CN107142326A - 一种杜泊羊snp标记及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种杜泊羊snp标记及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杜泊羊SNP标记及其筛选方法和应用。本发明根据特有的杜泊羊SNP标记，采用焦磷酸测序法、sanger测序法、基因芯片法、或飞行时间质谱法进行SNP分型分析，鉴定供试品种是否为杜泊羊。本发明的品种真实性鉴定方法与常规测定方法的对比，其操作简便、无位点间的干扰，适于高通量操作；本发明是以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性；5h之内即可完成品种鉴定工作；结果判定简单：鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。

Description

一种杜泊羊SNP标记及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于羊品种鉴定技术领域，尤其涉及一种杜泊羊SNP标记及其筛选方法和应用。
背景技术
杜泊羊(Dorper)源于南非干旱地区肉用型绵羊，是波斯黑头羊与有角陶赛特羊杂交育成，该品种具有生长快、抗旱及抗病能力强、肉质鲜美等优点，被誉为世界钻石级绵羊。杜泊羊适应性极强，好饲养，牧草利用率高，能够在干旱、半热带地区健康成长，繁殖率高。肉羊生产在我国畜牧业中是一个弱项，近年来，我国从国外引进了许多优良肉用绵羊，用来杂交改良本地羊，取得了一定成绩。
了解引进肉用绵羊品种的遗传多样性及其遗传关系，对于品种起源进化研究、种质资源保护以及科学开发利用均具有重要的指导意义。90年代末期，我国黑龙江、宁夏等省区已引进，效果良好。当前，随着电子商贸的发展，更多的养殖户、养殖厂商通过中国畜牧街这类畜牧商贸网站来进行杜泊羊的交易、引种繁育，把它作为终端杂交父本来改善肉品质，具有很好的效果。
目前对于杜泊羊的品种鉴定工作主要依赖于表型性状的鉴定和传统的标记鉴定方法。
随着杂交育种的推广，一方面，高代杂交群体的个体表型与亲本的高度相似，无法单纯地利用杜泊羊的毛色、角型、体型等表型性状特征进行准确区分；另一方面，生产制作出的动物产品已经不能再表现出所属品种的表型性状特征，因此也就无法利用表型性状对其进行鉴别。因此，仅利用表型性状特征进行品种资源的鉴定不够准确、全面和科学。传统的标记鉴定方法诸如细胞学标记、生物化学标记以及免疫学标记，虽然已经在品种鉴定中进行应用，但由于这些标记的多态性低和信息量小，且是对基因的间接反映，受到基因与环境互作的影响比较大，在生产实践中有很大的局限性。
DNA分子遗传标记问世为克服这一难题提供了有效的解决途径。DNA分子遗传标记具有不受表型、时空的限制、多态性好等特点，因此常常被用来进行品种鉴定的工作。其中，最常用的DNA分子标记是微卫星标记和SNP(single nucleotide polymorphism)标记。
微卫星标记被首先用于进行个体鉴定，其缺点是由于不同实验室的条件不同而难以实现标准化和规模化。
单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因组DNA水平上发生的单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。随着山羊与绵羊的全基因组测序工作的完成，羊基因组的信息基本趋于完善。目前已知羊的基因组大约有26亿对碱基，其中可能发生变异的位点多达46401347(NCBIdbSNP142)，平均每60个碱基就可能出现一个SNP。研究表明健康个体之间基因组碱基差异大约为0.1％，即两个随机个体中每1200-1500个碱基就会有一个差异碱基。实验室现有羊基因组信息的个体数量约为600只，SNP位点信息约有40-50M。这些SNPs不仅是造成品种间差异的重要因素，而且大量研究还证实，有些SNP与羊的多种经济性状都有关系。随着SNP分型技术的发展，SNP标记的发现和定位越来越多。相对于以限制性片段长度多态性为代表的第一代遗传标记和微卫星多态性为代表的第二代遗传标记，SNP具有分布广泛、数量多等特点，成为了第三代遗传标记，更加适合于基因性状及品种鉴定的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种杜泊羊SNP标记及其筛选方法和应用。本发明基于SNP位点对杜泊羊品种的真实性进行鉴定，克服了表型性状特征进行品种鉴定的缺陷性。
本发明第一方面，提供一种杜泊羊SNP标记，所述杜泊羊的特异SNP位点如表1所示：
表1
突变类型中“/”左侧表示该SNP位点参考基因组(ref)的碱基类型，“/”右侧表示该SNP位点等位(alt)碱基类型。
本发明第二方面，还提供所述杜泊羊SNP标记的筛选方法，所述杜泊羊SNP标记的筛选方法操作如下：从世界范围内选出多个绵羊个体涵盖多个绵羊品种作为总样本，总样本中杜泊羊个数占0.5～3％，并获得总样本中各绵阳个体10X的全基因组SNP数据，然后从总样本中取出50％～90％的绵羊个体包括3～10只杜泊羊作为实验样本，从实验样本的Allele频率数据中筛选出仅在杜泊羊中高频出现的SNP位点；将总样本中剩余的杜泊羊和其他品种绵羊做验证实验。
筛选时若位点满足在杜泊羊中alt频率与其他各种绵羊在该位点的alt频率的差值在0.75及以上，则该位点即被判断为杜泊羊的特有的高频SNP位点，在此基础上，将实验样本中所述3～10只作为一个群体，其他品种的绵阳作为另一个群体，计算杜泊羊与其他品种绵阳之间的Fst值，仅保留Fst在0.9以上的SNP位点，最后筛选出1522个SNP位点作为杜泊羊的特征SNP位点。
本发明第三方面，还提供一种基于所述SNP标记的杜泊羊品种或其畜产品的鉴定方法，所述鉴定方法利用焦磷酸测序法、sanger测序法、基因芯片法、或飞行时间质谱法进行SNP分型分析，鉴定供试品种是否为杜泊羊。
进一步地，利用焦磷酸测序法进行SNP分型分析，具体操作如下：
步骤(1)采用对应所述SNP位点的PCR引物对(-F和-R)及GoTaqMaster Mix(除了模板、引物和水的其它组份)，分别以供试品种和对照品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
步骤(2)应用PCR引物(-F和-R)，将供试品种和杜泊羊对照品种的PCR扩增产物以及其他原料置于焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序；
步骤(3)测序结束后使用“SNP”模式对30个杜泊羊SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在所述SNP位点上的分型情况，只要有一个SNP位点分型相同即为同一品种，否则，为不同品种。
步骤(1)中PCR扩增反应体系为：总体积为50uL，其中：Master Mix(除了模板、引物和水的其它组份，提供反应环境)25uL，10umol/L PCR引物各1uL，DNA模板2uL，用灭菌去离子水补齐至50uL。
进一步地，利用基因芯片法进行SNP分型分析，具体操作如下：
步骤a、取实验动物，耳静脉取血，从血样中提取基因组DNA。
步骤b、取步骤a得到的基因组DNA，与固有30个探针的核酸芯片进行杂交；
步骤c、完成步骤b后，将核酸芯片中的各个点进行末端延伸，从而获知基因组DNA中30个SNP位点的分型；如果有超过800个SNP位点分型相同即为同一品种，否则为不同品种。
作为优选，判断检验样本是否为杜泊羊时，检验样本在所述杜泊羊SNP标记位点中有高于800个alt阳性位点即可判定样本个体为杜泊羊。
本发明第四方面，还提供所述杜泊羊SNP标记在生物遗传多样性或物种适应性进化研究中的应用。
本发明的特点如下：本发明首先通过全基因组范围内的SNP数据筛选得到杜泊羊特异的SNP位点，为保证所得位点的特异性，本发明实施例中用以分析比较的绵羊个体达800多只，且样本品种覆盖全世界主要大洲超过106个品种；得到的杜泊羊的特异性位点准确性高，基于所述SNP位点可以快速进行杜泊羊个体及其肉质来源的品种鉴定，鉴定时绵羊供试品种有800个及以上的SNP位点分型与德克赛尔羊相同即为同一品种，否则为不同品种。基于所述SNP位点和出现概率，确定了有高准确度的判断依据并经过了严格的检验，用以进行杜泊羊品种鉴定，克服了表型性状特征进行品种鉴定的缺陷性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首先筛选得到杜泊羊可信度极高的特异的SNP位点，并基于所述SNP位点和出现概率，确定了有高准确度的判断依据并经过了严格的检验，用以进行杜泊羊品种鉴定；
本发明的品种真实性鉴定方法与常规测定方法的对比，其操作简便、无位点间的干扰，适于高通量操作；本发明以焦磷酸测序技术为基础，具有很高的准确性；且快速高效，5h之内即可完成品种鉴定工作；鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
以下实施例中涉及的SNP位点筛选方法如下：从世界范围内选出849个绵羊个体涵盖106个绵羊品种，并获得其10X的全基因组SNP数据。其中的杜泊羊有6只，然后从700个绵羊个体包括4只杜泊羊的Allele频率数据中，筛选出仅在杜泊羊中高频出现的SNP位点，筛选策略如下：若位点满足在杜泊羊中alt频率与其他各种绵羊在该位点的alt频率的差值在0.75及以上，则该位点即被判断为杜泊羊的特有的高频SNP位点，基于此种方法筛选出1784个符合要求的SNP位点。在此基础上，将样本中4只杜泊羊作为一个群体，其他个品种作为另一个群体，计算二者之间的Fst值，仅保留Fst在0.9以上的点，故最后筛选出1522个SNP位点作为杜泊羊的特征SNP。验证：将剩余的2只杜泊羊与140只其他品种绵羊做验证实验，结果为：2只杜泊羊的alt阳性位点均高于800，其他品种绵羊的alt阳性位点均少于200。另依据筛选出的位点在453只绵羊数据集中做Pca分析，结果显示杜泊羊群体被明显区分。
实施例1焦磷酸法测定杜泊羊品种
(1)试剂：Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液；上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物；Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序：扩增反应的总体积为50μL，其各种成分分别为：2×GoTaqMaster Mix25μL，10μmol/L引物各1μL，对供试品种和对照品种DNA模板2μL(黄瓜种子DNA)，用灭菌去离子水补齐至50μL；反应程序：95℃预变性10min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸45S，循环50次，最后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)测序反应体系：50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharosebeads，1300rpm涡旋混匀15min，经Vacuum prep workstation单链分离，释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中，80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温；将酶(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓，即可上机测序。
(4)测序时间8～10min，测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的30个绵羊SNP位点进行分型分析，比较供试品种和对照品种在1522个SNP位点上的分型情况。对照品种和供试品种1为杜泊羊，供试品种2为杜泊杂种羊。结果表明，供试品种1与对照品种在986个SNP分型结果上相同，所以供试品种与对照品种为同一品种，即是杜泊羊。供试品种2与对照品种在754个SNP分型结果上相同，所以供试品种2是混有杜泊羊血统的杂种羊。
焦磷酸法测序时：测序引物与PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育；四种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反应体系，如与模扳配对(A—T，C—G)，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测，并由可见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。
实施例2PCR扩增法测定杜泊羊品种
随机选择24只阿勒泰羊，24只巴音布鲁克羊和29只杜泊羊作为样品个体，采集这些羊的血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至100ng/ul，保存备用。采用表2所列引物以待测样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系为：加入0.4μL的TaqDNA polymerase(5U/μL)，5μL的10×PCR Buffer，4μL的MgCl2(25mmol/μL)，1μL的Forwardprimer(10pmol/μL)，1μL的Reverse primer(10pmol/μL)，4μL的dNTP(2.5mmol/μL)，2μL的模板DNA和32.6μL的ddH2O，共50μL。
采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物的回收与纯化。收集产物进行测序，之后对测序结果进行进行序列匹配，找到SNP位置并分析，确定SNP类型。比较待测样本和对照品种在1522个SNP位点上的分型情况，最终29份血液样本在1522个位点上至少有850个以上的匹配，最多达到998个匹配；其余48份样本全无位点匹配，对于杜泊羊的鉴定的准确性均达到了100％，其中全部匹配为杜泊羊，否则，不是杜泊羊。
实施例3基因芯片法测定杜泊羊品种
步骤1、取实验动物，耳静脉取血，从血样中提取基因组DNA。
步骤2、取步骤1得到的基因组DNA，与固有30个探针(30个探针分别为序列表2的序列1至序列30所示的单链DNA分子)的核酸芯片进行杂交。
步骤3、完成步骤2后，将核酸芯片中的各个点进行末端延伸，从而获知基因组DNA中30个SNP位点的基因型。
步骤4、取步骤1得到的基因组DNA，进行全基因组测序，获知基因组DNA中1522个SNP位点的基因型。结果表明，步骤3的结果和步骤4的结果完全一致。杜泊羊的48头实验动物的1522个SNP位点中能够至少匹配上861～998个位点。非杜泊羊的16头实验动物的1522个SNP位点匹配个数都低于750。

Claims (6)

1.一种杜泊羊SNP标记，其特征在于，所述杜泊羊的特异SNP位点如下：
突变类型中“/”左侧表示该SNP位点参考基因组(ref)的碱基类型，“/”右侧表示该SNP位点等位(alt)碱基类型。
2.如权利要求1所述的杜泊羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，所述杜泊羊SNP标记的筛选方法如下：从世界范围内选出多个绵羊个体涵盖多个绵羊品种作为总样本，总样本中杜泊羊个数占0.5～3％，并获得总样本中各绵阳个体10X的全基因组SNP数据，然后从总样本中取出50％～90％个绵羊个体包括3～10只杜泊羊作为实验样本，从实验样本的Allele频率数据中筛选出仅在杜泊羊中高频出现的SNP位点；将总样本中剩余的杜泊羊和其他品种绵羊做验证实验。
3.如权利要求2所述的杜泊羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，筛选时若位点满足在杜泊羊中alt频率与其他各种绵羊在该位点的alt频率的差值在0.75及以上，则该位点即被判断为杜泊羊的特有的高频SNP位点，在此基础上，将实验样本中所述3～10只作为一个群体，其他品种的绵阳作为另一个群体，计算与其他品种绵阳之间的Fst值，仅保留Fst在0.9以上的SNP位点，最后筛选出1522个SNP位点作为杜泊羊的特征SNP位点。
4.一种基于如权利要求1所述的SNP标记的杜泊羊品种或其畜产品的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法利用焦磷酸测序法、sanger测序法、基因芯片法、或飞行时间质谱法进行SNP分型分析，鉴定供试品种是否为杜泊羊。
5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，判断检验样本是否为杜泊羊时，检验样本在所述杜泊羊SNP标记位点中有高于800个alt阳性位点即可判定样本个体为杜泊羊。
6.如权利要求1所述的杜泊羊SNP标记在生物遗传多样性或物种适应性进化研究中的应用。
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