CN113073133A - 放大微量dna并用于多种核酸检测的方法及核酸检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种连接扩增放大微量DNA并用于下游多种核酸检测的方法，包括：提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；使用所述第三产物进行下游核酸检测。此外，本发明还提供一种核酸检测装置。本发明提供技术方案，实现将微量DNA扩增至几百纳克甚至微克级别以满足下游核酸检测，确保在进一步核酸检测中能够有足量的DNA投入，提升核酸检测的准确性；并且操作简单，无需用到特殊的酶和原材料即可实施，有效降低了实施的总体成本。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因测序核酸检测技术领域,具体涉及一种放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法及核酸检测装置。
【背景技术】
目前的核酸检测技术主要是基于DNA PCR扩增技术。PCR扩增技术是聚合酶链式反应技术的英文缩写，即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应需要的模板DNA投入量从10ng-100ng起。但PCR反应由于需要特定的引物进行扩增，所产生的产物为定向产物，而非所有DNA模板统一扩增。并且DNA模板量低也会影响检测结果的准确性。
液态活检技术中一个重要的组成部分就是游离DNA的检测。游离DNA含量因人而异，但总体含量较低，一般10ml血液中含量在几纳克到几十纳克之间。检测游离DNA主要方法有下一代测序(Next-generation Sequencing，NGS)测序，微滴式数字PCR(DropletDigital PCR,ddPCR)，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time，PCR)，以及基于飞行质谱处理等。NGS测序的优势是通量高、检测灵敏，但检测时间周期长且价格高，并且需要专业的生物信息分析。ddPCR技术检测灵敏度高但通量较低。qPCR技术则检测方法简便但同样检测通量低。飞行质谱则是多重PCR+单碱基延伸+核酸飞行质谱检测。ddPCR，qPCR，PCR，以及基于飞行质谱技术对DNA的含量要求较高，也需要有一定的量的DNA才能满足其需要。更多的核酸检测方法如芯片检测、PCR检测等还难以应用到游离DNA这类微量DNA的检测。
现有微量DNA放大技术主要来源于单细胞测序。主要技术有：1.PEP，即引物延伸预扩增(Primer Extension Preamplification，PEP)，直接采用随机引物进行扩增，主要缺陷是产物量低，随机引物会引入到下一阶段导致检测结果产生偏差。2.DOP-PCR，即简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed，DOP)PCR，使用随机引物对所有DNA进行扩增后再特异性扩增，是在PEP的技术基础上改进一步。主要缺陷是当模板量低时，扩增会有偏向性。并且聚合酶和扩增引物需要进行优化。3.LM-PCR，即连接介导的PCR反应(Ligation-mediated Polymerase Chain Reaction，LM-PCR)，是针对打断的双链DNA进行接头连接，再使用接头相关引物进行扩增的技术。主要缺陷是；操作复杂繁琐，步骤较多容易使模板DNA丢失。并且不能用于甲基化扩增。4.pWGA，即基于引物酶的全基因组扩增(Primer-based Whole Genomeamplification，pWGA)，通过使用噬菌体T7 gp4酶使双链DNA变性再通过多点的引物对基因组进行扩增。主要缺陷是成分复杂，引入多种酶和试剂，保真度较低。5.MDA，即多次位移放大扩增(Multiple Displancement Amplification，MDA)，引物与Phi29 DNA聚合酶协作扩增目的基因片段。主要缺陷是需要大量的模板，当模板量低时，产物扩增偏向性会较大。6.MALBAC，即多次退火环状循环扩增(Multiple Annealingand Looping-based Amplification Cycles，MALBAC)，一部分引物进行随机扩增，一部分引物形成环形产物以阻止过度扩增。主要缺陷是当模板量低时很容易产生偏向性，以及获得不到特异性产物。
目前的微量DNA放大技术基本都存在扩增偏向性、模板容易丢失等问题，并且还不能用于甲基化DNA检测。因此需要有一种可以迅速放大低量DNA的技术，并匹配下游多种核酸检测技术。
【发明内容】
本发明的目的在于解决因微量DNA不能用于常规核酸检测的难点，通过无偏差放大微量DNA并应用于下游核酸检测以及用于放大经亚硫酸盐转化/酶转化法处理得到的微量单链DNA并检测其甲基化状态。
为实现上述目的，本发明提供一种放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，所述放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法包括：
提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；
对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；
对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；
对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；
使用所述第三产物进行下游核酸检测；所述核酸检测包括测序、PCR、qPCR、ddPCR、飞行质谱处理、芯片检测和甲基化检测中的任意一种或多种。
进一步地，所述对所述单链DNA进行保守序列接头连接包括：
通过退火配对形成第一接头和第二接头；
将同一反应试管的所述单链DNA加入连接酶、第一接头以及等量的第二接头；
加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；
等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头。
进一步地，所述对所述单链DNA进行保守序列接头连接包括：
通过退火配对形成第一接头和第二接头；
在同一反应试管的所述单链DNA加入连接酶、第一接头以及连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应，得到反应完成后的第一接头连接混合物；
对所述第一接头连接混合物进行纯化后再加入连接酶、第二接头以及连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；
等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头。
进一步地，对所述第一接头连接混合物使用引物进行单链延伸形成双链DNA或者进行扩增形成单链产物，再对所述双链DNA进行连接或对所述单链产物进行连接。
进一步地，所述第一接头和第二接头浓度均为1μM-100μM，存储于-20℃冰箱。
进一步地，所述连接酶包括但不限于T4 DNA连接酶、T4 RNA ligase、CircLigase、Taq DNA Ligase、E.coli DNA Ligase和Ampligase中的任意一种或任意几种组合；所述连接酶的终浓度为0.1U/μL～100U/μL。
进一步地，所述扩增处理按照放大扩增反应及选择的扩增酶反应条件进行扩增，并引入匹配所述第一接头和第二接头的引物对。
进一步地，所述放大扩增反应包括聚合酶链式反应PCR方法或者等温扩增方法；所述扩增酶反应选择高保真酶，所述高保真酶选择无扩增偏向性的扩增酶。
进一步地，所述第三产物在进行核酸检测前还包括：
对所述第三产物进行纯化处理。
此外，本发明还提供一种核酸检测装置，所述核酸检测装置包括如上所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法。
本发明提供的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，通过在DNA样本两端添加保守序列接头，通过扩增保守序列接头对DNA样本进行扩增以获得足量DNA，同时，通过缩短扩增引物，进一步提高扩增效率，提高扩增产量，实现将微量DNA扩增至几百纳克甚至微克级别以满足下游核酸检测，确保在进一步核酸检测中能够有足量的DNA投入，提升核酸检测的准确性；并且本发明提供的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法操作简单，无需用到特殊的酶和原材料即可实施，有效降低了实施的总体成本。
【附图说明】
图1为本发明一实施例提供的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法的流程示意图；
图2为图1中一实施例的对所述DNA进行保守序列接头连接的流程示意图；
图3为本发明实施例一提供的gDNA放大产物经过8个循环PCR后的测序文库凝胶示意图；
图4为本发明实施例二提供的gDNA放大产物与10ng gDNA经过多重PCR 35个循环后的扩增产物凝胶示意图；
图5为本发明实施例三提供的针对3.1ng Unmethylated Lambda DNA(PromegaD1521)进行甲基化亚硫酸盐处理后放大，并将放大产物用于下游甲基化文库构建并分析的结果数据。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
请参阅图1，本发明提供一种放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，所述放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法包括：
步骤S10：提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；
步骤S20：对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；
步骤S30：对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；
步骤S40：对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；
步骤S50：使用所述第三产物进行下游核酸检测；所述第三产物即为经放大的DNA，实现将经放大的DNA用于下游多种核酸检测方法；具体地，所述核酸检测包括测序、PCR、qPCR、ddPCR、飞行质谱处理、芯片检测和甲基化检测中的任意一种或多种。
优选的，在本发明另一实施例中，对第三产物进行纯化后再进行核酸检测。
具体地，本发明提供的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法为一种连接扩增法，在DNA模板(即单链DNA)两端添加保守序列接头，通过扩增保守序列接头对DNA模板进行扩增以获得足量DNA，并用以进行下游核酸检测。
所采用的保守序列接头是指与现已知的所有生物基因组DNA都不匹配互补的DNA片段或是与需要检测的物种基因组不冲突不匹配的DNA序列。本发明中借鉴的是各测序平台使用的接头(adaptor)部分序列，但不仅限于各测序平台的接头序列。其他保守序列的引入也应在本发明保护范围之内。
较佳地，在本发明提供的另一实施例中，本发明提供的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法用于第一接头完成连接反应后使用引物经聚合酶进行单链延伸或者扩增获得模板互补链，再对形成的双链DNA进行连接抑或对形成的模板互补链进行第二接头的连接，并进行扩增。
其中使用到的所述聚合酶包括Klenow片段、T7 DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、DNA聚合酶I(E.coli)、TherminatorTM DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、phi29 DNA聚合酶、Bst2.0DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Deep VentR(exo–)DNA聚合酶、DeepVentRTM DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶大片段、Taq DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、DNA聚合酶、热启动Flex DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶、热启动超保真DNA聚合酶、超保真DNA聚合酶中一种或多种酶的组合。
具体地，提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；提供的DNA样本经过多聚核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase，PNK)37℃处理15分钟，再加热到95℃反应5分钟。反应完成的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。
请参阅图2，对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；具体地，步骤S20所述对所述单链DNA进行保守序列接头连接包括：
步骤S210：通过退火配对形成第一接头和第二接头；
步骤S220：将同一反应试管的所述单链DNA加入T4 DNA连接酶、T4 RNA ligase、CircLigase、Taq DNA Ligase、E.coli DNA Ligase、Ampligase等其中一种或多种组合、第一接头以及第二接头；
步骤S230：加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；
步骤S240：等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头。
具体在本发明一实施例中，所使用的保守序列接头借鉴的是illumina平台的接头adaptor，具体地接头序列如表1所示：
表1：
| 简称 | 序列(5’-3’) |
| A1-1 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN–# |
| A1-2 | P-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA |
| A2-1 | ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| A2-2 | NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT |
其中，N是随机碱基，N个数为2-25之间，N不参与A1-1/A1-2以及A2-1/A2-2退火配对。A1-2、A2-1序列也可以进行优化缩短，A1-2可适当减少3端碱基个数，A2-1可以缩短5端碱基个数，缩短的碱基数在0-25bp间。对应的A1-1及A2-2也缩短对应长度以与A1-2、A2-1固定碱基配对。“#”代表修饰，用于阻止A1-1进一步延伸或者连接，可以是SpacerC3，FAM，HEX，AMN等修饰中的一种或多种。
以上A1-1与A1-2退火配对，形成第一接头，记为A1接头。A2-1与A2-2退火配对，形成第二接头，记为A2接头。两种接头浓度均为1μM-100μM，存储于-20℃冰箱。
gDNA经机械打断或酶切打断至<5kb，cfDNA无需打断处理。若需要甲基化检测则DNA打断后经重亚硫酸盐处理或者转化酶处理。
将同一反应试管的所述单链DNA加入T4 DNA连接酶、第一接头以及等量的第二接头；加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；具体在本发明一实施例中，在同一反应管的DNA混合物中加入T4DNA连接酶(终浓度1U/μL～100U/μL)和A1接头以及等量A2接头(体系终浓度:0.05-50μM)，加入连接缓冲液，加水补足体积后于12-30℃反应10-120分钟，或者过夜反应(根据连接酶反应条件设定)。所用的缓冲液终浓度反应体系为：12-100mMTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，0.15-25mM MgCl2(氯化镁)，0.3-15mM DTT(二硫苏糖醇)，0.05-10mM ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)，(PH 5-9@25℃)，优选的加入1-60％PEG(聚乙二醇)。其中，mM＝mmol/L,毫摩尔每升；μM＝μmol/L,微摩尔每升；U/μL为酶活力单位每微升。
等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头，获得第一产物。
对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；具体地，在同一反应管中按照1：0.6-1：2.5比例加入AMPure XP(Beckman Coulter)磁珠或同等效果纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，95℃反应5分钟。反应完成的含磁珠的DNA混合物即为第二产物。将第二产物可直接进行PCR扩增或进一步去除磁珠后进行放大扩增。放大扩增的方法包括聚合酶链式反应(PCR)或者等温扩增方法。
对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；具体地，按照放大扩增反应体系及选择的扩增酶反应条件进行扩增，本环节中会引入匹配A1接头和A2接头的引物对。引物对长度可以根据A1接头/A2接头长度进行选择。引物3’端序列与接头序列互补部分应当完全匹配，优选的，引物应处于接头内部，短于接头序列；优选的引物浓度根据实验情况进行调整；优选的两个引物Tm值应相近，这里Tm值为熔解温度(Melting Temperature，Tm)。
扩增酶反应优选的选择高保真酶以确保低扩增错误率。优选的选择无扩增偏向性的扩增酶。若是检测甲基化DNA，则需要使用可以识别尿嘧啶并能针对含有尿嘧啶的DNA进行延伸扩增的聚合酶。按照扩增酶反应条件进行扩增，扩增完成的产物为第三产物，下一步，使用所述第三产物进行核酸检测。
所述第三产物在进行核酸检测前还包括：对所述第三产物进行纯化处理。具体地，将第三产物按照1：0.8-1：2.5比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，经纯化处理的第三产物可以进入下一步检测。
具体地，所述核酸检测包括测序、PCR、qPCR、ddPCR、飞行质谱处理、芯片检测和甲基化检测中的任意一种或多种。
实施例一
具体在本发明提供的实施例一中，针对10ng gDNA(NA12878细胞系DNA)进行甲基化放大并进行二代测序建库：
10ng gDNA经covaris S220超声波DNA剪切仪打断处理后，经亚硫酸盐处理后(ZymoTM EZ DNA Methylation-Gold Kits，Zymo D5005)，按照本发明完成接头连接并扩增处理后用于NGS建库检测。接头连接方法如前所述，21μL H2O溶解连接产物。
反应体系如表2所示：
表2：
| DNA | 21μL |
| KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix(KK2801) | 25μL |
| ShF | 2μL |
| ShR | 2μL |
| total | 50μL |
反应条件如表3所示：
表3：
所用引物序列如下：
ShF：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ShR：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
获得993.2ng放大产物(38ng/μL)即第三产物。
其中取38ng(1μL)作为测序模板DNA，通过加入引物IP56/IP734引入illumina完整接头以及测序用Index。
其中引物序列如下：
IP56:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
IP734:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
引物浓度浓度为10μM。
反应体系如表4所示：
表4：
| DNA | 1μL |
| H<sub>2</sub>O | 20μL |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix(KK2601) | 25μL |
| IP56 | 2μL |
| IP734 | 2μL |
| total | 50μL |
反应条件如表5所示：
表5：
扩增完成的产物按照1：1比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，26μL H2O溶解，获得1788.8ng文库(文库产物)。取5μL产物用于凝胶电泳检测。结果如图3所示，gDNA放大产物经过8个循环PCR后，通过IP56/IP734扩增加上了illumina完整接头序列，可以进行上机测序工作。10ng DNA经本发明放大到993.2ng。其中38ng放大产物作为模板继续放大到1788.8ng二代测序文库。由于文库扩增所用引物较长，文库产物片段要大于放大产物，符合预期。
实施例二
具体在本发明提供的实施例二中，针对10ng gDNA(NA12878细胞系DNA)放大产物用于下游PCR检测：
10ng gDNA按照本发明提供的连接扩增放大低量DNA方法进行接头连接并扩增处理后，将得到的第三产物用于多重PCR(mPCR检测)。接头连接方法如前所述，21μL H2O溶解连接产物。
KAPA HiFi HotStart Ready Mix(KK2601)体系扩增，15个循环，使用引物IP59/IP738。
反应体系如表6所示：
表6：
反应条件如表7所示：
表7：
所用引物序列如下：
IP59:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
IP738:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
扩增产物经纯化后，取30μL H2O溶解，获得1110ng放大产物(37ng/μL)。
取1μL产物作为模板进行多重PCR扩增。对照组采用10ng gDNA。
在本实施例中用到的引物及产物大小如表8所示：
表8：
反应体系如表9所示：
表9：
反应条件如表10所示：
表10：
扩增完成的第三产物取5ul用于凝胶检测，结果如图4所示，gDNA放大产物与10nggDNA经过多重PCR 35个循环后，经凝胶电泳检测均可以有效检出两个片段DNA；当同时检测KDR及NRAS两个基因片段时，经本发明放大的产物依然能够检测出两个基因片段，与10nggDNA扩增效果相当。
通过本连接扩增放大低量DNA方法可以完成30次或大于30次(根据放大产物质量及体积，理论上可以通过多次扩增或者增加放大反应PCR的循环数获得更多模板DNA)同类型实验。
实施例三
具体在本发明提供的实施例三中，针对3.1ng Unmethylated Lambda DNA(Promega D1521)进行甲基化亚硫酸盐处理后放大，并将放大产物用于下游甲基化文库构建并分析：
3.1ng Unmethylated Lambda DNA经covaris S220超声波DNA剪切仪经亚硫酸盐处理后(ZymoTM EZ DNA Methylation-Gold Kits，Zymo D5005)，按照本发明完成接头连接并经扩增处理后用于NGS建库检测。接头连接方法如前所述，21μL H2O溶解连接产物。
反应体系如表11所示：
表11：
反应条件如表12所示：
表12：
所用引物序列如下：
ShF：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ShR：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
获得1339.2ng放大产物。
其中取43.2ng放大产物作为测序模板DNA，通过加入引物IP56/IP734引入illumina完整接头以及测序用Index。
其中引物序列如下：
IP56:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
IP734:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
引物浓度浓度为10μM。
反应体系如表13所示：
表13：
| DNA | 1μL |
| H<sub>2</sub>O | 20μL |
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix(KK2601) | 25μL |
| IP56 | 2μL |
| IP734 | 2μL |
| total | 50μL |
反应条件如表14所示：
表14：
扩增完成的产物按照1：1比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，26μL H2O溶解，获得1857.6ng文库(文库产物)。将文库命名为OSL-18-I，进行测序及生物信息学分析。
请参阅图5，结果如图5所示：reads数为3,169,374条，碱基数为475,406,100，平均插入片段为110bp，覆盖深度中位数为250X。CpG，CHH，CHG含量均小于0.5％，说明转化效率大于99.5％。冗余度为19.4％，回帖率58.6％。GC含量为26％。
此外，本发明还提供一种核酸放大装置，所述核酸放大装置包括如上所述的连接扩增放大低量DNA方法。具体地，所述核酸检测装置包括自动化仪器、试剂盒或其他检测装置。
与现有技术相比，本发明提供的连接扩增放大低量DNA并将放大DNA用于下游多种检测的方法。通过在DNA样本两端添加保守序列接头，通过扩增保守序列接头对DNA样本进行扩增以获得足量DNA，同时，通过缩短扩增引物，进一步提高扩增效率，提高扩增产量，实现将微量DNA扩增至几百纳克甚至微克级别以满足下游核酸检测，确保在进一步核酸检测中能够有足量的DNA投入，提升核酸检测的准确性；并且本发明提供的连接扩增放大低量DNA方法操作简单，无需用到特殊的酶和原材料即可实施，有效降低了实施的总体成本。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种连接扩增放大微量DNA并用于下游多种核酸检测的方法，其特征在于，所述方法包括：
提供DNA样本变性形成单链DNA并经多聚核苷酸激酶处理得到修饰的单链DNA；
对所述单链DNA进行保守序列接头连接，以获得第一产物；
对所述第一产物进行纯化处理以得到第二产物；
对所述第二产物进行扩增处理以得到第三产物；
使用所述第三产物进行下游核酸检测；所述核酸检测包括测序、PCR、qPCR、ddPCR、飞行质谱处理、芯片检测和甲基化检测等核酸检测中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述对所述单链DNA进行保守序列接头连接包括：
通过退火配对形成第一接头和第二接头；
将同一反应试管的所述单链DNA加入连接酶、第一接头以及等量的第二接头；
加入连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；
等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头。
3.根据权利要求1所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述对所述单链DNA进行保守序列接头连接包括：
通过退火配对形成第一接头和第二接头；
在同一反应试管的所述单链DNA加入连接酶、第一接头以及连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应，得到反应完成后的第一接头连接混合物；
对所述第一接头连接混合物进行纯化后再加入连接酶、第二接头以及连接缓冲液，加水补足体积后进行连接酶反应；
等待所述连接酶反应完成，实现所述单链DNA连接第一接头和第二接头。
4.根据权利要求3所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，对所述第一接头连接混合物使用引物进行单链延伸形成双链DNA或者进行扩增形成单链产物，再对所述双链DNA进行连接或对所述单链产物进行连接。
5.根据权利要求2或3所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述第一接头和第二接头浓度均为1μM-100μM，存储于-20℃冰箱。
6.根据权利要求2或3所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述连接酶包括但不限于T4 DNA连接酶、T4 RNA ligase、CircLigase、Taq DNA Ligase、E.coli DNA Ligase和Ampligase中的任意一种或任意几种组合；所述连接酶的终浓度为0.1U/μL～100U/μL。
7.根据权利要求1所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述扩增处理按照放大扩增反应及选择的扩增酶反应条件进行扩增，并引入匹配所述第一接头和第二接头的引物对。
8.根据权利要求7所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述放大扩增反应包括聚合酶链式反应PCR方法或者等温扩增方法；所述扩增酶反应选择高保真酶，所述高保真酶选择无扩增偏向性的扩增酶。
9.根据权利要求1所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法，其特征在于，所述第三产物在进行核酸检测前还包括：
对所述第三产物进行纯化处理。
10.一种核酸检测装置，其特征在于，所述核酸检测装置包括如权利要求1至9任一项所述的放大微量DNA并用于多种核酸检测的方法。
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