CN111074354A - 一种低丰度dna突变测序文库的构建方法 - Google Patents

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CN111074354A CN202010017509.2A CN202010017509A CN111074354A CN 111074354 A CN111074354 A CN 111074354A CN 202010017509 A CN202010017509 A CN 202010017509A CN 111074354 A CN111074354 A CN 111074354A
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刘康雯
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Abstract

本发明提供了一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，所述方法采用3'末端封闭的核苷酸单链与待测基因组杂交，使与待测基因组中的野生型序列杂交形成完全互补配对的双链DNA，而与突变型序列形成在突变位点处不能互补的双链DNA，然后加入双链特异性核酸酶消化杂交形成的完全互补配对的双链DNA，从而选择性地富集含有DNA突变的序列；富集后的DNA序列两端连接测序接头，再采用基于梯度关键变性温度的PCR进行扩增，使含不同突变类型的序列在不同关键变性温度下有效扩增，得到能成为高通量测序技术可用的DNA文库。本发明方法构建的低丰度DNA突变测序文库，可提高NGS检测低丰度样本的准确度和灵敏度。

Description

一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法。
背景技术
人类基因组计划的完成推动了基因突变研究的快速发展。近年来，“精准医疗”计划的提出更进一步促使基因突变及其检测方法研究成为生物学研究和临床精准医疗的热点和基础。随着检测技术的不断发展，研究人员利用高灵敏度的技术发现基因突变(含量从0～100％)通常表现为低丰度(≤1％)，而且这些低丰度基因突变对临床决策和结果评估产生重要的影响。
高通量测序(Next-generation sequencing,NGS)技术的发展彻底改变了生物学和临床医学领域的研究。NGS技术不但能对全基因组、外显子组或目标基因组区域进行测序，而且NGS的检测灵敏度远高于Sanger测序技术。但是，由于测序背景噪声的存在、模板起始用量偏多、NGS的错误率偏高(0.1～1％)等因素的影响，难以辨别真正的体细胞突变与测序错误或者背景噪声，导致NGS对低丰度基因突变的检测限约为1～2％。尽管研究人员提出分子条形码和多重序列判读等方法以改善NGS鉴定低丰度DNA序列的准确性，但是这些方法均通过增加测序覆盖度来实现，不仅浪费时间而且还限制通量。因此，采用NGS检测丰度≤1％的突变仍然是一项挑战。本发明提供一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，该方法基于双链特异性核酸酶能有效消化完全互补DNA双链序列的特点，选择性地效富集低丰度DNA突变，富集之后的DNA双链加测序接头后再采用基于梯度的关键变性温度(CriticalTemperature,Tc)的PCR扩增，使基因组中所含的不同类型的DNA突变序列得以有效扩增，克服了NGS检测低丰度样本准确度低以及检测限低的困难。
发明内容
本发明提供一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，本发明方法构建的测序文库用于NGS测序可提高对低丰度基因突变检测的准确率和灵敏度。
本发明提供一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，包括3'末端封闭的核苷酸单链与待测基因组杂交，所述3'末端封闭的核苷酸单链能与待测基因组中的野生型序列杂交形成完全互补配对的双链DNA，与所述野生型序列的突变型序列杂交形成在突变位点处不能互补配对的双链DNA；使用双链特异性核酸酶消化所述完全互补配对的双链DNA；对消化后的产物连接测序接头；对连接测序接头后的产物进行基于梯度关键变性温度的PCR扩增即得到测序文库，包括将所述连接测序接头后的产物平均分成8份或11份平行反应，每份平行反应按不同的起始关键变性温度变性，然后在起始关键变性温度的基础上按照步长0.2℃或者0.3℃升高变性直至温度梯度覆盖范围为2℃。3'末端封闭的核苷酸单链的序列是根据野生型序列设计和合成，因此当3'末端封闭的核苷酸单链与待测基因组杂交时，其可以与待测基因组中的野生型序列形成完全互补的双链DNA，但与突变型序列则形成在突变位点错配的非完全互补的双链DNA，然后加入双链特异性核酸酶消化完全互补的双链DNA，从而使待测基因组中的突变型DNA序列得以富集。另外，任何一条DNA序列都有一个低于其Tm的关键变性温度Tc，其通常比其Tm低2℃，仅有一个碱基差异的双链DNA，其关键变性温度Tc值也会不同，扩增效率也会有所不同，因此由于关键变性温度Tc值的微小变化(例如±0.2或者±0.3℃)可能使获得满意的突变富集变得困难。由于每条序列理论上所需的关键变性温度Tc值各不相同，因此不能采用单个热循环程序同时扩增含有多种突变类型的序列。在这种情况下，需要在测序之前采用现有的PCR热循环仪或新兴的高通量PCR平台富集多个序列中的突变。因此，本发明方法将富集之后的DNA序列加测序接头，再进行基于梯度关键变性温度的PCR扩增，即将连接测序接头的产物平均分成8份或者11份平行反应，每份反应的起始关键变性温度不同，然后在起始关键变性温度的基础上按步长0.2℃或者0.3℃升高变性，最终温度梯度的覆盖范围为2℃，于是落在相应关键变性温度范围内的扩增子中所包含的突变能够有效富集，而其余扩增子在扩增过程中不能扩增或不能富集突变，从而使基因组中各种类型的DNA突变序列得以有效扩增得到测序文库。
优选地，所述待测基因组可以通过CTAB方法或使用DNA提取试剂盒对样品进行基因组DNA提取而获得。
优选地，在所述3'末端封闭的核苷酸单链与待测基因组杂交前先对所述待测基因组进行多重PCR扩增，以获取更多的目标序列。
优选地，所述3'末端封闭的核苷酸单链的长度为19-26bp，Tm范围为62-67℃，所述3'末端封闭的封闭方式为3'-ddNTP、3'-Pi或3'-NH2。
优选地，所述双链特异性核酸酶为一种热稳定核酸酶，能够特异性地消化完全互补的双链DNA，对非完全互补DNA双链的移除速率低于完全互补的DNA双链的移除速率，从而使待测基因组中的突变型DNA序列得以富集。
优选地，所述测序接头为Illumina或Ion Torrent平台的测序接头。
优选地，所述起始关键变性温度通常设置为比引物Tm低2℃。
本发明提供一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，该方法基于双链特异性核酸酶能有效消化完全互补DNA双链序列的特点，选择性地效富集低丰度DNA突变序列，并在富集之后的DNA双链两端加上测序接头后，再采用梯度关键变性温度变性，可以使基因组中不同类型的DNA突变序列得以有效扩增。
本发明方法在PCR过程中采用梯度关键变性温度方法扩增，能有效解决含不同突变类型的各序列不能同时扩增的问题，因此适用于多个PCR扩增子的同时富集；本发明方法的最大优点是将低丰度突变序列首先进行富集，然后再采用梯度关键变性温度进行扩增，避免低丰度样本在NGS文库制备过程中上机样本量不足的问题；本发明方法对微量甚至超微量样本具有较好的富集效果，可以用于微量样本以及微量样本中突变序列的高通量测序文库制备。
附图说明
图1为本发明低丰度DNA突变测序文库的构建方法的原理图；
图2为双链特异性核酸酶富集突变型序列的原理图；
图3为突变含量为5％的样本经本发明文库制备方法和传统文库制备方法后获得的PCR产物的凝胶电泳检测结果比较图。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。
本实施方式包括如下步骤：
(1)样品DNA提取
提取样品的DNA可以利用CTAB方法，也可以使用DNA提取试剂盒，提取步骤参考相应说明书。
(2)3'末端封闭的核苷酸单链的设计和合成
根据野生型序列和其突变位点设计和合成3'末端封闭的核苷酸单链，使单链包含该突变位点，且单链与野生型序列能完全互补。3'末端封闭的核苷酸单链可以为多种不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列包含不同的突变位点，以便同时富集不同类型的突变型DNA。3'末端封闭可以通过将3'末端碱基去磷酸化、氨基化或巯基化使其不能被聚合酶延伸。
(3)多重PCR扩增
如图1(a)步骤，使获得位于不同区域的目标序列。具体方法为：
根据PCR技术原理配置PCR反应体系，该体系包括提取的样品DNA、DNA聚合酶、引物、四种dNTP和Mg2+。
特别地，多重PCR扩增反应液包括：1×PhusionTM高保真缓冲液，每种dNTPs0.2mM，1.5mM MgCl2，0.05U/μL PhusionTMDNA聚合酶，多对特异引物，且每条引物的浓度为0.1μM，3ng基因组DNA。
对多重PCR扩增反应液进行PCR扩增，步骤为：
1)预变性，使PCR反应体系在94℃以上如98℃保持2min以上如2min，使模板DNA从双链DNA充分解链为单链；
2)变性，通常是94℃以上如98℃保持10s钟以上如15s，作用仍起到使双链DNA(包括野生型Wild-type和突变型Mutant-type序列)解链；
3)延伸，使温度保持在Ta℃2min以上如4min，在该温度下DNA聚合酶使引物序列延伸；
4)循环2)-3)步，通常循环次数为13-18，使获取更多的目标序列；
5)4℃保存。
(4)富集突变型DNA序列
如图1(b)步骤，使突变型序列得以富集。具体方法为：
将步骤(1)得到的3'末端封闭的核苷酸单链与步骤(2)得到的多重PCR扩增产物放入PCR仪中进行反应。
反应步骤为：
1)预变性，在94℃以上如98℃保持2min以上如2min，如图2(a)步骤所示使反应体系中的双链DNA充分解链为单链DNA；
2)杂交，温度迅速降低到70℃左右并保持1min左右，如图2(b)步骤加入3'末端封闭的核苷酸单链，使3'末端封闭的核苷酸单链与变性后得到的DNA单链充分配对结合，包括与野生型序列的相应片段形成完全互补配对的双链DNA，与野生型序列的突变型序列形成在突变位点错配的非完全互补配对的双链DNA；
3)消化，温度迅速降低到67℃左右，如图2(c)步骤加入双链特异性核酸酶(DSN)消化20min左右，使完全互补配对的双链DNA得以移除从而使突变型DNA序列得以保存而富集如图2(d)步骤所示，然后升温至94℃以上并保持2min以上，例如2min使双链特异性核酸酶失活。
4)4℃保存。
(5)测序接头连接
如图1(c)步骤，在突变富集后的产物两端加上测序接头。具体方法为：将上述步骤(4)得到的突变型序列富集产物与Illumina高保真聚合酶混合物混合，特别地，为将10μL所述突变型序列富集产物与测序接头各400nM和40μL 1×Q5 Hot Start高保真聚合酶混合物混合，然后放入PCR仪中进行反应。特别地，反应方法为：95℃预变性3min：扩增18～35个循环：98℃变性10s，随后从80℃以每秒0.2℃的速率降温至72℃，再从72℃以每秒0.2℃的速率升温到76℃，最后76℃延伸30s。然后对扩增后的产物进行纯化，可采用DNA纯化试剂盒根据说明书进行纯化，然后用TE缓冲液溶解(pH 8.0)纯化产物。纯化产物可以用文库片段分析仪进行评估，以保证合适文库构建的文库片段长度。
(6)基于梯度关键变性温度的PCR扩增
如图1(d)步骤，进行基于梯度关键变性温度的PCR扩增获得测序文库。具体方法为：测序接头连接后，将产物等分成8或者11份平行反应，并分别加入1×PhusionTM高保真缓冲液、引物0.2μM、5U/μL PhusionTMDNA聚合酶、1.5mM MgCl2以及四种dNTPs各200μM，使每份作为一个独立的PCR反应。在聚合酶的作用下，采用不同的梯度Tc值对8或者11份平行反应进行PCR扩增，即8份或者11份平行反应的起始关键变性温度值不同，通常设置为比引物Tm值低约2℃，然后在起始关键变性温度值的基础上按步长0.2℃或0.3℃升高，最终温度梯度覆盖范围为约2℃。以等分成11份平行反应、步长为0.2℃为例，对基于梯度关键变性温度的PCR扩增进行具体说明：11份平行反应从第1到第11份对应采用如表1的Tc1至Tc11起始关键变性温度(即第1份采用Tc1，第2份采用Tc2，第3份采用Tc3，以此类推)变性，然后关键变性温度按步长0.2℃升高而进行PCR扩增，且每一份的温度梯度覆盖范围为2℃。
表1.梯度关键变性温度
Figure BDA0002359460350000071
具体的反应程序以第1份平行反应采用起始关键变性温度Tc1为例进行说明：反应程序包括下面从第1到第12阶段：
第1阶段：扩增8个循环：98℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第2阶段：扩增8个循环：Tc1变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第3阶段：扩增8个循环：Tc1+0.2℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第4阶段：扩增8个循环：Tc1+0.4℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第5阶段：扩增8个循环：Tc1+0.6℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第6阶段：扩增8个循环：Tc1+0.8℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第7阶段：扩增8个循环：Tc1+1.0℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第8阶段：扩增8个循环：Tc1+1.2℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第9阶段：扩增8个循环：Tc1+1.4℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第10阶段：扩增8个循环：Tc1+1.6℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s；
第11阶段：扩增8个循环：Tc1+1.8℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s。
第12阶段：扩增8个循环：Tc1+2.0℃变性10s，Ta退火20s，72℃延伸10s。
上述第1-12阶段中的Ta是退火温度，其温度值通常比引物Tm低5℃以内进行设计，Tc1的设置通常比引物Tm低2℃。均分的其余10份参照上述第1-12阶段反应程序对应采用起始关键变性温度Tc2-Tc11进行梯度PCR扩增，即起始关键变性温度Tc1做相应修改即可。
最后将上述11份PCR扩增产物进行混合，即可得到含不同关键变性温度Tc的各条目标样本，从而构建好文库，可直接用于NGS测序如图1(e)所示。
当然，也可以将测序接头连接后的产物平均分成8份，步长设定为0.2℃或0.3℃，温度梯度覆盖范围在2℃左右均可。
实施例：低丰度突变样本(突变含量为5％)的测序文库制备
1、本发明文库构建步骤为：
(1)基因组DNA提取
首先，从冷冻黑素瘤组织以及来自正常组织中采用DNeasyTMBlood&Tissue Kit(Qiagen)试剂盒提取基因组DNA，并预先评估黑素瘤样本的突变含量、类型等信息。提取后的基因组DNA保存在-20℃待用。
(2)低丰度突变样本准备
将1个预先评估过的黑素瘤样品稀释到人类野生型基因组DNA中，以产生突变体DNA丰度为5％样本。
(3)多重PCR扩增
取基因组DNA进行多重PCR扩增，以便同时分析多条目的片段。(a)多重PCR扩增反应液包括：1×PhusionTM高保真缓冲液，每种dNTPs 0.2mM，1.5mM MgCl2，0.05U/μLPhusionTMDNA聚合酶，0.1μM各引物对，3ng基因组DNA；多重PCR扩增所需引物如表2所示。(b)扩增条件：98℃预变性2min，扩增13-18个循环：98℃变性15s，Ta℃延伸4min；
表2.本发明所用多重PCR扩增引物
Figure BDA0002359460350000091
(4)突变型序列富集
将5％突变样本和25nM一系列根据KRAS、BRAF、TP53和EGFR四个目标区域的序列设计的3'末端封闭的核苷酸单链(序列见表3)放入PCR仪中进行反应。反应条件为：98℃变性2min，70℃杂交1min，随后降低温度至～67℃，并在反应体系中加入双链特异性核酸酶消化20min，升温至95℃ 2min使双链特异性核酸酶失活。经双链特异性核酸酶消化后的样本纯化后用于测序引物接头连接。
表3. 3'末端封闭的核苷酸单链
Figure BDA0002359460350000101
(5)测序接头连接
将以下混合液进行PCR扩增，以连接Illumina接头。(a)混合液包括：40μL 1×Q5Hot Start高保真聚合酶混合物、Illumina接头各400nM和10μL突变型序列富集产物；(b)PCR扩增反应的条件为：95℃预变性3min：扩增18～35个循环：98℃变性10s，随后从80℃以每秒0.2℃的速率降至72℃，再以每秒0.2℃的速率升温到76℃，最后76℃延伸30s；取扩增后的产物纯化，用TE缓冲液溶解(pH 8.0)。将制备好的文库用文库片段分析仪进行评估，以保证合适的文库片段长度；
(6)基于梯度关键变性温度的PCR扩增
测序接头连接后，将产物等分成11份平行反应，每份作为一个独立的PCR反应。在聚合酶的作用下，采用11个不同的起始关键变性温度Tc1-Tc11(如表4)对11份平行反应进行PCR扩增，即每份平行反应采用其中一个但不重复的起始关键变性温度，然后在各自的起始关键变性温度的基础上按照步长0.2℃增加进行变性且温度梯度覆盖范围为约2℃。
表4.本实施例梯度关键变性温度
Figure BDA0002359460350000111
在相同的反应试剂下，对已制备的样本进行本发明的扩增方式：
(a)反应试剂：1×PhusionTM高保真缓冲液，1μL已制备的混合液，引物0.2μM，25nM3’末端封闭的核苷酸单链，5U/μL PhusionTMDNA聚合酶，1.5mM MgCl2，以及四种dNTPs各200μM；
(b)反应程序：以均分的其中1份平行反应采用表4中的起始关键变性温度Tc1＝82.6℃且步长为0.2℃进行的PCR扩增为例，其反应程序包括如下第1至12阶段：
第1阶段：扩增8个循环：98℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第2阶段：扩增8个循环：82.8℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第3阶段：扩增8个循环：82.8+0.2℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第4阶段：扩增8个循环：82.8+0.4℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第5阶段：扩增8个循环：82.8+0.6℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第6阶段：扩增8个循环：82.8+0.8℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第7阶段：扩增8个循环：82.8+1.0℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第8阶段：扩增8个循环：82.8+1.2℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第9阶段：扩增8个循环：82.8+1.4℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第10阶段：扩增8个循环：82.8+1.6℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s；
第11阶段：扩增8个循环：82.8+1.8℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s。
第12阶段：扩增8个循环：82.8+2℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s。
均分的其余10份参照上述第1-12阶段反应程序分别采用表4中起始关键变性温度Tc2-Tc11，步长为0.2℃进行梯度PCR扩增。当然，每一份采用的起始关键变性温度均不相同。最后将11个扩增产物混合，即可得到含不同关键变性温度的各条目标样本得到测序文库。
2、传统方法构建测序文库
低丰度突变样本准备同上，传统方法测序文库构建参考文献：Coren A.Milbury,et.al.,Clinical Chemistry 58:3,580–589(2012).构建好的文库用电泳进行检测。
3、本发明方法构建的文库和传统方法构建的文库的结果比较
将本发明方法构建的文库和传统方法构建的文库采用1.5％琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳，电泳结果如图3所示，泳道1位Maker，泳道2、3分别为本发明文库和传统文库PCR的电泳结果，可见本发明方法构建的文库的电泳条带亮度较传统方法所获得的电泳条带更亮，说明采用本发明中先富集再梯度Tc扩增的方式获得的文库中低丰度突变序列更丰富。因此，本发明方法构建的低丰度DNA突变文库能运用微量甚至超微量突变样本的NGS检测，提高检查灵敏度和准确度。
需要说明的是，上述实验例中所涉及的实验操作，部分实验操作具有一定的通用性，因而未加详细描述，未详细描述部分内容参考其它实验例中相关操作或参考现有技术，不再赘述。

Claims (5)

1.一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，其特征在于，包括3'末端封闭的核苷酸单链与待测基因组杂交，所述3'末端封闭的核苷酸单链能与待测基因组中的野生型序列杂交形成完全互补配对的双链DNA，与所述野生型序列的突变型序列杂交形成在突变位点处不能互补配对的双链DNA；使用双链特异性核酸酶消化所述完全互补配对的双链DNA实现突变型DNA序列的富集；对富集的突变型DNA连接测序接头；对连接测序接头后的产物进行基于梯度关键变性温度的PCR扩增，包括将所述连接测序接头后的产物平均分成8份或11份平行反应，每份平行反应按不同的起始关键变性温度变性，然后在起始关键变性温度的基础上按照步长0.2℃或者0.3℃升高变性，直至温度梯度覆盖范围为2℃，获得能成为高通量测序技术可用的DNA文库。
2.如权利要求1所述的一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，其特征在于，所述3'末端封闭的核苷酸单链的长度为19-26bp，Tm范围为62-67℃；所述3'末端封闭的封闭方式为3'-ddNTP、3'-Pi或3'-NH2。
3.如权利要求1所述的一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，其特征在于，所述双链特异性核酸酶为一种热稳定核酸酶，能够特异性地消化完全互补的双链DNA，对非完全互补DNA双链的移除速率低于完全互补的DNA双链的移除速率。
4.如权利要求1所述的一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，其特征在于，所述测序接头为Illumina或Ion Torrent平台测序接头。
5.如权利要求1所述的一种低丰度DNA突变测序文库的构建方法，其特征在于，所述起始关键变性温度设置为比引物Tm低2℃。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858401A (zh) * 2017-10-31 2018-03-30 重庆邮电大学 一种低丰度基因突变的富集方法
CN107893109A (zh) * 2017-11-08 2018-04-10 重庆邮电大学 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107858401A (zh) * 2017-10-31 2018-03-30 重庆邮电大学 一种低丰度基因突变的富集方法
CN107893109A (zh) * 2017-11-08 2018-04-10 重庆邮电大学 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN SONG等: "Elimination of unaltered DNA in mixed clinical samples via nuclease-assisted minor-allele enrichment", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
ELENA CASTELLANOS-RIZALDOS等: "Single-Tube, Highly Parallel Mutation Enrichmentin Cancer Gene Panels by Use of Temperature-Tolerant COLD-PCR", 《CLINICAL CHEMISTRY》 *

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