CN107893109A - 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，本发明方法在PCR扩增前对用作DNA模板的样品DNA进行处理，使3'末端被封闭的含突变位点的核苷酸单链作为杂交链与野生型和突变型序列杂交，双链特异性核酸酶能特异性地移除杂交链与野生型序列形成的完全互补配对的同源双链DNA，但不能移除杂交链与突变型序列形成的非完全互补的异源双链DNA。移除后的产物经PCR扩增，PCR扩增所用的一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'‑5'校读活性的聚合酶作用下，使野生型序列不能扩增，但突变型序列得以指数扩增，由此有效富集低丰度基因突变序列，提高了富集灵敏度和准确度，同时本发明方法还可以同时富集多种突变型序列从而提高扩增效率。

Description

一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法。

背景技术

人类基因组计划的完成推动了基因突变研究的快速发展。近年来，“精准医疗”计划的提出更进一步使基因突变及其检测方法研究成为生物学研究和临床精准医疗的热点和基础。随着检测技术的不断发展，研究人员发现大多数基因突变表现为低丰度(含量从0～100％)，并且这些低丰度基因突变在医学和生物学等领域具有重要的研究意义。不断出现的新方法和技术为低丰度基因突变的富集提供了可靠的前景，这些技术大部分基于PCR技术原理。PCR即聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系主要包括五种试剂即引物、DNA聚合酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg²⁺)，PCR反应步骤主要包括预变性、变性、退火和延伸，其中变性、退火和延伸3步的循环运行为核心步骤。变性即通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火即当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；延伸即在DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg²⁺存在的条件下，5'→3'的DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，变性、退火和延伸3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×10^6～7拷贝。目前，已经报道了在PCR扩增之前、之中或之后减少野生型序列的方法，但是这些方法通常适用于单个PCR扩增子，或仅适用于序列特异性酶能识别的少数DNA靶标。另外，PCR扩增过程可能引入由碱基错配导致的假阳性，导致基因突变很难和假阳性信息区分开来。近年来，随着高通量技术的出现，移除样本中大量野生型DNA序列的需求日益增加，例如高通量测序文库制备之前移除大量野生型DNA。通常高通量测序无法检测丰度低于～2％的DNA突变，采用移除大量野生型DNA序列的方法能有效富集低丰度突变型序列以期提高测序检测限。本发明提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，该方法能同时扩增多个PCR扩增子，而且野生型序列移除是在PCR扩增反应前进行的，它能有效避免PCR扩增过程碱基错配导致的假阳性，而且本发明中PCR扩增过程通过引入一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'-5'校读活性的聚合酶作用下，野生型序列与该引物完全互补而不能继续延伸，而突变型序列由于最后一个错配使错配碱基被切除而继续延伸，使突变型序列进一步得以富集。该方法简单、准确度高，可应用于医学和生物学的许多领域，以推动个体化医疗的发展。

发明内容

鉴于此，本发明提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变的富集方法，操作简单且准确性更好的富集方法，能同时扩增多个PCR扩增子，且有效避免PCR扩增低丰度突变基因过程中的假阳性问题。

本发明采用的技术方案是：

一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，包括样品DNA提取、样本处理、PCR扩增和结果分析，所述样本处理的步骤包括杂交和消化，所述杂交为首先将提取的样品DNA与杂交链混合得到杂交混合物，所述杂交链为3'末端被封闭的核苷酸单链，所述3'末端被封闭的核苷酸单链的序列根据野生型序列设计和合成且包含突变位点，所述突变位点为所述野生型序列与所述野生型序列的突变型序列相比对碱基不一致的位置，然后将所述杂交混合物于高温变性使所述样品DNA从双链DNA解链为单链DNA，最后降温使所述杂交链与所述单链DNA中的所述野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与所述单链DNA中的所述突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA；所述消化为在所述杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶并使所述同源双链DNA降解，然后升温使所述双链特异性核酸酶失活，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶；所述PCR扩增的反应体系中的DNA模板为所述消化得到的产物；所述PCR扩增的反应体系中的引物不能与所述杂交链结合，所述引物的扩增片段包含所述突变位点。当然，所述3'末端被封闭的核苷酸单链可以为多种不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列包含不同的突变位点，所述引物的对数与所述核苷酸序列的种数相同且每一对引物对应扩增一个含突变位点的片段。因此，本发明方法可以富集一种突变型序列也可以同时富集多种突变型序列，即扩增一个扩增子或同时扩增多个扩增子。如果是富集一种突变型序列，那么只需要设计一种序列的3'末端被封闭的包含突变位点的核苷酸单链作为杂交链，和设计一对能扩增含该杂交链对应的突变位点的序列的引物，从而富集一种突变型序列；如果是同时富集多种突变型序列，由于每一种突变型序列不同，各自具有各自的突变位点，则每一种突变型序列均需要根据其突变位点对应设计一种序列的3'末端被封闭的包含该突变位点的核苷酸单链作为杂交链和一对能扩增含该突变位点的序列的引物，因此同时富集多种突变型序列时杂交链为多种不同的核苷酸序列的3'末端被封闭的核苷酸单链，引物也相应为多对，从而能够达到同时富集的目的。

优选地，所述反应体系中的DNA聚合酶为具有3'端到5'端核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，所述引物根据野生型序列设计和合成，所述引物中的正向引物或反向引物的3'末端被封闭且3'末端碱基在所述突变位点上。所述高保真聚合酶可以为Phusion^TMDNA聚合酶、KOD FX DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。在PCR扩增过程中，所述3'末端被封闭的正向引物或反向引物的3'端最后一个碱基会与突变型序列在突变位点发生错配，但体系中的高保真DNA聚合酶可以移除该错配碱基而使引物得以延伸，确保了突变型序列的准确、有效富集；此时即使模板中还存有野生型序列，由于其将与3'末端被封闭的正向引物或反向引物完全互补配对而不能被延伸。

优选地，所述引物的序列根据突变型序列设计和合成，所述引物的正向引物或反向引物包含所述突变位点。在PCR扩增过程中，所述含突变位点的引物能够与突变型序列完全互补配对结合从而稳定延伸；此时即使模板中还存有野生型序列，由于其与含突变位点的正向引物或反向引物在突变位点发生碱基错配从而降低延伸效率，使突变序列得以大幅扩增。

优选地，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶。

优选地，所述3'末端被封闭的方法为3'末端的核苷酸被去磷酸化、被氨基化或被巯基化。3'末端被封闭的核苷酸链不能直接被DNA聚合酶延伸。

优选地，所述引物扩增的序列的长度在200bp以内。

优选地，所述结果分析的方法为焦磷酸测序、Sanger测序或高分辨溶解曲线。

本发明方法基于PCR技术，但在PCR扩增以前对用作DNA模板的样品DNA进行处理，使3'末端被封闭的含突变位点的核苷酸单链作为杂交链与野生型和突变型序列杂交，双链特异性核酸酶能特异性地移除杂交链与野生型序列形成的完全互补配对的同源双链DNA，但不能移除杂交链与突变型序列形成的非完全互补的异源双链DNA，从而移除野生型序列。移除后的产物经PCR扩增，在PCR扩增过程中通过引入一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'-5'校读活性的聚合酶作用下，野生型序列与该引物完全互补而不能继续延伸，而突变型序列由于最后一个错配使错配碱基被切除而继续延伸，使突变型序列进一步得以富集，因此提高了富集灵敏度和准确度，同时本发明方法还可以同时富集多种突变型序列从而提高扩增效率。

附图说明

图1为本发明一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法的原理图；

图2为本发明方法富集突变含量为5％的样本序列与传统PCR扩增突变含量为5％的样本序列的焦磷酸测序检测结果比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

实施方式：

1、样品DNA提取

提取样品的DNA可以利用CTAB方法，当然也可以使用DNA提取试剂盒提取样品的DNA，提取步骤参考相应说明书。

2、样本处理

对提取的样品DNA按本发明方法进行样本处理，具体为：

①杂交：将样品DNA与杂交链混合为杂交混合物，并于高温(通常于94摄氏度以上至少2分钟)变性使样品DNA从双链DNA解链为单链DNA(如图1中的(a)步骤)，然后降温(通常降温至70摄氏度左右保持1-2分钟)使杂交链与已解链的单链DNA中的野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA。如图1所示的(b)步骤，在70摄氏度，3'末端被封闭的核苷酸单链与野生型序列单链杂交形成同源双链，与突变型序列单链杂交形成异源双链。

②消化：在上一步杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶(DSN)并使同源双链DNA降解(通常于67摄氏度左右保持20分钟可降解)，然后升温使双链特异性核酸酶失活(通常94摄氏度以上2分钟可使其失活)。如果2所示的(c)步骤，加入双链特异性核酸酶(DSN)后，DSN可以切割野生型序列单链但不能切割突变型序列单链。

3、PCR扩增

首先构建PCR反应体系，将主要的五种试剂即引物对(一条普通引物和一条3'末端位于突变位点上且被封闭的引物)、dNTP、高保真DNA聚合酶、模板DNA(为经本发明经样本处理的产物)和缓冲液(其中需要Mg²⁺)混合，然后于PCR仪上执行PCR程序，即进行预变性、变性、退火和延伸的步骤，其中变性、退火和延伸3步循环30次以上。如图1所示的(f)步骤，由于野生型序列与3'末端位于突变位点上且被封闭的引物完全互补而引物不能继续延伸，而与突变型序列最后一个碱基发生错配使错配碱基被移除而使引物继续延伸，使突变型序列进一步得以富集。

当然，由于移除了大部分的野生型序列，PCR反应体系中的引物对的2条引物为普通引物、DNA聚合酶为普通DNA聚合酶也是可以实现本发明低丰度基因突变富集的目的的。

4、结果分析

对PCR产物进行焦磷酸测序、Sanger测序、高分辨溶解曲线等进行分析，检测突变型基因片段的富集效果，具体分析方法可根据相关说明书进行操作。

实施例：低丰度突变样本(突变含量为5％)的富集及检测

为了验证本发明方法在实际样本中的可行性，采用了突变含量为5％的样本进行鉴定。本实施例中，对样本分别进行(1)本发明方法的经双链特异性核酸酶消化处理，随后用本发明中的引物进行PCR扩增和(2)不做任何处理，然后用普通引物进行PCR扩增。扩增后的产物用焦磷酸测序平台进行富集效果检测和比较。具体方法为：

1、样本准备

由生物技术公司构建野生型质粒和突变型质粒，两种质粒对应的突变位点为G>A。然后制备突变型质粒和野生型质粒的质粒混合物，其中突变型质粒占5％。

2、本发明样本处理及PCR扩增

(1)样本处理

①在已制备的突变含量为5％的质粒混合物中加入3'末端被封闭的核苷酸单链的杂交链得到样品混合物，杂交链的序列(突变位点处碱基用下划线标注)为：5'-GAAGGGCATGAGCTGCGTGATGAGCTGCACGG-PO₄-3'；

②将样品混合物放入PCR仪中进行反应使杂交，反应条件为：98℃变性2min，70℃杂交1min，随后降低温度至67℃；

③在杂交后的样品混合物中加入双链特异性核酸酶于67℃消化20min，然后升温至95℃2min使双链特异性核酸酶失活。

(2)PCR扩增

PCR反应体系：1×Phusion^TM高保真缓冲液，1μL上一步样本准备的产物(10⁷个拷贝/μL，作为模板)，引物F和R各0.2μM，5U/μL Phusion^TMDNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，以及四种dNTPs各200μM；

引物可以扩增含突变位点的序列，具体序列为：

F：5'-CCACCGTGCAGCTCATCAC-PO₄-3'，

R：5'-Biotin-TGTGTTCCCGGACATAGTCCA-3'，

其中反向引物的5'端生物素(Biotin)标记为引物合成公司在合成引物时完成，生物素标记以方便获得焦测序所需的PCR样本。

PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，55.3℃退火10s，72℃延伸20s，35个循环；72℃延伸1min；4℃保持；

3、传统的样本不做任何处理的PCR扩增

对制备的突变含量为5％的质粒混合物(突变位点G>A)不经任何处理，将其作为模板直接进行PCR扩增，扩增引物不变，具体反应体系和反应程序为：

PCR反应体系：1×Phusion^TM高保真缓冲液，1μL已制备的突变含量为5％的质粒混合物(10⁷个拷贝/μL)，引物F和R(同上)各0.2μM，5U/μL Phusion^TMDNA聚合酶，1.5mM MgCl₂，以及四种dNTPs各200μM；

PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，55.3℃退火10s，72℃延伸20s，扩增35个循环；72℃延伸1min；4℃保持。

4、结果检测

(1)焦测序样本预制备及测序

上述本发明方法(第2步)和传统方法(第3步)获得的PCR产物分别用5μL的链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液清洗两遍，弃上清。再加入5μL链霉亲和素包裹的磁珠和五倍体积的结合反应缓冲液在斡旋振荡仪上振荡使磁珠悬浮。在45μL的PCR产物中加入50μL结合反应缓冲液和磁珠的混合物，常温震荡混合15min，使生物素标记的PCR样本和链霉亲和素包裹的磁珠连接。利用真空样本制备系统将磁珠释放到96孔样本板，得到单链的待测序模板。然后，单链测序模板、测序引物(5'-CCGTGCAGCTCATCA-3')和结合反应缓冲液的混合物在加热板上80℃加热2min，使测序模板和测序引物进行结合，冷却至室温后进行焦测序。其中，测序引物采用商业化焦测序仪器自带的PSQ assay designsoftware设计。

在试剂仓中加入测序所需的各种试剂PyroMark Gold Q96 SQA Reagents(5×96))，将含有经磁珠固定的PCR样本的96孔板和试剂仓放入测序仪中，设定测序参数。此处，在A、G、C、T对应的试剂仓中分别加入dATPαS、dCTP、dGTP和dTTP进行合成测序反应。设置测序方式为G/C/T/G/C/T/A/G/C，开始测序。

(2)经样本处理和不处理的PCR产物的焦测序结果比较

图2为经两种方式处理的PCR产物的焦磷酸测序结果比较图。如图2的A图中，经本发明方法双链特异性核酸酶消化的样本经本发明3'末端位于突变位点上且被封闭的引物进行PCR扩增后的焦磷酸测序结果，突变位点处C和T的峰高分别约为60和20，检测到的突变含量约为25％。然而，如图2的B图中，样本经不做任何处理的、用传统引物的PCR扩增后的焦磷酸测序结果，突变位点处C和T的峰高分别约为73和3，检测到的突变含量约为4％。检测到的含量与实际含量有些许差异，这是由于检测时仪器本身误差所致。该结果说明，经过经双链特异性核酸酶消化和3'末端位于突变位点上且被封闭的引物进行PCR扩增后，野生型序列被有效移除，突变型序列得以有效富集。因此，本发明能特异性地移除样本中大量的野生型序列使突变型序列得以有效富集。该低丰度基因突变富集方法能有效用于微量甚至超微量突变样本的富集和检测。

需要说明的是，上述实验例中所涉及的实验操作，部分实验操作具有一定的通用性，因而未加详细描述，未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术，不再赘述。

Claims (7)

1.一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，包括样品DNA提取、样本处理、PCR扩增和结果分析，

所述样本处理的步骤包括杂交和消化；

所述杂交为首先将提取的样品DNA与杂交链混合得到杂交混合物，所述杂交链为3'末端被封闭的核苷酸单链，所述3'末端被封闭的核苷酸单链的序列根据野生型序列设计和合成且包含突变位点，所述突变位点为所述野生型序列与所述野生型序列的突变型序列相比对碱基不一致的位置，然后将所述杂交混合物于高温变性使所述样品DNA从双链DNA解链为单链DNA，最后降温使所述杂交链与所述单链DNA中的所述野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与所述单链DNA中的所述突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA；

所述消化为在所述杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶使所述同源双链DNA降解，然后升温使所述双链特异性核酸酶失活，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶；

所述PCR扩增的反应体系中的DNA模板为所述消化得到的产物；

所述PCR扩增的反应体系中的引物不能与所述杂交链结合，所述引物的扩增片段包含所述突变位点。

2.如权利要求1所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述3'末端被封闭的核苷酸单链为多种不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列包含不同的突变位点，所述引物的对数与所述核苷酸序列的种数相同且每一对引物对应扩增一个含突变位点的片段。

3.如权利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述反应体系中的DNA聚合酶为具有3'端到5'端核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，所述引物根据野生型序列设计和合成，所述引物中的正向引物或反向引物的3'末端被封闭且3'末端碱基在所述突变位点上。

4.如权利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述引物的序列根据所述突变型序列设计和合成，所述引物的正向引物或反向引物包含所述突变位点。

5.如权利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述3'末端被封闭的方法为3'末端的核苷酸被去磷酸化、被氨基化或被巯基化。

6.如权利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述引物扩增的序列的长度在200bp以内。

7.如权利要求1或2所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，所述结果分析的方法为焦磷酸测序、Sanger测序或高分辨溶解曲线。