CN104846062A - 一种基于snp标记的黄瓜品种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于单核苷酸多态性标记的黄瓜品种鉴定的方法。该方法是利用焦磷酸测序技术对黄瓜的12个单核苷酸多态性标记进行分型分析,以达到对黄瓜品种进行真实性鉴定的结果。本发明的检测方法在5h之内即可完成黄瓜品种真实性鉴定工作,具有稳定、高通量、精准的等特点。
Description
技术领域
本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域,具体涉及黄瓜品种真实性鉴定的检测方法,是一种利用焦磷酸测序技术对黄瓜的12个SNP位点进行分型分析的方法。
背景技术
黄瓜是人民日常生活中十大蔬菜品种之一,因其独特的风味和口感深受广大消费者喜爱,产品销售时间长,品种种植地域广。我国黄瓜种业一直领先世界,特别是天津科润黄瓜研究所培育的“津优”、“津美”号等黄瓜品种是天津市支柱型种子品牌,远销30个省、市、自治区,已覆盖全国黄瓜露地栽培面积的60%以上,在市场占有率明显高于先正达等国际种子公司。
伴随着我国黄瓜种业的优势发展,市场上出现了一些套牌品种,以次充好,影响了种植户的产量和收入;甚至人非法盗取育种材料进行繁种,严重影响了我国育种单位的利益及我国黄瓜种业的健康发展,因此,亟需建立一种精准、高通量、高自动化的黄瓜种子品种鉴定和纯度检测技术体系,服务于种子执法单位的监管检测及育种单位种子质量内部控制,而其中,多态性强、密度高、遗传稳定的分子标记指纹图谱的构建及配套高通量、高自动化的检测模式是检测技术体系的关键。常规的标记技术如形态特征标记、同工酶标记、RAPD标记、SSR标记等技术具有标记密度不足、操作复杂、不能自动化分析差等缺点,不能满足市场的要求。
本专利立足我国黄瓜育种产业发展,结合生物信息学分析和分子生物学实验技术,筛选、确认黄瓜SNP位点,确定黄瓜品种鉴定核心SNP位点,建立精确、快速、高通量和高度自动化的基于SNP标记的黄瓜品种鉴定技术体系奠定基础,为保护我国黄瓜育种单位产权利益,维护我国黄瓜育种产业健康、快速发展提供技术支撑,对规范、监管种子市场、保护种植户的产量和收入具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种基于SNP标记的黄瓜品种真实性鉴定方法,为实现上述目的,本发明提供如下的技术方案:
用于黄瓜品种真实性鉴定的12个SNP位点,以及用于检测该12个位点的12套引物,其特征在于:
注:“Biotin-”代表该引物在5’端加上生物素标记修饰。
本发明所述基于SNP标记的黄瓜品种真实性鉴定方法,该方法以供试品种基因组DNA为模板,对已知SNP标记位点进行PCR扩增分析,结合应用焦磷酸测序技术对标志性核酸位点进行SNP分型分析,其包括如下步骤:
(1)采用12套PCR引物(-F和-R)及GoTaqMaster Mix,分别以供试品种和对照品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增;其中的PCR扩增反应体系为:总体积为50μL,其中: Master Mix 25μL,10μmol/L引物各1μL,DNA模板2μL,用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序为:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存;
(2)应用焦磷酸测序特异性引物(-S),分别对供试品种和对照品种的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(3)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况,全部相同为同一品种,否则,为不同品种。
本发明所述的检测方法,其中的Binding Buffer47μL指的是:10mmol/L Tris-HCl,2mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,0.1%Tween20,pH7.6的溶液;Annealing Buffer38.8μL指的是:20mmol/L Tris-AC,2mmol/L MgAc2,pH7.6的溶液。
本发明所述的检测方法,其中每条引物分别配制成浓度为100μmol/L的贮存液,工作浓度为10μmol/L。
本发明所述的检测方法,DNA模板指的是从黄瓜种子中提取的基因组DNA。
本发明所述的检测方法,焦磷酸测序全过程为:测序引物与PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶,以及底物APS和荧光素一起孵育;四种dNTP(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)之一被加入反应体系,如与模扳配对(A—T,C—G),此dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP的焦磷酸基团(PPi)释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比;ATP硫酸化酶在三磷酸腺苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号,光信号由CCD摄像机检测,并由可见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比;然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序,即可从反应光强的信号峰中读出。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法,下面对本发明的试验方法做以详细的说明。
1、原理
本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是:在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度, 达到实时测定DNA序列的目的。本发明的测序方法具有准确性高,重复性好,自动化程度高和操作简单等优点。
2、引物设计
本发明依据12个多态性较强的黄瓜SNP标记位点,设计12套特异性引物。引物由上海生物工程公司合成。
表1引物序列表如下:
3、反应条件
PCR扩增反应试剂需要GoTaqMaster Mix、PCR扩增引物及模板DNA。测序反应试剂需要PCR扩增产物、Sepharose Beads、Binding Buffer、测序引物及Annealing Buffer,需要有焦磷酸测序仪,测序时间8~10min。
材料与方法:
(1)试剂:Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液;上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物;Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序:扩增反应的总体积为50μL,其各种成分分别为:2×GoTaqMaster Mix25μL,10μmol/L引物各1μL,模板DNA2μL,用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存。
(3)测序反应体系:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(4)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况,全部相同为同一品种,否则,为不同品种。
本发明用于黄瓜品种真实性的检测,具有以下优点:
(1)本发明的黄瓜品种真实性鉴定方法与常规的测定方法的对比,其操作简便、适于高通量操作。
(2)精准性:该发明是以焦磷酸测序技术为基础,具有很高的准确性。
(3)快速高效:5h之内即可完成黄瓜品种鉴定工作;
(4)结果判定简单:鉴定结果可以直接从可见光信号峰值读出。
具体实施方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法,下面对本发明的试验方法做以详细的说明,在此需加以说明的是:本发明所述的引物序列见表1。黄瓜种子模板DNA的提取:常规CTAB法提取(见附件)。
实施例1
(1)试剂:Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液;上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物;Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序:扩增反应的总体积为50μL,其各种成分分别为:2×GoTaqMaster Mix25μL,10μmol/L引物各1μL,对供试品种和对照品种DNA模板2μL(黄瓜种子DNA),用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存。
(3)测序反应体系:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(4)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个 SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明,供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上相同,所以供试品种与对照品种为同一品种。
实施例2
(1)试剂:Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液;上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物;Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序:扩增反应的总体积为50μL,其各种成分分别为:2×GoTaqMaster Mix25μL,10μmol/L引物各1μL,供试品种和对照品种的模板DNA2μL(黄瓜种子DNA),用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存。
(3)测序反应体系:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ 96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(4)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明,供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上相同,所以供试品种与对照品种为同一品种。
实施例3
(1)试剂:Promega公司生产的GoTaqMaster Mix溶液;上海生工合成的特异性扩增引物和测序引物;Biotage公司生产的Sepharose Bead。
(2)扩增反应体系及扩增程序:扩增反应的总体积为50μL,其各种成分分别为:2×GoTaqMaster Mix25μL,10μmol/L引物各1μL,供试品种和对照品种的模板DNA2μL(黄瓜种子DNA),用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存。
(3)测序反应体系:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(4)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对供试品种和对照品种的12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况。结果见下表。
结果表明,供试品种与对照品种在12个SNP分型结果上有6个位点相同,6个位点不同,因此供试品种与对照品种不是同一品种。
附件:常规CTAB法提取黄瓜种子DNA
(1)取黄瓜种子10粒,放入研钵中,加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3~4次,磨碎成粉末为止;
(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液,充分混合、悬浮试样(依试样不同,可适当增加缓冲液的用量),65℃保育30min,期间不停颠倒混匀;
(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管,加入1倍体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中;
(4)加入1倍体积的氯仿:异戊醇(24:1),充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中;
(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液,室温静置保育60min;12000g离心15min,弃上清;加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀;12000g离心10min,转移上清至一新离心管。
(6)加入0.6倍体积异丙醇,倒置离心管轻柔混合,室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70%乙醇溶液,并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。
(7)干燥DNA沉淀,加30μL水或TE缓冲液溶解DNA。
Claims (2)
1.用于黄瓜品种真实性鉴定的12个单核苷酸多态性位点,以及用于检测该12个位点的12套PCR-焦磷酸测序检测引物,其特征在于:
注:“Biotin-”代表该引物在5’端加上生物素标记修饰。
2.一种采用权利要求1所述的12套特异性引物,使用PCR-焦磷酸测序方法,鉴定黄瓜品种真实性的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)采用权利要求1中所述的12套引物中的PCR引物(-F和-R)及GoTaqMaster Mix,分别加入供试品种和对照品种的DNA模板进行PCR扩增;其中的PCR扩增反应体系为:总体积为50μL,其中: 10μmol/L引物各1μL,DNA模板2μL,用灭菌去离子水补齐至50μL;反应程序为:95℃预变性10min,94℃变性30S,50℃退火30S,72℃延伸45S,循环50次,最后72℃延伸7min,4℃保存;
(2)采用权利要求1所述的焦磷酸测序特异性引物(-S),分别对供试品种和对照品种的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分析:50μL PCR产物中加入47μL Binding buffer和3μL Sepharose beads,1300rpm涡旋混匀15min,经Vacuum prep workstation单链分离,释放到预先加入38.8μL Annealing buffer和1.2μL测序引物的PSQ96测序反应板中,80℃金属加热块上放置2min后冷却至室温;将酶、底物和A、T、C、G成分加入试剂仓,即可上机测序。
(3)测序时间8~10min,测序结束后使用“SNP”模式对12个黄瓜SNP位点进行分型分析,比较供试品种和对照品种在12个SNP位点上的分型情况,全部相同为同一品种,否则,为不同品种。
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