CN112458085A

CN112458085A - 一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法

Info

Publication number: CN112458085A
Application number: CN202011458082.6A
Authority: CN
Inventors: 张腾龙; 杨春燕; 杨文娟; 李旋; 张亮; 周启明
Original assignee: Beijing Qiuzhen Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Beijing Qiuzhen Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明涉及分子检测技术领域，尤其是指一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法，一种新型分子捕获优化探针，由以下部分组成：靶区域互补序列探针A‑单分子标记序列A‑正向引物识别序列A‑连接序列‑反向引物识别序列B‑单分子标记序列B‑靶区域互补序列探针B；一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法：包括以下步骤：S1，合成新型分子捕获优化探针；S2，形成环状结构；S3，加入4种游离的核苷酸，形成完整的环化探针；S4，加入链霉亲和素磁珠；S5，用PCR扩增直接产生靶向区域的测序文库。本发明操作简单，具有高特异性，有效节约成本，节省时间，对DNA样品的完整度要求不严格，所需DNA样品少、花费低，还能有效较少引物二聚体。

Description

一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法

技术领域

本发明涉及分子检测技术领域，尤其是指一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法。

背景技术

目标序列捕获测序是通过定制感兴趣的基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的研究策略。近年来发展起来的捕获技术，如杂交捕获技术，其样本在杂交前被随机打断成200-500bp左右的片段，寡核苷酸探针可能与一些含有部分目标片段的非靶标序列杂交，导致捕获的特异性较差。多重PCR捕获技术是在一个反应体系中同时扩增多个目的片段，扩增子越多，不均一性也越高，PCR扩增的效率使其应用受到一定的限制。

分子倒置探针(Molecular Inversion Probe，MIP)技术是最新发展起来的一项新型分子靶向捕获技术，该技术通过设计特异的探针对已知特定目的基因组序列进行捕获，将目标区域富集后再进行高通量测序，其具有特异性强、重复性好、操作简单、费用低廉且对DNA完整度要求不高等特点，并且弥补了杂交捕获技术、PCR多重捕获技术等分子捕获手段的不足。分子倒置探针技术的应用越来越广泛，现已应用于单核苷酸多态性(SNP)分型、外显子测序、拷贝数变异、杂合性丢失、体细胞突变、DNA甲基化和可变剪接等方面的研究。然而，分子倒置探针技术在探针设计及文库构建等方面仍存在一些不足，还需要进一步的优化完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法，操作简单，具有高特异性，有效节约成本，节省时间，对DNA样品的完整度要求不严格，所需DNA样品少、花费低，还能有效较少引物二聚体。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种新型分子捕获优化探针，由以下部分组成：

靶区域互补序列探针A-单分子标记序列A-正向引物识别序列A-连接序列-反向引物识别序列B-单分子标记序列B-靶区域互补序列探针B；

所述连接序列为2-12个尿嘧啶核糖核苷酸，缩写为dUTP，所述dUTP的3'端被标记生物素形成生物素标记的dUTP，用于结合链霉亲和素磁珠，所述生物素标记的dUTP间隔分布，所述生物素标记的dUTP之间的间隔为1-10个未标记生物素的dUTP，所述连接序列有1-6个所述生物素标记的dUTP，所述连接序列包含的未标记生物素的dUTP，可被USER酶识别并切割；

所述连接序列连接靶区域互补序列探针A-单分子标记序列A-正向引物识别序列A和通用引物识别序列2--单分子标记序列b--靶区域互补序列探针B反向引物识别序列B-单分子标记序列B-靶区域互补序列探针B，形成一个完整的改良新型分子捕获探针，降低分子刚性，捕获或大或小的目标区域。

优选地，所述正向引物识别序列A如SEQ ID NO：1，表示为：5'-CTTCAGCTTCCCGATTACGG-3'，所述反向引物识别序列B如SEQ ID NO：2，表示为：5'-GCACGATCCGACGGTAGTGT-3'；

所述单分子标记序列A用N_1-8表示，所述单分子标记序列B用N_9-16表示。

优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。

优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列的反义链区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。

优选地，每个新型分子捕获优化探针中的所述单分子标记序列A和单分子标记序列B在每一个探针中的序列是不同的；同时所述单分子标记序列A和单分子标记序列B的序列也是不同的；所述单分子标记序列a和单分子标记序列b的长度分别在4～12个碱基对之间。

优选地，每个新型分子捕获优化探针不与靶目标区域的任何序列大致上互补；所述正向引物识别序列A和反向引物识别序列B的长度分别在14～30个碱基对之间；所述反向引物识别序列分别与PCR扩增的正向引物和反向引物之间有部分或全部互补；解链温度55℃～65℃，GC含量35～70％。

优选地，每个新型分子捕获优化探针包含SEQ ID NO.3的核苷酸序列，U_2-12表示连接序列。

优选地，所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列为N_1-8 CTTCAGCTTCCCGATTACGG U_2- ₁₂GCACGATCCGACGGTAGTGTN_9-16，其中U_2-12表示连接序列。

一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，包括以下步骤：

S1，根据靶目标区域序列设计并合成新型分子捕获优化探针；

S2，针对捕获的目标区域，靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B可特异性与目标区域模板互补结合，形成含有一个核苷酸至几百个核苷酸缺口的环状结构；

S3，在步骤S2得到的环状结构中加入4种游离的核苷酸，所述4种游离的核苷酸为dATP、dTTP、dGTP和dCTP，在DNA聚合酶的作用下以靶目标序列为模板填补缺口，DNA连接酶催化探针区域两端的3'，5'-磷酸二酯键，形成完整的环化探针；

S4，在步骤S3中得到的环化探针中加入链霉亲和素磁珠用于富集捕获目标序列；之后在捕获洗脱后的体系内加入USER酶识别未标记生物素的dUTP用于切断环化探针和未反应的探针；

S5，用PCR扩增直接产生靶向区域的测序文库，此时的PCR扩增产物即为测序文库；这样扩增产生的PCR产物无需再构建高通量测序文库，可直接进行上机测序，简化步骤节约时间；其中，所述PCR扩增的正向引物包括Illumina测序接头和正向通用引物，所述PCR扩增的反向引物包括Illumina测序接头和反向通用引物。

优选地，所述PCR扩增正向引物的序列包括5’-AATGATACGGCGACCACACCGAGATCTACACNNNNNNNNCACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTAATCGGGAAGCTGAAG-3’SEQ ID NO.4的核苷酸序列，其中NNNNNNNN表示样品条形码序列1；所述PCR扩增反向引物的序列包括5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCN’N’N’N’N’N’N’N’GTGACTGGAGGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACGATCCGACGGTAGTGT-3’SEQ ID NO.5的核苷酸序列，其中N’N’N’N’N’N’N’N’表示样品条形码序列2。

优选地，所述样品条形码1和样品条形码2的核苷酸序列不同。

优选地，所述目标区域模板为DNA或RNA；样品来源可以是肿瘤患者的体液、组织、全血、福尔马林石蜡包埋样品；肿瘤患者包括患有任何实体瘤的个体；任何实体瘤包括肺癌实体瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、神经系统肿瘤、头颈部肿瘤等。

优选地，所述DNA连接酶包括各种DNA连接酶，如T4 DNA连接酶、E.coliDNA连接酶等。

优选地，所述的DNA聚合酶包括各种DNA聚合酶，如高保真DNA聚合酶PfuDNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、Q5 DNA聚合酶等。

本发明的有益效果：

1)高特异性、节约成本：连接序列为尿嘧啶核糖核苷酸，可用于USER酶的识别，不仅可以切断环化探针，而且可以切断未杂交的线性探针，有效减少非特异性扩增，减少无效数据的产生，节约成本；

2)节省时间：连接序列碱基标记生物素后，使用链霉亲和素磁珠可以快速捕获探针序列，节省实验时间；

3)对DNA样品的完整度要求不严格：因为两端的探针与靶目标区域的结合长度最多仅需35bp左右，因此适用于部分降解的DNA样本，特别是福尔马林石蜡包埋样本(Formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)；

4)操作简单：使用“先捕获，后建库”的方式，无需DNA打断步骤，建库步骤只需要PCR扩增即可，无需专门构建文库便可以直接上机测序，不仅大大简化操作步骤，而且缩短操作时间；

5)所需DNA样品少、花费低：基于新型分子捕获优化探针捕获的目标序列经PCR扩增后可以直接上机测序，因此只需要少量的DNA样品即可完成操作(≥100ng)。此外，尽管分子倒置探针技术的总体费用较高，但其与其他富集技术相比，特异性好，背景噪音影响小，捕获效率高，测序数据质量好，进而降低了对每个样本的检测成本；

减少引物二聚体：与线性探针相比，能够指数级减少由于线性引物序列所引起的交叉反应及二聚体现象，既具备分子倒置探针的优势，又结合了杂交捕获技术的特点。

附图说明

图1为本发明的新型分子捕获优化探针结构；

图2为本发明的新型分子捕获优化探针杂交捕获靶目标区域的流程；

图3为本发明的捕获后模板的PCR扩增示意图。

附图标记：

U-标记生物素，此间隔为一个未标记生物素的dUTP。

U_2-12表示连接序列(为随机序列，不生成核苷酸序列表)。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

探针的设计：

根据肺癌靶向治疗、免疫治疗相关的27基因(ALK、ARAF、BCL2L11、BRAF、CDKN2A、EGFR、ERBB2、ERBB4、FGFR1、KRAS、MDM2、MET、MTOR、NRAS、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PIK3CA、POLD1、PTEN、RB1、RET、RICTOR、ROS1、STK11、TP53、TSC1)的靶向区域设计单个的靶向新型分子捕获优化探针，形成基因panel(基因组合)。

实施例2

探针的组成：

探针是一组长度在120～150nt之间的范围内寡核苷酸序列，探针的5'端需要磷酸化处理，连接序列内包含2～12个dUTP且某些dUTP的3'端被生物素修饰；其结构组成例如图1，包括靶区域互补序列A、B，正向引物识别序列A和反向引物识别序列B，单分子标记序列A、B和连接序列。

实施例3

DNA的提取：

采用试剂盒(QIAamp DNA FFPE tissue kit)提取肺癌患者的肿瘤组织石蜡切片，具体的操作参见试剂盒产品说明书。

实施例4

靶向杂交捕获流程：

(1)杂交捕获实验需要100～500ng的DNA模板，然后加入300fmol探针混合液，1μL10X Chosenligase DNA酶反应缓冲液，杂交反应在热循环仪上进行，首先98℃变性3min，然后下降到85℃持续30min，之后60℃持续60min，最后56℃持续120min。

(2)在上述杂交程序完成后，加入5μL的Chosenmix1混合物，混合物包括DNA聚合酶、DNA连接酶、dNTP、NAD+等缓冲液等，将上述反应液，在热循环仪上56℃孵育60min，72℃孵育20min。在该步骤的体系内，在DNA聚合酶的作用下，从杂交探针的3'端会以目标靶向区域DNA为模板进行DNA合成，当探针延申到探针的5'端时，通过DNA连接酶利用此处的磷酸根进行共价环化，形成一个封闭的单链环状DNA，见图2。

(3)准备缓冲液，按比例稀释1×缓冲液，如下表1

表1

将稀释好的1×清洗液1吸出一半、全部的1×增强清洗液放入65℃PCR仪加热进行后续步骤的热洗脱；

实施例5

目标区域捕获：

使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将1mg磁珠加入1.5mL离心管，至于磁力架上，弃上清，用200μL1×磁珠清洗试剂清洗两遍后，使用100μL 1×磁珠清洗试剂重悬磁珠，转移到0.2mL PCR管内，等65℃反应4h结束后，将其置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，然后将磁珠置于65℃热循环仪上，在1min内将杂交反应液转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR管中，迅速震荡混匀，放回65℃热循环仪，计时45min，每隔8min震荡混匀一次，保持磁珠处于悬浮状态。

实施例6

洗脱非杂交片段：

65℃清洗：先使用预热到65℃的1×清洗液1清洗一遍，再使用预热到65℃的增强清洗液清洗两遍；室温清洗：一次使用1×清洗液、1×清洗液2和1×清洗液3各清洗一遍。最后置于磁力架上，弃上清，加入22.5μL无核酶水重悬磁珠。

将重悬磁珠后转移到新的反应管内，然后加入ChosenUSER混合物，这一步是通过USER酶切断环化探针和未反应的探针，反应条件是37℃孵育10～15min。

在上述捕获探针的延伸且环化后的产物中，加入Chosenmix2混合物，其中含有DNA聚合酶及其缓冲液、dNTP和通用引物a、b等，之后进行PCR反应；PCR反应条件：95℃2min；98℃15s，65℃45s，7245s:12～15个循环，扩增示意图见图3。

扩增后的产物需进行磁珠纯化，使用70％或80％乙醇洗涤两遍。扩增后的每个样品具有不同的测序条形码，可实现对样品的多重测序；同时，不同样品的扩增产物也可进行混合后纯化，得到目标产物。使用Qubit对产物进行定量，并使用QIAxcel Advanced或Agilent 2100生物分析仪等相关片段分析仪器进行文库片段分布检测。

实施例7

目标捕获产物测序：

将PCR产物文库，使用下一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)进行单端或者双端测序。如果使用单端测序，则读取可由正向引物识别序列A、单分子标记序列A、靶序列捕获区域组成，便可进行下游数据分析。

实施例8

检测结果：

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京求臻医学检验实验室有限公司

<120> 一种新型分子捕获优化探针及其文库构建方法

<141> 2020-12-10

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 正向引物识别序列A(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Ala Thr Thr

1 5 10 15

Ala Cys Gly Gly

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 反向引物识别序列B(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Thr Ala

1 5 10 15

Gly Thr Gly Thr

20

<210> 3

<211> 90

<212> PRT

<213> PCR扩增正向引物的序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 3

Ala Ala Thr Gly Ala Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Ala

1 5 10 15

Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Asn

20 25 30

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys

35 40 45

Cys Cys Thr Ala Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Thr

50 55 60

Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr Cys Gly Thr Ala Ala Thr Cys Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly

85 90

<210> 4

<211> 88

<212> PRT

<213> PCR扩增反向引物的序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 4

Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Gly Gly Cys Ala

1 5 10 15

Thr Ala Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn

20 25 30

Asn Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala

35 40 45

Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Gly

50 55 60

Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys

65 70 75 80

Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gly Thr

85

Claims

1.一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：由以下部分组成：

2.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：所述正向引物识别序列A如SEQ ID NO：1，表示为：5'-CTTCAGCTTCCCGATTACGG-3'，所述反向引物识别序列B如SEQ ID NO：2，表示为：5'-GCACGATCCGACGGTAGTGT-3'；

3.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。

4.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B是针对靶目标区域的特异性序列，与模板靶序列的反义链区域互补；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B之间的距离为1～500bp，最适合的距离为90～200bp；所述靶区域互补序列探针A和靶区域互补序列探针B的长度分别在14～35个碱基对之间；解链温度55℃～65℃；GC含量35％～75％。

5.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针中的所述单分子标记序列A和单分子标记序列B在每一个探针中的序列是不同的；同时所述单分子标记序列A和单分子标记序列B的序列也是不同的；所述单分子标记序列a和单分子标记序列b的长度分别在4～12个碱基对之间。

6.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针不与靶目标区域的任何序列大致上互补；所述正向引物识别序列A和反向引物识别序列B的长度分别在14～30个碱基对之间；所述反向引物识别序列分别与PCR扩增的正向引物和反向引物之间有部分或全部互补；解链温度55℃～65℃，GC含量35～70％。

7.根据权利要求1所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：每个新型分子捕获优化探针包含SEQ ID NO.3的核苷酸序列，U2-12表示连接序列。

8.根据权利要求7所述的一种新型分子捕获优化探针，其特征在于：所述SEQ ID NO.3的核苷酸序列为N_1-8 CTTCAGCTTCCCGATTACGG U_2-12GCACGATCCGACGGTAGTGT N_9-16，其中U_2-12表示连接序列。

9.根据权利要求1-7所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：所述PCR扩增正向引物的序列包括5’-AATGATACGGCGACCACACCGAGATCTACACNNNNNNNNCACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGTAATCGGGAAGCTGAAG-3’SEQ ID NO.4的核苷酸序列，其中NNNNNNNN表示样品条形码序列1；所述PCR扩增反向引物的序列包括5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCN’N’N’N’N’N’N’N’GTGACTGGAGGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCACGATCCGACGGTAGTGT-3’SEQ ID NO.5的核苷酸序列，其中N’N’N’N’N’N’N’N’表示样品条形码序列2。

11.根据权利要求10所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：所述样品条形码1和样品条形码2的核苷酸序列不同。

12.根据权利要求9所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：所述目标区域模板为DNA或RNA；样品来源可以是肿瘤患者的体液、组织、全血、福尔马林石蜡包埋样品；肿瘤患者包括患有任何实体瘤的个体；任何实体瘤包括肺癌实体瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、神经系统肿瘤、头颈部肿瘤等。

13.根据权利要求9所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：所述DNA连接酶包括各种DNA连接酶，如T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶等。

14.根据权利要求9所述的一种新型分子捕获优化探针的文库构建方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶包括各种DNA聚合酶，如高保真DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、Q5 DNA聚合酶等。