CN110305946A

CN110305946A - 基于高通量测序的dna甲基化检测方法

Info

Publication number: CN110305946A
Application number: CN201910639369.XA
Authority: CN
Inventors: 施小龙; 唐超; 吴永忠; 王颖; 綦俊
Original assignee: Chongqing University Cancer Hospital
Current assignee: Chongqing University Cancer Hospital
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-10-08

Abstract

本发明公开一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，通过用亚硫酸氢盐处理DNA片段，通过末端转移酶延伸单链DNA片段的3’末端引入核苷酸同聚物序列，通过与核苷酸同聚物序列互补的引物延伸产生双链并引入测序公共接头序列，通过5’端生物素修饰将延伸的序列结合到链霉亲合素包被的磁珠上以及第二次3’末端引入核苷酸同聚物序列，通过第二条带有公共接头序列的引物延伸引入第二公共接头序列，通过用公共PCR引物扩增延伸的DNA产物制备出基因组甲基化特异的DNA测序文库，然后对DNA测序文库进行测序确定DNA片段的序列。本发明具有高通量、高特异性、高灵敏度的优点，能很好地适用于片段化的血液游离DNA和石蜡包埋组织DNA，尤其是短片段DNA的甲基化检测。

Description

基于高通量测序的DNA甲基化检测方法

技术领域

本发明属于核酸测定技术领域，具体涉及一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法。

背景技术

DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰，是表观遗传学(epigenetics)的重要组成部分。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA methylatransferase,Dnmt)催化下，以S—腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程。

在真核生物细胞中，DNA甲基化通常发生在CG二联碱基或CNG三联碱基处。研究表明，70-80％的CpG为甲基化，CpG在CpG密度高的区域趋于低甲基化，在低CpG密度区域趋于高甲基化。在ES细胞的研究表明，只有10％的CpG低密度区是非甲基化的，只有0.3％的高CpG密度区是甲基化的。60％的基因的5’端具有CpG岛，通常这些CpG岛是不甲基化的，但在发育过程中一小部分发生了甲基化，并导致启动子的沉默。例如印记基因和X-失活染色体含有CpG岛基因，胞嘧啶上的甲基化模式程序化的改变说明了甲基化维持和决定在细胞命运的特异性有重要的作用。小鼠上的研究表明在受精之后雄核迅速发生了去甲基化，母系的基因组在几个分裂之后也发生了去甲基化。在移植期，除印记基因没有去甲基化外，发生了全基因组范围去甲基化。

启动子区通常不会发生甲基化。但在癌中涉及全基因组的和基因特异的去甲基化以及超甲基化。许多生长促进基因在癌症中被激活，例如，在胃癌中HRA5，Cyclin D2，在肾癌中carbonic anhydrase IX和在结肠癌中S100钙结合蛋白A4因超低甲基化而被激活。此外许多在正常组织表达的基因在癌细胞中被超低甲基化激活，如MAGE基因家族。人类乳突淋瘤病毒HPV16通过去甲基化的激活是影响子宫癌癌症潜伏期的主要机制。有证据表明错配修复基因1(hMLH1)和O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)DNA修复基因所发生的启动子CpG岛的高甲基化/转录静息化是肿瘤基因组突变高发的直接原因。以负责清除向DNA中鸟嘌呤第6位氧原子上的烷基化，从而阻遏G向A突变的MGMT蛋白为例，结直肠癌中该基因启动子CpG岛的高甲基化与癌基因Ras和抑癌基因p53中G向A突变相关。另外，甲基化的胞嘧啶通过脱氨而转化为胸腺嘧啶被认为是高等真核生物进化过程中，基因组的CpG频率逐步降低和肿瘤中抑癌基因p53的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶核苷酸的机制。肺癌发病早期抑癌基因p16的启动子CpG岛即呈高甲基化状态的报道，也进一步支持DNA甲基化状态的异化是肿瘤发生早期事件的观点。最近，雌激素和它莫西芬(一种抗雌激素,用于治疗妇女乳腺癌或不育症)诱导的PAX2的激活和子宫内膜的增殖被发现是因为PAX2启动子的超低甲基化造成的。相反，抑癌基因的沉默和启动子的超甲基化有关，如RB，p16，VHL，MLH1，APC和E-cadherin。

许多研究显示启动子异常甲基化在许多肿瘤的发生过程中是一个频发的早期事件，因此肿瘤相关基因的甲基化状态是肿瘤发生的一个早期敏感指标，被认为是一种有前景的肿瘤分子生物标志物(biomarker)。更为重要的是，癌变细胞可以释放DNA到外周血中。正常人外周血中都存在纳克级的游离DNA，当肿瘤产生时，肿瘤细胞可以释放DNA到外周血中，并在血清/血浆中富集，其DNA含量比正常人外周血中要高数倍。研究发现外周血血浆/血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。这些生物样品比较容易获得，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以为肿瘤的早期诊断提供非常有价值的信息。与其它类型的肿瘤分子标记物相比，检测启动子异常甲基化有更多的优点。某一基因在不同类型肿瘤中，其启动子异常甲基化的区域是相同的，检测比较方便；另外与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。

有关基因启动子异常甲基化与肿瘤发生之间的关系的研究，目前主要集中在以下4类基因：抑癌基因(包括Rb、VHL、p16IN K4a、p15INK4b、p14ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A)、DNA修复基因(MGMT和hMLH1)、肿瘤分子侵袭转移相关基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代谢酶基因(GSTP1)。这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调控、凋亡、DNA损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化。Esteller等检测了22例非小细胞肺癌(NSCLC)的肿瘤组织和血清中p16、DAPK、GSTP1及MGM T等基因的启动子区异常甲基化状态，发现68％(15/22)的肿瘤组织中存在至少一种基因的启动子甲基化；而在15例组织阳性。病例中，有11例同时在血清中也检测到了启动子异常甲基化的存在。另有许多研究者也分别从肝癌、头颈部癌、食管癌及结肠癌患者的肿瘤组织和血清中同时检测出了某些肿瘤相关基因的启动子甲基化。Palmisano等检测了21例肺鳞癌患者的肿瘤组织和痰液中p16、MGMT启动子异常甲基化情况，发现所有痰样品中都存在一种或两种基因的启动子区异常甲基化。其中10例痰样是在肿瘤确诊后采集的；另11例痰样来自有吸烟史或其它暴露的高危人群，这11例监测对象在随后5～35月都被确诊为肺癌。而这21例痰样经痰细胞形态学检验为阳性的仅有4例。因此检测基因启动子区异常甲基化是一个非常敏感的指标。这些研究结果表明：DNA甲基化的检测可以作为癌症的早期症断和风险评估的手段。而覆盖了全基因组的所有种类的肿瘤的超甲基化分子标记的芯片的问世为癌症的研究和诊断提供了一个有力的工具。

在临床上对肿瘤抑制基因启动子的甲基化状态的检测可以为评估肿瘤风险、制定预防策略、获得早期诊断和跟踪肿瘤预后提供指导。通过检测ctDNA的甲基化可以实现无创液体活检。然而循环血液中可提取的游离DNA大概在每毫升0.1-50纳克左右(1,5)，平均大约20纳克左右。而在这区区的20纳克DNA中，来源于肿瘤的DNA更是微乎其微。在肿瘤发病的早期，肿瘤细胞DNA即可被释放到外周血中，但含量极小。其次，血液游离DNA大部分为片段化的DNA，主峰在170bp左右，不适合采用随机引物延伸的方法引入测序街头。

因此，开发一种具有高灵敏度、高通量、能适合于短DNA片段测序的甲基化DNA检测方法对肿瘤的研究具有非常重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种高灵敏度、高通量、适合于短DNA片段测序的DNA甲基化检测方法。

本发明公开了一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，包括如下步骤：

1)用亚硫酸氢盐处理待测基因组DNA，亚硫酸氢盐将DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U)，而甲基化胞嘧啶保持不变，从而使得最初互补的单链DNA不再互补，从而得到单链DNA；

2)用T4核酸激酶处理单链DNA使3’端去磷酸化得到3’端去磷酸化DNA；

3)用末端转移酶TDT延伸3’端去磷酸化DNA，在3’端引入核苷酸同聚物序列；

4)将3’端引入核苷酸同聚物序列的DNA用5’端生物素修饰的、含有第一公共接头序列的以及含有与3’末端引入核苷酸同聚物序列互补序列的引物Primer U1G进行杂交退火，并用DNA聚合酶进行延伸；

5)循环延伸线性增加延伸产物量；

6)纯化去除未延伸的单链延伸引物；

7)通过5’端生物素修饰将延伸的引物序列结合到链霉亲合素包被的磁珠上，通过DNA变性分离非结合链；

8)用末端转移酶TDT延伸结合在链霉亲合素磁珠上的单链DNA片段，在3’末端引入核苷酸同聚物序列；

9)用含有第二公共接头序列和含有与3’端引入的核苷酸同聚物序列互补序列的引物Primer U2A与固定在磁珠上的单链DNA互补区域杂交，并加入DNA聚合酶进行延伸；

10)用含有第一个测序接头序列和第二个测序接头序列的PCR引物扩增延伸的DNA产物制备出基因组甲基化特异的DNA测序文库；

11)对PCR扩增文库进行高通量测序，所述高通量测序可以是利用Illumina的测序仪、华大基因的测序仪或赛默飞以及其他商业化的高通量测序仪进行，在此不做限制。

本发明中，所述待测基因组DNA可以为各种动植物基因组DNA或人类基因组DNA，可以是血液游离DNA(cfDNA)、石蜡包埋组织DNA(FFPE DNA)、或血液游离的循环肿瘤组织DNA(ctDNA)。所述DNA的片段小可为0.01-0.25kb、0.01-0.3kb、0.01-0.4kb、0.01-0.5kb、0.02-0.25kb、0.01-5kb、0.1-1kb、0.1-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb，当待测基因组DNA为循环肿瘤DNA(ctDNA)时，片段大小一般为170bp左右。

优选地，所述步骤3)中在3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

优选地，所述步骤4)中的引物Primer U1G中的第一公共接头序列为与第一个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列；所述步骤9)中的引物PrimerU2A包含的第二公共接头序列为与第二个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列。

优选地，所述步骤4)中的引物Primer U1G中还包含有DNA分子标签序列，所述DNA分子标签序列以短链随机碱基的形式插入到引物Primer U1G中。分子标签序列也叫分子条形码(molecular barcode)或分子指数(molecular index)或唯一标识符(UID)，或独特分子标识符(UMI)。通常以短链随机碱基的形式(如NNNNDNNNN，NNNNNN，NNNNNNNN)掺入延伸引物中，可以减轻NGS中PCR重复和偏向扩增的问题。

优选地，所述DNA分子标签序列包含简并性碱基D，其中D＝A+G+T。在DNA分子标签中设计简并性碱基D，可以避免引物末端和引物之中的随机碱基序列之间进行退火和延伸。

优选地，所述步骤4)中延伸使用的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow聚合酶，DNA聚合酶I、Klenow聚合酶(exo-)中的一种。

优选地，所述步骤5)中的循环延伸次数为1-10个循环。

优选地，所述步骤6)中纯化去除未延伸的单链延伸引物的方法为用AMpure XPbeads纯化去除未延伸的单链延伸引物或采用外切酶I切除单链引物去除未延伸的单链延伸引物。

优选地，所述步骤8)中3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

优选地，所述步骤9)中的引物Primer U2A包含的第二公共接头序列为与第二个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列。

优选地，所述步骤11)中对PCR扩增文库进行高通量测序前需要对扩增的DNA测序文库进行纯化和质控。

本发明的有益效果为：本发明的DNA甲基化检测方法通过利用末端延伸酶引入了2个公共的测序接头序列，通过PCR扩增制备成测序文库，并且通过线性扩增增加检测的灵敏度，通过分子标签实现数字化的定量，可以实现微量降解样本的甲基化DNA建库和测序。本发明的DNA甲基化检测方法可以同时对全基因组进行甲基化检测，也可以通过靶向富集检测目标区域的甲基化状态，适用于几个到几万个目标区域，如启动子区域、CpG岛区域、CpG岛外区域以及印记基因区域，具有高通量的优点；本发明的DNA甲基化检测方法的起始DNA的量仅需要10ng甚至更低，具有高灵敏度；本发明的DNA甲基化检测方法还适合于短DNA片段的测序。

附图说明

图1为引物Primer U1G和引物Primer U2A的结构示意图；

图2为本发明实施例基于高通量测序的DNA甲基化检测方法的流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

1)血液游离DNA提取：采用Magen的游离DNA提取试剂盒，新鲜血液用EDTA-Na+管收集，7-8ml；室温下离心(1000g/min,10min)，收集上清，在4℃离心，12000转/min，10min，得到的上清(实得4-5ml)进行cfDNA提取纯化。

2)亚硫酸氢盐转化：提取的基因组DNA经过亚硫酸氢盐处理，试剂采用QIAGEN的EpiTect Bisulfite Kit，将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶保持不变，其中亚硫酸氢盐优选亚硫酸氢钠。

3)3’端去磷酸化：取10ng亚硫酸氢盐转化的cfDNA，加入T4PNK激酶反应液用于3’端去磷酸化。反应体系为：10ng亚硫酸氢盐转化的cfDNA，2ul 1×T4ligase buffer(NEB)，1ul T4PNK激酶(NEB)，补水至体积20ul，在37℃反应1h，然后用2.0×AMpure XP beads纯化，用15ul洗脱液洗脱。

4)3’端引入polyC同聚物：15ul 3’端去磷酸化的DNA，1ul末端转移酶(TdT，NEB产品)，0.5ul dCTP(10mM，NEB产品)，2ul 1×末端转移酶反应缓冲液，补水至体积20ul，在37℃反应1h，然后用2.5×AMpure XP beads纯化，用15ul洗脱液洗脱。

5)引入第一公共序列：向如上制备的DNA溶液中，加入2ul 10×NEBuffer2(NEB)，0.25ul 10mM dNTPs(NEB)和0.5ul 20uM primerU1G1(序列如SEQ ID No.1所示，其中，简并性碱基H＝A+C+T；D＝G+A+T；N＝A+C+G+T)。在94℃保温1分钟和4℃孵育5分钟后，向溶液中加入1ul 50U/ul Klenow片段(exo-)(NEB)开始引物延伸反应。将反应温度在16℃保持5分钟，以1℃/分钟的速率升温至37℃，最后在37℃保持20分钟。将样品在95℃温育1分钟并立即转移至冰中，然后加入新鲜的0.5ul 20uM primerU1G1，0.5ul Klenow exo-(50U/ul)和总共0.25μl的dNTP(10uM)。将反应温度在16℃保持5分钟，以1℃/分钟的速率升温至37℃，最后在37℃保持20分钟，然后再重复3次(总共5次延伸)。

6)磁珠吸附：延伸的产物根据制造商的指导使用1.8×Agencourt Ampure XP珠(Beckman Coulter)纯化DNA。将样品在10mM Tris-Cl(pH8.0)中洗脱，并与洗涤的M-280链霉抗生物素蛋白Dynabeads(Life Technologies)一起温育20分钟，同时在室温下旋转。磁珠用0.1N NaOH洗涤两次，用10mM Tris-Cl(pH8.5)洗涤两次。

7)3’端去磷酸化后引入polyT同聚物：将上述制备得到的磁珠重悬于20ul反应液(包括2ul 1×T4ligase buffer(NEB)，1ul T4PNK激酶(NEB))在37℃反应1h，然后用2.0×AMpure XP beads纯化，用15ul洗脱液洗脱，并重悬于20ul反应液(包括1ul末端转移酶(TdT，NEB产品)，0.5ul dTTP(10mM，NEB产品)，2ul 1×末端转移酶反应缓冲液)在37℃反应1h(旋转)，用10mM Tris-Cl(pH8.5)洗涤两次。

8)引入第二公共序列：将上述制备的磁珠重悬于50ul反应液(包括200uM dNTP，0.4μM primerU2A(序列如SEQ ID No.9所示)和1×NEBuffer2)中。将样品在75℃温育1分钟并立即转移到冰上，然后加入100U Klenow exo-(NEB)并在16℃温育5分钟，+1℃/15秒至37℃，37℃，90分钟。

9)测序文库扩增和测序：用10mM Tris-Cl(pH8.0)洗涤磁珠，并重悬于50ul PCR反应液(0.4mM dNTP，0.4μM PE1.0正向引物(序列如SEQ ID No.10所示)，0.4μM样品索引的PCR引物PE2.0-indexPM1(序列如SEQ ID No.11所示)，1U KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶(KAPA Biosystems)，1×HiFi Fidelity Buffer)中。然后通过PCR如下扩增文库：95℃2分钟，12-13重复(94℃20秒，65℃30秒，72℃30秒)，72℃3分钟和4℃保持。根据制造商的指南，使用1.5×Agencourt Ampure XP珠子纯化扩增的文库，并使用Agilent Bioanalyzer上的高灵敏度DNA芯片和Illumina文库定量试剂盒评估质量和数量。在HiSeq X-ten上进行150bp配对末端测序。

需要说明的是，本发明实施例中3’末端引入的核苷酸同聚物序列可以为polyC同聚物、polyT同聚物、polyA同聚物或polyG同聚物等，均可实现本发明的目的。本发明实施例中用于引物延伸的Klenow片段(exo-)还可以为高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow聚合酶、DNA聚合酶I等。

本实施例中的延伸引物Primer U1G1，样品索引的PCR引物PE2.0-indexPM1可以根据测序平台和测序条件进行调整和优化，如采用延伸引物Primer U1G1-8，和与其对应的样品索引的PCR引物PE2.0-indexPM1-8均可实现高通量检测DNA甲基化的目的。

本发明实施例中所述延伸引物Primer U1G1-8、对应样品索引的PCR引物PE2.0-indexPM1-8以及延伸引物Primer U2A具体如下：

其中，延伸引物Primer U1G1-8中的简并性碱基H＝A+C+T；D＝G+A+T；N＝A+C+G+T。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 重庆大学附属肿瘤医院

<120> 基于高通量测序的DNA甲基化检测方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Claims

1.一种基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

4)将3’端引入核苷酸同聚物序列的DNA用5’端生物素修饰的、含有第一公共接头序列的以及含有与3’末端引入核苷酸同聚物序列互补序列的引物PrimerU1G进行杂交退火，并用DNA聚合酶进行延伸；

5)循环延伸线性增加延伸产物量；

6)纯化去除未延伸的单链延伸引物；

11)对PCR扩增文库进行高通量测序确定DNA片段的序列。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤3)中在3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的引物Primer U1G中的第一公共接头序列为与第一个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列；所述步骤9)中的引物Primer U2A包含的第二公共接头序列为与第二个测序接头序列部分相同、完全相同、部分互补、或完全互补的序列。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中的引物Primer U1G中还包含有DNA分子标签序列，所述DNA分子标签序列以短链随机碱基的形式插入到引物Primer U1G中。

5.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述DNA分子标签序列包含简并性碱基D，其中D＝A+G+T。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤4)中延伸使用的DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow聚合酶、DNA聚合酶I、Klenow聚合酶(exo-)中的一种。

7.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤5)中的循环延伸次数为1-10个循环。

8.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤6)中纯化去除未延伸的单链延伸引物的方法为用AMpure XP beads纯化去除未延伸的单链延伸引物或采用外切酶I切除单链引物去除未延伸的单链延伸引物。

9.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤8)中3’端引入核苷酸同聚物序列时使用的延伸底物为dATP、dCTP、dGTP、或dTTP中的一种。

10.根据权利要求1所述的基于高通量测序的DNA甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤11)中对PCR扩增文库进行高通量测序前需要对扩增的DNA测序文库进行纯化和质控。