＋Ｆ＋Ｇ＋Ｈ）の目的関数を最大化するために、最適なプライマーを選択することができる。このコンセプトを更に説明するために、３つの例示的な目的関数について以下で詳細に説明する。
Ａ．目的の染色体由来の有効リード総数（Ｐ１）
それぞれの候補プライマーまたは候補プローブ用の例示的な目的関数を、目的の染色体（例えば、２１番染色体）由来の有効リード総数として定義してもよい。
Figure 0006830094
 式中、Ｋ０は、ミスマッチが０の部位の平均捕捉係数であり、Ｋ１は、ミスマッチが１つの部位の平均捕捉係数である。より具体的には、
Figure 0006830094
Figure 0006830094
 と表され、式中、ＴＭＴＣは総分子タグカウントである。
以下の式、
Figure 0006830094
 において、Ｋｅの値は実験データから推定可能であり、表１及び表２のプローブマトリックスから抽出した値を用いて、式（２）を、
Figure 0006830094
 に書き換えることができる。本明細書において、式（５）の分子は、有効部位（目的の染色体上の）の調整数を意味し得る。本明細書において、式（５）の分母は、ゲノム上の部位数を意味し得る。本明細書において、式（５）が定義するＰ１の値は、有効率または有用率のことを意味し得る。
Ｂ．目的の染色体上の有効部位総数（Ｐ２）
それぞれの候補プライマーまたは候補プローブ用の別の例示的な目的関数を、目的の染色体（例えば、２１番染色体）上の有効部位総数として定義してもよい。
Figure 0006830094
 式中、Ｋ０及びＫ１は、式（１）で定義したとおりである。より具体的には、Ｐ２を以下の式、
Figure 0006830094
 と定義してもよく、式中、Ｋｅは、式（４）で定義したとおりである。Ｐ１と同様に、Ｐ２の値もまた、表１及び表２のプローブマトリックスから抽出した値を用いて計算することができる。Ｐ２の値は、有効部位の調整数を意味し得る。
Ｃ．包括的なプローブ性能関数
それぞれの候補プライマーまたは候補プローブ用の目的関数を求めるための包括的な手法においては、以下の式を用いる。
Figure 0006830094
 式（５）及び式（７）を組み合わせて、式（８）を、
Figure 0006830094
 に書き換えることができる。式（４）と関連させて上記したとおり、実験データを用いてＫｅの値を推定可能であることに留意されたい。より具体的には、以下の式を用いる。
Figure 0006830094
 式（９）で定義したＰの値を複合スコアとして用い、候補プライマーまたは候補プローブについての総合的な予測性能を表してもよく、またＰの値は、有効部位の調整数と有効率（または有用率）との積のことを意味し得る。１つの例においては、式（９）で定義したＰの値を既定閾値と比較して、更なる検査または診断用に、関連する候補プライマーまたは候補プローブを選択するかどうかを判定してもよい。例えば、既定閾値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または、その他適切な数などの値であってもよい。
上記の例のいずれか、及び、それら例の任意の組み合わせを、本開示の範囲を逸脱することなく、目的関数として用いてもよい。このように目的関数を最適化してプライマーを選択することには、十分な有効リード数を得るのに必要な読み取り深度が低くなるという利点がある。原則的に、読み取り深度の向上は、不明瞭さ低減の改善に比例して変化する。
工程２０８では、工程２０６で行った最適化手法に基づいて、候補プライマー集合からプライマーを選択する。例えば、選択したプライマーは、最適な予測性能を有するプライマー、すなわち、工程２０６に関連させて記載した目的関数を最大化したプライマーに相当していてもよい。
例示的な実施形態では、多数のプライマー（例えば、ＭＩＰ）を、設計、合成、及び、試験する。プライマーを試験するために、それぞれの目的の染色体上の、及び、ゲノム全体にわたる（例えば、常染色体及び性染色体を含む）、固有部位及び非固有部位（ミスマッチがない、または、ミスマッチが１つ）の検索及びカウントプロセスに基づいて、表１及び表２の１つまたは複数の予測部位カウント数のそれぞれに対して値を生成する。上記の例または上記の例の組み合わせのいずれかを目的関数として用いて、それぞれのプライマーに割り振られプライマーの性能を示すスコアを表してもよい。プライマー同士をその性能に基づいて比較してもよく、最も性能の良いプライマーを選択してもよい。１つの例としては、プライマーのスコアを既定閾値と比較して、プライマーを選択するかしないかを判定する。詳細には、式（９）で表される目的関数を用いてそれぞれのプライマースコアを表す場合、閾値は、２、３、４、５、６、７、８、９、または、１０などの数に設定され得る。
例示的な実施形態では、更なる解析のため、ハイスコアのプライマー（例えば、上記表内のＭＩＰ ００３）が選択された。更なる解析の結果については、実施例３と関連させて以下で説明する。式（９）に従い判定したスコアが高い値であったため、ＭＩＰ ００３が選択された。詳細には、ＭＩＰ ００３は８．５５７のスコアを有していた。以下の表３は、ＭＩＰ ００３にアラインした、異なる染色体上のミスマッチのない固有部位（Ａ）及びミスマッチが１つある固有部位（Ｃ）の予測数についてまとめたものである。
Figure 0006830094
プロセス２００の工程または記載を、本開示における任意のその他実施形態と共に用いてもよいということが考えられる。更に、図２と関連させて説明した工程及び記載を、別の順番でまたは同時に実施して、本開示の目的を進めてもよい。例えば、任意の順番で、同時に、または、ほぼ同時に、これら工程のそれぞれを実施して、システムまたは方法のラグを軽減してもよく、または、システムまたは方法のスピードを増加させてもよい。更に、コンピュータデバイス１００、より詳細には、コンピュータデバイス１００のＣＰＵ１０６を用いて、プロセス２００を実施してもよいという点に留意すべきである。
図３は、例示的な実施形態に従い、検査対象の異数性状態を予測するためのプロセス３００のフローチャートである。プロセス３００は、検査対象のシークエンシングデータを受信する工程（工程３０２）、検査対象の部位捕捉基準を計算する工程（工程３０４）、参照対象集合の部位捕捉基準を受信する工程（工程３０６）、及び、検査対象の部位捕捉基準と参照対象の部位捕捉基準との比較に基づいて、検査対象の異数性状態を予測する工程（工程３０８）を含む。一部の実施形態では、部位捕捉基準は部位捕捉性能指標（ＳＣＥ）であり、それは、個々のそれぞれの部位における、固有分子識別子タグ数とリード数との比率のことである。一部の実施形態では、部位捕捉基準は部位捕捉密度指標（ＳＣＣ）であり、それは、個々のそれぞれの部位における、ＳＣＥの変動係数として計算される。例えば、染色体１：１〜１００は、１００のアラインしたリード、及び、９９の固有分子識別子タグを有することを意味する。それゆえ、ＳＣＥは９９％となる。別の例では、染色体１：１〜１００のうち１００の試料において、全１００試料が９０％超のＳＣＥを有するのに対し、染色体３：５００〜６００のうち１００の試料では、５０の試料のみが９０％超のＳＣＥを有し、残る５０の試料は９０％未満のＳＣＥを有する。それゆえ、ＳＣＣは、染色体３：５００〜６００と比較して、染色体１：１〜１００が、よりばらつきの少ない部位であることを示している。
工程３０２では、検査対象のシークエンシングデータを受信する。詳細には、検査対象は未知の異数性状態を有しており、受信したシークエンシングデータは、検査対象から核酸試料を採取して、再犯者分子反転プローブ（ＲＯ−ＭＩＰ）などのプライマー集団を用い、核酸試料中の部位集団を捕捉することにより得られる。図５と関連させて詳細に記載しているように、それぞれのＲＯ−ＭＩＰは、第１の標的ポリヌクレオチドアーム、第１の固有標的分子タグ、ポリヌクレオチドリンカー、第２の固有標的分子タグ、及び、第２の標的ポリヌクレオチドアームを配列内に含む。第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームが、集団内のＭＩＰ全体にわたり同一である一方、第１及び第２の固有標的分子タグは、集団内のＭＩＰ全体にわたり異なっている。ＲＯ−ＭＩＰアンプリコンは部位の捕捉により得られ、そのアンプリコンをシークエンスして、シークエンシングデータを取得する。
工程３０４では、目的の染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１）と、全ての染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１＋Ｓ２）との比率を求めるために、検査対象の染色体比率を計算する。。染色体比率は、任意の試料中における目的の染色体の比率指標（すなわち、目的の染色体由来のリードの比率）を提供する。図４の工程４２６、工程４２８、及び、工程４３０と関連させて、染色体比率を計算する１つの例示的な方法を記載する。
工程３０６では、参照対象集合の染色体比率集合を受信する。詳細には、参照対象は、既知の正倍数性状態を示す人々の集団に相当し得る。例えば、対象は、特定の目的の染色体におけるモノソミー、二染色体性、または、トリソミーを示していてもよい。工程３０４に関連させて行った説明と同じように（しかし、それぞれの参照対象について）、参照対象の染色体比率を計算する。図４と関連させてより詳細に記載しているように、染色体比率とは、選択したＲＯ−ＭＩＰが、その他の染色体と比較して目的の染色体上の配列を捕捉する性能のことを表している。
工程３０８では、検査対象の染色体比率（工程３０４で計算した）を参照対象の染色体比率（工程３０６で得た）と比較して、その比較に基づき検査対象の正倍数性状態を予測する。詳細には、統計的検定を用いて、検査染色体比率を参照染色体比率の集団と比較し、検査染色体比率が、同一の正倍数性状態に関連する参照染色体比率のクラスターのいずれかに属するかどうかを判定してもよい。本発明で使用する場合、「検査比率」は染色体比率を含み得る。
図４は、例示的な実施形態に従い、検査対象の正倍数性状態を予測するためのプロセス４００のフローチャートである。１つの例においては、プロセス４００を用いて、図３と関連させて示し説明したプロセス３００における工程３０８を実施してもよい。図３と関連させて説明したように、染色体比率を用いて、未知の正倍数性状態を有する検査対象における正倍数性状態を予測してもよい。
プロセス４００は、既知の遺伝子型を有するＳ試料から記録したデータを受信する工程（工程４０２）、及び、試料の反復パラメータｓを１に初期化する工程（工程４０４）を含む。それぞれの試料ｓにおいて、プロセス４００は、シークエンシングリードをフィルタリングし既知のアーティファクトを除去する工程（工程４０６）、リードをヒトゲノムにアラインする工程（工程４０８）、部位の反復パラメータｋを１に設定する工程（工程４１２）、及び、ｋ番目の部位における捕捉現象の数を測定する工程（工程４１４）を含む。全Ｋ部位及び全Ｓ試料を判定する場合、プロセス４００は更に、少なくとも１つの判定基準を満たすＫ部位のサブセットを同定する工程（工程４２４）、Ｓ試料中における検査試料ｔにおいて、目的の染色体由来のタグカウントの第１の合計Ｓ１を計算する工程（工程４２６）、検査試料ｔにおいて、目的の染色体以外の染色体由来のタグカウントの第２の合計Ｓ２を計算する工程（工程４２８）、検査試料ｔにおいて、染色体比率をＳ１／（Ｓ１＋Ｓ２）として計算する工程（工程４３０）、及び、検査試料ｔの染色体比率を参照染色体比率集合と比較することにより、検査試料ｔにおける正倍数性状態を選択する工程（工程４３２）を含む。
工程４０２では、Ｓ試料集合から記録したデータを受信する（Ｓ試料はそれぞれ、異なる対象から採取）。Ｓ試料の少なくとも１つは、正倍数性状態が未知であり得る検査対象から採取する。試料は対象から単離した核酸試料であってもよく、データは核酸試料から得たシークエンシングデータを含んでいてもよい。１つの例においては、ＲＯ−ＭＩＰ集団を用いて核酸試料中の部位集団を増幅し、ＲＯ−ＭＩＰアンプリコン集団を作製することにより、シークエンシングデータを取得する。その後、ＲＯ−ＭＩＰアンプリコンをシークエンスして、工程４０２で受信したシークエンシングデータを取得してもよい。
工程４０４では、試料の反復パラメータｓは１に初期化される。Ｓ試料を処理する際、Ｓ試料のそれぞれを処理して、それぞれの部位における捕捉現象の数を測定するまで、試料の反復パラメータｓをインクリメントする。
工程４０６では、試料ｓのシークエンシングリードをフィルタリングして既知のアーティファクトを除去する。１つの例においては、工程４０２で受信したデータを処理して、プローブ−プローブ間の相互作用の影響を除去してもよい。一部の実施形態では、全ＲＯ−ＭＩＰのライゲーション標的アーム及び伸長標的アームは、ペアエンドシークエンスリードにマッチする。ＲＯ−ＭＩＰの両方のアームにマッチしないリードは、無効と判定され棄却される。残りの有効リードのアーム配列を除去し、更に、ライゲーション末端及び伸長末端の両方にある分子タグをリードから除去してもよい。工程４１４における更なる処理のために、除去した分子タグを別々に保管しておいてもよい。
工程４０８では、トリミングして得たリードをヒトゲノムにアラインする。一部の実施形態では、アライメントツールを用いて、リードを参照ヒトゲノムにアラインしてもよい。詳細には、参照に対して特定のリードがどの程度良好にアラインを示すかで、アライメントスコアを判定してもよい。閾値超のアライメントスコアを有するリードは、本明細書において主要なアライメントであることを意味してもよく、保持しておく。それに対し、閾値未満のアライメントスコアを有するリードは、本明細書において派生的なアライメントであることを意味してもよく、棄却される。参照ゲノムに沿い複数の位置にアラインした任意のリードは、本明細書においてマルチアライメントであることを意味し、棄却される。
工程４１２では、部位の反復パラメータｋを１に初期化する。工程４１４では、ｋ番目の部位における捕捉現象の数を測定し、また、全てのＫ部位が判定されるまで、工程４１８で部位の反復パラメータｋをインクリメントする。
全てのＫ部位が判定されると、プロセス４００は、少なくとも１つの判定基準を満たすＫ部位のサブセットを同定するための工程４２４に進む。例えば、Ｓ試料全体にわたる捕捉現象の数の変動係数として部位捕捉密度指標を求めてもよく、高い変動係数を有するこれら部位を棄却してもよい。
工程４２６では、検査試料において、目的の染色体由来のタグカウントの合計Ｓ１を計算し、工程４２８では、検査試料において、目的の染色体以外の染色体由来のタグカウントの合計Ｓ２を計算する。工程４３０では、染色体比率をＳ１／（Ｓ１＋Ｓ２）として計算する。それから、工程４３２で、検査試料における染色体比率を参照染色体比率集合（既知の正倍数性状態を有する参照対象から計算した）と比較して、検査対象における予測正倍数性状態を選択するために統計的検定を行う。
図４における工程の順番は例証目的のみのために示しており、本発明を何ら制限するものではない。
本明細書に記載する組成物及び方法が出願に適したように脚色または修正可能であること、本明細書に記載する組成物及び方法をその他の適切な用途に採用可能であること、及び、このようなその他の追加及び修正が本発明の範囲から逸脱しないということを、当業者は理解するであろう。
本開示は、以下に続く実験の詳細からより理解されよう。しかしながら、以下に続く実施形態でより完全に説明を行うが、記載する特定の方法及び結果は本開示を例示するに過ぎないということを、当業者は容易に理解するであろう。
［実施例］
実施例１：
ＭＩＰ設計、及び、目的の標的配列を捕捉するための方法
プローブの構築
図５に示すように、８０〜１０５ｂｐのサイズ範囲の単一オリゴヌクレオチド（第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さによる）を合成する。６Ｎボックスとは、それぞれの目的の標的配列における捕捉現象を定量するために用いる分子タグ配列のことを意味する。この特定の実施形態では、リードをカウントする代わりに、捕捉部位あたりの固有配列の数をカウントする。
部位捕捉反応
第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム（実験で決めた濃度の）を、２０ｕＬ緩衝反応液中の１〜２ｍＬ血漿から抽出したｃｓＤＮＡと混合した。混合液を、サーモサイクラー内で、プローブを鋳型へとアニールするのに最適化した温度でインキュベートした（９８℃で３分間→８５℃で３０分間→６６℃で１５分間）。このインキュベーションの間に、プローブ分子は、プローブ配列に対して相補的な特定の染色体位置において、ｃｓＤＮＡ鋳型にアニールする（図６の中央）。最も容易に予測される部位は、第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームに対して正確に相補的な配列を有する部位（不変部位）であるが、一方のアームに１つまたは複数の変異を有する部位もまた、やや効率は低くなるが標的となる。それぞれの反応液中における最適量のＭＩＰは、以下の３つの変動要因によって決まる。１）鋳型として用いるゲノム数（個体により幅広く変動し得る）、２）特定のプローブが標的とする総部位数、及び、３）不変部位と変異部位の比率。
ハイブリダイゼーションプログラムの完了後、酵素と試薬の混合液（５ｕＬ）を加えてから、その混合液を６６℃で１時間、そして７２℃で３０分間インキュベートし、その後、４℃まで冷却した。本発明者は、ハイブリダイゼーション温度及び伸長温度の両方を６６℃まで上げることによって、特異度が劇的に上昇することを確認した。この工程中、ギャップがＤＮＡポリメラーゼで埋められ、ＭＩＰは、ＤＮＡリガーゼにより共有結合して環状になる（図Ｅの下部）。この工程中、鋳型にアニールしたプローブだけが環状となり、直線状のプローブは、プライマー結合部位間にギャップが存在するために増幅されない。
捕捉部位の増幅
捕捉済みＭＩＰの混合液（２０ｕＬ）を、反応用混合液（耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰＳ、ＰＣＲ緩衝液、及び、プローブ主鎖に対して相補的なユニバーサルプライマーを含有）（５０ｕＬ）へと加えた（図Ｆの上部）。プールした試料ライブラリのマルチプレックスシークエンシングを可能とする、異なる「バーコード」配列を有するプライマーを用いて、それぞれの試料を増幅させた。電気泳動できれいなアンプリコンバンドが観察されるまで、反応液を実験で決めた数のＰＣＲサイクルに供した。Ａｍｐｕｒｅビーズを用いてＰＣＲ産物を精製してから、Ｑｕｂｉｔフルオロメーターを用いて定量した。
捕捉部位のシークエンシング
全ての試料が等しい濃度となり、リードの割り当てが試料全体にわたり確実に均一となるように、精製したＰＣＲ産物をライブラリにプールした。部位特異的なギャップの完全配列を決定するために、シングルエンドシークエンシングまたはペアエンドシークエンシングのいずれかを用いて、７５〜１００サイクルでライブラリをシークエンスした。シングルエンドシークエンシングを用いる場合、リードは、ライゲーションアームに続き、分子タグ、及び、伸長／ライゲーション工程中に埋められた固有ギャップ配列からなる。伸長アームのシークエンシングは、プローブから配列が判明しているため不要である。
実施例２：
シークエンスデータ解析、及び、対象内の異数性検出
異数性検出に有用とするために、シークエンシングの生データを処理する必要がある。まず最初に、シークエンシングリードをフィルタリングし、既知のアーティファクト（プローブ−プローブ間の相互作用、主鎖配列、または、アダプター配列など）を除去する。それから、ＭＩＰのライゲーションアーム及び伸長アーム（すなわち、第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム）を、それぞれのアーム内に最大１塩基対のミスマッチを許容として、シークエンスリードにマッチさせる。この基準に適合しないリードを無効として扱い棄却する。有効リードのアーム配列をトリミングし、続く処理工程で使用するリードファイルからシークエンスを削除することにより、シークエンスデータから非ゲノム部分を除去する。同時に、ライゲーション末端及び伸長末端の両方にある分子タグは、後の工程にて捕捉現象をカウントするために別々に残す。ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアプログラムを用いて、トリミングしたリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）にアラインする。それから、ｓａｍｔｏｏｌｓソフトウェアプログラムを用いて、アラインしたリードに対してフィルタリングを行い、有効ペアとしてアラインしないリード、または、非固有にアラインするリードを除去する。固有にアラインしたリードのみを残すように、アライメントパラメータ及びフィルタリングパラメータを慎重に選択する。アラインしフィルタリングしたリード（ｂａｍ形式ファイル）を調査し、固有ＭＩＰギャップ配列を有するそれぞれの標的部位（すなわち、固有な目的の標的配列）の固有分子タグをカウントする。これらのカウントは、次世代シークエンシングプラットフォーム（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００フローセル）を用いてシークエンスしたＭＩＰ−標的ハイブリダイゼーション現象における、初期の数である。個々のそれぞれの部位における部位捕捉性能指標（ＳＣＥ）を計算する。個々のそれぞれの部位における部位捕捉密度指標（ＳＣＣ）を、ＳＣＥの変動係数として計算する。実験データから得た部位捕捉性能の変動指標に基づいて、これら部位の一部を棄却する。この工程には、染色体比率における試料−試料間のばらつきを抑え、後の工程で計算する陽性試料のＺ値を上昇させる働きがある。任意の試料について、目的の染色体（例えば、２１番染色体）上における残りの部位由来の固有分子タグカウントの合計（Ｓ１）を計算し保存する。残りの参照部位における合計（Ｓ２）を計算し保存する。２つの合計間の比率（染色体比率 ＝ Ｓ１／（Ｓ１＋Ｓ２））を、任意の試料における目的の染色体の比率指標として計算する。それぞれの検査試料について、正常な胎児染色体カウント（すなわち、正常核型の胎児）を有する参照試料集合と対照させて、染色体比率指標を用いて目的の染色体（例えば、２１番染色体）のＺ値を計算する。任意の試料におけるＺ値の絶対値が所定の閾値を超えた場合に、異数性（例えば、トリソミー及びモノソミー）または正倍数性の同定を行う。
上記方法を用いて、妊娠している女性由来の４８点の試料について、ダウン症候群（２１番染色体のトリソミー）の検査を行った。２点の試料がダウン症候群に対して陽性である一方で、４６点の試料が陰性であることをアッセイで確認した。陽性試料と陰性試料との間の境界線は非常にはっきりしており、陽性試料は両方とも、６超のＺ値を示した。図８を参照されたい。
実施例３：
妊娠している対象内における１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーの検出
本実施例では、本明細書に記載の方法を用いて、１３トリソミー、トリソミー１８、及び、トリソミー２１を有する妊娠女性と、健康な妊娠女性とを識別（または分類）することについて説明する。
１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーを検出するためのＺ値カットオフの決定
妊娠女性由来の血漿試料（４８点）の訓練事例集合（治験審査委員会承認済みの研究）を用いて、１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーを検出するためのＺ値カットオフを決定した。血漿試料のそれぞれは、異なる妊娠女性から採取した。４８点の血漿試料には、４０点の健康な試料、４点の２１トリソミー試料、３点の１８トリソミー試料、及び、１点の１３トリソミー試料が含まれていた。ＣＶＳ（絨毛採取）または羊水穿刺で採取した胎盤細胞または胎児細胞の核型解析により、トリソミー症例を確認した。
部位捕捉反応
４８人の妊娠女性のそれぞれから抽出した血漿ＤＮＡに対して、以下の部位捕捉反応を実施した。抽出した血漿ＤＮＡを、実験で決めたプローブ濃度で、水、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（１ｘ）、及び、ＲＯ−ＭＩＰと混合した。部位捕捉反応用混合液を、サーマルサイクラー内で、９８℃で３分間、８５℃で３０分間、そして６６℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、ｄＮＴＰ（０．６ｍＭ）、ＮＡＤ（０．４ｘ）、ベタイン（０．３Ｍ）、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（１ｘ）、水、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（５ユニット）、及び、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦポリメラーゼ（０．４ユニット）を含有するマスターミックスを、部位捕捉反応用混合液に加えた。それから、混ぜ合わせた混合液を、サーマルサイクラー内で、６６℃で６０分間、そして、７２℃で３０分間インキュベートしてから、４℃で保持した。
捕捉部位の増幅
インキュベート後、混ぜ合わせた混合液（２０μＬ）を、フォワードインデックスプライマー（５００ｎＭ）及びリバースインデックスプライマー（５００ｎＭ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１ｘ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、水、ならびに、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＳポリメラーゼ（０．４ユニット）を含有するＰＣＲマスターミックスに加えた。固有のリバースプライマーインデックスを用いて、それぞれの試料にバーコードを付加した。ＰＣＲ反応用混合液を、サーマルサイクラー内で、９８℃で３分間、９８℃で１０秒間を２０サイクル、６５℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間インキュベートした。それから、ＰＣＲ反応用混合液を７２℃で５分間保持後、４℃で保持した。
シングルエンドシークエンシング
ＰＣＲ増幅したライブラリをＡｍｐｕｒｅＸＰビーズで精製し、試料を等しい濃度で共にプールした（プールあたり試料４８点）。マルチプレックスライブラリのそれぞれを、シングルＳＲフローセルにロードし、ＨｉＳｅｑ ２５００のＲａｐｉｄ Ｒｕｎモードで１０６サイクル、シークエンスした。
データ解析：
シークエンシングデータをフィルタリングしアラインした。それぞれの染色体（すなわち、１３番染色体、１８番染色体、または、２１番染色体）に固有にアラインしたリード由来の固有分子タグ／識別子の数（この分子は「Ａ」と「Ｃ」との合計に類似）を、１番染色体〜２２番染色体に固有にアラインしたリード由来の固有分子タグ／識別子の総数（この分母は「Ａ」、「Ｃ」、「Ｅ」及び「Ｇ」の合計に類似）で割ることにより、１３番染色体、１８番染色体、及び、２１番染色体の染色体比率（Ｐｉ）を計算した。しかしながら、表２の値（Ｅ〜Ｈ）がゲノム全体（１番染色体〜２２番染色体、Ｘ染色体、及び、Ｙ染色体を含む）にわたる全ての染色体を含む一方で、ここでの分母は、Ｘ染色体またはＹ染色体にアラインするリードを含まない場合がある。詳細には、Ｘ染色体またはＹ染色体にアラインするリードの数は、その他の染色体（目的の染色体を含む）にアラインするリードの数よりも著しく多い場合がある。この場合、分母内に、Ｘ染色体またはＹ染色体にアラインするリードを含むことは、結果として得られる比率を著しく下げる場合があり、Ｚ統計値の計算にノイズ及びひずみが生じる恐れがある。それゆえ、目的の染色体がＸ染色体でもＹ染色体でもない場合（例えば、常染色体異数性を検出する場合）、Ｘ染色体またはＹ染色体にアラインするリードは、分子及び分母の両方から除外され得る。あるいは、目的の染色体が性染色体である場合（例えば、性染色体異数性を検出する場合）、Ｘ染色体及び／またはＹ染色体にアラインするリードは、分子及び分母に含まれ得る。
結果として得られた比率を元に、変異のない試料の平均値（ｘｉ）及び標準偏差（ｓｉ）を計算し、また、それら平均値及び標準偏差を用いて、それぞれの試料のＺ値（［Ｐｉ−ｘｉ］ｓｉ）を計算する。Ｚ値の解析により、全ての健康な試料が、１３番染色体、１８番染色体、及び、２１番染色体に対して、＜３．０のＺ値を有する一方で、陽性試料が、１３番染色体、１８番染色体、及び、２１番染色体に対して、＞３．０のＺ値を有することが明らかとなった。それゆえ、＞３．０のＺ値を有する試料を、１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーに対して陽性とみなすことにした。＜３．０のＺ値を有する試料を、１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーに対して陰性とみなす。
１３トリソミー、１８トリソミー、及び、２１トリソミーを検出するための感度及び特異度の測定
妊娠女性由来の試料（４２２点）のテスト事例集合（治験審査委員会承認済みの研究）を用いて、テストの感度及び特異度を測定した。それぞれの試料は、異なる妊娠女性から採取した。これら４２２点の試料には、３８７点の健康な試料、２１点のＴ２１試料、９点のＴ１８試料、及び、５点のＴ１３試料が含まれていた。ＣＶＳまたは羊水穿刺で採取した胎盤細胞または胎児細胞の核型解析により、トリソミー症例を確認した。
部位捕捉反応
４２２人の妊娠女性のそれぞれから抽出した血漿ＤＮＡに対して、以下の部位捕捉反応を実施した。抽出した血漿ＤＮＡを、実験で決めたプローブ濃度で、水、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（１ｘ）、及び、ＲＯ−ＭＩＰと混合した。捕捉反応用混合液を、サーマルサイクラー内で、９８℃で３分間、８５℃で３０分間、そして６６℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、ｄＮＴＰ（０．６ｍＭ）、ＮＡＤ（０．４ｘ）、ベタイン（０．３Ｍ）、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液（１ｘ）、水、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（５ユニット）、及び、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦポリメラーゼ（０．４ユニット）を含有するマスターミックスを、部位捕捉反応用混合液に加えた。それから、混ぜ合わせた反応用混合液を、サーマルサイクラー内で、６６℃で６０分間、そして、７２℃で３０分間インキュベートしてから、４℃で保持した。
捕捉部位の増幅：
インキュベート後、混ぜ合わせた混合液（２０μＬ）を、フォワードインデックスプライマー（５００ｎＭ）及びリバースインデックスプライマー（５００ｎＭ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１ｘ）、ｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、水、ならびに、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＳポリメラーゼ（０．４ユニット）を含有するＰＣＲマスターミックスに加えた。固有のリバースプライマーインデックスを用いて、それぞれの試料にバーコードを付加した。ＰＣＲ反応用混合液を、サーマルサイクラー内で、９８℃で３分間、９８℃で１０秒間を２０サイクル、６５℃で２０秒間、そして７２℃で３０秒間インキュベートした。それから、ＰＣＲ反応用混合液を７２℃で５分間保持後、４℃で保持した。
シングルエンドシークエンシング：
増幅ライブラリをＡｍｐｕｒｅＸＰビーズで精製し、試料を等しい濃度で共にプールした（プールあたり試料４８点）。全体で９つのプールがあり、最初の８つのプールは、プールあたり４７点の検査試料及び１点の対照試料を含み、９つ目のプールは、４６点の検査試料及び１点の対照試料を含んでいた。マルチプレックスライブラリのそれぞれを、シングルＳＲフローセルにロードし、ＨｉＳｅｑ ２５００のＲａｐｉｄ Ｒｕｎモードで１０６サイクル、シークエンスした。
データ解析：
訓練事例集合と同様に、４２２人の妊娠女性それぞれに由来するＤＮＡに対して、部位捕捉反応、捕捉部位の増幅、及び、１０６サイクルのシングルエンドシークエンシングを実施した。それぞれの試料から得たシークエンスデータを用いて、１３番染色体、１８番染色体、及び、２１番染色体のＺ値を計算した（図１０〜図１２）。訓練事例集合により決定したカットオフを用いると、特異度（例えば、真陰性率、または、真陰性数を真陰性と偽陽性との合計で割ったもの）は、１３トリソミーで５／５、１８トリソミーで９／９、及び、２１トリソミーで２１／２１となり、＞９９．９％となった。感度（例えば、真陽性率、または、真陽性数を真陽性と偽陰性との合計で割ったもの）は、１３番染色体で＞９９．２％となり、１８番染色体で＞９９．９％となり、また、２１番染色体で＞９９．５％となった。
図１０のグラフは、１３トリソミーを検出するためのプライマー検査性能を示す。図１０のｙ軸はＺ統計値を表し、ｘ軸は、左側に５点の１３トリソミー試料（順不同）、及び、右側に残りの５４５点の試料（Ｚ統計値が低下する順）を表している。図１０に示すとおり、全５つの１３トリソミー試料は、３．０超のＺ統計値を有しており、プライマーを用い、陽性試料として正確に同定され、５／５の感度となった。健康な試料のうち少数が３．０超のＺ統計値を有し、９９．２％の特異度となった。
図１１は、図１１が１８トリソミーを検出するためのプライマー検査性能を示すこと以外は、図１０と類似している。全９つの１８トリソミー試料は、３．０超のＺ統計値を有しており、プライマーを用い、陽性試料として正確に同定され、９／９の感度となった。更に、ほぼ全ての健康な試料が陰性試料として正確に同定され、９９．９％超の特異率となった。図１２もまた、図１２が２１トリソミーを検出するためのプライマー検査性能を示すこと以外は、図１０と類似している。全２１の２１トリソミー試料は、プライマーを用い、陽性試料として正確に同定され、２１／２１の感度となった。更に、ほぼ全ての健康な試料が陰性試料として正確に同定され、９９．８％超の特異率となった。
図１０〜図１２に示す結果は、本開示のシステム及び方法が、異数性検出において高感度及び高特異度を有するプライマーを選択するのに有効な手段を提供することを示している。その他の方法もまた、同じような水準の性能（例えば、感度及び／または特異度を測定することによる）を有していてもよい。例えば、ショットガンシークエンシングを用いて、同様の性能を達成してもよい。しかしながら、本開示は、その他の手法に優るいくつかの利点を有している。その理由としては、本開示では１種類のプライマーだけを用いているため、その他の手法と比べて、よりコストを抑え、よりシンプルに、かつより効率的となり得るからである。
本開示で提供する実施例は主に、例証の目的のため、コピー数多型、染色体異常、または、微小欠失を同定するためのシステム及び方法に関する、多数の異なる例示的な実施形態に焦点を合わせている。しかしながら、本開示の機能及び操作を著しく変更することなく、１つまたは複数の実施形態における全般的な様式及び設計を変更可能であることを理解されたい。更に、任意の１つの実施形態に記載する特徴及び制限を、本明細書における任意のその他実施形態へと適用してもよく、また、１つの実施形態に関連する記載及び例を、適切な方法で任意のその他実施形態と組み合わせてもよい、という点に留意すべきである。その上、本開示で提供する図面及び例は、例示のみを意図するものであり、本開示を何ら制限するものではない。更に、上記のシステム及び／または方法を、その他のシステム及び／または方法へと適用してもよく、または、その他のシステム及び／または方法に従い用いてもよい（その他のシステム及び／または方法は、コピー数多型の同定に直接関連していてもよいシステム及び／または方法を含む）という点に留意すべきである。
本開示の方法に従い記載されるプロセスのいずれかを実行するコンピュータデバイスにおける、例示的な実施形態を示す図である。 本開示における一部の方法に従い、プローブを設計及び選択するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。 本開示における一部の方法に従い、検査対象の異数性状態を予測するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。 本開示における一部の方法に従い、検査対象の異数性状態を予測するための、より詳細な別の例示的なプロセスを示すフローチャートである。 本開示における一部の方法に用いる、例示的な分子反転プローブ（ＭＩＰ）の配列を示す図である。ＭＩＰは、以下の構成要素、第１の標的ポリヌクレオチドアーム（「ライゲーションアーム」と記載）、ポリヌクレオチドリンカー（「主鎖」と記載）、及び、第２の標的ポリヌクレオチドアーム（「伸長アーム」と記載）を配列内に含み、またそのリンカーは、第１の固有標的分子タグ（「６Ｎ」と記載）、ＰＣＲ用フォワードプライマー、ＰＣＲ用リバースプライマー、及び、第２の固有標的分子タグ（こちらも「６Ｎ」と記載）を含む。ＭＩＰのそれぞれにおける第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームは、目的の部位に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である。固有分子タグは、ランダムなポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、「実質的に相補的」とは、両方のアームにおいてミスマッチが０であること、または、一方のアームのみにおいてミスマッチがせいぜい１であることを意味する（例えば、標的ポリヌクレオチドアームが、目的の部位に隣接する、核酸内の第１及び第２の領域にそれぞれハイブリダイズする場合）。一部の実施形態では、「実質的に相補的」とは、両方のアームにおいてミスマッチの数が少ないこと、例えば、せいぜい１、２、３、３、５、６、７、または、８であることを意味する。 本開示の方法における、プローブによるハイブリダイゼーション及び伸長／ライゲーションを示す図である。第１の標的ポリヌクレオチドアーム（「ライゲーションアーム」と記載）及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム（「伸長アーム」と記載）を、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズするのに好適な条件下で、ＤＮＡにＭＩＰを添加する。ハイブリダイゼーション後、伸長／ライゲーション条件下で、ポリメラーゼ及びリガーゼを添加してから、ライゲーションアームと伸長アームとの間に固有ギャップ配列を含む目的の標的配列全体にわたりＤＮＡ合成を行うことにより、環状オリゴヌクレオチド（「捕捉済みプローブ」）を作製する。アンプリコン及びｃｓＤＮＡが融解すると、捕捉済みプローブを増幅する準備が整う。 捕捉済みプローブの増幅及びシークエンシングを示す図である。シークエンシングアダプター及びＰＣＲ用フォワードプライマーまたはＰＣＲ用リバースプライマーを含む核酸分子を環状アンプリコンの主鎖に結合させてから、ＭＩＰにより作製された全ての環状オリゴヌクレオチドをＰＣＲを用いて増幅する。その後、例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いてアンプリコンのシークエンスを行ってから、それぞれのアンプリコン内に存在する固有分子タグの数をカウントすることにより、得られたアンプリコンのリード数を測定する。 ２１番染色体トリソミー（ダウン症候群）検査の結果を示す図である。検査した４８点の試料のうち４６点がダウン症候群に対して陰性であった一方、２点の試料がダウン症候群に対して陽性であった。２点の陽性試料を、Ｚ値が６超の上部右側に示す。 本開示の実施形態における、Ａｌｕ因子へのプローブのハイブリダイゼーションを示す図である。 トリソミー１３を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。 トリソミー１８を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。 トリソミー２１を検出するためのＭＩＰ実施例において評価した、検査性能を示す図である。

Claims (22)

  1. 胎児における異数性をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）母体血液試料から単離した核酸試料を得ることと、
    ｂ）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の１つまたは複数の集団を用いることにより、工程ａ）で得た前記核酸試料中における複数の目的の標的配列を捕捉して、複数のレプリコンを作製することと、
    前記ＭＩＰ集団内の前記ＭＩＰのそれぞれは、
    i）一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームであって、前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの対は、同一であり、且つ、前記複数の目的の標的配列におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である、前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
    ii）１つまたは複数の固有分子タグ；及び
    iii）ポリヌクレオチドリンカー；
    を含み、
    ｃ）工程ｂ）で得た前記レプリコンから増幅した複数のＭＩＰアンプリコンをシークエンスすることと、
    ｄ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第１のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第１のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
    ｅ）レプリコンを増幅したそれぞれのＭＩＰにおける前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｃ）で得た前記複数のアンプリコンにおける第２のアンプリコン集団のそれぞれの捕捉現象の数を測定することと、前記第２のアンプリコン集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
    ｆ）工程ｄ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第１のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
    ｇ）少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｆ）で決定した前記部位捕捉基準の第１のサブセットを同定することと、
    ｈ）工程ｅ）で測定した捕捉現象の数の少なくとも一部に基づいて、そこから前記第２のアンプリコン集団を作製した、それぞれの目的の標的配列の部位捕捉基準を決定することと、
    ｉ）前記少なくとも１つの判定基準を満たす、工程ｈ）で決定した前記部位捕捉基準の第２のサブセットを同定することと、
    ｊ）工程ｇ）で同定した部位捕捉基準の前記第１のサブセットから求めた第１の指標を、工程ｉ）で同定した部位捕捉基準の前記第２のサブセットから求めた第２の指標で正規化して、検査比率を得ることと、
    ｋ）前記検査比率を、正倍数性または異数性を示すことが既知である参照対象から単離した参照核酸試料に基づいて計算した、複数の参照比率と比較し、前記胎児における異数性を示す検査比率の有無を判定することと、
    を含む、前記方法。
  2. 前記１つまたは複数の固有分子タグが、前記配列内の少なくとも２つの固有分子タグ：
    第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
    であり、
    前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっている、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸試料はＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記部位捕捉基準は、部位捕捉性能指標（ＳＣＥ）または部位捕捉密度指標（ＳＣＣ）である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 工程ｂ）で提供した前記ＭＩＰレプリコンのそれぞれは、
    ｉｉｉ）前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームをそれぞれ、前記核酸試料中の対応する前記第１及び第２の領域にそれぞれハイブリダイズすることと、前記第１及び第２の領域は目的の標的配列に隣接し、
    ｉｖ）前記ハイブリダイゼーション後、ライゲーション／伸長用混合液を用いて、前記２つの標的ポリヌクレオチドアーム間に存在するギャップ領域を伸長及びライゲートし、一本鎖環状核酸分子を作製することと、
    により作製される、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、ｃ）の前記シークエンシング工程の前に、インデックスＰＣＲ反応を含み、前記インデックスＰＣＲ反応は、以下の構成要素、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記ＭＩＰアンプリコンのそれぞれに導入する、前記方法。
  7. 前記バーコード化ＭＩＰアンプリコンは、以下の構成要素、第１のシークエンシングアダプター−第１のシークエンシングプライマー−前記第１の固有分子タグ−前記第１の標的ポリヌクレオチドアーム−捕捉核酸−前記第２の標的ポリヌクレオチドアーム−前記第２の固有分子タグ−固有試料バーコード−第２のシークエンシングプライマー−第２のシークエンシングアダプター、を配列内に含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記検査比率及び前記参照比率は、染色体比率である、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記染色体比率は、目的の染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１）と、全ての染色体由来の全固有捕捉現象の合計（Ｓ１＋Ｓ２）との比率により定義される、請求項８に記載の方法。
  10. 胎児における異数性をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）母体血液試料由来のゲノムＤＮＡ試料を得ることと、
    ｂ）前記ゲノムＤＮＡ試料を、マルチウェルプレートのそれぞれのウェルへと加えることと、前記マルチウェルプレートのそれぞれのウェルはプローブ混合液を含み、前記プローブ混合液は分子反転プローブ（ＭＩＰ）集団及び緩衝液を含み、
    前記ＭＩＰ集団内のそれぞれのＭＩＰは、
    i）一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームであって、前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアームの対は、同一であり、且つ、前記複数の目的の標的配列におけるそれぞれの配列に隣接する、前記核酸内の第１及び第２の領域に対して、それぞれ実質的に相補的である、前記一対の第１及び第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
    ii）１つまたは複数の固有分子タグ；及び
    iii）ポリヌクレオチドリンカー；
    を含み、
    前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっており、
    ｃ）前記ＭＩＰの前記プローブ混合液を含む前記ゲノムＤＮＡ試料をインキュベートして、前記複数の目的の標的配列を捕捉することと、
    ｄ）伸長／ライゲーション用混合液を、前記ＭＩＰ及び前記複数の目的の標的配列を含むｃ）の前記試料へと加えて、複数のＭＩＰアンプリコンを作製することと、前記伸長／ライゲーション用混合液は、ポリメラーゼ、複数のｄＮＴＰ、リガーゼ、及び、緩衝液を含み、
    ｅ）エキソヌクレアーゼ混合液を、前記標的及び対照ＭＩＰアンプリコンへと加えて、過剰プローブまたは過剰ゲノムＤＮＡを除去することと、
    ｆ）インデックスＰＣＲ用混合液をｅ）の前記試料へと加えて、一対のインデックスプライマー、固有試料バーコード、及び、一対のシークエンシングアダプターを、前記複数のアンプリコンへと加えることと、
    ｇ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第１の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第１の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
    ｈ）超並列シークエンシング法を用いて、前記固有分子タグの数に基づいて、工程ｆ）で提供したバーコード化アンプリコンの第２の集団におけるシークエンシングリードの数を測定することと、バーコード化アンプリコンの前記第２の集団は、前記目的の標的配列の前記シークエンスにより同定され、
    ｉ）工程ｇ）で測定した第１のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、部位捕捉基準を計算し、工程ｈ）で測定した第２のシークエンシングリードの数の少なくとも一部に基づいて、複数の対照プローブ捕捉基準を計算することと、
    ｊ）少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準を有する前記ＭＩＰアンプリコンの前記集団における部位捕捉基準のサブセットを同定することと、
    ｋ）前記部位捕捉基準を、前記少なくとも１つの判定基準を満たす対照プローブ捕捉基準の前記サブセットから計算した係数で正規化して、検査正規化部位捕捉基準を得ることと、
    ｌ）工程ｂ）〜工程ｈ）における同一の標的部位及び対照部位、標的集団、対照集団のサブセットを用いて、前記検査正規化部位捕捉基準を、既知の遺伝子型を示す参照対象から得た参照ゲノムＤＮＡ試料に基づいて計算した複数の参照正規化部位捕捉基準と比較し、前記胎児における異数性を示す検査正規化部位捕捉基準の有無を判定することと、
    を含む、前記方法。
  11. 前記１つまたは複数の固有分子タグが、前記配列内の少なくとも２つの固有分子タグ：
    第１の標的ポリヌクレオチドアーム−第１の固有分子タグ−ポリヌクレオチドリンカー−第２の固有分子タグ−第２の標的ポリヌクレオチドアーム；
    であり、
    前記ＭＩＰのそれぞれにおける前記第１及び第２の固有分子タグの組み合わせは、前記ＭＩＰのそれぞれにおいて異なっている、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記血液試料は、全血試料、血漿試料、または、血清試料である、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記血液試料は、血漿試料である、請求項１２に記載の方法。
  14. ａ）前記第１及び／または第２の標的ポリヌクレオチドアームの長さは、１４〜３０塩基対であり、及び／または、前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有し、及び／または、前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、３０％〜８０％のＧＣ含有量を有する；及び／または
    ｂ）前記第１及び／または第２の固有分子タグの長さは、４〜１５塩基対であり、及び／または、前記固有分子タグのそれぞれは、４５℃〜８０℃の融解温度を有する；及び／または
    ｃ）前記ポリヌクレオチドリンカーは、２０〜１，０００塩基対の長さを有し、及び／または、前記ポリヌクレオチドリンカーは、４５℃〜８０℃の融解温度を有し、及び／または、前記ポリヌクレオチドリンカーは、３０％〜８０％のＧＣ含有量を有する、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記標的ポリヌクレオチドアームのそれぞれは、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する；及び／または、前記ポリヌクレオチドリンカーは、３０％〜７０％のＧＣ含有量を有する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも１種の増幅用プライマーを含む、請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ポリヌクレオチドリンカーは、増幅用フォワードプライマー及び増幅用リバースプライマーを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記増幅用フォワードプライマーの前記配列は、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧ−３´（配列番号：１）のヌクレオチド配列を含む；及び／または、
    前記増幅用リバースプライマーの前記配列は、５´−ＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：２）のヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ポリヌクレオチドリンカーは、５´−ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ−３´（配列番号：３）のヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記第１の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３´（配列番号：４）のヌクレオチド配列を含む；及び／または、
    前記第２の標的ポリヌクレオチドアームは、５´−ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：５）のヌクレオチド配列を含む、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記ＭＩＰは、５´−ＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ（Ｎ１−６）ＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＧＡＣＧＧＴＡＧＴＧＴ（Ｎ７−１２）ＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＡＡ−３´（配列番号：６）のヌクレオチド配列を含み、（Ｎ１−６）は前記第１の固有分子タグを表し、（Ｎ７−１２）は前記第２の固有分子タグを表す、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記シークエンシング工程は、６〜８百万リードの読み取り深度を有する、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
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