CN115927731A - 一种用于构建荔枝snp指纹图谱的snp位点组合、应用及鉴定方法 - Google Patents

一种用于构建荔枝snp指纹图谱的snp位点组合、应用及鉴定方法 Download PDF

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夏志强
田阳阳
邹枚伶
江思容
王文泉
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Abstract

本发明提供一种用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合、应用及鉴定方法。所述SNP位点包括位于染色体Chr1~Chr15上的100个SNP位点。本发明提供的SNP位点组合,可用于构建荔枝SNP指纹图谱和荔枝品种的快速鉴定。本发明提供了专属于不同荔枝品种的全新的身份信息,可有效辨别个体真实性,追溯个体来源,在荔枝种质资源分类鉴定、分子辅助育种等方面具有良好的应用前景。

Description

一种用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合、应用及鉴定 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,特别涉及一种用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合、应用及鉴定方法。
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn),是无患子科、荔枝属常绿乔木,喜光向阳,广泛种植于广东、福建、海南等地区,品种繁多,具有极高的经济价值。荔枝开花因品种而异,早熟种早,迟熟种迟,有雌雄蕊异属性,但不同品种开花顺序、次数不同。荔枝原产于我国,历史悠久,其在我国的栽培和食用历史可以追溯到两千多年前的汉代。我国重视对种质资源的收集和保存,曾多次对荔枝种质资源进行详细记录和复查。近年来也发现了许多地方优质品种与国外品种。但同时繁多的品种和复杂的遗传背景,给荔枝品种鉴定带来了巨大的挑战。
DNA指纹图谱技术是基于DNA分子标记建立的能够用于种质资源分类鉴定的一种现代手段。构建植物品种DNA指纹图谱,可以克服单纯依据形态特征鉴定品种的局限性,这对于开展种质资源精准鉴定与基因发掘工作十分重要。DNA指纹图谱技术在品种资源多样性和品种鉴定研究中被广泛应用,但在荔枝上鲜有相关报道。且目前已有的品种鉴定标准大多是基于SSR、RAPD、RFLP标记,罕见基于SNP分子标记构建指纹图谱实现荔枝品种鉴定的方法。
发明内容
鉴于现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于构建荔枝DNA指纹图谱的SNP位点组合及其应用。以多个荔枝样本为研究对象,分析得到100个核心SNP位点信息,利用这些SNP位点信息构建出属于每个荔枝样本的指纹图谱。所构建的指纹图谱可用于荔枝种质资源分类鉴定以及育种等方面。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合,所述SNP位点包括:
第1位点,其位于1号染色体第545481bp处,变异类型为A/G;
第2位点,其位于1号染色体第687612bp处,变异类型为C/T;
第3位点,其位于1号染色体第2201119bp处,变异类型为A/T;
第4位点,其位于1号染色体第2201311bp处,变异类型为C/T;
第5位点,其位于1号染色体第2495548bp处,变异类型为A/G;第6位点,其位于1号染色体第6266484bp处,变异类型为T/C;第7位点,其位于1号染色体第9406000bp处,变异类型为C/T;第8位点,其位于1号染色体第12773035bp处,变异类型为A/G;第9位点,其位于1号染色体第44528637bp处,变异类型为C/T;第10位点,其位于1号染色体第45741119bp处,变异类型为A/G;第11位点,其位于1号染色体第46482639bp处,变异类型为T/G;第12位点,其位于1号染色体第47886198bp处,变异类型为T/C;第13位点,其位于2号染色体第2047845bp处,变异类型为G/A;第14位点,其位于2号染色体第2873495bp处,变异类型为A/G;第15位点,其位于2号染色体第3050057bp处,变异类型为C/T;第16位点,其位于2号染色体第3205244bp处,变异类型为G/A;第17位点,其位于2号染色体第3986010bp处,变异类型为C/T;第18位点,其位于2号染色体第9401342bp处,变异类型为G/C;第19位点,其位于2号染色体第14701915bp处,变异类型为A/T;第20位点,其位于2号染色体第14940219bp处,变异类型为C/A;第21位点,其位于2号染色体第18937247bp处,变异类型为G/C;第22位点,其位于2号染色体第19303257bp处,变异类型为G/A;第23位点,其位于2号染色体第19347507bp处,变异类型为G/A;第24位点,其位于2号染色体第24366194bp处,变异类型为T/C;第25位点,其位于2号染色体第27981666bp处,变异类型为T/C;第26位点,其位于2号染色体第39547698bp处,变异类型为C/A;第27位点,其位于2号染色体第46412613bp处,变异类型为A/G;第28位点,其位于3号染色体第13547391bp处,变异类型为A/G;第29位点,其位于3号染色体第23978208bp处,变异类型为T/C;第30位点,其位于3号染色体第27623748bp处,变异类型为C/T;第31位点,其位于3号染色体第32372734bp处,变异类型为C/T;第32位点,其位于3号染色体第32436153bp处,变异类型为G/C;第33位点,其位于3号染色体第37534278bp处,变异类型为G/A;第34位点,其位于3号染色体第40178822bp处,变异类型为C/T;第35位点,其位于4号染色体第10505266bp处,变异类型为T/A;第36位点,其位于4号染色体第21145172bp处,变异类型为A/G;第37位点,其位于4号染色体第22032464bp处,变异类型为T/C;第38位点,其位于4号染色体第24433528bp处,变异类型为C/T;第39位点,其位于4号染色体第25040719bp处,变异类型为G/C;第40位点,其位于4号染色体第33938135bp处,变异类型为T/G;第41位点,其位于4号染色体第35429916bp处,变异类型为T/C;第42位点,其位于4号染色体第35600405bp处,变异类型为C/T;第43位点,其位于5号染色体第25309407bp处,变异类型为T/C;第44位点,其位于5号染色体第25468956bp处,变异类型为G/A;第45位点,其位于5号染色体第26595920bp处,变异类型为G/A;第46位点,其位于5号染色体第27277565bp处,变异类型为A/G;第47位点,其位于5号染色体第30837768bp处,变异类型为G/A;第48位点,其位于5号染色体第32711351bp处,变异类型为C/T;第49位点,其位于6号染色体第8633342bp处,变异类型为C/T;第50位点,其位于6号染色体第15134822bp处,变异类型为A/G;第51位点,其位于7号染色体第1604239bp处,变异类型为A/C;第52位点,其位于7号染色体第4649920bp处,变异类型为C/T;第53位点,其位于7号染色体第24674969bp处,变异类型为T/C;第54位点,其位于7号染色体第26670200bp处,变异类型为G/A;第55位点,其位于7号染色体第31254686bp处,变异类型为T/C;第56位点,其位于7号染色体第32244592bp处,变异类型为C/T;第57位点,其位于8号染色体第12035697bp处,变异类型为G/A;第58位点,其位于8号染色体第16737377bp处,变异类型为G/A;第59位点,其位于8号染色体第20142748bp处,变异类型为C/A;第60位点,其位于8号染色体第24131867bp处,变异类型为A/G;第61位点,其位于8号染色体第25963400bp处,变异类型为G/A;第62位点,其位于8号染色体第26626811bp处,变异类型为G/A;第63位点,其位于8号染色体第30487362bp处,变异类型为A/G;第64位点,其位于8号染色体第31339022bp处,变异类型为T/C;第65位点,其位于9号染色体第3731164bp处,变异类型为C/G;第66位点,其位于9号染色体第19858161bp处,变异类型为C/T;第67位点,其位于9号染色体第19882512bp处,变异类型为C/G;第68位点,其位于9号染色体第31085651bp处,变异类型为C/T;第69位点,其位于10号染色体第32135357bp处,变异类型为T/C;第70位点,其位于11号染色体第6755607bp处,变异类型为G/A;第71位点,其位于11号染色体第6846610bp处,变异类型为A/T;第72位点,其位于11号染色体第14268737bp处,变异类型为G/A;第73位点,其位于11号染色体第19028655bp处,变异类型为A/C;第74位点,其位于11号染色体第22012737bp处,变异类型为A/G;第75位点,其位于11号染色体第28148373bp处,变异类型为A/G;第76位点,其位于11号染色体第28572323bp处,变异类型为G/C;第77位点,其位于11号染色体第29066153bp处,变异类型为T/C;第78位点,其位于12号染色体第4515625bp处,变异类型为G/A;第79位点,其位于12号染色体第7165484bp处,变异类型为C/T;第80位点,其位于12号染色体第11015330bp处,变异类型为C/G;第81位点,其位于12号染色体第19809428bp处,变异类型为A/G;第82位点,其位于12号染色体第25952010bp处,变异类型为G/A;第83位点,其位于12号染色体第28754729bp处,变异类型为T/C;第84位点,其位于12号染色体第28935367bp处,变异类型为A/G;第85位点,其位于13号染色体第1242043bp处,变异类型为A/G;第86位点,其位于13号染色体第8915121bp处,变异类型为A/T;第87位点,其位于13号染色体第9717661bp处,变异类型为T/C;第88位点,其位于13号染色体第15957404bp处,变异类型为G/C;第89位点,其位于13号染色体第24952068bp处,变异类型为C/T;
第90位点,其位于14号染色体第2964985bp处,变异类型为C/G;
第91位点,其位于14号染色体第11036295bp处,变异类型为G/A;
第92位点,其位于14号染色体第12556155bp处,变异类型为T/C;
第93位点,其位于14号染色体第15853622bp处,变异类型为A/C;
第94位点,其位于15号染色体第4969146bp处,变异类型为G/A;
第95位点,其位于15号染色体第9284099bp处,变异类型为C/G;
第96位点,其位于15号染色体第12769037bp处,变异类型为A/C;
第97位点,其位于15号染色体第22143654bp处,变异类型为C/T;
第98位点,其位于15号染色体第23482593bp处,变异类型为A/C;
第99位点,其位于15号染色体第26167572bp处,变异类型为T/C;
第100位点,其位于15号染色体第26961651bp处,变异类型为T/C。
一种荔枝DNA指纹图谱,利用所述的SNP位点组合构建而成。
本发明还涉及所述的SNP位点组合在构建荔枝DNA指纹图谱中的应用,以及在荔枝种质资源分类鉴定方面的应用。
另一发明,本发明还提供一种利用所述的SNP位点组合鉴定荔枝种质的方法,包括如下步骤:
(1)提取荔枝样品DNA;
(2)对荔枝样品DNA中的SNP位点进行检测;
(3)根据SNP位点的检查结果,进行基因分型,鉴定荔枝的品种。
进一步的,所述荔枝样品为荔枝新鲜叶片。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明基于荔枝重测序获得的SNP位点组合,可用于构建荔枝SNP指纹图谱和荔枝品种的快速鉴定。本发明提供专属于该荔枝品种全新的身份信息,可有效辨别个体真实性,追溯个体来源。
(2)本发明利用SNP位点组合,有效构建荔枝SNP指纹图谱,建立荔枝的分子身份证,只需要对待测样本进行相应的检测并与指纹图谱库比对,即可鉴定待测样本的来源分类,判断品种间亲缘关系的远近和测量品种间遗传距离。本发明获得的荔枝SNP指纹图谱对荔枝品种鉴定的准确率高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容,下面提供具体实施例,对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1-SNP位点组合的获取与荔枝品种指纹图谱的构建
根据重测序数据开发出所有SNP位点,对原始SNP位点过滤筛选,去除缺失个数大于1%以及纯合基因型0/0,1/1个数小于2的SNP位点,计算各SNP位点之间的相关性,保留相邻两条SNP相关性R2>0.95的SNP位点用作后续遗传算法的备选位点。
利用GaSnp软件,转换基因型格式并对SNP位点随机组合,计算出区别所有品种的一套过滤筛选后的SNP位点组合。最终挑选出100条核心SNP位点用于构建荔枝品种指纹图谱。各SNP位点的名称、所属染色体、起始位置和变异类型见表1,构建的各品种的指纹图谱见表2。
本发明利用表1得到的SNP位点对表2的473份荔枝材料进行鉴定,得到各品种相应的指纹序列,从表中可以看出,每个品种的指纹序列均不相同,表明可有效将473份材料进行区分开,实现对不同荔枝品种的准确区分。
表1用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合
Figure BDA0003999910790000061
Figure BDA0003999910790000071
Figure BDA0003999910790000081
表2荔枝各品种及其指纹序列
Figure BDA0003999910790000082
Figure BDA0003999910790000091
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Figure BDA0003999910790000271
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在表2的不同荔枝样本的指纹编码表中,指纹编码中的“0”是指基因型0/0;表示荔枝样本的某个样本中该位点纯合,即与参考基因组中该位点一致;指纹编码中的“1”是指基因型0/1,表示样本中该位点杂合,即与参考基因组中该位点部分一致;指纹编码中的“2”是指基因型1/1;表示样本中该位点变异,即与参考基因组中该位点完全不同。
实施例2-荔枝种质的鉴定
采用上述SNP位点组合鉴定荔枝种质的方法,包括如下步骤:
(1)以荔枝新鲜叶片作为荔枝样品,采用CTAB法进行荔枝样品DNA的提取:
①取约2g新鲜叶片,放入预冷研钵中,加PVP约0.08g,在液氮中迅速研成粉末,转入预冷的50mL离心管,加入提取预热的2%CTAB裂解液20mL,缓慢上下颠倒充分混匀后65℃水浴90min,水浴时,约15min颠倒混匀一次;
②取出离心管冷却至室温,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀,配平后静置10min,放入离心机中,12000r/min离心10min。吸上清液转入新50mL离心管,重复前一个步骤;吸上清液转入新50mL的离心管,加入预冷的无水乙醇,挑出漂浮的DNA,最后将DNA收集至1.5mL的离心管中,75%无水乙醇洗涤,风干DNA沉淀,加入TE缓冲液,溶解后再加RNaseA(20mg/mL),37℃水浴30min,取出4℃保存备用;
(2)采用高通量测序法对荔枝样品DNA中的SNP位点进行检测:
①利用扩增SNP位点组合的PCR扩增引物对组合,对荔枝样品DNA进行PCR扩增及电泳检测;配制PCR扩增体系(2μl DNA,1μl引物,17μl mix溶液)于PCR板中,设置PCR扩增程序;配制2%琼脂糖凝胶,取4μl PCR扩增产物进行电泳检测;②将含有目的条带的PCR产物,送测序公司进行SNP检测;
(3)根据SNP位点的检查结果,进行基因分型,鉴定荔枝的品种。
实施例3-验证荔枝SNP指纹图谱的准确性
本发明通过分析重复度、近似度高的荔枝品种间的遗传多样性及亲缘关系,发现利用分子标记法进行的聚类分析与传统的分类完全一致,表明获得的荔枝指纹图谱可有效用于荔枝种质资源的分类鉴定,包括:
(1)采用本发明上述的SNP位点组合,评价所获得的荔枝群体的遗传变异和结构,发现获得荔枝样本种群存在较丰富的遗传变异;
(2)对所获得的荔枝品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,发现聚类结果与传统的形态学分类结果一致,且遗传相似系数高;
(3)利用本发明荔枝SNP位点组合构建的进化树与其他位点构建的进化树一样,说明获得的473份荔枝SNP指纹图谱信息可有效地鉴别不同的荔枝样本,准确性高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于构建荔枝SNP指纹图谱的SNP位点组合,其特征在于:所述SNP位点包括:第1位点,其位于1号染色体第545481bp处,变异类型为A/G;
第2位点,其位于1号染色体第687612bp处,变异类型为C/T;
第3位点,其位于1号染色体第2201119bp处,变异类型为A/T;
第4位点,其位于1号染色体第2201311bp处,变异类型为C/T;
第5位点,其位于1号染色体第2495548bp处,变异类型为A/G;
第6位点,其位于1号染色体第6266484bp处,变异类型为T/C;
第7位点,其位于1号染色体第9406000bp处,变异类型为C/T;
第8位点,其位于1号染色体第12773035bp处,变异类型为A/G;
第9位点,其位于1号染色体第44528637bp处,变异类型为C/T;
第10位点,其位于1号染色体第45741119bp处,变异类型为A/G;
第11位点,其位于1号染色体第46482639bp处,变异类型为T/G;
第12位点,其位于1号染色体第47886198bp处,变异类型为T/C;
第13位点,其位于2号染色体第2047845bp处,变异类型为G/A;
第14位点,其位于2号染色体第2873495bp处,变异类型为A/G;
第15位点,其位于2号染色体第3050057bp处,变异类型为C/T;
第16位点,其位于2号染色体第3205244bp处,变异类型为G/A;
第17位点,其位于2号染色体第3986010bp处,变异类型为C/T;
第18位点,其位于2号染色体第9401342bp处,变异类型为G/C;
第19位点,其位于2号染色体第14701915bp处,变异类型为A/T;
第20位点,其位于2号染色体第14940219bp处,变异类型为C/A;
第21位点,其位于2号染色体第18937247bp处,变异类型为G/C;
第22位点,其位于2号染色体第19303257bp处,变异类型为G/A;
第23位点,其位于2号染色体第19347507bp处,变异类型为G/A;
第24位点,其位于2号染色体第24366194bp处,变异类型为T/C;
第25位点,其位于2号染色体第27981666bp处,变异类型为T/C;
第26位点,其位于2号染色体第39547698bp处,变异类型为C/A;
第27位点,其位于2号染色体第46412613bp处,变异类型为A/G;
第28位点,其位于3号染色体第13547391bp处,变异类型为A/G;
第29位点,其位于3号染色体第23978208bp处,变异类型为T/C;
第30位点,其位于3号染色体第27623748bp处,变异类型为C/T;
第31位点,其位于3号染色体第32372734bp处,变异类型为C/T;
第32位点,其位于3号染色体第32436153bp处,变异类型为G/C;
第33位点,其位于3号染色体第37534278bp处,变异类型为G/A;
第34位点,其位于3号染色体第40178822bp处,变异类型为C/T;
第35位点,其位于4号染色体第10505266bp处,变异类型为T/A;
第36位点,其位于4号染色体第21145172bp处,变异类型为A/G;
第37位点,其位于4号染色体第22032464bp处,变异类型为T/C;
第38位点,其位于4号染色体第24433528bp处,变异类型为C/T;
第39位点,其位于4号染色体第25040719bp处,变异类型为G/C;
第40位点,其位于4号染色体第33938135bp处,变异类型为T/G;
第41位点,其位于4号染色体第35429916bp处,变异类型为T/C;
第42位点,其位于4号染色体第35600405bp处,变异类型为C/T;
第43位点,其位于5号染色体第25309407bp处,变异类型为T/C;
第44位点,其位于5号染色体第25468956bp处,变异类型为G/A;
第45位点,其位于5号染色体第26595920bp处,变异类型为G/A;
第46位点,其位于5号染色体第27277565bp处,变异类型为A/G;
第47位点,其位于5号染色体第30837768bp处,变异类型为G/A;
第48位点,其位于5号染色体第32711351bp处,变异类型为C/T;
第49位点,其位于6号染色体第8633342bp处,变异类型为C/T;
第50位点,其位于6号染色体第15134822bp处,变异类型为A/G;
第51位点,其位于7号染色体第1604239bp处,变异类型为A/C;
第52位点,其位于7号染色体第4649920bp处,变异类型为C/T;
第53位点,其位于7号染色体第24674969bp处,变异类型为T/C;
第54位点,其位于7号染色体第26670200bp处,变异类型为G/A;
第55位点,其位于7号染色体第31254686bp处,变异类型为T/C;
第56位点,其位于7号染色体第32244592bp处,变异类型为C/T;
第57位点,其位于8号染色体第12035697bp处,变异类型为G/A;
第58位点,其位于8号染色体第16737377bp处,变异类型为G/A;
第59位点,其位于8号染色体第20142748bp处,变异类型为C/A;
第60位点,其位于8号染色体第24131867bp处,变异类型为A/G;
第61位点,其位于8号染色体第25963400bp处,变异类型为G/A;
第62位点,其位于8号染色体第26626811bp处,变异类型为G/A;
第63位点,其位于8号染色体第30487362bp处,变异类型为A/G;
第64位点,其位于8号染色体第31339022bp处,变异类型为T/C;
第65位点,其位于9号染色体第3731164bp处,变异类型为C/G;
第66位点,其位于9号染色体第19858161bp处,变异类型为C/T;
第67位点,其位于9号染色体第19882512bp处,变异类型为C/G;
第68位点,其位于9号染色体第31085651bp处,变异类型为C/T;
第69位点,其位于10号染色体第32135357bp处,变异类型为T/C;
第70位点,其位于11号染色体第6755607bp处,变异类型为G/A;
第71位点,其位于11号染色体第6846610bp处,变异类型为A/T;
第72位点,其位于11号染色体第14268737bp处,变异类型为G/A;
第73位点,其位于11号染色体第19028655bp处,变异类型为A/C;
第74位点,其位于11号染色体第22012737bp处,变异类型为A/G;
第75位点,其位于11号染色体第28148373bp处,变异类型为A/G;
第76位点,其位于11号染色体第28572323bp处,变异类型为G/C;
第77位点,其位于11号染色体第29066153bp处,变异类型为T/C;
第78位点,其位于12号染色体第4515625bp处,变异类型为G/A;
第79位点,其位于12号染色体第7165484bp处,变异类型为C/T;
第80位点,其位于12号染色体第11015330bp处,变异类型为C/G;
第81位点,其位于12号染色体第19809428bp处,变异类型为A/G;
第82位点,其位于12号染色体第25952010bp处,变异类型为G/A;
第83位点,其位于12号染色体第28754729bp处,变异类型为T/C;
第84位点,其位于12号染色体第28935367bp处,变异类型为A/G;
第85位点,其位于13号染色体第1242043bp处,变异类型为A/G;
第86位点,其位于13号染色体第8915121bp处,变异类型为A/T;
第87位点,其位于13号染色体第9717661bp处,变异类型为T/C;
第88位点,其位于13号染色体第15957404bp处,变异类型为G/C;
第89位点,其位于13号染色体第24952068bp处,变异类型为C/T;
第90位点,其位于14号染色体第2964985bp处,变异类型为C/G;
第91位点,其位于14号染色体第11036295bp处,变异类型为G/A;
第92位点,其位于14号染色体第12556155bp处,变异类型为T/C;
第93位点,其位于14号染色体第15853622bp处,变异类型为A/C;
第94位点,其位于15号染色体第4969146bp处,变异类型为G/A;
第95位点,其位于15号染色体第9284099bp处,变异类型为C/G;
第96位点,其位于15号染色体第12769037bp处,变异类型为A/C;
第97位点,其位于15号染色体第22143654bp处,变异类型为C/T;
第98位点,其位于15号染色体第23482593bp处,变异类型为A/C;
第99位点,其位于15号染色体第26167572bp处,变异类型为T/C;
第100位点,其位于15号染色体第26961651bp处,变异类型为T/C。
2.一种荔枝DNA指纹图谱,其特征在于,利用权利要求1所述的SNP位点组合构建而成。
3.权利要求1所述的SNP位点组合在构建荔枝DNA指纹图谱中的应用。
4.权利要求1所述的SNP位点组合在荔枝种质资源分类鉴定方面的应用。
5.一种利用权利要求1所述的SNP位点组合鉴定荔枝种质的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)提取荔枝样品DNA;
(2)对荔枝样品DNA中的SNP位点进行检测;
(3)根据SNP位点的检查结果,进行基因分型,鉴定荔枝的品种。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于:所述荔枝样品为荔枝新鲜叶片。
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