CN102978205A - 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明基于illumina公司的Hiseq测序平台提供的接头序列和测序流程,设计了内切酶特异性的粘性末端序列接头,成功的建立了DNA标签文库的建库方法,并应用于Hiseq2000测序,开发分子标记,从而应用于群体遗传学研究和遗传图谱的绘制。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序领域,尤其涉及一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。
背景技术
RAD(restriction association site DNA) 是酶切位点附近的DNA序列标签。RAD可以作为一种分子标记应用于基因定位,图谱绘制等。RAD标记的密度可以通过在分离的过程中应用不同的内切酶获得。RAD标记技术与第二代测序技术的完美结合,能够快速而且高通量的实现标记开发,图谱绘制等。RAD标记技术能够降低基因组的复杂度,不受基因组序列有无的限制,操作简便,能够快速的开发出大量的分子标记,从而广泛应用于群体的遗传研究。
发明内容
为了实现上述的技术目的,本发明提供了一种标记开发的高通量测序的接头及其运用方法。
本发明的一个目的是提供两种特殊结构的接头分子A和B。
本发明提供的双链接头DNA序列分子A,包括正向和反向两条链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成:与Illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列P7相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列;反向链与正向链除了突出的粘性末端外,其余序列与正向链互补,并在5’末端进行磷酸化修饰。接头A的结构如图1所示。
前述的提供的双链接头DNA序列分子A,其中所述的正向链为序列表中序列1。
前述的提供的双链接头DNA序列分子A,其中所述的与illumina公司的Hiseq2000测序平台测序序列p7相同的寡核苷酸片段,为序列表中序列1的第5-61位。
前述的提供的双链接头DNA序列分子A,其中所述的与待测DNA的3’端互补的粘性酶切位点序列,为序列表中序列1的第1-4位。
前述的提供的双链接头DNA序列分子A,其中所述的反向链为序列表中序列2。
前述的提供的双链接头DNA序列分子A,其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰,为序列表中序列1的第1位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。
本发明提供的局部双链的接头DNA序列分子B,包括一个长的正向链和一个短的反向链。正向链从5’末端到3’末端依次由如下部分组成:与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段和与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸突出末端;反向链与正向链的一部分序列互补并在5’末端进行磷酸化修饰。接头B的结构如图2所示。
前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B,其中所述的正向链为序列表中序列3。
前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B,其中所述的与Illumina公司的测序平台测序序列P5相同的寡核苷酸片段,为序列表中序列3的第1-57位。
前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B,其中所述的与待测DNA的3’端互补的一个脱氧核糖核苷酸为序列表中序列3的第58位。
前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B,其中所述的反向链为序列表中序列4。
前述的提供的局部双链的接头DNA序列分子B,其中所述的在反向链5’末端进行磷酸化修饰,为序列表中序列4的第1位的脱氧核糖核苷酸进行的磷酸化修饰。
本发明的第二个目的是提供一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,包括如下步骤: 1)将所述用于标记开发的基因组DNA用特定的限制性内切酶消化,并将所述的接头A与消化产物连接,得到含有接头A的连接产物;2)对步骤1)得到的连接产物进行打碎,打碎大小集中在300—700bp之间;3)对步骤2)得到的打碎产物纯化回收之后,进行末端补平,加dATP,并进行接头B的连接;4)对步骤3)得到的连接产物进行纯化并定量后进行PCR扩增,并将扩增产物纯化后,在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序;5)进行生物信息分析后,确定酶切位点SNP或INDEL等标记。流程图如图3所示。
前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,步骤1)中,所述将基因组DNA消化的酶切体系包括:酶切缓冲液、限制性内切酶、0.1—1ug的基因组DNA,所述限制性内切酶在酶切体系中的浓度为0.5 U/ul;所述的连接体系包括:上述酶切产物、接头A、ATP、连接酶,所述的接头A 的浓度为100nM,所述的ATP的浓度为1mM,所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5 U/ul。
前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,步骤2)中,所述的打碎的条件为使用covaris打碎仪器并调整相应的参数。
前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,步骤3)中,所述的回收打碎产物的方法为采用PCR产物回收试剂盒进行回收;所述的末端补平体系为使用NEB 公司的Quick Blunting kit 进行;所述的加dATP的体系包括:dATP,加A缓冲液,加dATP的聚合酶,所述的dATP 的浓度为5 mM,所述的聚合酶在所述的反应体系中的浓度为0.05 U/ul;所述的接头B的连接体系包括:接头B,ATP、连接酶,所述的接头B 的浓度为10 uM,所述的ATP的浓度为1mM,所述连接酶在所述连接体系中的浓度为0.5 U/ul。
前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,步骤4)中,所述的PCR体系包括:引物,聚合酶混合物,以及步骤3)中得到的连接产物。所述的引物的浓度为0.2 uM,所述聚合酶混合物在所述PCR体系中所占的50%的体积。
前述的一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,其中所述的基因组DNA为任何单倍体或二倍体材料的DNA,包括动物、植物、微生物等。
本发明的实验证明,本发明提供的接头分子A和B,能够连接到DNA片段的两端,运用本发明的建库方法,成功的构建了DNA文库,并成功的运用在illumina公司的Hiseq2000的测序平台进行测序,获得大量的分子标记位点;同时,可以实现多个样本的混合建库,根据需要调整获取的分子标记的数目。本发明提供了一种便捷,高效,快速的标记开发的方法,在居群遗传、图谱绘制、种质评价和鉴定等研究和应用领域有着广泛的应用前景。
附图说明
图1为接头A的结构示意图;
图2为接头B的结构示意图;
图3为建库流程示意图;
图4为所述材料基因组DNA酶切产物琼脂糖凝胶电泳图;
图5为对酶切基因组DNA产物加上接头A之后的打碎产物的琼脂糖凝胶电泳图(切胶回收前后);
图6 为对加上接头B的连接产物进行PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法,所用核苷酸序列均由上海Invitrogen生物公司合成。所用试剂如无特别说明均为NEB公司的产品,所用水均为超纯水。
1、基因组DNA的酶切和接头A的连接。
1)样品浓度测定:使用Qubit (美国)对样品DNA浓度测定,进行精准定量,并使用0.8% 琼脂糖凝胶,120v电压,电泳1小时,检测样品质量,确保水稻基因组DNA样品完整无降解。
2)以步骤1)检测的水稻基因组DNA100ng~1ug为模板进行限制性酶切。反应体系和反应条件如下:样品DNA (150~250 ng/μl) 0.1-1 μg ,Restriction Enzyme(EcoRI) 1 μl,10×NEB Buffer 2 5 μl,补加H2O至总体积为50 μl,将上述混合液37℃处理15 min~2 h后,65℃处理20 min。取出1ul进行电泳检测,结果表明,酶切充分,得到均匀弥散的条带,如附图4。
3)接头A的连接:在步骤2)得到的消化产物中,补加ATP,T4连接酶,连接缓冲液以及接头A,在室温连接。具体的反应体系和反应条件如下:步骤2)中的消化产物50ul,100 mM ATP 1 μl,10×NEB Buffer 2 1 μl,(1000 u)T4 DNA Ligase,0.5 μl,加H2O 5 μl,100nM Adaptor1 2.5 μl,总共60 ul,室温(或16℃)下连接2h;连接产物65℃20 min,连接酶活性失活。
2、 连接产物的随机打碎,补平,加dATP。
1)将步骤1中得到的连接产物使用 covaris(美国)破碎至300-700bp,使用Qiagen PCR试剂盒回收打碎产物,具体步骤按照Qiagen试剂盒操作说明书进行。
2)对上述回收产物进行末端补平。反应体系和反应条件如下:打碎产物DNA 30 μl,10×Blunting Buffer 5 μl,1 mM dNTP 10 μl,Quick Blunting kit Enzyme Mix,1 μl,加H2O 9 μl,总体系50 μl;反应条件:30 ℃孵育30 min。
3)对步骤2)的补平产物进行纯化:将上述产物进行胶回收,纯化目的片段。1.0% 琼脂糖凝胶电泳,切胶回收300-700bp范围的条带。整个回收过程按照Qiagen胶回收试剂盒操作说明书进行。如附图5。
4)对步骤3)中的纯化产物进行加dATP,反应体系和条件如下:步骤3)中的补平产物,20 μl,100 mM dATP1 μl,10×NEB Buffer 2 3 μl,Klenow exo- (NEB) (50,000 units/ml) 0.3 μl,H2O 5.5 μl,总体积30 μl;反应条件:充分混匀,37 ℃孵育30 min, 75 ℃20 min 热失活。
3、 接头B的连接。
1)将步骤2的连接产物,加入接头B,反应体系和条件具体如下:连接产物30 μl,NEB Buffer 22 μl,10 uM 接头B 2.5 μl,(1000 u)T4 DNA Ligase 0.5 μl,加H2O15 μl,总体积50 μl,室温(或16℃)下连接2小时,连接产物65℃20min,连接酶活性失活。
2)将步骤1)中的连接产物等体积AMP μre XP Beads纯化1次。纯化过程严格按照使用说明书进行。
3)将步骤2)中的回收产物进行Qubit定量,用于下一步PCR反应。
4、 PCR扩增目的片段。
1)将步骤3中回收的产物,精准定量10ng用于PCR反应,得到的PCR产物,即为所构建的文库。反应体系和条件如下:DNA样品3 μl,PCR Primer 11 μl,PCR Primer 2 1 μl,2×Phusion PCR Master Mix 25 μl,H2O 20 μl,总共50 μl,应条件为:先98℃预变性1min;然后98℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共10个循环;最后72℃ 延伸5 min。Primer 1的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’;Primer 2的序列为5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
2)将步骤1)中的PCR产物等体积AMP μre XP Beads纯化两次。纯化过程严格按照使用说明书进行。取出1ul进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,得到300—700富集的条带,如附图6。
3)将步骤2)中的纯化产物进行Qμbit精准定量。
5、 文库库检和上机。
1)将步骤4中所得的纯化产物稀释到1ng/ul,取出1ul用于Agilent2100(美国Agilent公司)检测,另外再取1ul用于QPCR(Biorad公司)检测,根据检测结果,决定上机浓度。
2)根据步骤1)所得的浓度,将文库稀释到上机要求后,在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序。
6、上机结果质控。
1)对水稻RAD基因组数据进行酶切位点分析,共5,533个。
2)对下机数据16M过滤出有酶切位点的reads,再将PEreads用BWA是用较严格的参数比对到水稻基因组上,可以正确成对比上基因组的reads为42,6410对,read2上含酶切位点的总数目为590,905对。
3)BWA比对位置和基因组上酶切位点能够完全重合的数目情况统计如下:过滤后reads正向比对的有4546处,和基因组能完成重合的数目为4370处。
4)有78.9%的酶切位点被覆盖到。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表1
<110> 北京诺禾致源生物信息科技有限公司
<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法
<160> 4
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰
<400> 1
aattgatcgg aagagcgtcg tgtagggaaa gagtgtagat ctcggtggtc gccgtatcat 60
t 61
序列表2
<110> 北京诺禾致源生物信息科技有限公司
<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法
<160> 4
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰
<400> 2
acgtgtgctc ttccgatc 19
序列表3
<110> 北京诺禾致源生物信息科技有限公司
<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法
<160> 4
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
序列表4
<110> 北京诺禾致源生物信息科技有限公司
<120> 一种应用于标记开发的高通量测序的接头及其运用方法
<160> 4
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在第1位碱基进行磷酸化修饰
<400> 4
CTAGCCTTCT CGCAGCAC 18
Claims (5)
1.一种接头序列A,其特征在于,是如下1)或2)的核苷酸:
1)由序列表中序列1和2所示的核苷酸序列组成的接头;
2)将序列表中序列2的核苷酸残基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头A同样功能的核苷酸序列。
2.一种接头序列B,其特征在于,是如下1)或2)的核苷酸:
1)由序列表中序列3和4所示的核苷酸序列组成的接头;
2)将序列表中序列4的核苷酸残基序列经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具与接头B同样功能的核苷酸序列。
3.一种运用上述接头A和B进行高通量测序开发分子标记的方法,其特征在于:分步连接权利要求1中接头A 和权利要求2中接头B,构建DNA文库。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的DNA来源,是植物、动物或者微生物。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,测序平台为illumina Hiseq2000测序平台。
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