CN105274629A - 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 - Google Patents
简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105274629A CN105274629A CN201510792459.4A CN201510792459A CN105274629A CN 105274629 A CN105274629 A CN 105274629A CN 201510792459 A CN201510792459 A CN 201510792459A CN 105274629 A CN105274629 A CN 105274629A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- joint
- mixture
- methylate
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 19
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 18
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 17
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 16
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000011161 development Methods 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 14
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101100008050 Caenorhabditis elegans cut-6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000011365 genetic imprinting Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种可适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。
背景技术
DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA甲基化检测的金标准全基因组重亚硫酸盐测序WGBS或BS-Seq(Wholegenomebisulfatesequencing)[1]，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏度。然而，正是由于BS-Seq能够对全基因组甲基化检测，也导致了测序深度高、测序费用高等弊端。
2005年AlexanderMeissner等[2]在NucleicAcidsResearch首次提出简化的表观重亚硫酸氢盐测序技术(RRBS，ReducedRepresentationBisulfiteSequencing)，该方法通过MspI酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，同时实现CpG位点的单碱基精度检测的高分辨率和测序数据的高利用率。RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法，可以实现多个样本的比对基因组分析，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。
目前，RRBS测序技术主要用于人和小鼠，需要2-5ug基因组DNA起始构建文库。传统的RRBS文库构建方法如下：
(1)gDNA酶切：2～5μg基因组DNA起始量，采用MspI酶切gDNA，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
(2)末端修复：以dNTP为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和Klenow片段对酶切后的粘性末端修复成平末端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
(3)加“A”：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow片段(3'-5'exo-)为平末端3'端加A，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
(4)加“甲基化接头”：采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA片段两端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
(5)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收150-325bp范围内的片段，QIA-quickGelExtractionKit进行胶纯化回收；
(6)重亚硫酸氢盐处理：加入一定比例λ-DNA至胶回收产物作为对照，采用EZDNAMethylation-GoldKit对胶回收产物进行Bisulfite反应；
(7)PCR扩增：采用KAPAHiFiHotStartUracil+ReadyMix对Bisulfite产物进行PCR扩增，扩增产物Ampure磁珠纯化，文库构建完成；
(8)文库质控：对文库进行2100峰图和QPCR质控，合格后高通量测序；
(9)上机测序：根据需求选择测序策略和测序数据量。
RRBS测序技术的高性价比赢得了科研工作者的青睐，特别在多样本分析方面得到广泛的应用，取得了较好的成效。然而，在实际应用过程中，RRBS也显示出一定的局限性，存在的主要问题是：
(1)对于石蜡包埋样本或其他低质量样本，数据浪费严重，数据利用率低；
(2)RRBS建库一般要求起始样本的gDNA量为2～5μg，这使得珍贵的(一般而言都是少量的)临床样本，很难达到建库起始量的要求。
参考文献
[1]Li,N.,etal.,WholegenomeDNAmethylationanalysisbasedonhighthroughputsequencingtechnology.Methods.2010.52(3):p.203-12.
[2]AlexanderMeissner,AndreasGnirke,GeorgeW.Bell,etal.Reducedrepresentationbisulfitesequencingforcomparativehigh-resolutionDNAmethylationanalysis.NucleicAcidsResearch.2005,33(18):5868-5877.
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在末端修复步骤中使用dCTP、dGTP与dATP的适当比例的混合物代替传统的dNTP提供单脱氧核糖核苷酸、且将末端修复步骤与加A步骤合并进行，可是实现适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：
步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；
步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片段；
步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。
2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA的量为50～500ng。
3.根据项1或2所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA来自于低质量样本。
4.根据项3所述的方法，其中，所述低质量样本是石蜡包埋样本。
5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中的所述混合物中，dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:9～1:1:11。
6.根据项1～5中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中采用包含所述酶切产物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修复及3'端加A；
反应条件为30～50℃、0.5～12小时。
7.根据项1～6中任一项所述的方法，其中，所述步骤C中采用包含所述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化接头；
反应条件为10～30℃、0.5～5小时。
8.根据项1～7中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。
9.一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒，其用于实施项1～8中任一项所述的方法，其包括：
用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合物，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP。
10.根据项9所述的试剂盒，其还包括选自下组中的至少一种或全部：
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂；
用于所述3'端加A的试剂；
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂；
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂；
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂；和
用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂。
发明效果
根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
附图说明
图1为100ng起始量的传统的RRBS建库流程文库RRCS140069-1-52检测结果。
图2为100ng起始量的本发明的RRBS建库流程文库RRCS140071-1-55检测结果。
发明的具体实施方式
首先，在一个方面中，本发明提供一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法(本发明的方法)，该方法包括：
步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；
步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片段；
步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。
在本发明的方法中，所述步骤A中的基因组DNA(gDNA)的量可以为50-500ng。而且，基因组DNA可以来自于低质量样本，这里低质量样本是指其中的基因组DNA已经发生了相当程度的降解的样本，例如石蜡包埋样本(FFPE)。
本发明人经过深入研究发现，传统的RRBS建库方法不适用于低质量样本的原因主要有以下两点：
1.传统的RRBS建库中，末端修复采用dNTPs(dCTP、dGTP、dTTP与dATP的混合物)提供单核苷酸，而降解后的样本gDNA中存在许多降解本身产生的片段，这些片段能够像酶切片段一样被修复补平，从而作为待测序片段进入到最终的文库中。在非CG岛区域，降解后的片段通常不含CG位点，因而这降低了测序数据的利用率，造成数据浪费；
2.传统的RRBS建库中，纯化环节较多，而每次纯化均有损失；同时传统的RRBS建库中片段筛选得到的产物量极低，约在10ng左右，在胶回收过程中极其容易丢失，导致建库失败的风险。
针对上述问题点，本发明人对传统的RRBS建库方法进行了如下改进：
1.对于传统的RRBS建库中dNTP容易引物降解片段末端补平，采用dCTP和dGTP两种底物进行末端修复，因为MspI酶切后产生的粘性末端为CG两个碱基，dCTP和dGTP补平酶切产生的末端不平，能够降低降解片段的补平比例。
2.对于传统的RRBS建库中纯化步骤较多的问题，采用末端修复和加“A”反应合并进行的策略。同时，为了避免加“A”反应中末端加入过多的C和G，使用dCTP：dGTP：dATP为适当摩尔比的混合物(无dTTP)进行末端修复和加“A”合并反应，以此省去末端修复后的纯化过程；同时也可对加“A”后的反应产物不做纯化处理，直接进行加“甲基化接头”的连接反应。此外，采用先PCR扩增再片段筛选的策略，降低建库失败的风险。
3.此外，由于本发明的方法中省略了多个纯化步骤，可能会导致甲基化接头连接效率低。本发明的方法中采用适度延长连接反应时间的方法来提高连接效率。
所述步骤B中的所述混合物中，dCTP：dGTP：dATP的摩尔比优选1:1:9～1:1:11，更优选为1:1:10。该摩尔比对本发明的方法而言是至关重要的。所述步骤B中采用包含所述前一步的酶切产物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修复及3'端加A，这意味着步骤B的反应体系中不包含dTTP。除了使用所述混合物代替dNTP之外，该反应体系可以包含传统RRBS建库方法中用于末端修复和3'端加A的那些试剂。
所述步骤B的反应条件可以为30～50℃，0.5～12小时。
所述步骤C中可以采用包含所述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化接头，该反应体系可以与传统RRBS建库方法中用于加甲基化接头的反应体系相同。但，反应条件需适当优化，以使连接反应进行得更加充分，例如可以为10～30℃(优选20℃)、0.5～5小时。
步骤D、步骤E和步骤F均可以采用传统RRBS建库中用于该步骤的方法或试剂来进行。需要说明的是，传统的RRBS建库中依次进行片段筛选、重亚硫酸氢盐处理和PCR扩增。
优选地，本发明的方法中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。所述纯化步骤可以采用传统RRBS建库中用于该产物的纯化的方法、试剂或装置来进行。
在另一个方面中，本发明还提供一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒(本发明的试剂盒)，其可用于实施本发明的方法。
本发明的试剂盒必须包含用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合物，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:10～1:1:20、优选1:1:9～1:1:11、更优选1:1:10，且该混合物中不包含dTTP。
优选地，本发明的试剂盒还可以包括选自下组中的至少一种或全部：
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂，例如MspI酶及相应的酶切反应缓冲液等；
用于所述3'端加A的试剂，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应的反应缓冲液等，可以与所述的用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂相同；
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂，例如甲基化接头、T4DNA连接酶及相应的连接反应缓冲液；
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂，例如EZDNAMethylation-GoldKit(Zymo公司产品)等；
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂，例如KAPAHiFiHotStartUracil+ReadyMix、Ann公共引物、Index引物等；
用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂，例如QIA-quickGelExtractionKit(Qiagen公司产品)等。
除了采用所述混合物代替dNTPs以外，本发明的试剂盒中所包含的试剂、装置等可以与用于传统的RRBS建库方法的试剂盒中包含的那些相同。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是用于解释本发明，而非用于限定本发明。
以石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，分别采用传统的RRBS建库流程和本发明的RRBS建库流程构建文库，文库构建、文库质控和信息分析结果如下。
7.1文库构建
以同一份石蜡包埋保存两年的人乳腺癌样本为材料，构建的两个RRBS文库的相关参数如下表：
7.1.1传统的RRBS建库流程
(1)MspI酶切：100ng起始量建库，按照下表反应体系进行酶切，37℃酶切6小时；
酶切产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，75.0μLEB洗脱。
(2)末端修复和加A：按照下表反应体系进行末端修复，条件20℃反应30分钟；
产物过膜纯化，32.0μLEB洗脱。
(3)加“甲基化接头”反应：按照下表反应体系进行加接头反应，条件20℃反应15分钟；
加接头反应产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，30.0μLEB洗脱。
(4)片段筛选：2％琼脂糖凝胶电泳回收150～325bp文库，QIA-quickGelExtractionKit进行胶纯化回收，20μLddH2O洗脱。
(5)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMethylation-GoldKit对上步产物进行重亚硫酸氢盐处理，34μLEB洗脱。
(6)PCR扩增：按下表体系进行反应，扩增条件为95℃5分钟；98℃30秒，(98℃10秒，62℃30秒，72℃30秒)12cycles；72℃5分钟，4℃保存；
反应产物用1.8倍Ampure磁珠纯化，30μLEB洗脱。
(7)至此，传统的RRBS建库流程文库构建完毕，共需要3天完成整个文库构建，文库命名为RRCS140069-1-52。
7.12本发明的RRBS建库流程
(1)MspI酶切：100ng起始建库，按照下表反应体系进行酶切，37℃酶切6小时；
酶切产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，16.0μLEB洗脱。
(2)末端修复和加“A”：按下表体系进行反应，条件为37℃反应1小时；
反应产物不纯化，直接进行加“甲基化接头”反应。
备注：dNTP(无dTTP)中不含有dTTP，只有dCTP、dGTP和dATP三种，并且dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:10。
(3)加“甲基化接头”：按下表体系进行反应，条件为20℃反应1小时；
反应产物用QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化，20μLddH2O洗脱。
(4)重亚硫酸氢盐处理：采用EZDNAMethylation-GoldKit对上步产物进行重亚硫酸氢盐处理，17.0μLEB洗脱。
(5)PCR扩增：按下表体系进行反应，扩增条件为98℃2分钟；(98℃20秒，60℃30秒，72℃1分钟)15cycles；72℃5分钟，4℃保存；
反应产物用1.8倍Ampure磁珠纯化，30μLEB洗脱。
(6)片段筛选：2％琼脂糖凝胶电泳回收150～325bp文库，QIA-quickGelExtractionKit进行胶纯化回收，15μLEB洗脱。
(7)至此，本发明的RRBS建库流程文库构建完毕，共需要2天完成整个文库构建，文库命名为RRCS140071-1-55。
7.2文库质控
将7.1中构建完成的两个RRBS文库用安捷伦2100生物分析仪进行质检，图谱如下。图1为100ng起始量的传统的RRBS建库流程文库RRCS140069-1-52检测结果，图2为100ng起始量的本发明的RRBS建库流程文库RRCS140071-1-55检测结果。
由2100检测图可看出，图2中150～300bp之间存在RRBS文库2100峰图最常见的两个尖峰，但是图1中150～300bp之间只存在RRBS文库2100峰图最常见的一个尖峰。说明针对起始量低的FFPE样本来说，改进后的RRBS建库流程构建的文库片段分布与标准的RRBS建库流程文库一致，文库质控合格；但是如果采用传统的RRBS建库流程，针对FFPE样本构建出的文库则丢失掉了一大部分的信息。从文库质检的结果上表明我们发明的RRBS建库的方法更适合于微量低质量的样本。
7.3信息分析
对传统方法构建的RRBS文库RRCS140069-1-52和本发明的RRBS文库RRCS140071-1-55进行SE50测序，对数据进行过滤比对后，所得到的数据质控结果如表1。
表1两种RRBS建库流程文库信息质控结果
由表1可看出，100ng起始量的DNA采用传统方法做出的结果在EnzymeCuttingRate(％)、CleanQ30BasesRate(％)、UniqueMappedRate(％)等参数都差于我们发明的方法做出的结果。另外，同样100ng起始量采用我们发明的方法构建文库的5mC假阳性率比传统方法构建文库降低约1/2，使得测序结果更符合CG位点中C的真实甲基化状态。
还需要说明的是，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案；并且，在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下，作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合，来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案，并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
Claims (10)
1.一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：
步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；
步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；
步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片段；
步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；
步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA的量为50～500ng。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA来自于低质量样本。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述低质量样本是石蜡包埋样本。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤B中的所述混合物中，dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:9～1:1:11。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤B中采用包含所述酶切产物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修复及3'端加A；
反应条件为30～50℃、0.5～12小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤C中采用包含所述3'端加A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化接头；
反应条件为10～30℃、0.5～5小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。
9.一种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒，其用于实施权利要求1～8中任一项所述的方法，其包括：
用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合物，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其还包括选自下组中的至少一种或全部：
用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂；
用于所述3'端加A的试剂；
用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂；
用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂；
用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂；和
用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510792459.4A CN105274629B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510792459.4A CN105274629B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105274629A true CN105274629A (zh) | 2016-01-27 |
| CN105274629B CN105274629B (zh) | 2017-11-17 |
Family
ID=55144430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510792459.4A Active CN105274629B (zh) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105274629B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106854679A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-06-16 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 甲基化dna检测方法 |
| CN107858409A (zh) * | 2017-11-12 | 2018-03-30 | 深圳市易基因科技有限公司 | 一种微量降解基因组dna甲基化建库测序方法及其试剂盒 |
| CN109593839A (zh) * | 2017-09-29 | 2019-04-09 | 上海交通大学 | 一种dna突变及甲基化状况检测方法 |
| CN112553298A (zh) * | 2019-09-10 | 2021-03-26 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102409408A (zh) * | 2010-09-21 | 2012-04-11 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法 |
| CN103088433A (zh) * | 2011-11-02 | 2013-05-08 | 深圳华大基因科技有限公司 | 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用 |
| CN104894233A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-09-09 | 上海昂朴生物科技有限公司 | 一种多样本多片段dna甲基化高通量测序方法 |
| CN105002569A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-10-28 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 转录组文库及其构建方法 |
-
2015
- 2015-11-17 CN CN201510792459.4A patent/CN105274629B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102409408A (zh) * | 2010-09-21 | 2012-04-11 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法 |
| CN103088433A (zh) * | 2011-11-02 | 2013-05-08 | 深圳华大基因科技有限公司 | 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用 |
| WO2013064066A1 (zh) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 深圳华大基因科技有限公司 | 全基因组甲基化高通量测序文库的构建方法及其应用 |
| CN104894233A (zh) * | 2015-04-22 | 2015-09-09 | 上海昂朴生物科技有限公司 | 一种多样本多片段dna甲基化高通量测序方法 |
| CN105002569A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-10-28 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 转录组文库及其构建方法 |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106854679A (zh) * | 2016-02-03 | 2017-06-16 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 甲基化dna检测方法 |
| CN106854679B (zh) * | 2016-02-03 | 2021-06-18 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 甲基化dna检测方法 |
| CN109593839A (zh) * | 2017-09-29 | 2019-04-09 | 上海交通大学 | 一种dna突变及甲基化状况检测方法 |
| CN107858409A (zh) * | 2017-11-12 | 2018-03-30 | 深圳市易基因科技有限公司 | 一种微量降解基因组dna甲基化建库测序方法及其试剂盒 |
| CN107858409B (zh) * | 2017-11-12 | 2021-05-04 | 深圳市易基因科技有限公司 | 一种微量降解基因组dna甲基化建库测序方法及其试剂盒 |
| CN112553298A (zh) * | 2019-09-10 | 2021-03-26 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 |
| CN112553298B (zh) * | 2019-09-10 | 2023-06-23 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种可以改善全基因组甲基化测序偏向性的建库方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105274629B (zh) | 2017-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7256748B2 (ja) | エラーが訂正された核酸配列決定への適用を伴う標的化核酸配列濃縮のための方法 | |
| US11155813B2 (en) | Semi-random barcodes for nucleic acid analysis | |
| CN102796808B (zh) | 甲基化高通量检测方法 | |
| EP2663655B1 (en) | Paired end random sequence based genotyping | |
| EP3555305B1 (en) | Method for increasing throughput of single molecule sequencing by concatenating short dna fragments | |
| Morgan et al. | Genetic diagnosis of familial breast cancer using clonal sequencing | |
| CN103103624B (zh) | 高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
| Devonshire et al. | Application of next generation qPCR and sequencing platforms to mRNA biomarker analysis | |
| Kivioja et al. | Counting absolute number of molecules using unique molecular identifiers | |
| CN102409408B (zh) | 一种利用微量基因组dna进行全基因组甲基化位点精确检测的方法 | |
| KR20170020704A (ko) | 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법 | |
| WO2018195217A1 (en) | Compositions and methods for library construction and sequence analysis | |
| CN103806111A (zh) | 高通量测序文库的构建方法及其应用 | |
| CN103060924A (zh) | 微量核酸样本的文库制备方法及其应用 | |
| CN105274629A (zh) | 简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒 | |
| CN108138228B (zh) | 用于下一代测序的高分子量dna样品追踪标签 | |
| CN102978206A (zh) | 一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法 | |
| US20220073977A1 (en) | Methods and materials for assessing nucleic acids | |
| CN103571822B (zh) | 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法 | |
| CN105506084A (zh) | 快速高效检测基因组dna羟甲基化的方法及试剂盒 | |
| CN102978205A (zh) | 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法 | |
| US20230304069A1 (en) | Methods and compositions for single cell analysis | |
| EP3988665B1 (en) | Method and use for construction of sequencing library based on dna samples | |
| CN105349528A (zh) | 用于全基因组甲基化重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法 | |
| KR20220161754A (ko) | 표적 dna 증폭 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100176 Beijing City, Daxing District branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street 88 Hospital No. 8 Building 2 unit 701 room Applicant after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Address before: 100176 Beijing City, Fengtai District branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street 88 Hospital No. 8 Building 2 unit 701 room Applicant before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171114 Address after: 100176 Beijing branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street 88 Hospital No. 8 Building 2 unit 701 room Co-patentee after: BEIJING ANNOROAD MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Patentee after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Co-patentee after: ZHEJIANG ANNOROAD BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Co-patentee after: ANNOROAD (YIWU) MEDICAL INSPECTION CO.,LTD. Address before: 100176 Beijing City, Daxing District branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street 88 Hospital No. 8 Building 2 unit 701 room Patentee before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240410 Address after: Room 701, Unit 2, Building 8, No. 88 Kechuang 6th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing, 100176 Patentee after: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: BEIJING ANNOROAD MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Address before: 100176 room 701, unit 2, building 8, courtyard 88, Kechuang 6th Street, Beijing Economic and Technological Development Zone, Beijing Patentee before: ANNOROAD GENE TECHNOLOGY (BEIJING) Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: BEIJING ANNOROAD MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd. Patentee before: ZHEJIANG ANNOROAD BIO-TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: ANNOROAD (YIWU) MEDICAL INSPECTION CO.,LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |