CN102337345B

CN102337345B - 基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒

Info

Publication number: CN102337345B
Application number: CN 201110346459
Authority: CN
Inventors: 侯一平; 扎拉嘎白乙拉; 云利兵; 颜静; 翟仙敦; 罗海玻; 李英碧
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: CN102337345A

Abstract

本发明属法医学领域，具体涉及一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。本发明试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液、以及单碱基延伸反应混合液构成。所述试剂盒通过单管内的复合扩增反应和多重单碱基延伸反应，利用法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台，可一次性快速、准确地获得生物检材的20个三等位基因SNP遗传标记的分型，确定检材的个体来源，为法医个人识别提供一种新的技术手段。该试剂盒在法医学领域具有良好的应用前景。

Description

基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒

技术领域

本发明属于法医学领域，具体涉及一种用于法医个体识别的基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。

背景技术

法医DNA分析通过对生物性检材进行DNA遗传标记的检测来实现亲子鉴定和个人识别的目的。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是基因组特定核苷酸位置上单个碱基变异引起的DNA序列多态性，是人类基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型。SNP作为第三代DNA遗传标记，具有含量丰富、遗传稳定、突变率低、扩增片段小等特点，在法医学亲子鉴定和个人识别中有特殊的应用价值。

但是，传统意义上的SNP是指DNA序列中有两种碱基变化的多态性，这种二等位基因的SNP有其局限性。首先，二等位基因的SNP其信息量与具有较多等位基因的STR遗传标记差距较大，至少需要50-60个SNP位点才能达到13-15个常用STR的累计个人识别率和非父排除率。而大量二等位基因SNP的复合扩增，不仅增加了检测成本，且大大增加了复合检测和数据分析的难度。二等位基因SNP的另一个局限性在于无法用于混合样本的分析。混合样本，尤其是混合血痕，是暴力犯罪和意外事故中常见的生物性检材。二等位基因SNP无法提示混合样本中多个来源个体的存在，因而对混合样本的分析无能为力。

随着人类基因组单体图计划和千人基因组计划的进展，一种特殊类型的SNP——三等位基因SNP(Tri-allelic SNP)引起法医遗传学研究者的关注。三等位基因SNP是指在一个群体中基因的特定核苷酸位置上出现三种碱基，其中最少的一种在群体中的频率大于1％。理论上，三等位基因SNP具有低突变率、只需扩增很短DNA片段就可以包含SNP位点等特点，而且由于等位基因数量增加，因此可以用比二等位基因SNP少的位点数就可获得和现有STR系统大致相同的个人识别率和非父排除率。然而，目前有关三等位基因SNP在法医物证领域的研究还属于起步阶段。2004年，Phillips等首次提出了三等位基因SNP在法医物证领域应用的可能性，并在欧洲和非洲人群中发现了9个三等位基因SNP。而Westen等在2009年通过在荷兰人和欧美混血人群中共发现了11个具有三等位基因的SNP，并证实它们可以有效地分型降解样本。Antoinette等同时采用DNA修饰酶法、miniSTR系统和三等位基因SNP系统对降解样本进行分型，结果显示三等位基因SNP非常适合鉴定降解样本。

目前为止，可以应用于法医学个人识别的三等位基因SNP数量有限，尚无法构建可与现有STR系统媲美的高识别能力的体系。筛选到一组适宜的三等位基因SNP遗传标记，构建一种高效能的复合检测体系，将为法医的个人识别提供一种新的技术手段。开发出基于现有法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台的三等位基因SNP复合检测试剂盒，将极大推动这种新技术在法医个人识别中的推广和应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是实现利用三等位基因SNP遗传标记对未知来源的人类生物学检材进行法医学个人识别，从而能确定所述样本的个体来源。

本发明解决该技术问题的方案是提供一种基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒。该基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。

其中，上述试剂盒中所述复合扩增引物混合物包含了20个三等位基因SNP遗传标记的共计40条扩增引物，各条引物的核苷酸序列分别为表1中SEQ ID No.1至SEQ ID No.40所示。

表1单管内复合扩增引物对

所述复合扩增引物混合物能在单管内对含有20个三等位基因SNP遗传标记的所有DNA片段一次性同时扩增。

其中，上述试剂盒中所述的多重单碱基延伸反应引物混合物包含20个三等位基因SNP遗传标记的共计20条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列为表2中SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示。

表2单碱基延伸反应引物序列

序号	SNP基因座的rs号	各多重单碱基延伸引物序列	序列表中的序号
				1	rs1630312	AGGCAGGCATCAAAGTGCA	SEQ ID No.41
2	rs3091244	8C-GCACCCAGATGGCCACT	SEQ ID No.42
				3	rs2069945	TCAGG-GCTACACTATCTCTGTCTCAGTTTC	SEQ ID No.43
4	rs6001030	8C-TATCTATTGATAAACATGAGTTCTT	SEQ ID No.44
				5	rs140676	10C-CTGTGTCTTGGAGGAAAATTGAGAG	SEQ ID No.45
6	rs356167	14C-CATTGCTGTTGTTGTTCTTCTTCTT	SEQ ID No.46
				7	rs941454	18C-TTTCCTTTTTGCAGTGTTAAAAACC	SEQ ID No.47
8	rs10045	22C-GTAATTTAATAAAAAAAACTAAGGA	SEQ ID No.48
				9	rs3743842	27C-TCATTACATGAGACCCTGTGTGTC	SEQ ID No.49
10	rs2298556	37C-ACTTTACGGGACTGAAAA	SEQ ID No.50
				11	rs3816662	35C-CAGAGTTAGACATCAAAGTTGCCG	SEQ ID No.51
12	rs230722	38C-ATGCAATTACACAACAGAACACTAT	SEQ ID No.52

13	rs10811897	41C-CTTTCATAACTTCTCAATTCTGACA	SEQ ID No.53
				14	rs17287498	43C-GAAAATTAACTGCATTTGTTTTTAC	SEQ ID No.54
15	rs385780	51C-TTCTCTCTGAGCTCCAGACAC	SEQ ID No.55
				16	rs11141033	51C-GGATATGGGAAAAGACTCTTCTGC	SEQ ID No.56
17	rs4540055	58C-CACTTTTGAATACCACGCCTGAC	SEQ ID No.57
				18	rs3812847	62C-TAGCTCCCAAGCTGGTTGATTT	SEQ ID No.58
19	rs2032582	62C-TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG	SEQ ID No.59
				20	rs2278786	65C-ATTCTTTAAATGAGGTGCATAGTCT	SEQ ID No.60

所述多重单碱基延伸引物前端“-”符号前为加尾序列，阿拉伯数字其后字母表示加尾序列中重复的碱基类型，阿拉伯数字表示该碱基的重复次数。

所述的多重单碱基延伸反应引物混合物能利用上述复合扩增引物混合物的扩增产物为模板，在单管内进行20个三等位基因SNP遗传标记的多重单碱基延伸反应。

其中，上述试剂盒中所述的等位基因分型物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成；各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的三个等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物；所述的等位基因分型物混合物包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的rs号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如表3所示；

表320个三等位基因SNP的等位基因分型标准物核苷酸序列及所加荧光标记

所述各序列中“-”符号前为加尾序列；阿拉伯数字其后字母表示加尾序列中重复的碱基类型，阿拉伯数字表示该碱基的重复次数。

本发明三等位基因SNP检测试剂盒的有益效果为：本发明试剂盒包含20个三等位基因SNP遗传标记，其个人识别率显著高于二等位基因SNP，且所有位点均分布于不同染色体或染色体臂上，位点之间不存在连锁不平衡，从而使系统具有高效能；本试剂盒应用了单管内复合扩增和多重单碱基延伸技术，可以一次性获得生物性检材的20个三等位基因SNP遗传标记的基因分型，快速进行法医学的个体识别；本试剂盒包括了特有的等位基因分型物混合物，确保分型准确；该试剂盒复合扩增产物长度最短仅68bp，最长不超过180bp，故本试剂盒对于法医学常见的降解检材的检测具有优势；本试剂盒检测的所有SNP位点均有三个等位基因，所以可用于混合样本的检测。由于本试剂盒是基于法医遗传实验室通用的毛细管电泳平台建立的，所以具有广泛推广和应用价值。

附图说明

图1为本发明对69号生物检材的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值提示DNA链长度，纵坐标数值表示荧光强度，1-20代表不同的三等位基因SNP编号(与表1的编号对应)。

图中所标的GS-120LIZ表示内标(购自AB公司，Applied Biosystems)。A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。从图中可以清晰地观察到该检材的所有二十个三等位基因SNP的分型结果，证明本发明三等位基因SNP复合检测试剂盒可以准确检测生物学样本。

图2为等位基因分型标准物的毛细管电泳检测结果。图中的横坐标数值提示DNA链长度纵坐标数值表示荧光强度，1-20代表不同的三等位基因SNP编号(与表1的编号对应)。

图中所标的GS-120LIZ为内标；A、T、C、G代表四种脱氧核糖核苷酸。该图可以观察到总共60个荧光标记的DNA片段，证明了本发明中的等位基因分型标准物混合物包括了涉及的20个三等位基因SNP所有已知等位基因的单碱基延伸反应产物。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒是基于筛选得到的20个三等位基因SNP遗传标记，利用目前法医遗传学实验室常用的毛细管电泳体系构建的。该试剂盒由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成。

该试剂盒的工作原理是首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，在单管内同时扩增获得所有含有20个三等位基因SNP的DNA片段。然后以此20个DNA片段为模板，利用单碱基延伸反应混合液和单碱基延伸反应引物混合物进行多重单碱基延伸反应以获得待测样本的20个三等位基因SNP的单碱基延伸反应产物。最后进行毛细管电泳，并利用等位基因分型标准物混合物分析待测样本的多重单碱基延伸反应产物，确定分型结果。

在本发明中，三等位基因SNP的选择对复合检测试剂盒的构建极其关键。目前已报道的具有法医学应用价值的三等位基因SNP位点极其有限，所以要开发三等位基因SNP的复合检测试剂盒就必须首先从庞大的SNP数据库中筛选出可应用于法医学个人识别的三等位基因SNP遗传标记。本发明中新建立的三等位基因SNP的筛选标准为：1)最小等位基因频率(minorallele frequency，MAF)大于5％；2)可以设计出合适的多重单碱基延伸引物和单管内复合扩增引物；3)与自然选择和疾病不相关；4)不在基因组重复序列内；5)为避免SNP基因座之间的连锁不平衡，选择在不同染色体或不同染色体臂的SNP。

根据建立的上述标准，本发明共筛选出20个三等位基因SNP用于建立法医学个人识别的复合检测体系。经过群体调查实验证明，本发明的三等位基因SNP复合检测体系具有较高的个人识别率，累积个人识别率达到0.999999999999267，即无关个体中不可分辨率小于全球人口总数的倒数，这意味着利用该试剂盒可以将全球所有无关个体区分开。试剂盒中所涉及的20个三等位基因SNP位点信息如表4。

表420个三等位基因SNP位点

序号	SNP基因座	染色体	染色体臂	核苷酸定位	多态性
						1	rs1630312	1	q	117967214	A/G/C
2	rs3091244	1	p	157951287	A/C/T
						3	rs2069945	20	q	33225498	C/G/T
4	rs6001030	22	q	36885850	A/C/T
						5	rs140676	15	p	25399268	A/G/T
6	rs356167	4	p	90892793	C/G/T
						7	rs941454	17	p	18171105	A/C/G
8	rs10045	3	q	123627642	A/C/T
						9	rs3743842	16	p	4998792	A/C/G
10	rs2298556	11	p	60027901	A/G/T
						11	rs3816662	17	q	76992181	A/C/G
12	rs230722	12	q	64387626	A/G/T
						13	rs10811897	9	p	2333733	A/G/T
14	rs17287498	10	q	54200794	A/C/T
						15	rs385780	19	q	48855586	C/G/T
16	rs11141033	9	q	87408635	A/C/G
						17	rs4540055	4	q	38479650	A/C/G
18	rs3812847	13	q	74955741	C/G/T
						19	rs2032582	7	q	38479650	A/C/T
20	rs2278786	2	p	46057300	C/G/T

本发明试剂盒在对上述筛选到的三等位基因SNP的检测中运用了复合扩增技术。复合扩增技术可以在一个反应体系中一次性的扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和成本的优点，适应法医学鉴定的实际需要。复合扩增引物的设计是该技术的关键和难点，在设计引物时，我们考虑了以下因素：1)分别包含20个SNP遗传标记的各扩增片段长度应有差异，这样即可对复合扩增反应是否成功进行检测；2)扩增产物长度短，以用于降解检材的检测。

我们根据公共SNP数据库提供的DNA序列设计了近百条复合扩增引物，结合我们的实际经验，经过反复筛选、优化，得到了表1中所列的20对复合扩增引物。这些引物长度在18-25bp之间，退火温度均为60±1℃，扩增产物在68-177bp之间，所有引物、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。

本试剂盒利用上述复合扩增引物，获得了包含20个SNP遗传标记的扩增产物，继而以此为模板，进行单碱基延伸反应。单碱基延伸反应技术是一种基于四种荧光素标记的双脱氧核糖核苷酸进行等位基因特异性引物延伸的反应。多重单碱基延伸反应可以在一个反应体系中同时获得多个SNP位点的单碱基延伸产物，实现对多个SNP位点的一次性同时检测。其特点在于，通过设计不同长度的单碱基延伸引物，可以同时分析多个SNP位点，即根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据不同的双脱氧核糖核苷酸所标记荧光素的不同区分SNP的不同等位基因。为了实现对多个SNP位点同时进行单碱基延伸反应，多重单碱基延伸引物的退火温度应该大致相同，且引物自身、引物之间、引物与模板之间无明显的发卡结构、错配和二聚体结构。

尤为重要的是，要根据单碱基延伸反应产物长度的不同来区分不同的SNP位点，多重单碱基延伸引物之间长度必须有差异。在本试剂盒中，我们设计的单碱基延伸引物包括两个部分，第一部分为3’端与SNP上游序列互补的序列，第二部分为5’端的加尾序列，为长度有差异的重复序列(Poly-C)或非人源DNA序列。加尾序列的应用使不同位点的单碱基延伸引物长度不同，最终使不同位点的单碱基延伸产物之间有长度差异。考虑到不同长度范围的DNA片段在毛细管电泳中电泳行为的差异，在我们设计的所有单碱基延伸引物中，30bp以下引物之间相差5bp，31至50bp引物之间相差4bp，51bp至90bp引物之间至少相差3bp。

最后设计出的所有20个三等位基因SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物的序列参见表5(各序列的序列号分别在表1和表2中)。

表5 20个三等位基因SNP位点复合扩增引物和多重单碱基延伸引物参照表

序号	SNP基因座	复合扩增引物e(5’-3’)	多重单碱基延伸引物(5’-3’)
				1	rs1630312	上游ATCTCTCAGGGCTCCACTTTG	AGGCAGGCATCAAAGTGCA
		下游TGATTTGGGCTGAAGTAGGTG
				2	rs3091244	上游GGAGGAGGCAGGCATCAA	8C-GCACCCAGATGGCCACT
		下游TAGACCCACTTTACGGGACTGAA
				3	rs2069945	上游TTGACTGCCTACGTGCAAACCT	TCAGG-GCTACACTATCTCTGTCTCAGTTTC
		下游GGGCAATGGGCTTTACATACATTA
				4	rs6001030	上游GGACTTCCTTAAACAAGACACAA	8C-TATCTATTGATAAACATGAGTTCTT
		下游AGTCCAAATACACACCTTTTGTCA
				5	rs140676	上游GGTGGCATTTAGCCATTCATT	10C- CTGTGTCTTGGAGGAAAATTGAGAG
		下游AAAAACACAGAGCAAACATTAGCA
				6	rs356167	上游CCAAAACCATCACCACAGTTC	14C- CATTGCTGTTGTTGTTCTTCTTCTT
		下游AGCCATTGGATTTTGTAAGAAGG
				7	rs941454	上游CCCAAAACTGTGATGGAACAT	18C-TTTCCTTTTTGCAGTGTTAAAAACC
		下游CCAGCCAGAAGTAGAAACTTGATG
				8	rs10045	上游GTTGCTGGTATGAGGATTTCG	22C-GTAATTTAATAAAAAAAACTAAGGA
		下游GCCCCTAGTTACACTGATTGCAT
				9	rs3743842	上游ATTGGGCAGGTGAGCACTT	27C- TCATTACATGAGACCCTGTGTGTC

下游ACTGCGTGCCAGGCTTCT
	10	rs2298556	上游GATATGTGCATCAATGGGGTAGC	37C-ACTTTACGGGACTGAAAA
下游TAGACCCACTTTACGGGACTGAA
	11	rs3816662	上游CCCCACATTCCCGGATTC	35C-CAGAGTTAGACATCAAAGTTGCCG
下游CGTCCCGCTCCATAAGTG
	12	rs230722	上游CAGATAGGAACTGCCTGGATCTAG	38C-ATGCAATTACACAACAGAACACTAT
下游CGGAAACGAGAAGATGCAATTAC
	13	rs10811897	上游AGTCATGCCCATTTATTTATGTATTG	41C-CTTTCATAACTTCTCAATTCTGACA
下游GAGGCAGGAGAATCGCTTTTAG
	14	rs17287498	上游GGGCTGGACAGGAGAACAAC	43C-GAAAATTAACTGCATTTGTTTTTAC
下游GGGAGGGTGCAAAGTGAAAAT
	15	rs385780	上游AGACTTCTCTCTGAGCTCCAGACA	51C-TTCTCTCTGAGCTCCAGACAC
下游AGATGGGGAGTTTTGTTTAGGAC
	16	rs11141033	上游GAACACAGTCATGCCCATTTATTT	51C-GGATATGGGAAAAGACTCTTCTGC
下游GGTGAATCCCCATCTCTACTAAAC
	17	rs4540055	上游TCTTTCCACCTCCTAGCCAACTC	58C-CACTTTTGAATACCACGCCTGAC
下游TCTTTCCACCTCCTAGCCAACTC
	18	rs3812847	上游GATCCCATTTCCTTAGGCTACATA	62C-TAGCTCCCAAGCTGGTTGATTT
下游GCTCCCAAGCTGGTTGATTT
	19	rs2032582	上游CTTTGAGGAATGGTTATAAACACA	62C-TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG
下游CTGGACAAGCACTGAAAGATAAGA
	20	rs2278786	上游TCATCTGGTAAGCCTTTCTCTTGG	65C-ATTCTTTAAATGAGGTGCATAGTCT
下游AACGAGGCACACCAGCATTCT

本发明试剂盒中引入等位基因分型标准物混合物是为了准确地分析样本基因型，本发明中提供的等位基因分型标准物混合物包括了所有20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物，各个SNP遗传标记的等位基因分型标准物是利用其单碱基延伸引物对该SNP在群体中观察到的三个等位基因进行单碱基延伸反应得到的产物。因此本试剂盒中的等位基因分型物混合物包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因。对未知样本进行毛细管电泳分析时，并列地进行等位基因分型标准物混合物的毛细管电泳分析，通过未知样本和已知等位基因分型标准物混合物的电泳结果比对，可以确定未知样本的基因分型。

本发明试剂盒的结果分析在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合扩增和单碱基延伸技术进行三等位基因SNP遗传标记的检测，根据单碱基延伸反应产物长度的不同区分不同的SNP位点，根据荧光素的不同区分SNP的不同等位基因，利用目前法医遗传学实验室通用的毛细管电泳平台即可进行分析。因此本发明建立的基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒可以直接应用于任何一个有毛细管电泳平台的法医遗传实验室，具有普适性，易于推广应用。

更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分可为：

a)复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl₂、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分。

b)复合扩增引物混合物：如表1所示的20个三等位基因SNP遗传标记的扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；复合扩增反应混合液和复合扩增引物混合物用于获得含有20个三等位基因SNP遗传标记的DNA片段。

c)扩增产物纯化试剂：含有核酸外切酶1(Exo I)及其缓冲溶液(Exo I Buffer)、虾碱性磷酸酶(SAP)及其缓冲溶液(SAP Buffe)等成分；用于将复合扩增的产物进行纯化，以便于进行下一步操作。

d)多重单碱基延伸反应引物混合物：表2所述的20条多重单碱基延伸反应引物组成的混合物。

e)单碱基延伸反应混合液：包括DNA聚合酶、缓冲液、MgCl₂、荧光标记双脱氧核糖核酸等成分。

f)等位基因分型标准物混合物：由表3所述的60个荧光素标记DNA片段组成，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60个等位基因。

复合扩增反应混合液、扩增产物纯化试剂可按本领域常用的配方或按分子生物学手册进行配制，也可直接使用商业化的产品。单碱基延伸反应混合液则一般需使用商业化的产品。

至于提取待检测样本中的DNA的模板，可使用本领域目前的各种常规试剂，提取DNA模板可以参照现有的常规方法即可进行。

利用本发明所述试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；

1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。

2)利用上述复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液对步骤1提取的DNA进行单管内复合扩增。

所述复合扩增PCR的反应的循环参数为：94℃，5分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；然后72℃，10分钟。

3)纯化步骤2的复合扩增产物，并以它为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物和单碱基延伸反应混合液进行单管内多重单碱基延伸反应。

所述单碱基延伸反应的循环参数为：94℃，10秒，50℃，5秒，60℃，30秒，25个循环后4℃保存。

4)纯化步骤3的产物后进行毛细管电泳分析，根据电泳结果获得样本的基因型。

进一步的，上述方法步骤4中所述的多重单碱基延伸产物分析包括以下步骤：将多重单碱基延伸反应产物纯化后和等位基因分型标准物混合物进行毛细管电泳分析，通过与等位基因分型标准物混合物比对，获得待检测样本的基因型。

以下用具体实例进一步具体说明本发明，其中所用试剂无特殊说明均使用以下试剂和仪器；

1)自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪310型， ABI公司

2)PCR扩增仪 9600型，ABI公司

3)台式高速离心机 EPPENDORF公司

4)紫外分光光度计岛津公司

5)纯水装置 Millipore公司

6)移液器 EPPENDORF公司

7)Hi-Di甲酰胺 ABI公司

8)核酸外切酶1 TaKaRa Biotechnology公司

9)虾碱性磷酸酶 TaKaRa Biotechnology公司

10)内标(GenescanTM Size Standard GS-120LIZ) ABI公司

实施例一本发明试剂盒的制备

用于检测的三等位基因SNP复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：

a)复合扩增引物混合物。由表1所示的扩增引物混合得到，由TaKaRa Biotechnology公司合成，将合成好的20对扩增引物用超纯水配置为50pM/μL，然后按照表6中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。

b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用TaKaRa Biotechnology公司的PCR反应混合液One shot La PCRTM Mix。

c)多重单碱基延伸反应引物混合物。由表2所示的单碱基延伸反应引物混合得到，由TaKaRa Biotechnology公司合成。将合成好的20个单碱基延伸反应引物用超纯水配置为50pM/μL，以表7中给出参数配成多重单碱基延伸引物混合物。

d)单碱基延伸反应混合液。本实施例中使用ABI公司的产品SNaPshot ready reactionmix。

e)等位基因分型标准物混合物。由按表3所示的60条荧光标记DNA片段组成，标记等位基因分型标准物的绿色、黑色、蓝色和红色荧光标记物分别为dR6G、dTAMRATM、dR110和dROXTM，由ABI公司提供荧光标记物并按其手册标记。

将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，用于后继的实验。

表6复合扩增引物的浓度

表7多重单碱基延伸引物的浓度

实施例二使用本发明试剂盒检测100个无关汉族个体检材

使用上述基于三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，我们进行了100个无关汉族个体检材的检测。具体的检测过程按如下进行：

a、用Chelex-100法从100个无关汉族个体血样中提取基因组DNA，作为复合扩增模板。

b、以步骤a中的DNA模板，利用复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液将样本在下述扩增体系中进行复合PCR扩增。

扩增的热循环参数

从第2步到第4步循环35次

5、72℃ 10分钟

c、多重PCR产物的纯化，下列为每一个样品扩增产物的纯化体系

扩增产物纯化反应条件：

37℃ 80分钟

85℃ 15分钟

4℃ 保存

d、以上一步纯化得到的产物为模板，利用多重单碱基延伸引物混合物进行单碱基延伸反应。

单碱基延伸反应的热循环参数：

96℃ 10秒

50℃ 5秒

60℃ 30秒

循环25次。

e、纯化上一步单碱基延伸反应产物。

单碱基延伸反应产物纯化体系：

单碱基延伸反应产物纯化反应条件：

37℃ 80分钟

85℃ 15分钟

4℃ 保存。

f、毛细管电泳。

分别取1.5μL步骤e中得到的纯化后的延伸产物和等位基因分型标准物混合物(每次加入1.5ul)，加入7.5μL的Hi-Di甲醇胺和0.5μL内标混匀；然后95℃下变性3min，4℃下迅速冷却后，用美国AB公司的DNA自动分析仪(自动激光荧光毛细管电泳DNA测序仪，310型)进行电泳检测。

电泳条件：1500V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；应用Data Collection 3.0软件收集数据，Genemappe V3.2软件进行结果分析。

由于检测了100个样本，以69号样本为例，参见附图1、图2。图1表示第69号样本的分型

结果，可以清晰地分辨该样本具有的所有等位基因；图2为等位基因分型物混合物的结果，可以清晰地分辨这20个三等位基因SNP遗传标记在人群中观察到的所有已知等位基因。

所得的所有100个样本的结果见表8，从表中可以看到没有任何两个样本的基因型是相同的。说明本发明采用的扩增引物和延伸引物可以完全分辨这100个不相关个体。

而以上结果还使用sanger测序法(双脱氧链终止法)和Pyrosequencing测序法(焦磷酸测序法)进行测序验证，三种方法检测结果一致，证明了本试剂盒检测结果的准确性。

Claims

1.基于20个三等位基因SNP遗传标记的法医学复合检测试剂盒，其特征在于：由分离包装的复合扩增引物混合物、多重单碱基延伸反应引物混合物、等位基因分型标准物混合物、复合扩增反应混合液和单碱基延伸反应混合液构成；

所述复合扩增引物混合物，包含了20个三等位基因SNP遗传标记的共计40条扩增引物，各条引物的核苷酸序列分别为下表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.40所示：

所述多重单碱基延伸反应引物混合物包含20个三等位基因SNP遗传标记的共计20条单碱基延伸引物，这些单碱基延伸引物的核苷酸序列分别为下表中SEQ ID No.41至SEQ ID No.60所示：

序号 SNP基因座的rs号各多重单碱基延伸引物序列序列表中的序号 1 rs1630312 AGGCAGGCATCAAAGTGCA SEQ ID No.41 2 rs3091244 8C-GCACCCAGATGGCCACT SEQ ID No.42 3 rs2069945 TCAGG-GCTACACTATCTCTGTCTCAGTTTC SEQ ID No.43 4 rs6001030 8C-TATCTATTGATAAACATGAGTTCTT SEQ ID No.44 5 rs140676 10C-CTGTGTCTTGGAGGAAAATTGAGAG SEQ ID No.45 6 rs356167 14C-CATTGCTGTTGTTGTTCTTCTTCTT SEQ ID No.46 7 rs941454 18C-TTTCCTTTTTGCAGTGTTAAAAACC SEQ ID No.47 8 rs10045 22C-GTAATTTAATAAAAAAAACTAAGGA SEQ ID No.48 9 rs3743842 27C-TCATTACATGAGACCCTGTGTGTC SEQ ID No.49 10 rs2298556 37C-ACTTTACGGGACTGAAAA SEQ ID No.50 11 rs3816662 35C-CAGAGTTAGACATCAAAGTTGCCG SEQ ID No.51 12 rs230722 38C-ATGCAATTACACAACAGAACACTAT SEQ ID No.52 13 rs10811897 41C-CTTTCATAACTTCTCAATTCTGACA SEQ ID No.53 14 rs17287498 43C-GAAAATTAACTGCATTTGTTTTTAC SEQ ID No.54 15 rs385780 51C-TTCTCTCTGAGCTCCAGACAC SEQ ID No.55 16 rs11141033 51C-GGATATGGGAAAAGACTCTTCTGC SEQ ID No.56 17 rs4540055 58C-CACTTTTGAATACCACGCCTGAC SEQ ID No.57 18 rs3812847 62C-TAGCTCCCAAGCTGGTTGATTT SEQ ID No.58 19 rs2032582 62C-TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG SEQ ID No.59 20 rs2278786 65C-ATTCTTTAAATGAGGTGCATAGTCT SEQ ID No.60

所述各序列中“-”符号前为加尾序列，阿拉伯数字其后字母表示加尾序列中重复的碱基类型，阿拉伯数字表示该碱基的重复次数；

所述的等位基因分型标准物混合物由20个三等位基因SNP遗传标记的等位基因分型标准物构成，包括60个荧光素标记DNA片段，对应20个三等位基因SNP遗传标记的所有已知60 个等位基因；所述60个荧光素标记DNA片段各自所对应的SNP基因座的rs号、核苷酸序列及标记的荧光素类型如下表所示；

所述各序列中，“-”符号前为加尾序列；阿拉伯数字其后字母表示加尾序列中重复碱基的类型，阿拉伯数字表示该碱基的重复次数。