CN106011259A - 多浪羊snp标记及其筛选方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多浪羊SNP标记及其筛选方法与应用，属于动物分子标记领域。本发明通过遗传分化系数方法从商业化绵羊基因组SNP芯片中筛选并进一步通过连锁不平衡分析剔除强连锁不平衡的SNP标记(r2>0.2)，从而获得本发明多浪羊SNP标记。本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定且标记间不存在显著的连锁不平衡，因此，在应用本发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，无位点之间的干扰，大大提高了多浪羊品种鉴定的准确性，并有效降低了鉴定成本。
Description
技术领域
本发明属于动物分子标记领域，具体涉及多浪羊SNP标记及其筛选方法与应用。
背景技术
目前对于绵羊的品种鉴定工作主要依赖于表型性状的测定和分析。随着杂交育种的推广，一方面，高代杂交群体的个体表型与亲本的高度相似，无法利用表型性状进行区分；另一方面，动物产品已经不能再表现出品种的表型特征，也无法利用表型性状进行鉴别。因此，单纯利用表型性状特征进行品种资源的鉴定不够准确、全面和科学。
DNA分子遗传标记问世为克服这一难题提供了有效的解决途径。DNA分子遗传标记由于不受表型，时空限制、多态性好等特点，常常被用来进行此项工作。其中，最常用的DNA分子标记是微卫星标记和SNP标记。
微卫星标记被首先用于进行个体鉴定，其缺点是由于不同实验室的条件不同而难以实现标准化和规模化。相反，SNP标记由于其广泛分布，并且开发了相应的高通量检测技术平台，有利于实现检测和分析的标准化和规模化，进而被广泛应用。
近年来，基于绵羊全基因组序列，开发了绵羊Ovine 50K Beadchip和Ovine HDBeadchip的SNP芯片，其中50KSNP芯片已被广泛用于绵羊品种的遗传结构分析、全基因选择信号分析、全基因关联分析和绵羊的品种鉴定。然而由于SNP芯片中无关位点的干扰，降低了其进行绵羊品种鉴定的准确性，同时芯片检测分析高成本也极大地制约了其在绵羊及其畜产品遗传种质的鉴定中规模化的推广和应用。
发明内容
多浪羊是新疆的一种优良肉脂兼用型绵羊品种，因其中心产区在麦盖提县故又称麦盖提羊，是新疆的地理标志产品之一。多浪羊体大、产肉多、肉质鲜嫩，被毛含绒毛多，毛质较好，繁殖率高，具有早熟性，是组织羔羊肉生产的理想品种。
本发明的目的之一在于提供多浪羊SNP标记，能够用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定，且准确性高、成本低。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明通过遗传分化系数方法从商业化绵羊基因组SNP芯片(即：绵羊全基因组50KSNP芯片)中筛选并进一步通过连锁不平衡分析剔除掉强连锁不平衡的SNP标记(即r2>0.2的SNP标记，其中：r为各SNP位点与LSDL值最大的SNP位点的距离)，从而获得本发明多浪羊SNP标记。具体的所述标记为：s24380.1、OAR10_29469450.1、OAR25_10264608.1、DU490596_503.1、OAR17_5388531.1、OAR13_51886803.1中的一种或几种。
本发明所述SNP标记的位点的物理位置是基于绵羊V3.1基因组测序序列确定的，所述多浪羊SNP标记的LSDL值是基于绵羊个体间的遗传分化系数确定的。
本发明进一步公开了多浪羊SNP标记的筛选方法，包括以下步骤：
(1)利用商业化基因组试剂盒(天根生化北京科技有限公司)提取待测绵羊样品基因组DNA：随机挑选多个包含多浪羊的绵羊样品个体，并对挑选出的绵羊样品基因组DNA进行提取；
(2)对绵羊全基因组50KSNP芯片的基因型进行分析：利用绵羊全基因组50KSNP芯片基因型分析方法，对所述步骤(1)中挑选出的绵羊样品个体及其SNP进行质量控制，明确挑选出的绵羊样品的品种；
(3)利用待测样品间的LSDL(locus-specific branch lengths)值筛选出用于多浪羊品种鉴定的SNP标记：从不同品种的绵羊样品中随机选取样品个体作为参考群体，通过遗传分化系数方法，得到多浪羊每个SNP位点的LSDL值，根据得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值的大小从高到低进行排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选；
(4)对用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证：利用对数似然比率的方法(log-likelihood ratios，LLR)进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记。
本发明更进一步地公开了上述步骤(3)中所述的从得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中选择排序靠前的SNP位点进行多浪羊SNP标记的筛选的具体步骤为：
S1：从得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中挑选出LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点；
S2：对相同染色体上的SNP位点的连锁不平衡进行分析，基于从所述步骤S1中挑选出的LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点及其最大LSDL值的多浪羊SNP位点，剔除强连锁不平衡的SNP位点；
S3：将没有进行连锁不平衡分析的SNP位点与步骤S2中筛选得到的SNP位点，重新根据LSDL值的大小从高到底进行排序；
S4：按照步骤S3中SNP位点的排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选，至少挑选出LSDL值排名前3位的多浪羊SNP位点作为所得多浪羊SNP标记。
本发明更进一步地公开了上述步骤(4)中所述利用对数似然比率的方法进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记的具体步骤为：
D1：计算出不同品种的绵羊样品在筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP位点上的每个等位基因频率，进而计算出每个基因型的理论频率，如一个等位基因频率为p，则另外一个等位基因频率为1-p，相对应的三种基因型的理论频率分别为p2、2p(1-p)和(1-p)2；
D2：计算出每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性；
D3：根据步骤D2中得到的每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性，利用对数似然比率的方法对筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证。
本发明进一步公开了用于检测所述多浪羊SNP标记的引物对。根据本发明所述多浪羊SNP位点对应序列即可设计正向引物和反向引物。引物设计原则为本领域技术人员所熟知。
本发明所述的多浪羊SNP标记应用于多浪羊品种或其畜产品鉴定中，包括以下步骤：
(1)提取待测绵羊样品的基因组DNA；
(2)利用上述引物对，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
(4)根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型；
(5)利用对数似然比率的方法进行鉴定，比较多浪羊与待测样品的对数似然比率值的大小，对数似然比率大于零的则鉴定为多浪羊品种或其畜产品；反之，则鉴定为不是多浪羊品种或其畜产品。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定，在应用本发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，克服了表型鉴定的缺陷，简单易行，且无位点间的干扰，大大提高了多浪羊品种或其畜产品鉴定的准确性并有效降低了成本。
具体实施方式
下文将结合具体实施例进一步详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种在阿勒泰羊和巴音布鲁克羊中筛选多浪羊SNP标记的方法，包括如下步骤：
(1)选取108只包含阿勒泰羊、巴音布鲁克羊和多浪羊的绵羊样品个体，采集这些绵羊的血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至100ng/ul，保存备用。
(2)将制备好的DNA样品，进行绵羊全基因组50K SNP芯片(illumina Ovine 50KBeadchip)基因型分析，对得到的108个个体和54 241个SNP用Plink软件进行质量控制：个体检出率(call rate)>0.9，SNP检出率>0.9，最小等位基因频率(MAF)>0.01，哈伯格平衡(HWE)>0.000001。由于其中一只羊个体检出率小于0.9，经过质控后，所以最后剩余107个个体，包括34只阿勒泰羊(ALT)，34只巴音布鲁克羊(BY)和39只多浪羊(DL)，用于分析。
(3)随机选择24只阿勒泰羊，24只巴音布鲁克羊和29只多浪羊作为参考群体，利用Popgene软件分别计算多浪羊与阿勒泰羊、多浪羊与巴音布鲁克羊的、阿勒泰羊与巴音布鲁克羊的遗传分化系数(Pair Fst)，多浪羊与阿勒泰羊的遗传分化系数设为FSTDLBY，多浪羊与巴音布鲁克羊的遗传分化系数为FSTDLALT，阿勒泰羊与巴音布鲁克羊的遗传分化系数为FSTBYALT。计算每个品种的每个位点的locus-specific branch lengths，即：LSDL值，对于多浪羊的LSDLDL计算公式则为：LSDLDL＝(FSTDLBY+FSTDLALT-FSTBYALT)/2，挑选出多浪羊LSDL值排名前30位的SNP位点，详见表1，用于下一步个体鉴定。
表1多浪羊，阿勒泰羊和巴音布鲁羊的LSDL值
挑选出的SNP位点大部分都位于2号染色体上，利用Haploview对多浪羊参考群体中挑选出的位点的连锁不平衡进行分析，获得s24380.1与其他各个SNP位点之间距离的平方值r2，如表2所示，剔除掉r2>0.2的相关位点，最终2号染色体上仅保留了s24380.1、s61605.1、s53985.1、OAR2_57729090.1、OAR2_58107393.1和OAR2_61592242.1这6个位点。
表2 s24380.1与各个SNP位点之间的距离平方值
将剩余的没有进行连锁不平衡分析得SNP位点的LSDL值排序，挑选出LSDL值最高的3个SNP位点：s24380.1、OAR10_29469450.1和OAR25_10264608.1。
(4)分别计算出3种绵羊的这3个位点的每个等位基因的频率，然后推算出每个基因型频率，如表3所示。
表3三个绵羊品种三个位点可能的基因型频率
选取10只阿勒泰羊，10只巴音布鲁克羊和10只多浪羊作为待鉴定个体，计算每个个体每个SNP位点基因型属于每个品种的可能性：
首先，假设每个个体均为多浪羊，以检测个体AL503为例，在s24380.1位点的基因型为AG，多浪羊的可能性则为Log100.2378，在OAR10_29469450.1位点和OAR25_10264608.1位点的基因型分别为AG和AA，其为多浪羊的可能性分别为Log100.0339和Log100.0360。该个体为多浪羊的可能性为Log10TDL3＝Log100.2378+Log100.0339+Log100.0360＝-3.54，其他待检测个体详见表4；其次，假设每个个体均为阿勒泰羊，同样的方法计算每个个体为阿勒泰羊的可能性Log10TALT3，详见表5。再次，假设每个个体均为巴音布鲁克羊，同样的方法计算每个个体为巴音布鲁克羊的可能性Log10TBY3，详见表6。
表4基于三个位点计算待检测个体为多浪羊可能性Log10TDL3
表5：基于三个位点计算待检测个体为阿勒泰羊可能性Log10TALT3
续表5：基于三个位点计算待检测个体为阿勒泰羊可能性Log10TALT3
表6基于三个位点计算待检测个体为巴音布鲁克羊可能性Log10TBY3
利用对数似然比率的方法LLR(log-likelihood ratios)鉴别个体，具体计算公式为LLR1＝Log10TDL3-Log10TALT3，LLR2＝Log10TDL3-Log10TBY3，多浪羊与阿勒泰羊或者巴音布鲁克羊的LLR值相减大于0时，个体是多浪羊而不是阿勒泰羊或者巴音布鲁克羊，利用该方法对待检测的个体进行鉴定，对于多浪羊的鉴定的准确性均达到了100％，见表7。至此我们鉴别出3个有效SNP标记用于阿勒泰羊，巴音布鲁克羊和多浪羊混杂群体中的多浪羊个体或者产品的鉴定。
表7基于三个位点计算检测多浪羊
续表7基于三个位点计算检测多浪羊
实施例2
本实施例提供了一种在德国肉用美利奴和中国美利奴羊中筛选多浪羊SNP标记的方法，包括如下步骤：
(1)选取159只包含德国肉用美利奴、中国美利奴羊和多浪羊的绵羊个体样品，采集这些绵羊的血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至100ng/ul，保存备用。
(2)将制备好的DNA样品，进行绵羊全基因组50K SNP芯片(illumina Ovine 50KBeadchip)基因型分析，对得到的159个个体的54 241个SNP用Plink软件进行质量控制：个体检出率(call rate)>0.9，SNP检出率>0.9，最小等位基因频率(MAF)>0.01，哈伯格平衡(HWE)>0.000001。经过质控后，包括60只德国肉用美利奴(GMM)，60只中国美利奴羊(CM)和39只多浪羊(DL)，用于分析。
(3)随机选择50只德国肉用美利奴，50只中国美利奴和29只多浪羊作为参考群体，利用GenePop软件分别计算德国肉用美利奴与多浪羊、多浪羊与中国美利奴、德国肉用美利奴与中国美利奴羊的遗传分化系数(Pair Fst)，多浪羊与中国美利奴的遗传分化系数设为FSTDLCM，多浪羊与德国肉用美利奴的遗传分化系数为FSTDLGMM，中国美利奴与德国美利奴的遗传分化系数为FSTBYALT。计算每个品种的每个位点的locus-specific branch lengths，即：LSDL值，对于多浪羊的LSDLDL计算公式则为：LSDLDL＝(FSTDLCM+FSTDLGMM-FSTCMGMM)/2，挑选出多浪羊LSDL值排名前30位的SNP位点，详见表8，用于下一步个体鉴定。
表8多浪羊，德国肉用美利奴和中国美利奴的LSDL值
挑选出LSDL值最高的3个SNP位点：DU490596_503.1、OAR17_5388531.1和OAR13_51886803.1。由于这三个SNP位点分别位于不同的染色体上，因此不考虑连锁不平衡的问题。
(4)分别计算出3种绵羊的这3个位点的每个等位基因的频率，然后推算出每个基因型频率，如表9所示。
表9三个绵羊品种三个位点理论上的基因型频率
选取10只多浪羊，10只德国肉用美利奴和10只中国美利奴作为待鉴定个体，计算每个个体每个SNP位点基因型属于每个品种的可能性。具体计算方法同实施例1，结果详见表10、表11、表12。
表10基于三个位点计算待检测个体为多浪羊可能性Log10TDL3
表11基于三个位点计算待检测个体为德国肉用美利奴羊可能性Log10TDMM3
续表11基于三个位点计算待检测个体为德国肉用美利奴羊可能性Log10TDMM3
表12基于三个位点计算待检测个体为中国美利奴羊可能性Log10TCM
续表12基于三个位点计算待检测个体为中国美利奴羊可能性Log10TCM
利用对数似然比率的方法LLR(log-likelihood ratios)鉴别个体，具体计算公式为LLR1＝Log10TDL3-Log10TGMM3，LLR2＝Log10TDL3-Log10TCM3，多浪羊与德国肉用美利奴或者中国美利奴羊的LLR值相减大于0时，个体是多浪羊而不是德国肉用美利奴或者中国美利奴羊，利用该方法对待检测的个体进行鉴定，对于多浪羊的鉴定的准确性均达到了100％，见表13。至此我们鉴别出3个有效SNP标记用于德国肉用美利奴、中国美利奴羊和多浪羊混杂群体中的多浪羊个体或者产品的鉴定。
表13基于三个位点计算检测多浪羊
实施例3
本发明的鉴定方法与现有鉴定多浪羊方法的比较，见表14。
表14本发明的鉴定方法与现有鉴定多浪羊方法的比较
本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定，在应用本发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，克服了表型鉴定的缺陷，简单易行，且无位点间的干扰，大大提高了多浪羊品种或其畜产品鉴定的准确性并有效降低了成本。
Claims (10)
1.多浪羊SNP标记，其特征在于，所述SNP标记是从商业化绵羊基因组SNP芯片中筛选并通过连锁不平衡分析剔除强连锁不平衡的SNP标记得到，具体包括：s24380.1、OAR10_29469450.1、OAR25_10264608.1、DU490596_503.1、OAR17_5388531.1、OAR13_51886803.1中的一种或几种。
2.如权利要求1所述的多浪羊SNP标记，其特征在于，所述商业化绵羊基因组SNP芯片为绵羊全基因组50KSNP芯片，所述强连锁不平衡的SNP标记为r2>0.2的SNP标记。
3.如权利要求2所述的多浪羊SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的位点的物理位置是基于绵羊V3.1基因组测序序列确定的，所述多浪羊SNP标记的LSDL值是基于绵羊个体间的遗传分化系数确定的。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用商业化基因组试剂盒提取待测绵羊样品基因组DNA；
(2)对绵羊全基因组50KSNP芯片的基因型进行分析；
(3)利用待测样品间的LSDL值筛选出用于多浪羊品种鉴定的SNP标记；
(4)对用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证。
5.如权利要求4所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)随机挑选多个包含多浪羊的绵羊样品个体，并对挑选出的绵羊样品基因组DNA进行提取；
(2)利用绵羊全基因组50KSNP芯片基因型分析方法，对所述步骤(1)中挑选出的绵羊样品个体及其SNP进行质量控制，明确挑选出的绵羊样品的品种；
(3)从不同品种的绵羊样品中随机选取样品个体作为参考群体，通过遗传分化系数方法，得到多浪羊每个SNP位点的LSDL值，根据得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值的大小从高到低进行排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选；
(4)利用对数似然比率的方法进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记。
6.如权利要求5所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述从得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中选择排序靠前的SNP位点进行多浪羊SNP标记的筛选的具体步骤为：
S1：从得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中挑选出LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点；
S2：对相同染色体上的SNP位点的连锁不平衡进行分析，基于从所述步骤S1中挑选出的LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点及其最大LSDL值的多浪羊SNP位点，剔除强连锁不平衡的SNP位点；
S3：将没有进行连锁不平衡分析的SNP位点与步骤S2中筛选得到的SNP位点，重新根据LSDL值的大小从高到底进行排序；
S4：按照步骤S3中SNP位点的排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选，至少挑选出LSDL值排名前3位的多浪羊SNP位点作为所得多浪羊SNP标记。
7.如权利要求5所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述利用对数似然比率的方法进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记的具体步骤为：
D1：计算出不同品种的绵羊样品在筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP位点上的每个等位基因频率，进而计算出每个基因型的理论频率；
D2：计算出每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性；
D3：根据步骤D2中得到的每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性，利用对数似然比率的方法对筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证。
8.用于检测如权利要求1所述的多浪羊SNP标记的引物对。
9.如权利要求1所述的多浪羊SNP标记在多浪羊品种或其畜产品鉴定中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测绵羊样品的基因组DNA；
(2)利用权利要求6所述的引物对，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
(3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
(4)根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型；
(5)利用对数似然比率的方法进行鉴定，比较多浪羊与待测样品的对数似然比率值的大小，对数似然比率大于零的则鉴定为多浪羊品种或其畜产品；反之，则鉴定为不是多浪羊品种或其畜产品。
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