CN106854679A - 甲基化dna检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，所述方法包括用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，并且获得单链DNA片段；在所述单链DNA片段一端或两端加上接头；可选地环化所述加上接头的单链DNA片段；将所述加上接头的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。本申请还公开了检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒，以及单链连接试剂在制备检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途。

Description

甲基化DNA检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年2月3日提交的中国专利申请第201610077986.1的优先权，该申请的全部内容被通过引用方式并入本申请。
技术领域
本发明涉及检测特定基因组位置的DNA甲基化的方法。
背景技术
在真核生物的DNA中，部分胞嘧啶会发生甲基化，从而产生甲基化的DNA。研究表明，DNA的甲基化可能对DNA的功能有重大影响，特别是DNA甲基化可能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。例如，基因启动子序列的甲基化一般会抑制该基因的表达。在一些研究中发现，DNA甲基化对生物的正常发育是必需的。在另一些研究中发现，DNA甲基化同基因印记，X染色体失活，以及重复元件的抑制有关。特别的，一些研究中发现，DNA甲基化和肿瘤产生相关。
基因的启动子区或末端通常会存在一些富含“CG”核苷酸对(其中G紧随C后，两个核苷酸之间通过磷酸酯键相连，因此称为“CpG”)的区域。在哺乳动物的DNA中，60％～90％的CpG序列被甲基化(Ehrlich等，1982，Amount and distribution of 5-methyl-cytosinein human DNA from different types of tissues or cells,Nucleic Acids Research10(8):2709-21)。当基因的表达调控区中某些区段富含CpG(CpG序列出现频率远高于平均)时，将该区段称为CpG岛。研究表明，肿瘤细胞的DNA中发现部分基因的表达调控区发生了在正常情况下非甲基化或低甲基化的CpG岛甲基化程度明显增高的情况，抑制了一些基因(例如，抑癌基因)的表达。而另一方面，肿瘤细胞的DNA中还发现有部分基因的表达调控区发生CpG岛的甲基化程度降低的情况，使这些基因(例如，致癌基因)表达异常。因此，通过研究DNA片段特定基因组位置的甲基化情况可以获取关于肿瘤的重要信息。
肿瘤细胞在人体内会因为细胞凋亡、免疫反应等原因释放其基因组DNA至血液中。正常组织也会将正常的基因组DNA释放至血液中。这些血浆中存在的DNA统称为细胞外游离DNA(Cell-free DNA,cfDNA)，而其中的来自肿瘤细胞的部分则被称为循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)。检测ctDNA中的甲基化DNA对肿瘤的早期诊断很有帮助。但是，由于ctDNA在cfDNA中的丰度极低，这要求检测ctDNA中甲基化DNA的方法有极高的灵敏度。因此，需要一种具有高灵敏度和准确性的检测DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法。在一些实施方式中，该方法包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。
在一些实施方式中，经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段已经完全成为单链DNA片段。在一些实施方式中，经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段不完全是单链DNA片段，所述方法进一步包括变性经亚硫酸氢钠处理过的DNA片段以获得完全成为单链的DNA片段。
在一些实施方式中，通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段两端加上接头。在一些实施方式中，通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段的3'端加上接头，线性扩增所述3'端加上接头的单链DNA片段，并且通过单链DNA连接酶在所述3'端加上接头的单链DNA片段的扩增产物的3'端(对应于原始模板单链DNA片段的5'端)加上接头。
在一些实施方式中，其中所述接头包括DNA分子标签。在一些实施方式中，其中所述索引引物分别包括全部或部分与各所述接头相同或互补的序列。在一些实施方式中，所述接头可耐受亚硫酸氢盐。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在经亚硫酸氢钠处理前使用第二类限制性内切酶处理DNA片段。在一些实施方式中，所述第二类限制性内切酶选自下组：HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。
在一些实施方式中，将接上接头的单链DNA片段制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库的步骤包括利用索引引物对所述接上接头的单链DNA片段进行扩增。在一些实施方式中，所述扩增为指数扩增或线性扩增，所述索引引物分别包含部分或全部与各接头序列相同或互补的序列。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括：在制备DNA测序文库之前，环化所述加上接头的单链DNA片段。在一些实施方式中，使用高效环化试剂环化所述加上接头的单链DNA片段。在一些实施方式中，所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。在一些实施方式中，所述单链DNA环化酶是CircLigase。在一些实施方式中，所述方法包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。
在一些实施方式中，所述制备DNA测序文库的步骤包括：在所述环化步骤后，使用索引引物扩增环化的所述单链DNA片段，并且获得由包含所述特定基因组位置的DNA扩增产物组成的所述DNA测序文库。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用滚环扩增。
在一些实施方式中，所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定所述DNA测序文库的DNA序列。在一些实施方式中，所述制备DNA测序文库的步骤进一步包括：在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集特定扩增产物。
在一些实施方式中，在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。
在一些实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的游离DNA。在一些实施方式中，在所述细胞外的游离DNA中包含循环肿瘤DNA。
本发明的另一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括：亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；单链DNA连接试剂，所述单链DNA连接试剂能够连接单链DNA片段和接头序列；测序试剂。在一些实施方式中，所述单链连接试剂包括接头序列DNA片段、单链DNA连接酶、反应溶液。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括文库制备试剂，其可用于扩增包含特定基因组位置的单链DNA，所述文库制备试剂包括索引引物。在一些实施方式中，所述文库制备试剂进一步包括扩增试剂，在一些实施方式中，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、反应溶液和dNTPs。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括线性扩增试剂，所述线性扩增试剂包括线性扩增引物，其包括部分或全部与已连接至单链DNA片段的一端的接头互补的序列。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括环化试剂，所述环化试剂能够将单链DNA片段环化。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb。
在一些实施方式中，所述环化试剂为高效环化试剂。在一些实施方式中，所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。在一些实施方式中，所述单链DNA环化酶是CircLigase。在一些实施方式中，所述环化试剂进一步包括T4PNK，其可用于对DNA片段进行5'末端进行磷酸化处理和3'末端进行去磷酸化处理。在一些实施方式中，所述文库制备试剂包括用于反向PCR扩增的试剂或用于滚环扩增的试剂。
本发明的再一个方面提供了一种单链连接试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对制备得到的DNA测序文库进行测序。在一些实施方式中，通过单链连接酶在所述单链DNA片段两端加上接头。在一些实施方式中，通过单链连接酶在所述单链DNA片段3'端加上接头，线性扩增所述3'端加上接头的单链DNA片段，并且通过单链连接酶在所述3'端加上接头的单链DNA片段的扩增产物的3'端加上接头。
在一些实施方式中，所述检测进一步包括环化所述单链DNA片段，并且在所述环化步骤后使用索引引物扩增环化的所述单链DNA片段以制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库。
在一些实施方式中，所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。
在一些实施方式中，所述检测进一步包括在测序步骤前使用寡核苷酸探针富集包含特定基因组位置的DNA片段的扩增产物。
在一些实施方式中，本申请提供的方法可以检测含量低至1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、45ng、50ng、55ng、60ng、65ng、70ng、75ng、80ng、85ng、90ng、95ng、100ng的样品DNA。在一些实施方式中本申请提供的方法可以检测含量在1-100ng或者高于100ng的样品DNA。在一些优选的实施方式中，本申请提供的方法可以检测含量在20+5ng范围内的样品DNA。在一些实施方式中，本申请提供的方法中DNA的文库转化率在10-90％、10-80％、10-70％、10-60％、10-50％、10-40％、10-30％、10-20％、20--90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、30-90％、30-80％、30-70％、30-60％、30-50％、30-40％、40-90％、40-80％、40-70％、40-60％、40-50％、50-90％、50-80％、50-79％、50-60％、60-90％、60-80％、60-70％、70-90％、70-80％、80-90％之间。在一些实施方式中，本申请提供的方法可以在10ngDNA中检测出至少100、200、300、400、500、1000、104、105个甲基化位点。在一些实施方式中，本申请提供的检测方法的诱饵/靶标DNA的覆盖率不低于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更高。
附图说明
通过下面说明书和所附的权利要求书并与附图结合，将会更加充分地描述本申请内容的上述和其他特征。可以理解，这些附图仅描绘了本申请内容的若干实施方式，因此不应认为是对本申请内容范围的限定。通过采用附图，本申请内容将会得到更加明确和详细的说明。
图1：亚硫酸氢钠处理原理示意图；
图2：检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的一种实施方式；
图3：单链DNA环化处理示意图；
图4：反向PCR扩增包含甲基化位点的序列的示意图；
图5：滚环扩增包含甲基化位点的序列的示意图；
图6：经亚硫酸氢钠处理后制备的测序文库和未经亚硫酸氢钠处理制备的测序文库片段大小的比较。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法。
本发明中使用的术语“DNA”即脱氧核糖核酸，是组成遗传指令的长链聚合物生物大分子。DNA的组成单位是核苷酸，DNA中的每个核苷酸由含氮碱基、五碳糖(2-脱氧核糖)和磷酸基团组成。相邻的核苷酸通过脱氧核糖和磷酸形成酯键相连从而组成长链骨架组成。DNA的核苷酸中的含氮碱基一般有四种，分别为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。两条DNA长链上的碱基通过氢键配对，其中腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)配对，鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)配对。
本发明中使用的术语“包含DNA的样品”是指任何包含DNA片段的样品，其中包括但不限于细胞、组织、体液等。在一些实施方式中，所述包含DNA的样品为组织，例如活检组织或者石蜡包埋组织。在一些实施方式中，所述包含DNA的样品为细胞，例如细菌(包含病毒)或动植物细胞等。在另一些实施方式中，所述包含DNA的样品为体液，例如血液、血浆、血清、唾液、羊水穿刺液、胸腔积液、腹腔积液等。在一些特定的实施方式中，所述包含DNA的样品为血液、血清或血浆。在一些特定的实施方式中，包含在所述样品中的DNA为基因组DNA。在一些特定的实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的游离DNA(cfDNA)。在一些优选的实施方式中，包含在所述样品中的DNA为循环肿瘤DNA(ctDNA)。
“细胞外的游离DNA”是指在循环系统(例如，血液)中发现的游离于细胞外的DNA。其来源一般认为是由于细胞凋亡过程中释放的基因组DNA。研究发现，人体内绝大部分的细胞外的游离DNA的大小在160bp左右(参见Fan et al.,(2010)Analysis of the SizeDistributions of Fetal and Maternal Cell-Free DNA by Paired-End Sequencing,Clin Chem 56:81279-86)。
“循环肿瘤DNA”是指来源于肿瘤细胞的细胞外游离DNA。肿瘤细胞在人体内会因为细胞凋亡、免疫反应等原因释放其基因组DNA到血液中。由于正常细胞也同样会将其基因组DNA释放到血液中，因此，一般情况下，循环肿瘤DNA只占细胞外游离DNA的很小一部分。
本发明中使用的术语“DNA甲基化”是指一种表观遗传的修饰方式。在真核生物中，DNA的甲基化仅发生于胞嘧啶，具体是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶的上，使得胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种修饰。研究表明，DNA的甲基化对DNA的功能有重大影响，特别是DNA甲基化可能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。例如，基因启动子序列的甲基化一般会抑制该基因的表达。在一些研究中发现，DNA甲基化对生物的正常发育是必需的。在另一些研究中发现，DNA甲基化同基因印记，X染色体失活，以及重复元件的抑制有关。特别的，一些研究中发现，DNA甲基化和肿瘤产生相关。
本发明中所述的“DNA片段的特定基因组位置”泛指一切目标检测位置。在一些优选的实施方式中，所述DNA片段的特定基因组位置是指CpG富集的区域，特别是CpG岛区域。在另一些优选的实施方式中，所述DNA片段的特定基因组位置是指其甲基化程度与疾病(例如肿瘤、炎症、出生缺陷等)有关的CpG岛区域。
在一些实施方式中，所述检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段；在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。
在另一些实施方式中，所述检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；将经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段变性为单链DNA片段；在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；环化所述加上接头的单链DNA片段；使用索引引物对所述环化的加上接头的单链DNA片段制扩增备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。
本发明中所述的“亚硫酸氢钠处理”是指利用亚硫酸氢钠处理目标DNA片段，使得目标DNA片段中未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。具体地，在一定的温度和pH条件下，利用亚硫酸氢钠将变性DNA(单链DNA)中的胞嘧啶转化为胞嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物，对胞嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物进行水解脱氨基，得到尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物，最后，在一定条件下将尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物脱磺酸基得到尿嘧啶；在此反应中只有未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理下才会发生碱基变化，甲基化的胞嘧啶仍然保持不变。亚硫酸氢钠处理后由于未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，因此原来互补的两条单链DNA可能变得不再互补。在一些实施方式中，对目标DNA片段的亚硫酸氢钠处理会破坏目标DNA片段的结构，并且所述破坏是指将经亚硫酸氢钠处理的目标DNA片段打断成为更小的片段。
在一些实施方式中，在亚硫酸氢钠处理前使用第二类限制性内切酶对目标DNA片段进行处理。本发明中所述“第二类限制性内切酶”是指能识别和切割特定的4～8个碱基对序列的内切酶，其中大多数被识别的序列具有回文结构；第二类限制性内切酶的切割方式有三种：1)切割产生5'突出的粘性末端(sticky ends)，2)切割产生3'突出的粘性末端，3)切割产生平头末端(blunt ends)。本发明中所述“第二类限制性内切酶位点”包括本领域技术人员公知的任何第二类限制性内切酶位点，包括但不限于：ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、HpaII、KpnI、MspI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SmaI、SphI、XbaI、XhoI、XmaI。在一些实施方式中，所述第二类限制性内切酶选自下组：HpaII、MspI、SmaI、XmaI、BamHI。在一些实施方式中，所述第二类限制性内切酶为甲基化敏感性限制性内切酶。“甲基化敏感性限制性内切酶”对DNA的甲基化状态敏感，其切割甲基化和非甲基化序列的效率不同，从而可以用于区分甲基化和非甲基化序列。在一些实施方式中，所述第二类限制性内切酶为甲基化敏感性限制性内切酶，所述甲基化敏感性限制性内切酶选自HpaII、MspI、SmaI、XmaI、BamHI或其任意组合。在一些实施方式中，使用能够识别相同DNA靶序列但具有不同甲基化敏感性的限制性内切酶，例如，但不限于，HpaII/MspI、SmaI/XmaI等。在一些实施方式中，利用第二类限制性内切酶将目标DNA片段打断为更小的随机片段。在一些实施方式中，未包含特定甲基化修饰序列的DNA分子是不需要被最终测序的背景序列，利用第二类限制性内切酶消化目标DNA片段中未包含甲基化的区域可以达到降噪的效果。在另一些实施方式中，带有特定甲基化修饰序列的DNA分子是不需要被最终测序的背景序列，利用第二类限制性内切酶消化目标DNA片段中包含甲基化的区域可以达到降噪的效果。在另一些实施方式中，带有特定甲基化修饰的DNA分子是需要被测序的DNA区域，通过测序鉴定切割位点即可获知该DNA区域的甲基化状态。
在一些实施方式中，若起始的DNA片段>5kb，则所述检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法进一步包括在亚硫酸氢盐处理前对所述DNA片段进行切割处理(包括但不限于机械打断、使用特定的限制性内切酶进行酶切等)，使得切割得到的DNA片段大小适合后续处理，所述适合后续处理的DNA片段大小为0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb，并且使得所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置(目标检测位置)。在一些实施方式中，若起始的DNA片段>0.5kb，则需要在亚硫酸氢盐处理前对所述DNA片段进行切割处理，切割得到的DNA片段大小0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb。
本发明中所述的“将DNA片段变性为单链DNA的方法”是指本领域技术人员公知的任何方法，包括但不限于热变性(例如高于90℃)、碱(例如NaOH)处理等。
在一些实施方式中，在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。
在一些实施方式中，包含在所述样品中的DNA为细胞外的游离DNA。在一些实施方式中，包含在所述细胞外的游离DNA优选地为循环肿瘤DNA。
在一些实施方式中，在DNA片段(单链或双链)的一端或两端加上接头。
本发明中所述的“接头”是指根据需要在DNA片段(单链或双链)的一端或两端附加的特异性DNA序列，其通常在5-50bp长度范围内。
在一些实施方式中，在DNA片段为双链的情况下，可以通过设计在单链接头中包含与DNA片段的末端连接的序列或部分(例如杂交互补区、或者随机杂交短序列，例如poly-T)，之后通过将所述接头与目标DNA片段的互补链进行分子杂交，并且在杂交后通过加入聚合酶(如逆转录酶)来延伸接头将所述接头连接至目标DNA片段的末端。在另一些实施方式中，在DNA片段为双链并且DNA片段末端为粘性末端的情况下，可以设计接头序列并利用与接头互补的序列与其退火互补形成具有粘性末端的结构，之后通过连接酶将该互补短序列连接至目标DNA双链上，在后续过程中使DNA变性形成单链，从而达到在DNA片段末端加上接头的目的。在一些实施方式中，在亚硫酸氢盐处理前接上接头，所述接头可耐受亚硫酸氢盐。本发明中所述的“可耐受亚硫酸氢盐”是指所述接头中不含胞嘧啶或者不含未甲基化的胞嘧啶，从而在DNA片段经亚硫酸氢钠处理时，所述接头的序列不发生改变。
在一些优选的实施方式中，将DNA双链变性得到单链DNA片段，随后利用单链DNA连接酶将接头序列连接至单链DNA片段的一端(3'端)或两端。在一些实施方式中，利用单链DNA连接酶第一接头序列(3'接头序列)连接至单链DNA片段的3'端，随后利用至少包含部分与所述3'端接头序列互补的序列的线性扩增引物对一端加上接头的单链DNA片段进行N(N为大于等于1的整数)轮扩增，获得N倍原始拷贝数的与3'端具有接头序列的单链DNA片段互补的序列。在一些实施方式中，利用单链DNA连接酶将第二接头序列(5'接头序列)连接至一端已加上接头序列的单链DNA片段(经扩增的或未经扩增的)。在又一些实施方式中，在DNA片段为单链的情况下，可以对DNA片段及接头序列进行磷酸化、去磷酸化处理，后利用单链连接酶将接头序列连接至DNA片段的末端。本发明中所述的“单链DNA连接酶”是指本领域公知的任何可以连接两条DNA的酶，例如但不限于T4RNA Ligase，T4DNA Ligase，Taq DNALigase，E.coli DNA Ligase，Ampligase(Epicentre)。
连接在单链DNA片段的3'端的所述第一接头序列和连接在与所述单链DNA片段互补的序列的3'端的所述第二接头序列可以是相同的、不同的、互补的、部分互补的、包含部分相同序列的、包含部分互补序列的。在一些实施方式中，所述接头包括分子标签。本公开中使用的术语“分子标签”是指一段用于作为标签的序列，其可被连接至DNA片段的5'端、3'端或两端。在DNA测序中，特别是在高通量测序技术中，分子标签被用以标记特定的序列，在经过扩增、测序后可以根据标签序列的计数来确定被标记基因的表达量，或者用于追踪来自同一原始分子的扩增后DNA分子的信息，从而达到纠正扩增过程以及测序过程中的DNA序列随机错误的作用。分子标签可以是4-20个碱基的序列，可以是随机序列，即A/T/C/G随机排布而成，也可以是固定序列，如目前在用的16种8个碱基的分子标签序列如下：GACGTGAT，ACCACTGT，ACTTACGC，CTGTAGCT，GTAAGGAG，CACTTCGA，CATACCTG，TCGTGAGA，CGAGTGTA，CTATCTGC，TGGAACAC，AACTCACG，AATCCGAC，CAAGGAGT，GCATCCTA，CCTCTATC。
在一些实施方式中，本公开所提供的方法进一步包括在文库制备步骤前环化所述加上接头的单链DNA片段。本发明中所述的“环化单链DNA片段的方法”是指本领域技术人员公知的任何方法，包括但不限于使用高效环化试剂环化单链DNA。在一些实施方式中，所述高效环化试剂环化是DNA连接酶。在一些实施方式中，所述DNA连接酶是单链DNA环化酶(例如但不限于CircLigaseTM ssDNA Ligase，Epicentre科技公司)，其是一种热稳定的、APT依赖的连接酶，其能够催化单条单链DNA的5'-磷酸和3'-羟基基团的连接，从而使单链DNA环化。CircLigaseTM ssDNA Ligase与T4DNA Ligase和DNA Ligase不同，T4DNALigase和DNA Ligase仅能够连接彼此相邻的互补的DNA序列的末端，而CircLigaseTM ssDNA Ligase可以在没有互补序列存在的情况下连接单链DNA末端，大于15个碱基的线性单链DNA，包括cDNA，均可被CircLigase环化。因此，该酶在将线性单链DNA连接成环状单链DNA中具有重要作用。环状的单链DNA分子可被用作滚环复制或滚环转录研究的底物。
在一些实施方式中，在将所述加上接头的单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。所述5'末端的磷酸化和3'末端的去磷酸化可以通过本领域技术人员公知的任何方法进行，包括但不限于利用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)催化。T4PNK是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。T4PNK同时具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P→3'-OH+Pi(最适pH为5.9左右)。T4PNK的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近，因此可用于使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化和/或去除3'端磷酸基团，以确保后续连接反应顺利进行。
本公开中用于制备DNA测序文库的所述“索引引物”可以指单一引物或者成对引物，其分别包含部分或全部与第一接头序列、第二接头序列相同或互补的序列。
本公开中所述的“DNA测序文库”是指丰度达到可测序的程度的DNA片段集合，其中所述DNA片段集合中每条片段的一端或两端包含与测序用引物部分或全部互补的特定序列，从而可以直接用于后续的测序上机。
在一些实施方式中，将环化的加上接头的单链DNA片段制备为DNA测序文库的步骤包括：在所述环化步骤后扩增环化的所述加上接头的单链DNA片段，并且获得由包含所述特定基因组位置的DNA的扩增产物组成的所述DNA测序文库。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。在一些实施方式中，所述扩增的步骤使用滚环扩增。
本发明所述的“反向PCR”是指在已知一段序列的情况下，通过基于该已知序列设计引物，并且在引物外侧合成DNA从而达到扩增已知序列旁侧的DNA的目的。在本发明的一些实施方式中，反向PCR中的已知序列为所述DNA片段的特定基因组位置中的一段已知序列。在本发明的另一些实施方式中，反向PCR中的已知序列可以为前述的在DNA片段两端加上的接头的部分或全部。
本发明所述的“滚环扩增”是指一条引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状DNA单链。同样的，在本发明的一些实施方式中，滚环扩增中的引物可以是针对所述DNA片段的特定基因组位置中的一段已知序列的。或者，在本发明的另一些实施方式中，滚环扩增中的引物可以包括与前述的在DNA片段两端加上的接头的部分或全部互补的序列。
在一些实施方式中，将DNA进行环化后再进行扩增可以减少扩增过程对模板DNA片段长度的依赖，有利于将片段化的DNA(如血浆游离DNA)进行扩增，如传统的双引物正向PCR扩增技术，要求待扩增的模板DNA同时带有两条引物的序列，而当一个DNA模板长度过短时，将不能同时含有两条引物序列，在这种情况下，这样的DNA模板将不能被扩增。而反向PCR由于两条引物可以相距很近，从而更有利于对片段化的DNA(如血浆游离DNA)进行扩增，因此，通过先环化再进行反向PCR的方法可以实现对片段化DNA更高的检测灵敏度。
在一些实施方式中，所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定所述扩增产物的序列。
经亚硫酸氢钠处理后的DNA在测序时，或者上述经亚硫酸氢钠处理后的DNA在经扩增后(例如经反向PCR扩增或者滚环扩增后)，由未甲基化的胞嘧啶(C)转化的尿嘧啶(U)将转变为胸腺嘧啶(T)。通过对经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序并将测序结构与未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段的序列(已知序列或者通过对未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序得到的测序结果)进行比较，可以确定DNA片段中的特定基因组位置的甲基化情况，具体地可以通过在序列比对结果发现具有由C到T的转变的位置即为未被甲基化的位置。
在一些实施方式中，所述的方法中的将单链DNA片段制备为DNA测序文库的步骤进一步包括：在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集特定扩增产物(例如包含特定序列的扩增产物或者带有特定分子标签的扩增产物)。本发明中所述的“使用寡核苷酸探针富集包含所述特定基因组位置的DNA的扩增产物”的步骤可以通过本领域技术人员公知的任何方法完成，例如但不限于磁珠富集、标签pull-down等。
本发明的另一个方面提供了一种检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括：亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；单链DNA连接试剂，所述单链DNA连接试剂能够连接单链DNA片段和接头序列；测序试剂。在一些实施方式中，所述单链DNA连接试剂包括接头序列DNA片段、单链DNA连接酶、反应溶液。在一些实施方式中，所述单链DNA连接酶为T4RNA Ligase。在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括线性扩增试剂，所述线性扩增试剂包括线性扩增引物，其包括部分或全部与已连接至单链DNA片段的一端的接头互补的序列。在一些实施方式中，所述线性扩增试剂进一步包括DNA聚合酶、反应溶液和dNTPs。在一些实施方式中，所述接头序列DNA片段包括选自下组的一种或几种：与限制性内切酶位点序列部分或全部互补的序列、分子标签序列、与线性扩增引物部分或全部互补的序列。
在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括文库制备试剂，其可用于扩增包含特定基因组位置的单链DNA，所述文库制备试剂包括索引引物。在一些实施方式中，所述索引引物分别包括部分或全部与第一/第二接头序列相同或互补的序列。在一些实施方式中，所述索引引物还包括与后续测序步骤中使用的测序平台的捕获序列部分或全部互补的序列。在一些实施方式中，所述文库制备试剂进一步包括扩增试剂，在一些实施方式中，所述扩增试剂包括DNA聚合酶、反应溶液和dNTPs。
在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括环化试剂，所述环化试剂能够将单链DNA片段环化。在一些实施方式中，所述环化试剂为高效环化试剂。在一些实施方式中，所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。在一些实施方式中，所述单链DNA环化酶是CircLigase。在一些实施方式中，所述环化试剂进一步包括T4PNK，其可用于对DNA片段进行5'末端进行磷酸化处理和3'末端进行去磷酸化处理。在一些实施方式中，所述文库制备试剂包括用于反向PCR扩增的试剂或用于滚环扩增的试剂。
在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小适合后续处理，所述适合后续处理的DNA片段大小为0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.1-0.5kb、0.5-1kb或0.2-0.4kb，并且使得所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置(目标检测位置)。在一些实施方式中，所述切割试剂为盐溶液。在一些实施方式中，所述切割试剂为TE溶液(需要配合使用不包含在试剂盒内的DNA机械打断仪器)。在另一些实施方式中，所述切割试剂为内切酶(或内切酶及其反应溶液)。
本公开的再一个方面提供了一种单链DNA连接试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤：用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理可以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；通过单链DNA连接试剂在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备为包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；对制备得到的DNA测序文库进行测序。在一些实施方式中，通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段一端加上接头。在一些实施方式中，所述检测进一步包括：线性扩增所述一端加上接头的单链DNA片段。在一些实施方式中，所述检测进一步包括：通过单链DNA连接酶在所述一端加上接头的单链DNA片段的扩增产物的另一端加上接头。在一些实施方式中，所述检测进一步包括使用高效环化试剂环化所述加上接头的单链DNA片段，并且在所述环化步骤后使用索引引物扩增环化的所述单链DNA片段，所述测序步骤为测定扩增产物的序列。
在一些实施方式中，所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。
在一些实施方式中，所述检测进一步包括在测序步骤前使用寡核苷酸探针富集包含特定基因组位置DNA片段的扩增产物。
实施例
以下将通过一些非限制性实施例进一步描述本发明。需要说明的是这些实施例仅用于进一步说明本发明的技术特征，并非旨在也不能够被解释为对本发明的限制。所述实验例不包含本领域一般技术人员所公知的传统方法(不同种类样本中DNA的提取、纯化等)的详细描述。
实施例1：IRIS方法
以下提供了本申请所述的检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法的一种具体实施方式(IRIS方法)。可以参照图2以及以下具体来描述理解该具体实施方式。
样本处理
当目标DNA为细胞或组织中的基因组DNA时，通过DNA提取试剂盒或者通过DNA富集工具(DNA吸附柱、磁珠等)等提取或富集样品中包含的基因组DNA，利用Nanodrop测量DNA浓度，并进行记录。取2μg DNA，用双蒸水稀释至200μl，根据实际需求选择使用DNaseI酶或者限制性内切酶进行消化、超声打断、反复冻融等方法使上述DNA断裂为约200-800bp的片段(可选步骤)。通常采用超声打断，使用参数为振幅40、功率50w、时间15sec、间隔5sec、次数15，0-4℃低温下进行(超声参数可以根据实际情况进行摸索调整)。利用凝胶电泳确认经处理后的DNA片段大小在所需范围内。
当目标DNA为cfDNA时，可以使用qRT PCR对富集的cfDNA中的人基因组DNA中高丰度的ALU基因的短序列(115bp)和长序列(247bp)进行检测，其中115bp的ALU扩增子(ALU115)和247bp的ALU扩增子(ALU247)分别对应总DNA(cfDNA和基因组DNA)和基因组DNA的浓度，由此可计算出样本中的cfDNA含量。并且其中ALU247/ALU115浓度的比率表示样本的DNA完整性。可选地，可以使用MspI或其他类似的第二限制性内切酶处理富集的cfDNA，使得其断裂为约20-400bp的片段。
亚硫酸氢钠处理
取适量上述DNA于1.5ml EP管中，并加入5.5μl新鲜配置的3M的NaOH溶液，将EP管置于42℃水浴中孵育30min(在此过程中发生DNA变性得到单链DNA)。水浴期间,配制10mM氢醌和3.6mM亚硫酸氢钠溶液。其中3.6M的亚硫酸氢钠溶液配置步骤如下：使用双蒸水溶解1.88g亚硫酸氢钠，并以3M的NaOH滴定溶液至pH为5.0，定容为5ml。在42℃水浴孵育30min结束后，取30μl上述10mM氢醌至EP管中(溶液变成淡黄色)，之后再取520μl上述3.6M的亚硫酸氢钠溶液加入EP管中。在EP管外包上铝箔纸，轻柔颠倒混匀溶液，之后在EP管中加入200μl石蜡油封液，以防止水分蒸发。将上述EP管进一步置于50℃水浴中避光孵育16hr(完成胞嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物至尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物的转化)。之后利用市售的DNA纯化柱等方式将包含尿嘧啶-亚硫酸氢盐衍生物的DNA吸附于纯化柱上，经纯化洗脱后得到50μl的DNA洗脱液。加入5.5μl新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min；之后加入33μl 10M的乙酸铵以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右，并加入4μl 10mg/ml的糖原作为沉淀指示剂(因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于在用乙醇沉淀离心后识别回收物)；最后在溶液中加入270μl的冰(0-4℃)无水乙醇，将EP管置于-20℃环境中2-6hr(或过夜)以沉淀DNA(对应脱磺酸基步骤)。经沉淀的DNA可经多次70％的乙醇洗涤后干燥，再用双蒸水复溶获得经亚硫酸氢钠处理修饰后的DNA溶液。
在此反应中只有未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理下才会发生碱基变化，甲基化的胞嘧啶仍然保持不变(参见图1)。
应当理解，上述亚硫酸氢钠处理的实验操作仅为示例性的，本领域技术人员可以采用任何市售的亚硫酸氢钠处理试剂盒完成该步骤，其中在该步骤中使用的试剂、反应条件、反应时间等各不相同但基本原理基本一致。
由于在亚硫酸氢钠处理中包括碱处理步骤，从而使得初始DNA变性为单链DNA，并且在亚硫酸氢钠处理过程中DNA片段将基本保持变性形态，因此经亚硫酸氢钠处理的DNA片段通常为单链DNA片段。可选地，在亚硫酸氢钠处理后可以进一步包括变性步骤以保证全部DNA片段为单链DNA片段。
此外亚硫酸氢钠处理有时也会导致DNA片段的断裂，因此优选地在亚硫酸氢钠处理后在DNA片段的一端或两端加上接头。如图6所示，经亚硫酸氢钠处理后再经扩增生成的测序文库与未经亚硫酸氢钠处理而制备的测序文库相比>250bp的DNA片段明显减少，大小在50-100bp的DNA片段明显增多，这表明了亚硫酸氢钠处理破坏了DNA片段并且将其打断为更小的片段。
DNA片段的接头
在亚硫酸氢盐处理后，可以根据需要将特异性序列结合到DNA片段(单链或双链)的一端或两端，被加到DNA片段两端的特异性序列分别称为第一接头和/或第二接头。
在一个实施方案中，使用例如T4RNA ligase的单链DNA连接酶将第一接头序列(3'接头序列)和第二接头序列(5'接头序列)连接至单链DNA片段的两端。根据如下配方配置反应液：2μl 10X T4RNA Ligase连接反应溶液、1μl 10mM ATP、50-100pmol单链DNA片段、50-100pmol接头序列(与单链DNA片段基本等量)、1μl(10u)T4RNA Ligase、加入双蒸水补全反应体系至20μl。将反应体系保持在4℃孵育10-18个小时。
在另一个实施方案中，使用T4RNA Ligase将第一接头序列(3'接头序列)连接至单链DNA片段的3'端，随后利用至少包含部分与所述3'端接头序列互补的序列的线性扩增引物对一端加上接头的单链DNA片段进行N＝1-30轮线性扩增，获得N倍原始拷贝数的与3'端具有接头序列的单链DNA片段互补的序列。
线性扩增可用于扩增与已知DNA区段相连接的未知区段的序列，其与普通PCR的区别在于仅使用一条引物进行扩增，优势在于不同扩增片段扩增效率差异小，不同扩增产物的均一性好。在线性扩增中可以使用的反应条件与经典的聚合酶链反应所用条件的相似，例如使用Taq聚合酶，先对DNA进行94℃的30秒变性，之后重复58℃引物退火30秒和70℃延伸3分钟的步骤1-30个循环。
随后如上文所述的方法使用例如T4RNA Ligase的单链DNA连接酶将第二接头序列(5'接头序列)连接至经扩增的与3'端已加上接头序列的单链DNA片段互补的序列的3'端，获得两端加上接头或与接头互补的序列的单链DNA片段。
第一接头序列和第二接头序列可以是相同的、不同的、互补的、部分互补的、包含部分相同序列的、包含部分互补序列的。接头可以包括用于作为标签的一段序列作为分子标签，又例如，该接头可能含有与后续文库制备中使用的索引引物的部分或全部区域互补的序列。
在又一个实施方案中，第一接头可选择的可在其3'端或其5'端包含分子标签或特定序列。在后续的扩增中可以利用上述分子标签或特定序列对目标DNA进行特异性的扩增。或者在后续的测序中可以利用上述分子标签或特定序列对于包含该特定序列的分子进行特异性的富集。又或者在后续的测序步骤中可以根据标签序列的计数来确定被标记基因的表达量，或者用于追踪来自同一原始分子的扩增后DNA分子的信息，从而达到纠正扩增过程以及测序过程中的DNA序列随机错误的作用。
在某些具体实施方案中，本申请提供的方法与现有技术(例如但不限于，Illumina的方法或Swift Biosciences的方法)相比区别在于本申请的方法：i)在亚硫酸氢钠转化后加上接头序列；ii)第一次单链连接将亚硫酸氢钠转化后的单链DNA与3'端接头连接后，对带3'端接头的引物进行多轮线性扩增；iii)在扩增之后，再次使用单链连接方法以连接上5'端的测序接头；iv)两次单链连接的接头上面都带有n个(4<＝n<＝20)碱基作为UMI(Unique Molecular Identifiers)的分子标签，用于标记原始的DNA分子，所于后期分析中对背景噪音的降低，以及原始分子数计数等。
DNA测序
使用高通量DNA测序的方法对DNA文库进行测序。测序前可以通过利用寡核苷酸探针对目标测序DNA进行富集。
对于DNA甲基化的测序可以基本通过对经亚硫酸氢盐处理的DNA片段、或者经扩增的经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序并将测序结构与未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段的序列(已知序列或者通过对未被亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行测序得到的测序结果)进行比较，之后通过在序列比对结果发现具有由C到T的转变的位置即可能为被甲基化的位置。根据每个可能被甲基化的位置在多个拷贝中出现的频率评估该位置是否确实存在甲基化。
实施例2：IRIS方法的可选步骤
可选地，在IRIS方法中可以进一步包括将加上接头的单链DNA片段环化，并且扩增该环化的单链DNA片段以制备测序文库。
DNA环化
可选地，可以对上述经亚硫酸氢盐处理的DNA片段进行5'末端的磷酸化和3'末端的去磷酸化处理(参见附图2中虚线框中内容)。具体地，可以使用T4PNK并依照相应的说明书配置反应液并进行DNA片段的处理。例如，在50μl反应体系中加入5-50pmol单链DNA模板、5μl的10x T4PNK反应溶液、1μl的1mM ATP和10U的T4PNK酶，定容至50μl后将反应体系置于37℃孵育30分钟，最后经80℃孵育10min以使得T4PNK失活。
将经亚硫酸氢盐处理的DNA片段(经5'末端的磷酸化和3'末端的去磷酸化处理或未经该处理)置于95℃孵育2min使得上述DNA片段变性为单链DNA片段。一个典型的环化反应体系如下表所示：
表1.典型的环化反应体系
可以例如根据如下配方配置反应液：10pmol单链DNA模板、2μl CircLigase10x的反应溶液、1μl 1mM的ATP、1μl 50mM的MnCl2、1μl CircLigaseTM ssDNA Ligase(100U)，定容至20μl。并将上述配置的反应液置于60℃孵育1个小时。最后将反应溶液置于80℃孵育10min以使得CircLigaseTM ssDNA Ligase失活。(参见附图3中实线框中内容)
环化DNA的扩增
上述环化的DNA可以直接用于后续测序，或者当该环化的DNA丰度较低时，可以先对其进行扩增再将扩增产物应用于后续的测序步骤中去。
对环化DNA的扩增可以采取本领域技术人员公知的任何方法，较为常见的包括反向扩增和滚环扩增。
反向PCR扩增
反向PCR扩增可用于研究与已知DNA区段相连接的未知区段的序列，也可用于扩增环状的DNA片段，其中使用的引物对虽然与已知DNA区段内的两段相邻序列互补，但两引物3'端是相互反向的(参见附图3中的引物对：引物1和引物2、引物3和引物4；即每对引物对中两个引物的5'端相邻)。通过反向PCR扩增引物向上下游进行延伸，从而环状DNA的线性扩增产物(具体参见附图3)。
在反向PCR扩增中使用的反应条件与经典的聚合酶链反应所用条件的相似，例如使用Taq聚合酶，先对DNA进行94℃的30秒变性，之后重复58℃引物退火30秒合70℃延伸3分钟的步骤30个循环。
滚环扩增
可使用针对环化DNA已知的部分序列设计的引物或以针对环化DNA在环化前一端或两端接入的接头部分序列的引物来扩增环化的DNA，以产生多拷贝的线性连接的环化DNA的互补序列(参见附图4)。在滚环扩增中使用的反应条件也与经典的聚合酶链反应所用条件的相似，在此不做赘述。
实施例3：IRIS方法与SWIFT方法的比较数据
将IRIS方法与Swift Biosciences公司的Accel-NGS-Methyl-SeqTM方法进行比较。在本实验中使用人cfDNA作为检测对象比较两种方法的灵敏度、成库效率、准确率、mapping覆盖率等。根据上文所述的方法检测富集得到的cfDNA的浓度，分别取1ng、3ng、5ng、10ng的cfDNA进行检测，各检测均取两个样本进行平行实验。根据上文所述的方法制备IRIS文库，同时根据制造商的产品说明书(Cat#DL-ILMMS-12/48)构建SWIFT文库。根据输入的DNA量来调节线性扩增和/或文库制备过程中的PCR循环数，使用Qubit dsDNA HS试剂盒检测文库中的DNA浓度。接着使用探针面板(probe panel)对构建好的测序文库分别进行富集。取300-500ng DNA文库，使用NextSeq 500对经富集的文库进行测序，测序的读数长度为2x 150bp，随后使用bismark将测序读数与人基因组hg19的序列进行比对。在表2中列出的参数的基础上对文库的质量进行评估。
使用类似的总测序序列(reads)数(>10,000,000)以约65％～70％的定位率对所有检测的样本进行分析。如图2所示，SWIFT检测中，仅初始DNA量达10ng的样本达到了质控标准，由更低初始DNA量(5ng、3ng或1ng)的样本制备的文库虽然在去除重复读数前的平均诱饵覆盖率以及中靶率较高，其不能达到足够的平均诱饵/靶标覆盖率及均一性，即制备得到的文库不能产生足够的多样性。相反地，所有检测的IRIS文库(由初始DNA量为10ng、5ng、3ng及1ng的样本制备的)均达到了质控标准，显示适合用于后续检测，且即使是1ng初始DNA量的IRIS文库也能获得比10ng初始DNA量的SWIFT文库更好的效果。根据检测得到的数据还对IRIS和SWIFT方法分别的文库转化率进行了估算和比较。文库转化率的估算值为文库中分子数的估算值除以与输入DNA的量相对应的理论分子数。其中通过测序的深度以及基于Poisson分布的检测到的测序多样性(检测分子数)计算文库中分子数的估算值。每个cfDNA样本的转化率均被计算并总结在表3中，表3结果显示IRIS方法能够提供高于SWIFT方法至少5倍的转化率。
表2：IRIS方法与SWIFT方法的数据结果比较
表3：IRIS方法与SWIFT方法的文库转化率比较
应当理解，尽管在上文的实施例中详细地描述了本发明公开的方法的一些具体步骤的操作方法，但是这种描述仅仅是示例性的而并非是对本发明的限制。实际上，根据本发明的实施例，本技术领域的一般技术人员可以通过研究说明书、公开的内容及附图和所附的权利要求书，理解和实施对披露的实施方式的其他改变。除非文中另有明确说明，本文所使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”旨在也包括复数形式。本文中所用术语“包含(comprises)”，“包含(comprising)”，“包括(includes)”和/或“包括(including)”指定存在所陈述的特征，整数，步骤，操作，元件和/或部件，但不排除存在或添加一个或多个其它特征，整数，步骤，操作，元件，组件和/或它们的组。本文公开的体积、浓度、个数等数值不应被理解为仅限于所记载的确切数值。实际上，除非另有说明，每一个这样的数值意在既表示记载的数值又表示该数值附近的功能性等同范围。例如,公开为“20μL”的体积意在表示“约20μL”。本文所述“约”、“基本上”、“大概”、“近似”等旨在表示其描述数值或范围的±5％的数值或范围。同时，虽然本发明已经说明和描述了一些特定实施方式，本领域技术人员能够清楚知晓可以作出许多其他的改变和修饰而并不偏离本发明的主旨和范围，因此所附的权利要求旨在覆盖所有这些本发明主旨和范围内的改变和修饰。
除非明确排除或另有限制，本文引用的任何文档，包括任何交叉引用的或相关的专利或专利申请，其全部内容通过引用整体并入本文。本文对任何文档的引用并不代表承认该文档本身或其结合其他参考文献、教导、启示或任何此类发明的公开是本文公开的或要求保护的发明的在先技术。而且，当本文中任何术语的意思或定义与引用文档中相同术语的意思或定义相冲突时，以本文定义的术语意思或定义为准。

Claims (37)

1.一种用于检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的方法，其包括以下步骤：
用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，并且获得单链DNA片段；
在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；
使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；
对所述DNA测序文库进行测序以鉴定所述单链DNA片段的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括对经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段进行变性处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段两端加上接头。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段3'端加上第一接头，线性扩增所述3'端加上接头的单链DNA片段，并且通过单链DNA连接酶在所述3'端加上第一接头的单链DNA片段的扩增产物的3'端加上第二接头。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述接头包括DNA分子标签。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述索引引物包括全部或部分与所述接头互补的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在经亚硫酸氢钠处理前使用第二类限制性内切酶处理DNA片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第二类限制性内切酶选自下组：HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。
9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在制备DNA测序文库之前，环化所述加上接头的单链DNA片段。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用高效环化试剂环化所述加上接头的单链DNA片段。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因组位置。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述制备DNA测序文库的步骤包括：在所述环化步骤后，使用索引引物扩增环化的单链DNA片段，并且获得由包含所述特定基因组位置的DNA扩增产物组成的所述DNA测序文库。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增的步骤使用反向PCR扩增。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增的步骤使用滚环扩增。
17.根据权利要求1所述的方法，所述测序步骤使用高通量DNA测序技术测定包含所述特定基因组位置的所述DNA测序文库的DNA序列。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备DNA测序文库的步骤进一步包括：在扩增步骤后使用寡核苷酸探针富集特定扩增产物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品中的DNA包含细胞外的游离DNA，优选地，所述细胞外游离DNA也包括循环肿瘤DNA。
20.一种用于检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒，包括：
亚硫酸氢钠，所述亚硫酸氢钠以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
单链DNA连接试剂，所述单链DNA连接试剂能够连接单链DNA片段和接头序列；
文库制备试剂，其可用于扩增包含所述特定基因组位置的单链DNA片段。
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述单链DNA连接试剂包括接头序列DNA片段、单链DNA连接酶、反应溶液。
22.根据权利要求20所述的试剂盒，其中进一步包括线性扩增试剂，所述线性扩增试剂包括线性扩增引物，其包括部分或全部与已连接至单链DNA片段的一端的接头互补的序列。
23.根据权利要求20所述的试剂盒，其中进一步包括切割试剂，其可用于在亚硫酸氢钠处理前对所述DNA片段进行切割处理，使得切割得到的DNA片段大小为0.01-5kb、0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb、0.1-0.5kb、0.01-0.5kb、0.01-0.4kb、0.01-0.3kb、0.01-0.25kb、0.02-0.25kb、0.05-0.3kb或0.05-0.25kb。
24.根据权利要求20所述的试剂盒，其中进一步包括测序试剂。
25.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述文库制备试剂包括索引引物。
26.根据权利要求20所述的试剂盒，其中进一步包括环化试剂，所述环化试剂能够将单链DNA片段环化。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述环化试剂为高效环化试剂。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述高效环化试剂为单链DNA环化酶。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述环化试剂进一步包括T4PNK，其可用于对DNA片段进行5'末端进行磷酸化处理和3'末端进行去磷酸化处理。
30.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述文库制备试剂包括用于反向PCR扩增的试剂或用于滚环扩增的试剂。
31.一种单链DNA连接试剂在制备检测包含DNA的样品中DNA片段的特定基因组位置的甲基化的试剂盒中的用途，其中所述检测包括以下步骤：
用亚硫酸氢钠处理包含特定基因组位置的所述DNA片段，所述亚硫酸氢钠处理能够使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶,并且获得单链DNA片段；
使用单链DNA连接试剂在所述单链DNA片段的一端或两端加上接头；
使用索引引物对所述加上接头的单链DNA片段进行扩增以制备包含所述特定基因组位置的DNA测序文库；
对制备得到的DNA测序文库进行测序。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述检测进一步包括：对经亚硫酸氢钠处理过的所述DNA片段进行变性处理。
33.根据权利要求31所述的用途，其中通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段两端加上接头。
34.根据权利要求31所述的用途，其中通过单链DNA连接酶在所述单链DNA片段3'端加上接头，线性扩增所述3'端加上接头的单链DNA片段，并且通过单链DNA连接酶在所述3'端加上接头的单链DNA片段的扩增产物的3'端加上接头。
35.根据权利要求31所述的用途，其中所述检测进一步包括：使用高效环化试剂环化所述加上接头的单链DNA片段，并且在所述环化步骤后扩增环化的所述单链DNA片段，其中所述测序步骤为测定扩增产物的序列。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述检测进一步包括在将所述单链DNA片段环化前，对所述DNA片段的5'末端进行磷酸化处理和对3'末端进行去磷酸化处理。
37.根据权利要求31所述的用途，其中所述检测进一步包括：在测序步骤前使用寡核苷酸探针富集包含特定基因组位置的DNA片段的扩增产物。
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