CN102373511A

CN102373511A - 一种快速简便构建下一代高通量测序文库的方法

Info

Publication number: CN102373511A
Application number: CN2010102642368A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Wang Yujing
Priority date: 2010-08-27
Filing date: 2010-08-27
Publication date: 2012-03-14

Abstract

本发明涉及下一代高通量测序文库构建方法，适用于Illumina和Roche 454测序平台。该方法包括以下设计思想：主要实验部分在微珠(Beads)上或其他固体表面进行，微珠与含有测序接头序列的双链寡核苷酸相连，DNA/RNA热变性成单链后，与微珠上双链寡核苷酸退火杂交。加入含有聚合酶或反转录酶的溶液进行延伸。清洁后加入另一测序接头和T4DNA连接酶进行连接，最后将产物寡核苷酸从微珠上洗脱下，聚合酶链反应扩增后，测序文库构建完成。主要构建过程依次包括杂交、延伸、连接、洗脱和聚合酶链反应步骤。本发明有益的效果：实验过程快速、简洁、低成本。

Description

一种快速简便构建下一代高通量测序文库的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中下一代高通量测序文库构建方法，适用于Illumina和Roche 454测序平台文库构建。

背景技术

近年来，以Illuminma GAIIx/HiSeq 2000和Roche 454为代表的下一代测序高速发展。以Illumina产品为例，GAII读长从2008年的36碱基发展到现在的100碱基，通量从2008年的48M reads/run发展到现在的240M reads/run，测序能力提高了14倍。到目前为止，HiSeq 2000每个run可以达到2个人基因组30X覆盖的测序通量，约200G/run数据，上机操作时间也减少到了30分钟。另外，测序能力的提升使得将多个样品混合放入一条通道同时测序的方式更加普遍。但测序效率的提升和多样品混合测序的普及对样品的制备效率提出了更高的要求，而现有的样品制备方法经过几年的发展，一直赶不上测序能力的提高。因此，下一代高通量测序样品制备效率和成本成为了高通量测序普及的关键。

下一代高通量测序样品制备过程本质上是将符合测序长度的DNA/RNA插入到已有的测序载体中，即在待测序DNA/RNA两端连上已知的测序接头序列。目前主要采用的方法是先将DNA断裂到一定长度范围，然后经过末端修复及5’末端磷酸化、末端加A、连接接头、胶回收特定范围内的连接产物、PCR等主要步骤(图1)。需要6种主要的酶，4种酶反应体系，经过5次清洁纯化，对实验者分子生物学操作能力要求很高，实现多样品同时处理难度较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备下一代高通量测序文库的方法，整个实验过程简单、快速、成本低、文库质量高，实验结果重复性好。

本发明所提供的下一代高通量测序文库方法，设计思想如附图2所示。主要实验部分在特殊设计的微珠(Beads)上或其他固体表面进行(以微珠为例说明)，微珠与含有测序接头序列的双链寡核苷酸相连，双链寡核苷酸一条链的3’端悬出数个随机合成碱基，另一条链3’端与微珠相连。符合长度要求的DNA/RNA，热变性成单链后，与微珠退火杂交。清洁后加入含有聚合酶(Taq)或反转录酶的溶液进行延伸。如选用可3’末端悬A的聚合酶延伸，再次清洁后可直接加入含3’端悬T的另一测序接头和T4DNA连接酶进行双链连接，否则需使用如Exo-Minus Klenow可悬A的酶加A后进行另一接头连接。然后将产物寡核苷酸从微珠上洗脱下，聚合酶链反应(PCR)扩增后，测序文库构建完成。

本发明包括以下步聚：

1)材料：断裂到指定范围的DNA或RNA。

2)制备方法：

●变性：双链DNA 94℃加热5分钟后，迅速放入冰水2分钟；RNA 65℃加热5分钟后，迅速放入冰水2分钟。

●杂交：将上步中变性好的寡核苷酸迅速与如附图2描述的特殊设计的微珠混匀，室温杂交5分钟。

●清洁：根据所选用微珠进行。

●延伸：DNA时加入聚合酶溶液；RNA时加入1X反转录酶溶液。

●清洁：根据所选用微珠进行。

●连接：加入含3′端悬T的另一测序接头和T4DNA连接酶溶液，室温连接。

●清洁：根据所选用微珠进行。

●洗脱：根据所选用微珠，加入30μL相应的洗脱液洗脱，并收集洗脱产物。

●PCR富集：将洗脱产物进行聚合酶链反应扩增。

*说明：如延伸过程未选用具末端悬A功能的酶，需在延伸步骤后的插入3′末端悬A的步骤，根据所选用的酶进行。

3)文库质量检测

琼脂糖凝胶检测文库的纯度和得率。

本技术与现有技术相比具有以下优点和效果：

本技术文库构建可在2小时内完成，远小于耗时约8小时的传统构建方式，简化了实验过程，缩短操作时间，同时也避免了在实验过程中发生的污染的发生。由于仅用到3种常用酶，成本可降至传统方法的1/5～1/2，便于大规模平行构建。

附图说明

图1传统方式的下一代高通量测序文库构建方法。

图2本发明设计思想。

图3本发明聚合酶链反应扩增后文库的电泳图。

具体实验实施方式

1、取20uL图2描述的特殊设计的磁性微珠放入1.5mL ep管，置于磁力架上静置2分钟，吸走储存液，加入50uL杂交缓冲液。

2、取50uL 20ng/uL片断化后DNA 94℃加热5分钟后，迅速放入冰水2分钟。

3、变性后的DNA迅速与准备的微珠混匀，室温杂交5分钟。

4、将ep管置于磁力架上静置2分钟，吸走管内溶液。加入100uL清洗溶液清洁一次。

5、ep管加入聚合酶(1X LA Taq酶)溶液。

6、将ep管置于磁力架上静置2分钟，吸走管内溶液。加入100uL清洗溶液清洁一次。

7、ep管加入含3′端悬T的另一测序接头和T4DNA连接酶溶液，室温连接30分钟。

8、将ep管置于磁力架上静置2分钟，吸走管内溶液。加入100uL清洗溶液清洁一次。

9、在ep管加入30μL 10mM Tris(pH 8.0)，80℃加热2分钟，迅速将ep管置于磁力架上静置1分钟，将洗脱后的溶液迅速转入一只新ep管中。取15μL洗脱产物进行PCR富集，反应条件是：98℃30秒；98℃10秒，65℃30秒，72℃30秒，18个循环；72℃5分钟。然后将PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。从电泳图上看出，条带长度和设计的片断长度相吻合。经进一步上机测序验证后符合设计要求。

Claims

1.一种快速简便构建下一代高通量测序文库的方法，包含以下内容：

1)设计思想主要实验部分在特殊设计的微珠(Beads)上或其他固体表面进行，微珠或其他固体表面与含有测序接头序列的双链寡核苷酸相连，双链寡核苷酸一条链的3′端悬出数个随机合成碱基，另一条链3′端与微珠相连。

2)实施步骤：

DNA/RNA片断热变性成单链后，与微珠退火杂交。清洁后加入含有聚合酶(Taq)或反转录酶的溶液进行延伸。如选用可3′末端悬A的聚合酶延伸，再次清洁后可直接加入含3′端悬T的另一测序接头和T4DNA连接酶进行双链连接，否则需使用可悬A的酶加A后进行另一接头连接。然后将产物寡核苷酸从微珠上洗脱下，聚合酶链反应(PCR)扩增后，测序文库构建完成。

2.根据权力要求1所述微珠设计方案，其特征在于：微珠或其他固体表面连接的寡核苷酸为双链，含有测序接头，一条链的3′端悬出数个随机合成碱基，另一条链3′端与微珠或固体表面相连。

3.根据权力要求1所述的方法。其特征在于：主要文库构建过程在内容1)设计的微珠或其他固体表面上进行，并依次经历杂交、延伸、连接和洗脱步骤。