CN107338245B - 一种大规模制备单链dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法。具体来讲，所述方法包括以下步骤：1)合成可重复生产单链DNA的模板，其中，合成时在所述模板的5’端和3’端分别为启动子序列和一段通用接头序列；2)模板的纯化；3)对步骤2)纯化的模板进行体外转录反应合成RNA；4)以步骤3)中得到的RNA为模板进行逆转录反应合成单链DNA，其中逆转录反应的通用反转录引物为步骤1)所述通用接头序列的互补序列，并且所述通用反转录引物的dTTP核酸被dUTP核酸取代；以及5)使用UDG酶对步骤4)中逆转录反应合成的单链DNA末端带有的通用反转录引物序列进行消化，以对其纯化。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域。更具体地，本发明涉及利用体外转录、逆转录等技术提供了一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法。
背景技术
单链DNA是生命科学等领域研究的一种基本工具，近期在生物医药研究和发展中均取得了一些重大突破。在生物医疗领域，反义单链DNA已经被开发为基因靶向治疗的药物，用于抗病毒、抗肿瘤和治疗遗传性疾病；此外，当前的基因和分子生物研究开发领域取得的诸多进步，如生物基因组快速扫描技术、二代测序技术，必须依靠大规模平行制备的单链DNA，表I是单链DNA的各种应用的列表：
表I单链DNA的应用
| 单链DNA类型 | 应用 |
| 引物 | DNA测序、PCR |
| 探针 | 克隆杂交、诊断杂交 |
| 基因组 | 合成基因组 |
| 药物 | 反义疗法 |
| 生理研究 | 核磁共振、X射线晶体分析法 |
目前，单链DNA主要采用化学合成的方法，分为固相合成法和液相合成法，固相合成法通常使用亚磷酰胺缩合反应方式，液相合成法通常使用磷酸三酯缩合反应方式或者氢膦酸酯缩合反应方式，但其均存在产物纯度低，而纯化十分困难，且合成的目标序列出错率极高，大规模合成单链DNA的成本十分昂贵等问题，大大限制了寡核酸的研究和应用。目前虽然已开发芯片技术为大规模平行合成单链DNA提供了一种相对简单便捷的方法，但是，大多受到合成单链DNA种类或实验条件等方面的限制而无法推广成为一种实验室常规方法。为克服以上技术问题，本发明在传统化学合成单链DNA的方法上进行改进和扩展，利用体外转录、逆转录等技术提供了一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法，其克服了传统化学法合成单链DNA产物纯度低、产量低、成本高、平行性差的缺点。
技术方案
一方面，本发明提供了一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
1)合成可重复生产单链DNA的模板，其中，合成时在所述模板的5’端和3’端分别为启动子序列和一段通用接头序列(universal adaptor)，其中，模板的特征为长度差别不超过5个碱基，优选地，模板序列的长度相同，并且任意两个模板序列没有稳定的互补热稳定性结构。所述热稳定性结构是指互补区域在标准普通PCR离子浓度条件下解链温度不超过47℃，优选地，不超过30℃。
2)模板的纯化；
3)对步骤2)纯化的模板进行体外转录反应合成RNA；
4)以步骤3)中得到的RNA为模板进行逆转录反应合成单链DNA，其中逆转录反应的通用反转录引物为步骤1)所述通用接头序列的互补序列。优选地，所述通用反转录引物的dTTP核酸被dUTP核酸取代；
5)使用UDG酶对步骤4)中逆转录反应合成的单链DNA末端带有的通用反转录引物序列进行消化，以对其纯化。
具体地，在步骤1)中，通过晶芯微阵列基片微量合成单链DNA模板，采用化学合成的单链DNA作为制备所述单链DNA的模板，合成时在其5’端和3’端分别为启动子序列和通用接头序列，便于后续单链DNA大规模生产，带有启动子的PCR产物可以作为模板用于体外转录。优选地，所述启动子序列可为T7、SP6、T3或其他类型的启动子；更优选地，所述启动子序列和所述通用接头序列可如下：
启动子序列：5’TGCATAATACGACTCACTATAGGG 3’；
通用接头序列：5’GCTTCGGTTCACGCAATG3’。
具体地，在步骤2)中，所述纯化的方式为对称PCR，PCR反应所使用的正向引物和反向引物序列分别对应于步骤1)中的启动子序列和通用接头序列，PCR纯化使用的DNA聚合酶为热启动TAQ酶，PCR纯化循环数为5-20个循环，优选地，6-15个循环，更优选地，8-12个循环。
具体地，在步骤3)中，使用RNA聚合酶，特别是T7RNA聚合酶进行体外转录。
具体地，在步骤4)中，使用无RNase活性的逆转录酶(特别是无RNaseH活性的M-MLV逆转录酶)进行逆转录反应。
具体地，在步骤4)中，逆转录后，进一步包括使用的E.coli RNase H孵育以去除与单链DNA互补的RNA的步骤。
具体地，在步骤4)中，进一步包括加入标签和修饰。更具体地，根据用途需要，对逆转录产物进行进一步人工优化，包括为提高DNA序列退火温度或增加序列稳定性进行的核酸分子替代，如Locked Nucleic Acids(LNA)、Bridged nucleic acid(BNA)；再如为限制DNA序列的酶反应应答，如3’端加inverted dTTP等；再如核苷酸分子基团水平的修饰，如磷酸化、荧光标签、氨基酸标签、生物素标记等。
有益效果
根据本发明的大规模平行制备单链DNA的方法，由于在传统化学合成单链DNA的基础上，利用体外转录技术及逆转录技术的特点，在反应过程中始终以原始底物为模板进行反应，不会出现扩增漂移，克服了传统化学法合成单链DNA产物纯度低、产量低、平行性差的缺点，最终获得高产量平行性好的目标单链DNA。此方法操作简单便捷，大大降低了大规模平行制备单链DNA的成本，从而可实现大规模平行生产的目的。
附图说明
图1为PCR扩增产物纯化回收后凝胶电泳结果的照片。
图2为体外转录反应合成RNA产物稀释后凝胶电泳结果的照片。
图3为单链DNA纯化回收产物稀释后凝胶电泳结果的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如“J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002”中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、模板的合成
本发明中的模板委托北京艾吉康泰公司合成，涉及72个基因杂交探针panel，这些模板的启动子序列和通用接头序列如下：
启动子序列：5’TGCATAATACGACTCACTATAGGG 3’，
通用接头序列：5’GCTTCGGTTCACGCAATG 3’。
基因名称如下：
NRAS，AKT1，ALK，ATM，BRAF，BRCA1，BRCA2，KIT，CSF1R，DDR2，EGFR，FGFR1，FGFR2，FLT3，GNA11，GNAQ，ERBB2，HRAS，KDR，KRAS，MET，PDGFRB，PDGFRA，PIK3CA，PTCH1，
PTEN，RET，SMO，NTRK1，TSC1，CHEK2，MEK1，VEGFA，ABL1，APC，BRIP1，CDKN2A，CDH1，CTNNB1，ERBB4，EZH2，FBXW7，FGFR3，FOXL2，GNAS，HNF1A，IDH1，IDH2，JAK2
JAK3，MLH1，MPL，MSH2，MSH6，MTOR，NF1，NF2，NOTCH1，NPM1，PALB2，PMS2，PTPN11
RB1，ROS1，SMAD4，SMARCB1，SRC，STK11，TERT，TP53，TSC2，VHL。
2、模板的纯化
本发明采用对称PCR的方法对模板进行纯化，PCR反应所使用的引物、具体成分以及反应程序分别如下：
1)引物
正向引物：5’TGCATAATACGACTCACTATAGGG 3’；
反向引物：5’GCT TCG GTT CAC GCA ATG 3’。
2)PCR反应成分：
3)PCR反应程序：
4)PCR产物纯化回收：
使用北京天根通用型DNA纯化回收试剂盒(货号DP214)对PCR反应产物进行纯化回收，回收后使用Qubit3.0定量，纯化回收产物浓度为9.0ng/μL。产物稀释后凝胶电泳制备0.8％琼脂糖凝胶，电泳条件：120V，20min，PCR扩增产物纯化回收后凝胶电泳结果的照片如图1所示。
3、体外转录反应合成RNA
本发明的单链DNA模板上游添加了T7启动子，所以采用T7RNA聚合酶(南京诺唯赞T7高产RNA转录试剂盒，货号TR101)进行体外转录反应，操作过程中使用无核酸酶的试剂及EP管，避免引入RNA酶污染，反应的具体成分及操作步骤如下：
1)T7体外转录体系成分
| T7体外转录体系成分 | 用量(μL) | 备注 |
| 纯化回收产物 | 8 | 浓度：9.0ng/μL |
| 反应缓冲液(10×) | 2 | |
| ATP | 2 | |
| GTP | 2 | |
| UTP | 2 | |
| CTP | 2 | |
| T7RNA聚合酶混合物 | 2 | |
| 不含核酸酶的水 | 0 | |
| 共计 | 20 |
2)体外转录反应：混匀反应混合液并短暂离心(1-2s)收集，37℃孵育2个小时。
注：为了避免蒸发对反应体系的影响，使用PCR仪进行反应。对于小于0.3kb的短片段RNA的合成，为了达到最大产量，可以延长37℃孵育时间至4小时或者更长，16小时的过夜反应不会影响产物质量。
3)消化DNA模板：向反应体系中加入1μl DNase，37℃孵育15分钟消化用于转录的DNA模板。
4)RNA产物纯化及定量：
加入160μl不含RNA酶的水将反应液稀释到180μl并混匀。
加入20μl 3M的醋酸钠(pH5.2)到稀释后的反应体系中并混匀。
使用等体积的酚/氯仿(体积比1:1)抽提一次，并使用等体积的氯仿抽提2次。
收集上层水相到新的EP管中。
加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30分钟，离心机冷却至4℃后使用最大转速离心15分钟沉淀RNA。
弃上清并加入500μl预冷的70％乙醇洗涤RNA沉淀。
离心弃上清并使用不含RNA酶的水或者其它需要的缓冲液溶解RNA。
使用Qubit3.0定量，纯化回收产物浓度为3.2μg/μL。
产物稀释后凝胶电泳制备0.8％琼脂糖凝胶，电泳条件：120V，20min，转录反应合成RNA产物稀释后凝胶电泳结果的照片如图2所示。
4、逆转录反应合成单链DNA
使用M-MLV逆转录酶(无RNaseH活性，货号C28025)进行单链DNA的合成，为了便于通用反转录引物的消化，加入逆转录反应的通用反转录引物使用dUTP合成，这样在逆转录反应中形成单链DNA引物端带有dUTP，便于下一步对产物的纯化。如果生产出的单链DNA有特殊作用，可在逆转录过程中加入标签和修饰，便于后续应用，操作过程中使用无核酸酶的试剂及EP管，避免引入RNA酶污染，反应的具体成分及操作步骤如下：
1)将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中：
2pmol dUTP替代合成的通用反转录引物中的dTTP(引物序列：5’CAUUGCGUGAACCGAAGC 3’)；
500ng体外转录RNA纯化产物；
1μl 10mM dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP和dTTP均为10mM，pH中性)；
加入不含核酸酶的水至12μl。
2)混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却。短暂离心后，加入以下组分：
4μl 5×第一链合成缓冲液；
2μl 0.1M DTT；
1μl RNaseOUTTM核酸酶抑制剂(40单位/μl)。
3)在离心管中轻轻将各种成分混合，并在37℃下孵育2分钟。
4)在室温下加入1μl(200单位)M-MLV逆转录酶，轻轻地吹打混匀。
5)在37℃孵育50分钟。
6)在70℃加热15分钟以终止反应。
5、单链DNA纯化
1)通用反转录引物的消化：UDG酶能很好的工作于常用的各种PCR反应体系，因此在反应液中加入UDG酶即可，无需另加UDG缓冲液，但因各反应体系不同，UDG酶的加入量需依据反应体系进行调整，本发明直接在上步反应液中加入1μl活性为1U/μl的UDG酶(同科生物，货号TK01033)，50℃孵育30min消化，95℃孵育5min使携带dUTP的DNA链在dUTP碱基处降解，降解反应完成后灭活UDG酶。
2)单链DNA的提取纯化：使用苯酚氯仿法从反应体系中提取纯化单链DNA，具体操作步骤可参考本发明中以上体外转录反应合成RNA步骤中的RNA产物纯化步骤。
3)单链DNA的质检定量：使用Qubit3.0定量，纯化回收产物浓度为113ng/μl，产物稀释后凝胶电泳，制备0.8％琼脂糖凝胶，电泳条件：120V，20min，纯化回收产物稀释后凝胶电泳结果的照片如图3所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连晶泰生物技术有限公司
<120> 一种大规模制备单链DNA的方法
<130> DI17-0734-XC86
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 启动子
<400> 1
tgcataatac gactcactat aggg 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 通用接头
<400> 2
gcttcggttc acgcaatg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 通用反转录引物
<400> 3
cauugcguga accgaagc 18
Claims (10)
1.一种适用于实验室大规模平行制备单链DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
1)合成可重复生产单链DNA的模板，其中，合成时在所述模板的5’端和3’端分别为启动子序列和一段通用接头序列，其中，所述模板的特征为长度差别不超过5个碱基，并且任意两个模板序列没有稳定的互补热稳定性结构；
2)模板的纯化；
3)对步骤2)纯化的模板进行体外转录反应合成RNA；
4)以步骤3)中得到的RNA为模板进行逆转录反应合成单链DNA，其中逆转录反应的通用反转录引物为步骤1)所述通用接头序列的互补序列，并且所述通用反转录引物的dTTP核酸被dUTP核酸取代；以及
5)使用UDG酶对步骤4)中逆转录反应合成的单链DNA末端带有的通用反转录引物序列进行消化，以对其纯化，
其中，在步骤1)中，通过晶芯微阵列基片微量合成单链DNA模板，采用化学合成的单链DNA作为制备所述单链DNA的模板，合成时在其5’端和3’端分别为启动子序列和通用接头序列，并且所述启动子序列和所述通用接头序列如下：
启动子序列：5’TGCATAATACGACTCACTATAGGG 3’；
通用接头序列：5’GCT TCG GTT CAC GCA ATG3’。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2)中，所述纯化的方式为对称PCR，PCR反应所使用的正向引物和反向引物序列分别对应于步骤1)中的启动子序列和通用接头序列，PCR纯化使用的DNA聚合酶为热启动TAQ酶，PCR纯化循环数为5-20个循环。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，PCR纯化循环数为6-15个循环。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，PCR纯化循环数为8-12个循环。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，使用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，使用无RNase活性的逆转录酶进行逆转录反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤4)中，使用M-MLV逆转录酶进行逆转录反应。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，逆转录后，进一步包括使用的E.coliRNase H孵育以去除与单链DNA互补的RNA的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4)中，进一步包括加入标签和修饰。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，模板序列的长度相同。
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