CN113718052B - 5000个snp位点组合的应用及小麦品种真实性身份鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及5000个SNP位点组合的应用及小麦品种真实性身份鉴定的方法。根据本申请的技术方案，首先选定了5000个小麦SNP位点的组合，在此基础上，通过构建待测品种和标准样品的5000个SNP的DNA指纹图谱，进一步鉴定小麦品种真实性、小麦品种特异性、分析小麦种质资源、构建遗传连锁图谱和遗传定位；联分析；以及应用于小麦分子育种。

Description

5000个SNP位点组合的应用及小麦品种真实性身份鉴定的 方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及5000个SNP位点组合的应用及小麦品种真实性身份鉴定的方法。

背景技术

小麦是我国最重要的粮食作物之一，近年来播种面积和产量均占粮食总量的21％左右，占口粮消费的19％。优良品种的选育是保证粮食生产安全的源头，种质资源是农业科技原始创新与现代种业发展的物质基础。目前种质资源利用存在利用效率低的问题，主要原因是不能准确深入的进行分子鉴定和评价。另外随着近几年我国种业的快速发展，小麦品种未审先推、制售假冒伪劣以及侵权套牌问题较为突出，影响了我国种业自主创新和可持续发展。再加上小麦品种参试、审定和保护数量急剧增加，品种同质化严重，已经成熟应用的SSR标记法因具有标记密度低、不易实现数据整合和通量低等缺陷，不能准确有效快速的区分小麦品种，给管理者带来了巨大挑战。如何对小麦种质资源和品种进行精准快速的鉴定，已成为现今分子鉴定的重难点。

SNP(Single Nucleotide Polymorphism)是指基因组水平上单个核苷酸的变异，包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等，大多为二等位基因，具有标记密度高、分布广泛、通量高、数据统计简单，检测快、兼容性强等优点。国内外大公司相继推出了各种SNP位点高通量检测平台，能很好地弥补SSR标记的技术缺陷。现阶段位点高通量SNP检测方法主要有基因芯片和靶向测序技术等，基因芯片技术是一种具有高通量、高效率以及高自动化特点的方法，靶向测序技术是一种具有高通量和高准确率的方法，两种方法均可实现千万级别位点的检测，为小麦种质资源和品种的精准检测提供了有效的技术手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供根据本发明的采用5000个SNP位点组合的应用。

本发明的再一目的是提供使用5000个SNP位点进行小麦品种真实性身份鉴定的方法。

根据本发明的使用5000个SNP位点进行小麦品种真实性身份鉴定的方法包括以下步骤：

(1)构建待测样品和小麦标准样品5000个SNP位点的指纹数据；

(2)根据步骤(1)获得的待测样品和标准样品的指纹数据，将待测样品与标准样品的指纹成对比较，统计比较总位点数和差异位点数，计算待测样品与标准样品的位点相似度；

(3)根据待测样品与标准样品的位点相似度进行鉴定，

其中所述5000个SNP位点编号是WSNP01-WSNP5000，所在的染色体、具体物理位置以及等位变异信息如表1所示。

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根据本发明的采用5000个SNP位点组合进行小麦品种真实性身份鉴定的方法，其中，按公式LS＝(1-D/T)×100％计算计算待测样品与标准样品的位点相似度，其中，LS为位点相似度；T为比较总位点数；D为差异位点数。

根据本发明的采用5000个SNP位点组合进行小麦品种真实性身份鉴定的方法，其中，待测样品与标准样品比较，当位点相似度≤92.00％时，排除两者为同一品种；位点相似度在92％～98％之间时，不确定两者为同一品种；位点相似度≥98.00％，不排除两者属于同一品种。

根据本发明的采用5000个SNP位点组合进行小麦品种真实性身份鉴定的方法，其中，采用液相探针捕获或芯片技术获得待测样品和标准样品的上述5000个SNP位点的基因型数据。

根据本申请的技术方案，首先选定了5000个小麦SNP位点的组合，所述5000个SNP位点的物理位置是基于小麦品种中国春的全基因组序列比对确定的，所述小麦品种中国春全基因组序列的版本号为IWGSC RefSeqv1.0，所述5000个SNP位点编号是WSNP01-WSNP5000，所在的染色体、具体物理位置参照中国春全基因组序列(版本号为IWGSCRefSeqv1.0)确定。在此基础上，通过构建待测品种和标准样品的5000个SNP的DNA指纹图谱，进一步鉴定小麦品种真实性、小麦品种特异性、分析小麦种质资源(包括亲缘关系、遗传多样性、群体结构和杂种优势划群等)、构建遗传连锁图谱和遗传定位；关联分析；以及应用于小麦分子育种。本发明的技术方案具有以下优点和益处：

1、本发明提供的5000个SNP位点，是经过多平台、多样品、多次试验确定的，重复性和稳定性好，便于推广应用；

2、本发明提供的5000个SNP位点，在基因组上分布均匀，A、B、D基因组分别占比33.2％、34.1％和32.7％；无连锁关系；77％的位点MAF值高于0.2，PIC平均值为0.30，与约9万个SNP位点的区分效果呈极显著线性相关(P<0.01)，对小麦品种和种质资源的鉴定评价具有较高的分辨力。

3、本发明提供的5000个SNP位点，是通过育成品种、地方品种、种质等筛选出来的，既可用于品种鉴定，也可用于资源鉴定，适用范围广。

4、本发明提供的5000个SNP位点组合检测方法通量高，易实现规模化检测。应用芯片技术检测，5天即可得到一个样品的分布于全基因组的5000个位点的基因型，一张芯片可以同时检测96个样品，一个流程即可得到96个样品共48万个数据点，相比较靶向测序技术来说，检测时间较短，分析技术要求低。采用液相探针捕获技术检测，仅需2步PCR共3.5小时即可完成捕获建库全部流程，相比较芯片技术来说，灵活度高，检测成本低。

5、本发明提供的SNP位点组合在小麦中的应用，将加快小麦品种指纹数据库的构建的进程，推进SNP标记在分子育种等方面的应用，填补小麦SNP标记在小麦身份鉴定和特异性鉴定中的空白，为小麦品种管理、质量检测以及知识产权保护提供科技支撑，为小麦种质资源分析奠定了技术基础、加快优良小麦品种的选育。

附图说明

图1显示5000个位点染色体分布情况；

图2为5000个位点MAF统计图；

图3为5000个位点PIC值统计图；

图4显示5K SNP位点和90K芯片鉴定结果相关性分析；

图5为123份种质资源的聚类分析图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。以下实施例中所用的实验材料或试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中靶向测序技术使用的试剂盒购自石家庄博瑞迪生物技术有限公司，芯片技术使用的试剂盒购自美国Affymetrix公司。

本发明获得了5000个小麦SNP位点的组合，5K SNP位点，在基因组上分布均匀，A、B、D基因组分别占比33.2％、34.1％和32.7％；无连锁关系；77％的位点MAF值高于0.2，PIC平均值为0.30，与约9万个SNP位点的区分效果呈极显著线性相关(P<0.01)，对小麦品种和种质资源的鉴定评价具有较高的分辨力。

根据本发明的具体实施方式，构建了现有小麦审定品种的上述5K SNP位点的指纹数据库，首先提取小麦品种或种质的基因组DNA，然后通过以下方法构建上述5000个SNP位点的基因型数据，即构成小麦SNP指纹数据库。

1.采用液相探针捕获技术构建指纹数据库：1)测序文库构建：对步骤(1)中的基因组DNA片段化，将片段化的DNA末端修补齐，在DNA聚合酶的作用下在3’末端加上一个腺苷酸，然后通过DNA连接酶在DNA片段的两端连接含有通用引物序列的接头序列，最后通过一对通用引物扩增DNA片段；然后将制备好的测序文库和靶序列探针杂交，捕获出靶序列；2)对富集得到靶核酸文库进行二代高通量测序；3)对测序结果进行分析，获得上述5000个SNP位点的基因型数据，即构成小麦SNP指纹数据库。

2.采用DNA芯片技术构建指纹数据库：1)DNA扩增：对步骤(1)中的基因组DNA进行全基因组恒温扩增；2)DNA片段化、沉淀、干燥、重悬及质控；3)杂交、清洗、染色、扫描。(4)数据分析：采用软件对扫描出来的数据进行质量控制及基因分型，获得上述5000个SNP位点的基因型数据，即构成小麦SNP指纹数据库。

根据本发明的鉴定小麦品种真实性的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品和标准样品的基因组DNA；

(2)采用液相探针捕获或芯片技术获得待测样品和标准样品上述5000个SNP位点的基因型数据；

(3)品种真实性身份鉴定：根据步骤(2)获得的待测样品和标准样品的基因型数据，按照如下方法确定待测样品的真实身份：将送验样品与标准样品的指纹成对比较，统计比较总位点数和差异位点数。按公式LS＝(1-D/T)×100％(式中：LS—位点相似度；T—比较总位点数；D—差异位点数。)计算两份样品的位点相似度。待测样品与标准样品比较，当位点相似度≤92.00％时，排除两者为同一品种；位点相似度在92.00％～98.00％之间时，不确定两者为同一品种；位点相似度≥98.00％，不排除两者属于同一品种。

实施例1、小麦5K SNP位点组合的开发

利用BAAFS-wheat-Affymetrix 90K SNP芯片(84661个SNP位点)扫描190份代表样品，基于190份样品84661个SNP位点基因型数据进行分析，筛选出高质量多态性位点63543个。计算标记间的LD(linkage disequilibrium,LD，r²)值，保留r²<0.8的标记，加上79个功能标记，共计8061个位点构成小麦鉴定初选位点。提取8061个初选SNP位点的侧翼序列，设计并合成靶向测序捕获探针，结果显示5920个SNP位点能设计成功。选取28份样品进行5920个SNP位点的靶向测序技术分析，其中380个位点缺失率大于5％，剩余5540个位点。如表1所示，最后根据染色体分布情况和MAF值确定5000个SNP位点组合。

5000个SNP位点染色体分布见图1，其中，A基因组占比33.2％，B基因组占比34.1％，D基因组占32.7％；MAF值分布情况见图2，其中，77％的位点MAF值高于0.2，表明大多数位点多态性较高。PIC(polymorphism information content，多态信息含量)平均值为0.30，能较好的反应品种间的遗传多样性(图3)。比较芯片和靶向测序5000个位点的基因分型结果，发现55个位点存在差异，一致性占比98.9％，说明5K位点组合的平台兼容性比较高。利用5K位点和BAAFS-wheat-Affymetrix 90K SNP芯片的63622个高质量多态性位点对187份小麦代表样品进行遗传距离相关性分析，5K SNP位点和90K芯片鉴定结果呈极显著线性相关(P<0.01)，说明位点有很高的代表性(图4)。

实施例2、采用5K SNP位点组合构建我国北部冬麦区小麦审定品种DNA指纹

1、DNA提取和质量检测

采用CTAB法或试剂盒法提取248份北部冬麦区小麦审定品种(248份审定品种的名称见表2)种子或其他组织或器官的DNA，去除RNA，混合DNA样品至少含有30个以上的不同个体。DNA质量和浓度用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行测定，样品主带清晰，没有降解或轻微降解，芯片技术要求DNA样本浓度在50ng/μL以上，OD 260/280应在1.7-2.1之间，DNA的总量应大于2ug；液相探针捕获技术要求DNA样本浓度在30ng/μL以上，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD230≥1.8，DNA的总量应大于1.5ug。

表2 248份审定品种的名称

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2、采用液相探针捕获技术构建审定品种指纹数据库

采用酶切消化试剂或者超声波破碎试剂，对基因组DNA进行片段化。利用石家庄博瑞迪生物技术有限公司生产的GenoBaits建库试剂盒按照其提供的说明书构建靶核酸测序文库，使用Illumina平台进行测。对测序结果进行分析，获得上述5K SNP位点的基因型数据，构成小麦SNP指纹数据库。分析248份审定品种的指纹，发现每份品种具有独特的指纹。

3、采用DNA芯片技术构建审定品种指纹数据库

基于实施例1中的5K SNP位点设计探针，将探针分子固定在支持物上，制作DNA芯片。利用Affymetrix生产的试剂盒按照Affymetrix芯片标准流程操作，获得原始信号数据。采用Axiom Analysis Suite分析软件进行基因型分析，获得上述5K SNP位点的基因型数据，构成小麦SNP指纹数据库。

实施例3、采用5K SNP位点组合进行小麦品种真实性身份鉴定。

以下将详述如何利用实施例1中的5K SNP位点鉴别5个未知待测样品的真实身份。

(1)采用实施例2中基于液相探针捕获技术构建小麦指纹数据库的方法获得5个待测样品和5个标准样品5K SNP位点的指纹数据。

(2)根据步骤(1)获得的待测样品和标准样品的指纹数据，将待测样品与标准样品的指纹成对比较，统计比较总位点数和差异位点数，按公式LS＝(1-D/T)×100％(式中：LS—位点相似度；T—比较总位点数；D—差异位点数。)计算两份样品的位点相似度(表3)。

(3)根据待测样品与标准样品的位点相似度进行鉴定：待测样品1与标准样品济麦22号的位点相似度为100.0％，鉴定意见为不排除两者属于同一品种。待测样品2与标准样品中科麦36的位点相似度为97.70％，鉴定意见为不排除两者属于同一品种。待测样品3与标准样品舜麦1718的位点相似度为99.30％，鉴定意见为不排除两者属于同一品种。待测样品4与标准样品宁春4号的位点相似度为69.10％，鉴定意见为排除两者为同一品种。待测样品5与标准样品百农AK58的位点相似度为66.10％，鉴定意见为排除两者为同一品种。待测样品的鉴定结果与实际相符。

表3 5对待测样品鉴定结果

实施例4、采用5K SNP位点组合鉴定种质资源的遗传多样性

采用实施例2中基于DNA芯片技术构建小麦指纹数据库的方法构建本单位60份核心小麦不育系和63份核心恢复系5K SNP位点的指纹。利用Powermarker V3.25软件对基因多样性和多态性信息量(Polymorphism Information Content，PIC)等进行分析。选择基于Nei's(1983)遗传距离的UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmeticmeans)方法绘制聚类图。平均基因多样性值和多态性信息含量值为0.34和0.27；所有不育系与所有恢复系的平均遗传距离均在0.30以上，123份种质资源被分为2大类。结果如图5所示，不育系(编号以YS开头的材料)和恢复系(编号以YF开头的材料)分别被划分到不同的类群中。

Claims (5)

1.小麦5000个SNP位点组合在以下方面的应用，其特征在于，所述5000个SNP位点的物理位置是基于小麦品种中国春的全基因组序列比对确定的，所述小麦品种中国春全基因组序列的版本号为IWGSC RefSeqv1.0，所述5000个SNP位点编号是WSNP01-WSNP5000，所在的染色体、具体物理位置以及等位变异信息如下表所示，

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所述5000个SNP位点用于：

鉴定小麦品种真实性；鉴定小麦品种的特异性；分析小麦种质资源的遗传信息、构建遗传连锁图谱；遗传定位；关联分析；以及小麦分子育种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用所述5000个SNP位点组合鉴定小麦品种真实性包括以下步骤：

(1)构建待测样品和小麦标准样品的所述5000个SNP位点的指纹数据；

(2)根据步骤(1)获得的待测样品和标准样品的指纹数据，将待测样品与标准样品的指纹成对比较，统计比较总位点数和差异位点数，计算待测样品与标准样品的位点相似度；

(3)根据待测样品与标准样品的位点相似度进行鉴定。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，按公式LS＝(1-D/T)×100％计算计算待测样品与标准样品的位点相似度，其中，LS为位点相似度；T为比较总位点数；D为差异位点数。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，待测样品与标准样品比较，当位点相似度≤92.00％时，排除两者为同一品种；位点相似度在92％～98％之间时，不确定两者为同一品种；位点相似度≥98.00％，不排除两者属于同一品种。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用液相探针捕获或芯片技术获得待测样品和标准样品的所述5000个SNP位点的基因型数据。