CN114774522A - 一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用,该方法为针对每个拟检测的目标碱基,先通过在DNA双链各设计一个特异性引物为配对引物,分别对相同类型的检测样本进行线性扩增检测,从而根据检测结果判断不易出现单链碱基错误的DNA链,再使用特异性引物对该DNA链进行靶向线性扩增,获得线性扩增产物后,在线性扩增产物的3’端通过单链连接酶加上单链接头获得连接产物,最后进行文库构建、测序和生信分析。从而可避免单链碱基错误所导致的假阳性,降低检测错误率,提高对稀有目标DNA分子突变检测的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,特别涉及一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用。
背景技术
下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)属于一种高通量DNA检测技术,可应用于传染病、恶性肿瘤、产前筛查等多个领域。NGS检测流程中,一般需要对目标DNA进行扩增或富集以确保目标DNA分子的数量和浓度达到可被NGS测序仪检出的程度;同时还需要在目标DNA分子的两端上加上测序序列才能在测序时被测序引物在测序载体上簇化扩增,进行高通量测序。这种对目标DNA扩增并加上测序序列使之能被NGS测序仪测序的过程称之为“文库构建”,简称“建库”。
近年来精准医学的发展对NGS检测性能要求日渐提高,不但要求可以准确无误的检出目标DNA序列,并且需要检出数量极为稀少的目标DNA分子中的罕见碱基变异(如外周血中的循环肿瘤DNA,ctDNA)。文献Phylogenetic ctDNA analysis depicts early stagelung cancer evolution(Nature 2017)指出,在肿瘤早中期患者的外周血中仅含有0.1%以下的ctDNA分子。这些极其稀有的ctDNA分子与外周血其他正常细胞代谢的循环游离DNA(cfDNA)分子极其相似,仅在个别位点上存在碱基变异。如何能有效识别稀有ctDNA分子的碱基变异,对NGS的建库技术的要求上除了提高建库效率之外,降低文库分子构建时产生的随机错误也显得尤为重要。
多重PCR扩增是目前主流的NGS建库方法之一,该方法通过多对靶向不同目标序列的双端特异性引物、DNA聚合酶和dNTP,通过对反应混合物的温度控制(变性、退火、延伸)可以对多个目标序列同时扩增;此外,特异性引物上带有测序序列使之可以适配后续的测序。但是由于PCR技术本身的缺陷,如聚合酶的保真性问题、指数扩增的错误积累问题等,极易在PCR扩增过程中造成随机的碱基错误,使构建的文库分子携带了原本不存在的碱基变异。
另一类建库方法采用先将碎片化的目标分子连接通用接头,构建成文库分子,再通过靶向捕获的方式靶向测序,或直接全基因组测序。这类建库方式在第一步构建文库分子的时候,在通用接头上添加了分子标签序列,使每个文库分子可以用不同的分子标签序列加以区分,后续对测序数据进行基于分子标签序列的去重处理就可以消除文库扩增和测序过程中产生的随机错误,提高建库与测序过程的保真性。
但是还有一种错误使分子标签序列也无法消除,这种错误来源于DNA分子在保存或提取过程中产生的错误。DNA分子易受到外界化学因素的影响导致DNA样本中碱基化学结构发生变化而产生变异(如胞嘧啶的脱氨基变成尿嘧啶)。这种变异往往仅发生在DNA模版的一条链上(单链碱基错误),但是一旦文库扩增后,这种错误就会散布到所有的文库扩增产物的两条链上,连分子标签也无法纠正,最终导致测序的假阳性结果。
因此,如何有效抑制建库过程的随机错误与DNA分子在保存/提取过程中产生的单链碱基错误,有效提高NGS测序结果的准确性,是基因检测技术领域亟需解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术中的不足之处,特别为了解决现有技术无法判断DNA分子在保存或提取过程中产生的单链碱基错误的问题。
为解决上述问题及实现其他相关的目的,本发明一方面提供一种判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法。
在上述判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法的基础上,本发明又发展了一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明采用单端的引物对正确的DNA链(不易出现单链碱基错误的DNA链)进行线性扩增并文库构建;从而避免单链碱基错误对文库构建的影响。
2.本发明中所述的不易出现单链碱基错误的DNA链的判断方式为:针对每个拟检测的目标碱基,先通过在DNA双链各设计一个特异性引物(配对引物)分别对相同类型的样本进行线性扩增检测,从而根据检测结果确定容易/不易出现单链碱基错误的DNA链(经过研究,我们发现容易出现单链碱基错误的DNA链多数是拟检测的目标碱基为C碱基且正好位于CpG岛的DNA链,因此在设计线性扩增引物时应避免选择这一DNA链)。
3.由于线性扩增每一轮都只以目标DNA为模板,可有效避免引入碱基错误的累积,从而降低检测的背景噪声。
4.步骤上,先进行线性扩增,再进行接头单链连接,从而减少因为连接酶效率低所引致的目标DNA分子漏检。
5.结合双端样本标签序列的方法进行测序,以降低样本标签序列的生产质量对稀有目标DNA分子检测的影响。
6.结合具有3'-5'外切酶功能的高保真DNA聚合酶进行线性扩增,以进一步提高文库分子的碱基准确性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细地描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明一方面提供一种判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法,包括如下步骤:针对每个拟检测的目标碱基,先通过在DNA双链各设计一个特异性引物为配对引物,分别对相同类型的检测样本进行线性扩增检测,从而根据检测结果判断不易出现单链碱基错误的DNA链。
本发明还提供一种判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法,可以代替上述方法或者与前述方法同时使用,即申请人根据多次的实验发现,所述的单链碱基错误多发生在胞嘧啶和腺嘌呤,表现为当拟检测的目标碱基变异,且变异为C到T的碱基变异和/或A到G的碱基变异时,尤其是当胞嘧啶正好位于CpG岛时,其所在的DNA链为易出现单链碱基错误的DNA链,另一DNA链为不易出现单链碱基错误的DNA链。为了降低单链碱基错误导致的背景噪声,在设计线性扩增引物时应避免选择易出现单链碱基错误的DNA链作为引物结合的模板。其中,由于检测位点,样本类型,样本保存方式,样本处理方式和DNA提取方式的不同,产生单链碱基错误的机率和类型会有不同。但本申请通过大量的实践后发现,在选择线性扩增的DNA链,判断不易出现单链碱基错误的DNA链时,上述规律理论上通用于所有类型的DNA,本领域技术人员可以初步按照此规律选择合适的DNA链进行线性扩增。
对于上文所述的技术方案中,进一步的,所述根据检测结果判断不易出现单链碱基错误的DNA链的方法为:通过比较配对引物的突变检出情况进行判断,配对引物同时检出/没检出的突变定义为真突变/真阴性,只有其中一链引物检出而另一链引物没检出的突变定义为单链碱基错误。
在上述判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法的基础上,本发明又发展了一种高保真测序文库构建的方法。该方法包括如下步骤:通过选择不易出现单链碱基错误的DNA链(正确的DNA链),再使用特异性引物对该DNA链进行靶向线性扩增,获得线性扩增产物,然后在线性扩增产物的3’端通过单链连接酶加上单链接头,获得连接产物后进行文库构建、测序和生信分析。该方法避免了单链碱基错误对文库构建的影响。此外线性扩增可有效避免引入碱基错误的累积,降低检测的背景噪声;步骤上,先进行线性扩增,再进行接头单链连接,从而减少因为连接酶效率低所引致的目标DNA分子漏检。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,优选的,所述特异性引物的3’端至少部分的序列与目标区域互补,与目标区域互补的序列的长度≥16nt;
和/或,所述特异性引物所述特异性引物的3’末端核苷酸含有封闭基团修饰,优选的,所述的封闭基团为C3 Spacer基团,取代了特异性引物的3’末端核苷酸的3位C原子羟基;
和/或,所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合;
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,优选的,所述的线性扩增步骤还包括:采用具有3'-5'外切酶功能的高保真DNA聚合酶进行线性扩增;和/或,还包括特异性引物和dNTP。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,优选的,所述特异性引物的核苷酸序列包括SEQ ID No.1~26所示的序列之中的一种或多种的组合。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,优选的,所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合;
和/或,所述单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构,优选的,单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团;
和/或,所述单链连接酶选自T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶;
和/或,所述单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代,优选的,所述的封闭基团为C3 Spacer基团;
和/或,所述单链接头在接头连接的反应温度下为单链结构。
和/或,所述单链连接酶选自T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶(虽然使用的是RNA酶,但是连接的是DNA分子)。
和/或,所述单链接头的5’端区域为具有黏性末端的部分双链结构;
和/或,所述单链接头的核苷酸序列包括SEQ ID NO.27~32之中的一种或多种所示的序列。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,进一步的,在进行测序分析前,还需要进行文库构建的步骤,但是这些步骤并非本专利的必要条件。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,还包括对所获得的连接产物进行预扩增,并纯化预扩增产物的步骤。所述的连接产物进行预扩增是为了提供预扩增产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件对连接产物进行预扩增,并纯化预扩增产物(例如,磁珠纯化等)。进一步优选的,所述预扩增的反应体系中可以包括预扩增引物、和/或DNA聚合酶、和/或dNTP,所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶。进一步优选的,所述的预扩增引物包括前引物和后引物,其中:前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合;预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,进一步的,所述的预扩增产物进行扩库是为了提供文库产物。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件将预扩增产物进行扩库,并纯化扩库产物(例如,磁珠纯化等)。进一步优选的,所述扩库体系的反应体系中可以包括扩库引物、和/或DNA聚合酶、和/或dNTP,所述DNA聚合酶优选为B族DNA聚合酶(所述的B族DNA聚合酶的主要用途是切除所述特异性引物的3’末端核苷酸含有的封闭基团),进一步优选的,所述的扩库引物包括前引物和后引物,其中,扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列,扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
通过上述方法可以得到结构如下的文库分子,适合进行测序,以提供测序结果。本领域技术人员通常可以根据后续所需进行的测序方法,选择合适的条件将扩库产物进行测序,例如,可以是各种二代测序技术。
5’——第一测序序列——第一样品标签序列——第一通用序列——目标区域序列——分子标签序列——第二通用序列——第二样本标签序列——第二测序序列——3’。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,进一步的,所述的第一测序序列可以是Illumina测序体系的P5;和/或第一/第二样本标签序列可以是Illumina测序体系的i5或i7;和/或第一/第二通用序列可以是Illumina测序体系的SP1或SP2;和/或第二测序序列可以是Illumina测序体系的P7。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,采用线性扩增对不易出现单链碱基错误的DNA链进行文库构建和测序过程中,还结合双端样本标签序列的方法进行测序。进一步的,所述的双端样本标签序列的方法进行测序的步骤包括前文所述的:在文库分子的5’和3’两端分别连有样本标签,5’端的第一样本标签在线性扩增时加入,3’端的第二样本标签在接头连接时加入。双端样本标签序列的方法可以降低样本标签序列的生产质量对稀有目标DNA分子检测的影响。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,采用线性扩增对不易出现单链碱基错误的DNA链进行文库构建和测序过程中,还利用分子标签序列进行去重分析,以去除扩库与测序步骤带来的碱基错误。所述的利用分子标签序列进行去重分析即将相同分子标签序列的类似reads进行归类,去除重复后得到扩库前文库分子的原始序列信息。利用分子标签序列进行去重分析可以进一步降低文库构建和测序过程中引入的碱基错误。
对于上文所述的高保真测序文库构建的方法中,优选的,所述进行线性扩增的次数可以为1-100轮,进一步优选1-60轮,再优选1-40轮,最优选2-20轮。
本发明另一方面提供一种高保真测序文库构建的方法中所需的特异性引物,其所述特异性引物的核苷酸序列包括SEQ ID No.1~26所示的序列之中的一种或多种的组合。
本发明另一方面提供一种高保真测序文库构建方法中所用的试剂盒,所述包括:特异性引物、DNA聚合酶、单链接头、单链连接酶,其中,所述特异性引物为靶向上文所述的不易出现单链碱基错误的DNA的链引物。
本发明另一方面提供一种高保真测序文库构建的方法的应用。该应用包括对任何DNA分子检测突变的检测。
下述内容列出本申请实施例中使用的样本选择及引物信息:
1.下述实施例1中使用的检测样本为:正常人唾液样本DNA和结直肠癌患者的经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)处理的肿瘤组织样本DNA(各6例)。样本使用Qubit定量后,将样本浓度定为20ng/μL。
2.本发明实施例中使用的引物序列详见表1,供应商均为上海生工。
表1.实施例1中使用的引物序列
所有引物的3’末端都有C3 Spacer封闭基团修饰。粗体的序列表示第一通用序列,非粗体的序列表示与目标区域互补的序列。
3.单链接头与预扩增引物序列
表2-1.单链接头引物序列
表2-2.预扩增引物序列
单链接头的5’末端核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团,而3’末端核苷酸有C3Spacer基团修饰。单链接头中粗体的序列表示分子标签序列,底横线的序列表示第二通用序列,非粗体/非底横线/非斜体的序列表示第二样本标签序列,斜体的序列表示第二测序序列。预扩增引物中粗体的序列表示第一测序序列,非粗体/非底横线的序列表示第一样本标签序列,底横线的序列表示与第一通用序列互补的序列。
表3.各实验对应的单链接头与预扩增引物
实验序号 | 样本 | 单链接头 | 预扩增引物 |
1 | 唾液1 | UA1 | i1 |
2 | 唾液2 | UA2 | i2 |
3 | 唾液3 | UA3 | i3 |
4 | 唾液4 | UA4 | i4 |
5 | 唾液5 | UA5 | i5 |
6 | 唾液6 | UA6 | i6 |
7 | FFPE1 | UA1 | i1 |
8 | FFPE2 | UA2 | i2 |
9 | FFPE3 | UA3 | i3 |
10 | FFPE4 | UA4 | i4 |
11 | FFPE5 | UA5 | i5 |
12 | FFPE6 | UA6 | i6 |
*不同引物组合(正链/负链)以及不同样本类型(唾液/FFPE)分别上机测序,所用的混样体系相同。
4其他引物和探针
表4其他引物和探针
*P5-AMP是用于扩库的引物,与第一测序序列互补;F4-SP1和P7-AMP是qPCR法体系中用到的引物,其中F4-SP1是与第一通用序列互补的引物,P7-AMP是与第二测序序列互补的引物;而MGB-iSP2-1是qPCR体系中用到的探针,与第二通用序列互补。5其他试剂如表5:
表5其他试剂
试剂名称 | 厂家 |
APO-Enchanted DNA聚合酶I | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
5×Apo Buffer | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
APO biotin-dNTP mix 1 | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Blocking Reagent | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
链霉亲和素磁珠 | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer A | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer B | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer C | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer D | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
ssDNA ligase | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
10×ligase buffer | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
MnCl<sub>2</sub> | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
5×SLA Buffer | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
SLA高保真DNA聚合酶 | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
dNTP(10mM) | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
NA-Beads | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer E | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Buffer F | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
Realtime PCR Master Mix | TOYOBO |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen |
QC校准品 | 上海羿鸣生物科技有限公司 |
*APO-Enchanted DNA聚合酶I是一种具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶,5×ApoBuffer是线性扩增体系的缓冲液,APO biotin-dNTP mix 1是部分偶联有生物素的dNTP混合液,Blocking Reagent是用于封闭链霉亲和素磁珠的试剂,链霉亲和素磁珠是用于纯化线性扩增产物的磁珠,Buffer A-D分别是用于纯化线性扩增产物的结合缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2和洗脱缓冲液,ssDNA ligase是一种单链连接酶,10×ligase buffer是接头连接体系的缓冲液,MnCl2是接头连接体系的组分,5×SLA Buffer是用于预扩增或扩库的缓冲液,SLA高保真DNA聚合酶是用于预扩增或扩库的DNA聚合酶,dNTP Mix是用于预扩增或扩库的dNTP混合液,NA-Beads是用于纯化预扩增产物或扩库产物的磁珠,Buffer E和F分别是用于预扩增产物或扩库产物的结合缓冲液和洗脱缓冲液,Realtime PCR MasterMix是用于qPCR的混合液,Qubit dsDNA HS Assay kit是用于样本定量的试剂盒,QC校准品是用于质控的样本。
6实验设备如表6:
表6实验设备
仪器名称 | 厂家 |
Veriti 96Well Thermal Cycler l | Thermo |
离心机 | Eppendorf |
掌上离心机 | 其林贝尔 |
磁力架12孔/96孔 | Thermo |
7300plus Real-time PCR system | Thermo |
纯水仪 | PALL |
实施例1:
对拟检测的目标碱基的DNA双链分别设计引物(13对),形成正链引物组合和负链引物组合,分别对正常人唾液样本和结直肠癌FFPE肿瘤组织样本(各6个独立样本)的DNA进行线性扩增、文库构建和测序,通过比较配对引物的突变检出情况进行判断(配对引物同时检出/没检出的突变定义为真突变/真阴性,只有其中一链引物检出而另一链引物没检出的突变定义为DNA单链错误),从而验证线性扩增发现DNA单链错误的可行性实验。
1、线性扩增
1.1线性扩增体系配制
表7.线性扩增体系
1)按照表6先将5×Apo Buffer、APO biotin-dNTP mix 1和Apo-Enchanted DNA聚合酶I配制成Mix溶液;
2)后续加入引物组合和样本,加水使每个样本的反应体积为20μL。
3)开启线性扩增程序。
4)磁珠法纯化目的产物。
1.2线性扩增条件设置
表8.线性扩增条件
1.3磁珠法纯化线性扩增产物。
2、接头连接反应
2.1接头连接体系配制
表9.连接体系
接头连接体系的单链接头(样本标签序列因样本而不同)单独加,根据样本数,配制好除单链接头之外的相应反应体系混合液,根据建库样本信息表(表3)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的单链接头。
2.2接头连接程序
表10.连接程序
循环数 | 温度(℃) | 时间(分钟) |
1(热盖105℃) | 60 | 60 |
1(热盖105℃) | 90 | 3 |
1 | 8 | / |
3、预扩增反应
3.1预扩增反应体系的配制:
表11.预扩增反应体系
组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH<sub>2</sub>O | 12.75 | / |
5×SLA Buffer | 10 | 1× |
dNTP Mix | 1 | 200μM |
P5-i_AMP1 | 1 | 100nM |
P7-AMP | 1 | 200nM |
SLA高保真DNA聚合酶 | 0.25 | 0.011U/μL |
总量 | 26 | |
混合液置于4℃ | 26μL/孔 | |
连接产物 | 24 | |
总量 | 50 |
3.1.1预扩增体系的前引物(样本标签序列因样本而不同)单独加,根据样本数,在1.5mL离心管内配制好除前引物之外的相应反应体系混合液,然后分装到8连管中,根据建库样本信息表(表3)在相应的反应孔中加入含对应样本标签序列的前引物。
3.1.2在对应的反应孔中加入24μL连接产物。后放到PCR仪中反应。
3.2预扩增反应体程序
表12.预扩增反应程序
3.3磁珠法纯化预扩增产物。
4、扩库
4.1扩库反应体系的配制:
4.1.1按照下表配制相应的反应混合液。分装到8联管内。
表13.反应体系
组份 | 浓度 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH<sub>2</sub>O | 2 | / | |
5×SLA buffer | 5× | 6 | 1× |
dNTP Mix | 10mM each | 0.6 | 200μM |
P5-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
P7-AMP | 10μM | 0.6 | 200nM |
SLA高保真DNA聚合酶 | 2U/μL | 0.15 | 0.011U/μL |
总量 | 10 | ||
混合液置于4℃ | 10μL/孔 | ||
纯化后的预扩增产物 | 20 | ||
总量 | 30 |
4.1.2往扩库反应管内加入相应的纯化后的预扩增产物。快速离心10秒,放到PCR仪中反应。
4.2扩库反应程序:
表14.扩库反应程序
4.3扩库后磁珠法纯化。
按照如下体系配置文库总量检测体系,用于上机测序前的文库混样评估:
表15
组份 | 体积(μL) | 终浓度 |
ddH<sub>2</sub>O | 6.6 | / |
2×Realtime PCR Master Mix | 10 | 1× |
F4-SP1(10μM) | 0.6 | 300nM |
P7-AMP(10μM) | 0.6 | 300nM |
MGB-iSP2-1(10μM) | 0.2 | 100nM |
纯化后的扩库产物/QC校准品 | 2 | / |
总量 | 20 |
检测程序:
表16
5、文库测序
采用Illumina的NovaSeq6000平台对文库进行150bp双端测序。通过生信分析得到突变检测结果。具体的生信分析流程包括:先以BWA进行比对分析,再以Samtools进行ontarget分析,再以Fgbio进行去重分析,最后以Varscan进行变异识别。
6、实验结果
6.1、配对引物线性扩增建库后的突变检测结果:
表17.突变检测结果
注:检测结果N表示配对引物的正负双链都为阴性,P表示配对引物的正负双链都为阳性(真突变),+表示配对引物的正链为阳性但负链为阴性(正链单链碱基错误),-表示配对引物的负链为阳性但正链为阴性(负链单链碱基错误),+/-都属于单链碱基错误的一种。右侧有“*”标记的突变为位于CpG岛的C碱基突变。refN指参考基因组(HG38)中的正链碱基,mutN指突变后的正链碱基。S1-6指唾液1-6样本,F1-6指FFPE1-6样本。
表18.不同样本和CpG岛发生突变/单链碱基错误的频率
真突变 | 负链单链碱基错误 | 正链单链碱基错误 | |
唾液 | 0 | 3 | 6 |
FFPE | 12 | 15 | 9 |
唾液/FFPE(CpG) | 0 | 16 | 6 |
由表17数据可知,通过配对引物检测可以判断检出的突变的不同分类:BRAF_V600E、KRAS_G12V和TP53_G244C的突变同时发生在正链和负链,可定义为“真突变”;EGFR_T790M、ERBB2_L785F、ERBB2_R784C、KRAS_G12D、TP53_G245S和TP53_R248Q的突变只发生在负链,可定义为“负链单链碱基错误”;ERBB2_G660D、ERBB2_V794M、ERBB2_V842I和TP53_R248W的突变只发生在正链,可定义为“正链单链碱基错误”;ERBB2_S656C、KRAS_G13S、TP53_C238R、TP53_E258G、TP53_P250L和TP53_P250S的位点未有检出任何突变,可定义为“真阴性”;ERBB2_V777M和TP53_G245D的突变有时发生在正链,有时发生在负链,可定义为“非单链碱基错误”。通过线性扩增可以准确判断DNA的单链碱基错误。而通过配对引物检测可以找出拟检测的目标碱基中容易出现碱基错误的DNA链,例如EGFR_T790M突变容易在负链发生单链碱基错误、ERBB2_G660D突变容易在正链发生单链碱基错误,有助筛选合适的引物从而避免碱基错误所致的假阳性结果。
另外,由表18数据可知,实验也发现大部分的单链碱基错误都发生在CpG岛的C碱基(表17中以*号标记的突变):唾液/FFPE样本中67%(22/33)的单链碱基错误发生在CpG岛的C碱基。可见CpG岛的C碱基更容易发生单链碱基错误,因此也可以通过避免在拟检测的目标碱基位于CpG位点的DNA链设计引物来避免单链碱基错误所致的假阳性结果。
由表18数据可知,不同类型的样本发生单链碱基错误的概率有所不同,FFPE样本中的DNA样本与唾液样本中的DNA相比,出现单链碱基错误的机率更高。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 上海羿鸣生物科技有限公司
<120> 一种高保真测序文库构建的方法、试剂盒及应用
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagctgtgtt atctcctagg ttggctctg 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggctcagg acttagcaag aagttatgg 59
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggcctgc tgaaaatgac tgaatataaa 60
cttgtg 66
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcccttgg cttgcggact ctgtagg 57
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgacgcc caggctcagg acccccag 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccccaag accacgacca gcagaatg 58
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
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<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaccagca cgttccgagc ggccaagtcc 60
<210> 9
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagctccttt ataagcttct tcagtatatg 60
tcaatgaaaa c 71
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgccagg gaccttacct tatacaccgt 60
gc 62
<210> 11
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcacatcg aggatttcct tgttggcttt 60
cggag 65
<210> 12
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggccaata ttgtctttgt gttcccggac 60
atagtccag 69
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
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tg 62
<210> 14
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagtcttc cagtgtgatg atggtgagga 60
tg 62
<210> 15
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagttgcaga aaacagatct gtatttattt 60
cagtgttact tac 73
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
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taaaacaag 69
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
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<210> 18
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
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agg 63
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccctctc agcgtaccct tgtcccc 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaggccct cccagaaggt ctacatgg 58
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<212> DNA
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<400> 22
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtggatat tgcagcagtc agagccctta 60
ac 62
<210> 23
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagacaccca gtggagaagc tcccaacc 58
<210> 24
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccagtta acgtcttcct tctctctctg 60
tcatag 66
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctgctg ggcatctgcc tcacctccac 60
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggatccag acaactgttc aaactgatgg 60
g 61
<210> 27
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 27
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagacc gagtaatatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 28
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 28
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagact ctccggaatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 29
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 29
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagaca atgagcgatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 30
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 30
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagacg gaatctcatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 31
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 31
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagact tctgaatatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 32
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 32
gnntgnntgn ntgnnctgtc tcttatacac atctccgagc ccacgagaca cgaattcatc 60
tcgtatgccg tcttctgctt g 81
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 33
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggctatatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 34
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 34
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cctctattcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 35
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 35
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ggataggtcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 36
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 36
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tatgcgatcg tcggcagcgt cagatg 56
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ttcgccttcg tcggcagcgt cagatg 56
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<212> DNA
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact aagattatcg tcggcagcgt cagatg 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 39
aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29
<210> 40
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<400> 40
tcgtcggcag cgtcagatg 19
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 41
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 42
tctcgtgggc tcggaga 17
Claims (10)
1.一种判断目标DNA中不易出现单链碱基错误的DNA链的方法,其特征在于,针对每个拟检测的目标碱基,先对DNA双链各设计一个特异性引物为配对引物,分别对相同类型的检测样本进行线性扩增检测,从而根据检测结果判断不易出现单链碱基错误的DNA链;
和/或,当拟检测的目标碱基发生变异,且变异为C到T的碱基变异和/或A到G的碱基变异时,其所在的DNA链为易出现单链碱基错误的DNA链,另一DNA链为不易出现单链碱基错误的DNA链;优选的,所述C到T的碱基变异位于CpG岛。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述单链碱基错误是,通过比较配对引物的突变检出情况进行判断:配对引物同时检出的突变定义为真突变,配对引物同时没检出的突变定义为真阴性,只有其中一链引物检出而另一链引物没检出的突变定义为单链碱基错误。
3.一种高保真测序文库构建的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:先按权利要求1和/或2所述的方法判断不易出现单链碱基错误的DNA链,再对不易出现单链碱基错误的DNA链使用特异性引物进行线性扩增,获得线性扩增产物,然后在线性扩增产物的3’端通过单链连接酶加上单链接头,获得连接产物后进行文库构建、测序和生信分析。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述特异性引物的3’端至少有部分的序列与目标区域互补,优选的,与目标区域互补的序列的长度≥16nt;
和/或,所述特异性引物的3’末端核苷酸含有封闭基团修饰,优选的,所述的封闭基团为C3 Spacer基团,取代了特异性引物的3’末端核苷酸的3位C原子羟基;
和/或,所述特异性引物还包括第一通用序列、第一样本标签序列、第一测序序列中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的线性扩增步骤还包括:采用具有3'-5'外切酶功能的高保真DNA聚合酶进行线性扩增;和/或,还包括特异性引物和dNTP。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述单链接头包括第二测序序列、第二样本标签序列、第二通用序列、分子标签序列中的一种或多种的组合;
和/或,所述单链接头的5’末端的核苷酸被修饰、且在接头连接的反应温度下为单链结构,优选的,单链接头的5’末端的核苷酸的5位C原子连接有磷酸基团或腺苷基团;
和/或,所述单链连接酶选自T4 RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶;
和/或,所述单链接头的3’末端的核苷酸的3位C原子羟基被封闭基团取代,优选的,所述的封闭基团为C3 Spacer基团;
和/或,所述单链接头的5’端区域为具有黏性末端的部分双链结构。
7.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的文库构建包括对所获得的连接产物进行预扩增,及对预扩增产物进行扩库的步骤;
优选的,所述的预扩增的反应体系中包括预扩增引物、和/或DNA聚合酶、和/或dNTP,更优选的DNA聚合酶为B族DNA聚合酶;
优选的,所述的预扩增引物包括前引物和后引物,其中:前引物包括与第一通用序列互补的序列、与第一样本标签序列互补的序列、与第一测序序列互补的序列中的一种或多种的组合;预扩增引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列;
优选的,所述扩库的反应体系中包括扩库引物、和/或DNA聚合酶、和/或dNTP,优选的DNA聚合酶为B族DNA聚合酶。
优选的,所述的扩库引物包括前引物和后引物,其中,扩库引物的前引物包括与第一测序序列互补的序列,扩库引物的后引物包括与第二测序序列互补的序列。
8.权利要求1或3所述方法中所需的特异性引物,其特征在于,所述特异性引物的核苷酸序列包括SEQ ID No.1~26所示的序列之中的一种或多种的组合。
9.一种高保真测序文库构建方法中所用的试剂盒,所述试剂盒包括:特异性引物、DNA聚合酶、单链接头、单链连接酶,其中,所述特异性引物为靶向如权利要求1所述的不易出现单链碱基错误的DNA的链引物。
10.如权9所述的试剂盒在一种高保真测序文库构建的应用,该应用包括根据权利要求4所述方法对任何DNA分子检测突变的检测。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116200478A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-06-02 | 安徽安龙基因科技有限公司 | 一种基于单链连接的捕获建库方法和应用 |
-
2021
- 2021-01-22 CN CN202110089575.5A patent/CN114774522A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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